Summary
כאן, אנו מדווחים על לוקליזציה immunofluorescence של dynamin כדי להמחיש את הפרוטוקולים עבור זיהוי חלבונים בסעיפים epididymal העכבר פרפין-מוטבע ואלו של קו מונצחים תא epididymal (mECap18). אנו מתארים גם את הפרוטוקולים עבור הבידוד של חלבונים הפרשה של נוזל epididymal והן תאים ממוזגים מדיה.
Abstract
יותרת האשך בתרבית של מפיק אחד הנוזלים intraluminal המורכבים ביותר של כל בלוטה אנדוקרינית על מנת לתמוך את ההבשלה פוסט-האשכים ואחסון של spermatozoa. המורכבות כזה מתעוררת עקב הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע משולב של תאי אפיתל רירית. כאן, אנו מתארים את הטכניקות לניתוח של סינתזת חלבונים epididymal והפרשת על-ידי התמקדות משפחת חלבונים המודל של dynamin (DNM) mechanoenzymes; GTPases גדולים שיש להם פוטנציאל להסדיר אירועים סחר ממברנה דו כיווני. לצורך המחקר של ביטוי חלבונים ברקמת epididymal, נתאר מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. אנו מתארים גם מתודולוגיה אופטימיזציה בידוד ואפיון של exosome כמו שלפוחית, הידועה בשם epididymosomes, אשר מופרשים לתוך לומן epididymal להשתתף בתקשורת המערכת עם התבגרות תאי זרע. כמו בגישה המשלימה, נתאר גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד בתור תא העכבר מונצחים SV40 caput epididymal אפיתל (mECap18). יתר על כן, נדון בכלי השירות של שורת תאים mECap18 כדגם מתאים במבחנה בה לחקור את ויסות פעילות הפרשה epididymal. לענין זה, אנו מתארים את הדרישות culturing עבור התחזוקה של הקו תא mECap18 ושימוש של משטרי עיכוב תרופתי סלקטיבית כי הם מסוגלים להשפיע על הפרופיל שלהם חלבון הפרשה. האחרון הם העריכו בקלות באמצעות קציר של בינוני תרבות ממוזגים, ריכוז חלבונים המופרש בעזרת חומצת חומץ טריכלור/אצטון משקעים וניתוח עוקבות שלהם דרך מרחביות-דף ו- immunoblotting. אנו טוענים כי שיטות אלה משולבים מתאימים לניתוח של חלבון epididymal חלופי מטרות כהקדמה קביעת שלהם תפקיד פונקציונלי זרע התבגרות ו/או אחסון.
Introduction
Spermatozoa של כל זני יונקים לרכוש את הפוטנציאל להצגת תנועתיות מתקדמת קדימה, כדי להפרות ביצית במהלך את התקדמותם. בכמאה ממושכת דרך יותרת האשך, אזור המערכת הגברי צינור במיוחד האשכים, אשר ייתכן מאוד מיוחדים 7-14 ימים כדי לנווט (תלוי בזן)1. בשל עיבוי קיצוני של כרומטין האבהי שפיכת הרוב המכריע של הציטופלסמה שמלווה את cytodifferentiation של spermatozoa בתוך האשכים, התפקודית עוקבות שלהם מונעת באופן בלעדי על ידי האינטראקציה שלהם עם microenvironment epididymal. סביבה זה, בתורו, נוצר על ידי הפעילות הפרשה ואת ספיגת ידע של סומה epididymal הבטנה ומציג רמה יוצאת דופן של קטע-קטע וריאציה1. כך, המקטעים הפעילים ביותר במונחים של סינתזת חלבונים והפרשת הם אלה הממוקמים בחלק הפרוקסימלית של יותרת האשך (כלומר, caput ו קורפוס)2. פעילות זו מראות לפרופיל תפקודי של spermatozoa, עם תחילת הראשונה תאים להצגת ההיכר של כשירות תפקודית (כלומר., תנועתיות מתקדמת ואת היכולת לאגד zona solubilized-חומצה glycoproteins) הבאים שלהם מעבר דרך יותרת האשך caput3. תכונות אלה פונקציונלי להמשיך לפתח לפני שהגיע רמות אופטימלית כמו הזרע להגיע דיסטלי epididymal המקטע (תסמונת), שבה הן מאוחסנות במצב של השבתה הדרגתית לקראת השפיכה. היווצרות ואת התחזוקה של מאגר אחסון זה הזרע קשורה באופן אינטימי גם האפיתל הציפוי, אשר תסמונת נשלטת על ידי פעילות ספיגת ידע חזק4,5. למרות הבדלים אנטומיים כבר דווח על6,7,8, כגון חלוקת העבודה שינגן מופיע להיות מאפיין של יותרת האשך שמשותף בין רוב זני יונקים למד עד כה, לרבות משלנו9,10. אכן, מנקודת מבט קליני, הוא מוכר שאת תפקוד epididymal גורם תרומה חשובה האטיולוגיה של גורם זכרי פוריות11, ובכך הדגשת החשיבות להבנת ברגולציה של רקמה מיוחדת זו.
לכן זה מצער כי ההבנה שלנו של פיזיולוגיה epididymal, ואת המנגנונים המווסתים את השלבים רציפים של זרע התבגרות ואחסון בתוך רקמה זו, יישארו לפתור באופן מלא. בין הגורמים התורמים, הגבלת ההתקדמות במחקר epididymal הם המורכבות הכוללת של רקמה זו וידע מנגנון רגולטורי לשלוט microenvironment luminal שלה. מבחינה אנטומית, אנו יודעים כי מעבר ההבחנה בין מקטעי caput, קורפוס, תסמונת, יותרת האשך נחלקים עוד מספר אזורי (איור 1 א'), אחד המופרדים באמצעות septa12 , המאופיינת פרופילים נפרדים של הגן/חלבון הביטוי13,14,15,16,17,18. ואכן, על בסיס נתונים היסטוריים תעתיק פרופיל של ביטוי גנים סגמנטלי של יותרת האשך, דווחו כ 6 ו 9 אזורים epididymal נפרדים במודלים עכבר, חולדה, בהתאמה19,20. כאלה המורכבות משקף ככל הנראה את ההרכב של סומה epididymal, אפיתל pseudostratified הכוללת סוגי תאים שונים רבים; כל שונות ביחס לפעילותם לשפע, הפצה, הפרשה/ספיגת ידע לאורך דרכי. כך, התאים העיקריים הם עד כה הנפוץ ביותר תא epididymal סוג המהוות למעלה מ- 80% של כל תאי אפיתל. בהתאם לכך, תאים עיקריים אחראים עיקר ביוסינטזה והפרשת חלבון epididymal5. לעומת זאת, האוכלוסייה התא ברורה לדרג כסוג התא השני הנפוץ ביותר בטווח סומה epididymal, מעורבים בעיקר סלקטיבית ספיגת רכיבי luminal, את לחומצי הזה microenvironment5. הוספת רמה נוספת של מורכבות, אנדרוגנים וגורמים אחרים lumicrine ממוצא האשכים להפעיל שליטה דיפרנציאלית על כל אחד מסוגי התאים epididymal בהתאם שלהם מיצוב לאורך מערכת.
למרות המגבלות שהוטלו על ידי כאלה המורכבות, התקדמות משמעותית ממשיכות להתבצע תוך פתרון הבסיס מכניסטית של פונקציה epididymal. מפתח מחקרים אלה כבר היישום של אסטרטגיות מתקדמות ספקטרומטר מסה כדי ליצור רשימות מלאי בהיקף נרחב של פרוטאום epididymal, במשולב עם ניתוח מפורט של חלבונים בודדים מתוך סקרים אלה הראשונית. איור של גישה זו הוא שלנו אפיון האחרונות של משפחת DNM mechanoenzymes העכבר דגם21. ההתעניינות DNM הראשונית שלנו הייתה מונעת על ידי פעילות כפולה צימוד של exo - ותהליכים endocytotic. בונים על תצפיות אלה, היינו מסוגלים להפגין כי שלושה איזופורמים הקנוני של DNM (DNM1 - DNM3) הם מאוד שבאה לידי ביטוי האשך העכבר וממוקמים כראוי כדי למלא את תפקידי רגולטוריות הפרשת חלבון וקליטה21 . יתר על כן, היינו יכולים להבחין בבירור כל isoform DNM על בסיס לוקליזציה הסלולר וסלולריות תת שלהם, ובכך רומז שיש ברשותם משלימים, לעומת פעילות עודפת, בתוך האפיתל epididymal21.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ניסיוני המועסקים לצורך המחקר של DNM ביטוי האשך עכבר עם תקווה כי מידע זה מצא יישום רחבות אפיון חלופי חלבונים epididymal, ובכך לתרום שלנו ההבנה של הפונקציה של יסוד חשוב זה של מערכת הרבייה הגברית. באופן ספציפי, אנו מתארים את פיתוח מתודולוגיה חזקים immunofluorescence תיוג של חלבונים היעד בסעיפים epididymal פרפין-מוטבע, זיהוי עוקבות של ההתפלגות המרחבי של חלבונים אלה באמצעות immunofluorescence מיקרוסקופ. בהמשך, ואנחנו מתעדים שלנו לאחרונה ממוטבת פרוטוקולים22 עבור בידוד ואפיון של epididymosomes; שלפוחית קטנה, כמו exosome מהווים רכיבי מפתח של הפרופיל הפרשה epididymal, מופיעים להחזיק תפקיד חשוב בקידום זרע התבגרות23. כמו בגישה המשלימה, אנו מתארים גם גילוי immunofluorescence של חלבונים היעד ב קו תא אפיתל epididymal (mECap18) caput מונצחים העכבר ושימוש של משאב זה כמודל שבה לחקור ברגולציה של epididymal הפרשה בפעילות חוץ גופית בתוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ניסויית הכוללת אוסף רקמה חיה אושרו על-ידי אוניברסיטת ניוקסל טיפול בעלי חיים, יו ר ועדת האתיקה.
1. immunofluorescence מכתים הסעיפים Epididymal פרפין-מוטבע (דמויות 1 ו- 2)
- מיד לאחר המתת החסד של עכברים בוגרים באמצעות אינהלציה2 CO (עכברים שוויצרי, מעל בן 8 שבועות), בזהירות לנתח יותרת האשך (באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה) ללא עודפי רקמת חיבור ושומן, לטבול לשבועיים של Bouin פתרון (> עשר פעמים משקל נפח/רקמות) עבור קיבעון לילה.
- לשטוף את הרקמה עם 70% אתנול עם 2 × שינויים מדי יום במשך יומיים, ואז מייבשים באמצעות אתנול מדורגת (70%, 95% ל- 100%) לקראת חדירה והטבעה בתוך בלוק פראפין.
- בסעיף הבלוקים פרפין-עובי של 4-6 מיקרומטר ו הר בשקופיות כהכנה immunofluorescence מכתים.
- בשכונה fume, dewax הסעיפים פרפין epididymal על-ידי הוספת כמות מספקת של קסילן הצנצנת שקופית לחלוטין לטבול בסעיף רקמות (3 × 5 דקות כל פעם).
- נתרענן הסעיפים רקמות על ידי טבילת בפתרונות אתנול מדורגת מדולל מטוהרים H2O (100% אתנול 5 דקות, 100% אתנול 5 דקות, אתנול 90% 1 דקות, 80% אתנול 1 דקות, אתנול 70% 1 דקות, 50% אתנול 1 דקות).
- לשטוף את הסעיפים בצנצנת השקופית פעם במשך 5 דקות בתמיסת פוספט buffered מספיקות (PBS) לחלוטין לטבול סעיף הרקמה כולה (בצע את ההוראות עבור כל שוטף עוקבות).
- Decant אנטיגן מתאימות אחזור פתרון (כלומר., 10 mmol/L סודיום ציטרט, 50 mmol/L טריס pH 10.5 או solution(s) אחזור אנטיגן חלופיים, בהתאם אנטיגן יזוהו) לתוך השקופית מתלה במיקרוגל עד רתיחה. לטבול את השקופיות לתוך פתרון זה והנושא הסעיפים רקמות חום-induced אנטיגן אחזור בתנאי אופטימיזציה עבור הפרט נוגדנים (ראה טבלה 1).
התראה: ודא כי השקופיות לגמרי שקועים בפתרון אחזור אנטיגן במהלך תהליך השחזור אנטיגן. - הסר את מיכל שקופית מיקרוגל, מגניב לטמפרטורת החדר.
- לשטוף את השקופיות עם PBS ולהשתמש עט מרקר דוחה נוזלים שקופית לאתר סביב סעיף הרקמה.
- למקם את השקופיות במיכל humidified (שנוצרו על ידי רקמה בטעימת בבסיס של המיכל) ולהחיל פתרון חסימה (3% BSA/PBS, בעבר מסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר) עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את השקופיות פעם אחת עם PBS.
- דגירה הסעיפים עם המתאים נוגדן ראשוני מדולל ריכוז השפעול ממוטבת מסוננת 1% BSA/PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (יצירת עבור אנטי-DNM1, DNM2 ו- DNM3 נוגדנים; בטחונות עבור נוגדן anti-ATP6V1B1, ראה טבלה של חומרים לפרטים נוגדנים).
הערה: כדי להבחין ספציפית מ מחייב שאינם ספציפיים נוגדנים, יש צורך לכלול שלילי מחמירים (כלומר., נוגדנים משניים בלבד, ראשי נוגדן preabsorbed נגד immunizing פפטיד) פקדים חיובית24. - לחמם את השקופיות על-ידי הצבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- לשטוף את השקופיות 3 × עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 10 דקות.
- דגירה הסעיפים עם נוגדן המשני המתאים מדולל 1% BSA/PBS (מסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר) ב 37 ° C עבור 1 h (דילול 1:400 עבור כל נוגדנים משניים, ראה טבלה של חומרים לפרטים נוגדנים).
התראה: למנוע את המיכל שקופית בחושך שלב זה ואילך. תיוג כפול, בחרו שילוב תואם של נוגדנים משניים (כלומר., נוגדנים המשני חייב הועלו מינים שונים). - לשטוף את השקופיות 3 × עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 10 דקות.
- Counterstain הסעיפים propidium יודיד (PI, 7.48 μmol/L) או 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 4.37 μmol/L) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר לתייג את גרעין התא.
- לשטוף את השקופיות פעמיים עם PBS על פלטפורמה חזק (60 סל ד) למשך 5 דקות.
- הר הסעיפים עם 10% Mowiol 4-88 המבושלות פתרון של גליצרול 30% 0.2 מול/ליטר טריס (pH 8.5) ו- 2.5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-אוקטן.
- לסגור את coverslip עם הלק ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C להסתכלות לעתיד.
התראה: מומלץ לבצע ההדמיה של השקופיות ברגע המעשית לאחר ההכנה כדי למנוע אובדן מוגזם של זריחה.
בידוד 2 של Epididymosomes מן העכבר Caput יותרת האשך (איור 3)
- מיד לאחר המתת החסד של עכברים בוגרים באמצעות אינהלציה2 CO (שוויצרי עכברים מעל בן 8 שבועות), perfuse להערכת שלהם עם PBS (טרום התחמם עד 37 ° C) כדי לצמצם הזיהום בדם של הרקמה epididymal.
התראה: פלזמה דם מכילה אוכלוסיות מגוונות של exosomes, אשר גודל דומה ל- epididymosomes25. ניתן לקבל גישה היעילות של סיווג דם מרקמות epididymal דרך הביקורת של המגזר הראשוני, קטע epididymal vascularized מאוד ממוקם proximal את פלח caput (כלומר., אזור 1, איור 1A) - בזהירות לנתח האשך ללא שומן שמעליה, רקמת חיבור, ולאחר מכן לשטוף עם מדיום Biggers, ויטני, Whittingham שונה (BWW; pH 7.4, osmolality של 300 mmol/ק"ג מים26,27) כדי להפחית את כל הפוטנציאל עבור משטח זיהום בדם.
- כתם הרקמה epididymal כדי להסיר עודפי מדיה, לנתח caput יותרת האשך (כלומר., אזורי בתוך 2-5 איור 1A) העברה על צלחת פטרי טריים (35 × 10 מ"מ) המכיל BWW בינונית. ודא כי כמות בינונית מספיקה עבור ההחלמה הסופית.
הערה: עבור 6 caput אפידידימיס, מומלץ להשתמש mL 1.1 של המדיום כדי לאפשר החלמה של µL ~ 900, אז באופן שווה לפצל ואינה חלה על גבי של 2 מעברי צבע מוכן מראש (ראה שלב 2.9). - עושים מספר חתכים קטנים לתוך הרקמה caput עם סכין גילוח. לא מינצ הרקמה, ובכך להימנע מזיהום הדגימה עם תוכן cytosolic מוגזמת. דגירה לצלחת המכילה את הרקמה עם עצבנות קלה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשחרר את התוכן luminal.
- לסנן את המתלים הנובעת דרך ממברנות מיקרומטר 70 לפנות את הפסולת הסלולר.
- לאסוף את פילטרט של ונושא זה לצעדים צנטריפוגה רצופים ב 4 ° C עם הגדלת מהירות כדי לסלק פסולת הסלולר (כלומר., × 500 g2,000 × g, × 4,000 גרם, 8,000 × g, 5 דקות לכל; 17,000 × g עבור 20 דקות, לבסוף 17,000 × g של 10 דקות נוספות, או עד אין גלולה נוצר לאחר צנטריפוגה).
שים לב: חשוב להעריך את הצבע של בגדר לאחר השלב צנטריפוגה g 500 × הראשוני כדי להבטיח דם מזערית זיהום קיים. למחוק דוגמיות שבו גלולה זו מציגה את צבע ורוד. - הכן iodixanol מקוטע מעברי צבע (הכוללת 40%, 20%, 10%, 5% שכבות) על ידי דילול מדיום הדרגתיות צפיפות (הכוללת 60% (w/v) iodixanol מימית) עם פתרון של 0.25 סוכרוז מול/ליטר ו- 10 mmol/L טריס (pH 7.5).
- מכינים את המילוי ההדרגתי צינור ultracentrifuge (11 × 35 מ מ), עם כל חלק של 450 µL (איור 3). מבחינה ויזואלית לבדוק את המילוי ההדרגתי לאחר היישום של כל שבר כדי להבטיח כי הממשקים נוצרות בהצלחה בין כל שכבה ושכבה לפני טעינה הדגימה נוזלים epididymal. להכין טרי הדרגתי בכל יום של שימוש, עם זאת, ניתן לשמר את דגימת נוזל luminal epididymal ב 4 ° C עבור עד 2 שעות לפני הטעינה.
- להוסיף בזהירות 450 µL של epididymal luminal נוזלים השעיה (תואם להחומר שנאסף מן caput של 3 אפידידימיס) על גבי של מעבר צבע יחיד.
- Ultracentrifuge מעברי הצבע ב × 160,000 g ב 4 ° C עבור 18 h.
התראה: מאז צנטריפוגה זו מתנהל במהירות גבוהה מאוד, לכל הצינורות ultracentrifuge חייב להיות לזווג ומאוזנת בדיוק. בדוק הצינורות כדי להבטיח כי הם ללא כל נזק לעין, אשר עלול לסכן את תקינותם. - הסר בעדינות שברים שווים 12 (כל אחד המורכב 185 µL) החל מהשכבה העליונה, מתקדמת לכיוון החלק התחתון של מעבר הצבע. בריכת שברים שווי ערך התאוששה מעבר הצבע, אם ישים (עד שני מעברי צבע).
הערה: העכבר epididymosomes ביותר מועשרים שברים 9-1122, ראה איור 4 דיונים. - לאחר ההתאוששות ואיגום של שברים 9-11, לדלל לתוך 2 מ"ל של PBS, ultracentrifuge את הדגימות ב 100,000 × g ב 4 ° C עבור 3 h (13 × 56 מ מ צינור) כדי הצניפה את epididymosomes.
התראה: מאז בגדר epididymosome יכול להיות קשה לראות, ודא כי הכיוון של הצינורות הוא ציין כפי שהם ממוקמים בתוך הרוטור ולסמן את הצינור כדי לציין את מיקום ציפייה בגדר epididymosome. להבטיח כי כל שפופרת מכיל נפח מספיק (כלומר., העולה על 50% של קיבולת כוללת) לצמצם את הסיכון של קריסת צינור. - בזהירות תשאף וזורקים את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר epididymosome.
- להעריך את הטוהר epididymosome (איור 4).
- Resuspend בגדר epididymosome לתוך בינוני הרצוי בהתאם היישומים במורד הזרם. למשל, BWW בינוני משמש בדרך כלל עבור הניסויים מעורבים הדגירה משותף עם spermatozoa, או לחילופין מאגר פירוק מתאים כהכנה הרזולוציה של פרוטאום epididymal מרחביות-בעמוד.
3. immunofluorescence Staining של תאים mECap18
- הכנת coverslips סטרילי (אמור להתנהל בשכונה התרבות התא)
- להשרות את coverslips (12 × 12 מ"מ) אתנול 70% 10 דקות ולחטא ע י ייבוש תחת טמפרטורה גבוהה מעל מנורת אתנול.
- מגניב של coverslip 10 s לפני העברת צלחת טוב 12.
- להחיל פתרון סטרילי פולי-L-ליזין לכסות את coverslip ולהתיישב 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לבטל את הפתרון פולי-L-ליזין ו לשטוף את coverslip עם סטרילי H2O או מתאים בינוני.
- הכנה mECap18 תאים
- המעבר של aliquots של 2 × 105 תאים mECap18 כל טוב של הצלחת טוב 12 המכילה את coverslips.
- התרבות התאים עם mECap18 תא בינוני (DMEM בתוספת 1%-גלוטמין, 1% נתרן פירובט, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN μmol 50/L) המכיל עגל עוברית 10% סרום (FBS) בחממה 37 ° C תחת % 5 אווירה CO2 בן לילה.
- ברגע התאים לדבוק coverslip, למחוק את המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
- להוסיף כמות מספקת של 4% paraformaldehyde (PFA) מדולל ב- PBS לטבול את כל coverslip ולתקן את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- לבטל את הפתרון PFA ולשטוף את coverslips פעמיים ב- PBS.
- Immunofluorescence מכתים
- Permeabilize mECap18 תאים על ידי טבילה ב- 0.1% X-100 Triton ב- PBS למשך 10 דקות.
- יש לשטוף את coverslips עם PBS.
- לחסום mECap18 תאים עם 3% BSA והמשך עם immunolabeling של תאים ניצול פרוטוקולים מקבילה לאלו שתוארו מקטעי רקמת epididymal.
4. בידוד של חלבונים מאמצעי התרבות תאים ממוזגים
- אוסף של תאים ממוזגים תרבות בינוני
- המעבר aliquots של 4 × 105 תאים mECap18 כל טוב של 6 טוב צלחת בינונית תא mECap18 בתוספת 10% FBS במשך 24 שעות ביממה.
- לשטוף תאים mECap18 שלוש פעמים עם mECap18 תא בינוני (להכין בלי FBS) כדי להסיר FBS שיורית וכל הקשורים חלבון מזהמים.
- להוסיף 1.5 מ של mECap18 תא בינוני (להכין בלי FBS) מכל קידוח, דגירה עם mECap18 תאים עבור 12 ח ב חממה 37° C מתחת 5% CO2.
הערה: mECap18 תאים בשלב זה יכול להיות שקובעת אנטיגנים היעד השונות על פי תכנון ניסויים. - לאחר 12 שעות דגירה, לאסוף את תא בינוני צנטריפוגה ב × 2,000 g 10 דקות להסיר את כל פסולת הסלולר.
הערה: משך הדגירה הוא מסוגל להשתנות על פי הערכת עיצוב ניסיוני/קצה, תמורת זה הסובלנות של התא treatment(s) יישומית. מומלץ להתאים את התזמון של דגירה בהתבסס על משטרי ניסיוני ספציפיים על מנת להבטיח כי ניתן להשיג תוצאות אופטימליות. - להעריך את הכדאיות תא mECap18 דרך היישום של וזמינותו הדרה סטנדרטי trypan blue28. למחוק את כל החומר שבו תא הכדאיות ירדה מתחת ל 90% כדי למנוע הטיה שהוצגו על ידי חלבונים שוחררו תאים מתים או הגוססת.
- לבודד חלבונים מ תא בינוני כדלקמן או לשמור על בינוני ב-80 מעלות צלזיוס.
- בידוד חלבון (אמור להתנהל בשכונה fume)
- להוסיף 20% נפח של חומצת חומץ טריכלור צוננת של 100% 80% בנפח בינוני תאים ממוזגים, כדי לזרז את החלבונים שוחרר מן התאים mECap18 בתרבית. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם ערבוב מתמיד.
- לאחר הדגירה, גלולה זירז חלבונים על ידי צנטריפוגה (17, 000 × g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).
הערה: עקב כמות מוגבלת של חלבון צפוי להיות מופרש לתוך האמצעי, זה אפשרי כי בגדר לא להיות בקלות דמיינו לאחר צנטריפוגה. לכן, זה הכרחי כראוי להתמצא ברכבת התחתית לפני צנטריפוגה ולטפל שלא להפריע את המיקום צניפה ציפייה במהלך הסרת תגובת שיקוע. - למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה פעמיים עם אצטון צוננת לפני צנטריפוגה מחדש (17, 000 × g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).
- בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע לפני air-drying כל אצטון שיורית בתוך ברדס fume.
- Resuspend בגדר חלבון ב מאגר מיצוי מתאים כהכנה לניתוח הקצה לגילוי חלבון הפרשה מלאה פרופילים ו/או חלבונים היעד בודדים (למשל., מרחביות-דף, immunoblotting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 ו איור 2 הצג תוצאות נציג של immunofluorescence לוקליזציה של DNM האשך caput העכבר. כל אחד שלושה איזופורמים DNM חקר פרופילים נפרדים לוקליזציה התצוגה. לפיכך, DNM1 מאופיין על ידי תיוג ' מאטום לשקוף ' צנוע יחסית של תאי epididymal במהלך האשך פלח ואת caput הראשונית (איור 2 א). לעומת זאת, isoform DNM2 קודם זוהה בקרבת הגבול הבזליים ולבלוב מנוגדות של תאים במגזר הראשוני, לפני להיות מיקומו לתחום גרעיני מתקדם וניוון בסים בתאים בתוך המקטע caput במורד הזרם סמוכים (כלומר., אזורי 2-5) (איור 1ב, ג). ראוי לציין, עם זאת, עוצמת DNM2 תיוג בהדרגה ירד בין 2-5 של האשך caput, תוצאה בעיקרו של דבר המשקף את הפעילות הפרשה של אלה קטעים epididymal21 (איור 1ב, ג). בהתאם לכך, גרעיני מתקדם וניוון בסים תיוג של DNM2 לאחר מכן הוצגה כדי שיתאימו ההפצה של מנגנון גולג'י בתוך התאים העיקריים caput21. Spermatozoa מבודד באותו אזור epididymal הראה acrosomal אינטנסיבי תיוג עבור DNM2 (איור 1D). כמו אזהרה, לעומת זאת, תיוג DNM2 המקביל לא שגרתי זוהה על spermatozoa luminal בתוך מקטעי רקמת שלנו. תופעה זו הוא האחד. נתקלנו בכמה הזדמנויות בשעת החלת מגוון רחב של נוגדנים מיקוד אנטיגנים שונים epididymal/הזרע נובעת ככל הנראה עקב בעיות המשויכות אנטיגן המצגת ו/או מיסוך ב מקטעי רקמת פרפין-מוטבע. בכל מקרה, השונויות להדגיש את החשיבות של ביצוע תיוג immunofluorescent מקבילים של spermatozoa מבודדים לצד זה של הרקמה epididymal עצמו. שונות הן DNM1 והן DNM2, isoform DNM3 בעיקר זוהה בתחום הפסגה של מספר קטן של caput בתאי אפיתל (איור 2B, החצים הירוקים), אשר הוצגו להתכתב באוכלוסייה המשנה ברורה תא על-ידי שיתוף תיוג עם הסמן מוכרת ברור התא, ATP6V1B1 (איור 2B, חצים אדומים). באופן דומה, סמנים נציג הוכיחו מתאים המבדילים את סוגי תאים אפיתל epididymal שונות מסוכמות בטבלה 229,30,31 , 32 , 33 , 34.
בנוסף התיאור של הטכניקות עבור ההתאמה subcellular של חלבונים המתגוררים בתוך האפיתל epididymal, כאן, אנחנו גם מדווחים שלנו פרוטוקולים לאחרונה ממוטב עבור חקר חלבונים הפרשה אנקפסולציה בתוך . epididymosomes, שלפוחית קטנה חוץ-תאית המייצגים מרכיב חשוב של הסביבה שבה התרחשה luminal אחראי לתמיכה זרע התבגרות ואחסון22 משולב, שלב 2 איור 3 לספק דין וחשבון מפורט שלב אחר שלב המתודולוגיה המשמש את הבידוד של אוכלוסיות מועשר epididymosomes מרקמות epididymal caput העכבר. ראוי לציין, עם זאת, שיטות אלה חלים ברצון הבידוד של אוכלוסיות חלופי epididymosomes שמקורם דיסטלי יותר מקטעי epididymal. בשל הפוטנציאל לזיהום הדוגמאות הללו, אנחנו גם תיאר את הפרוטוקולים מחמירים אפיון זה אנחנו באופן שגרתי מעסיקים להכנה epididymosome כל. אלה כוללים את ההערכה של גודל והטרוגניות של אוכלוסיות epididymosome באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה והן בטכניקות פיזור אור דינאמי. במשולב, אנו גם מנצלים immunoblotting אסטרטגיות כדי להעריך את העשרת שלפוחית חוץ-תאית שזוהה סמני והיעדר חלבונים האופייניים של מזהמים פוטנציאליים המתאימים (כלומר., אנטי-המוגלובין (HBB) כמו סמן של זיהום בדם, anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15), נוגדנים anti-IZUMO1 כסמנים של cytoplasmic droplet, זיהום זרע, בהתאמה)22. אמנם מצאנו כי המזהמים הם נדירים, אם הם נמצאים, אנחנו מיד למחוק ההכנה epididymosome.
לוקליזציה שאינם חופפים של DNM איזופורמים של האשך caput בקשה חקירה נוספת של תפקידיהם פוטנציאליים בוויסות של microenvironment epididymal. למטרה זו, קו תא mECap18 מונצחים היה מנוצל כמודל במבחנה ללמוד פעילות הפרשה תא epididymal. אפיון הקודם של הקו הסלולרי הראו כי זה בנמלים אוכלוסיה לתא מעורב, אשר כתם חיובית גם סמנים התא העיקרי או ברור. יתר על כן, תאים mECap18 גם הוכיחו מתאים לדיווח פרופילים פיזיולוגיים של ביטוי גנים וחלבונים epididymal תחת שונות במבחנה טיפול משטרי35. לפני השימוש, לוקליזציה DNM נאמד mECap18 בתרבית תאים על ידי להשתקע אלה על coverslips שטופלו פולי-L-ליזין (איור 5A) ובאיומים אותם לאיתור immunofluorescence. בקנה אחד עם דפוסי ההפצה טלקוה caput מקטעי רקמת epididymal, DNM1 זוהה ברחבי הציטופלסמה של תאים mECap18, בעוד DNM2 היה מרוכז בתוך תחום גרעיני מתקדם וניוון בסים של תאים אלה DNM3 התאפיינה דיסקרטית מוקדים של הממברנה מכתים בתוך מספר האוכלוסייה משנה קטן (כלומר., 11%) של התאים mECap18 אשר היו ATP6V1B1 חיובי (איור 5B). נתונים אלו מאשרים את התועלת של הקו תא mECap18 כאל משאב יקר ערך עבור חוקרים את התפקיד של DNM בוויסות פעילות הפרשה/ספיגת ידע תא epididymal.
בהתאם לכך, שלב 4 מתאר את המתודולוגיה לניתוח של פעילות הפרשה של התאים mECap18; טכניקות אשר נתונות בהרחבה להערכת ההשפעה של מגוון תנאים ניסויים שונים. במחקר שלנו, אנחנו מוחלים סלקטיבי התערבויות תרופתי לדכא את הפעילות של DNM1 ו- DNM2 לפני הפריט החזותי, כימות של הפרופיל של חלבונים שוחרר מתאי mECap18 לתוך ממוזגים בינוני21. תכונה חשובה של ניתוח זה, עם זאת, היה כדי להבטיח mECap18 התאים היו ביסודיות לשטוף תרבותי בהיעדר FBS תוספי. צעד כזה היה חיוני כדי למנוע הזיהום של בינוני ממוזגים עם חלבונים FBS נגזר, אף על פי כן הוא נושא את הסיכון הנלווים של פגיעה mECap18 צמיחת תאים ו/או הכדאיות. שליטה על האפשרות הזו, שציינו כי הקו תא mECap18 נסבל FBS תרבות חופשית לבין המבוא של מעכבי DNM משך זמן דגירה חלון (כלומר-, 12 שעות). ואכן, במהלך הזמן הזה, הכדאיות תא נשארו מעל 90% בכל ניסיוני משכפל. גישה זו יכולה לשמש לכן אסטרטגיה הוכחה הרעיון שימושי כדי לזהות את הפונקציה של חלבונים ספציפיים epididymal לפני ביצוע ההשקעה לאסטרטגיות מניפולציה ג'ין.
| חום הנגרמת epitope אחזור פתרון | 10 mmol/L סודיום ציטרט | 50 mmol/L טריס (pH 10.5) |
| זמן | 3 דקות | 3 דקות |
| 6 דקות | 6 דקות | |
| 9 דקות | 9 דקות | |
| 12 דקות | 12 דקות |
טבלה 1 : תנאים כלליים עבור אופטימיזציה של אנטיגן חום-induced אחזור לשימוש עם פרפין-מוטבע מקטעים epididymal. תהליך קיבוע יכול להיות בעייתי כפי epitopes שונים לעיתים קרובות דורשים השימוש בטכניקות קיבוע שונות, ובכך המחייב המתודולוגיה ממוטבת עבור כל אנטיגן.
| סוג תאים אפיתל | הפצה | סמן | הפניות (PMID) |
| תא ראשי | כל יותרת האשך | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| ברור התא | Caput, קורפוס, תסמונת | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| התאים הבזליים | כל יותרת האשך | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| תא צר | קטע הראשונית | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
טבלה 2 : מתאים זיהוי סוגי שונים ראשי תאים אפיתל epididymal נציג סמנים.
איור 1: הביטוי המרחבי של DNM 2 בתוך האשך העכבר הפרוקסימלית. (א) דגם סכימטי של יותרת האשך המתארת את החלוקה למחיצות על האשך העכבר לתוך אזורי 10 פיזית מופרדים septa כפי שדיווח טרנר ו להביא בניהם20. במודל זה, אזור 1 תואמת את פלח הראשונית, אזורי 2-5 שיתאימו caput יותרת האשך, אזורי 6-7 שיתאימו האשך קורפוס, אזורי 8-10 מייצגים האשך תסמונת. (בג) Immunofluorescence לוקליזציה של DNM2 חשף דפוסי ההפצה אזור ספציפי (מסומן על ידי חץ לבן וחץ). הגבול בין אזור 1 ו- 2 הוא התחום בין קו מנוקד או מסומן על ידי חיצים צהובים. (ד) DNM2 מתבטאת גם בתחום spermatozoa מבודד מן האשך caput פרי-acrosomal. עם זאת, לא מכתים כל כך שגרתי זוהה spermatozoa luminal בתוך epididymal הסעיפים המתאימים. ep, תאים אפיתל; l, לומן; . שלילי, השליטה היחידה נוגדנים משניים. הניסויים היו משוכפלות על חומר שלוש חיות, נציג immunofluorescence התמונות מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זיהוי Immunofluorescence של DNM 1 ו- DNM 3 האשך caput העכבר. (א) הלוקליזציה של DNM136 נבדק ב העכבר caput האשך. (B) שותף לוקליזציה של DNM336 ו- the marker ברור התא, ATP6V1B137 האשך caput העכבר. ניתוח זה אישר כי שניהם DNM3 (ירוק חצים) ו ATP6V1B1 (חצים אדומים) שוכנים באוכלוסיה משנה התא ברורה אך להציג חפיפה תת הסלולר מינימלי. ep, תאים אפיתל; int, interstitium; l, לומן; sp, זרע; . שלילי, השליטה היחידה נוגדנים משניים. גרעין התא היו counterstained עם דאפי (כחול). הניסויים היו משוכפלות על חומר שלוש חיות, נציג immunofluorescence התמונות מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סכימטי של בידוד פרוטוקולים המשמשים העשרה של העכבר caput epididymosomes. לאחר הקרע, רקמת epididymal caput שקוע לתוך droplet BWW בינוני, חרות לשחרר את התוכן luminal. הנוזל luminal ואז מסונן דרך קרום מיקרומטר 70, הנובעת ההשעיה היא centrifuged-הגדלת מהירות על מנת הצניפה כל שאריות תאים שיורית. המתלה שנוקה ואז נטען על גבי של מעבר צבע צפיפות רציף (iodixanol פתרון), נתון ultracentrifugation לילה. מחיצה Epididymosomes לתוך שברים 9-11, אשר הם איחדו, נשטף באמצעות דילול לתוך PBS וחזר אל ultracentrifuge כדי הצניפה את epididymosomes. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הערכה של טוהר epididymosome. שברים שווים 12 נמצאו לאחר את ultracentrifugation של המילוי ההדרגתי של aliquot של כל אחד מוכן חלבון (א) ו RNA כמת, (B) גודל הטרוגניות הערכה באמצעות פיזור אור דינאמי, ו- (ג). immunoblot ניתוח epididymosome סמן הפצה. אפיון נוסף השלבים כללו (D) כפול-תיוג של epididymosomes מרוכז על גבי חרוזים לייטקס אלדהיד/סולפט (E) הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים הערכה, הערכת immunoblot (נ) spermatozoa (זרע) וזיהום תאי הדם האדומים (RBC) באמצעות אנטי-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, זיהום droplet cytoplasmic/זרע) או אנטי-המוגלובין (HBB, RBC זיהום). Immunoblots היו ובחן גם עם מטען epididymosome ידוע (26 פרוטאוזום הלא-ATPase רגולטוריות יחידת משנה 7, PSMD7; חום הלם חלבון 90kDa בטא 1, HSP90B1; וחבר בטא טובולין, TUBB). נתונים אלה פורסמו במקור דו חות מדעיים (רמב"ם: 27549865), היה שפירטתי כאן באישורו של המו ל, ספרינגר הטבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: Immunofluorescence זיהוי של DNM איזופורמים בתאים mECap18 לחשוף התפלגות תבניות אקורד זה עם אלה שזוהו caput epididymal רקמות. (א) סכמטי של coverslip לקראת תרבית תאים mECap18 סטרילי. (B) תמונות immunofluorescence נציג של DNM מכתים דפוסי ההפצה הסלולר חשף (חיצים, שיבוץ (תיוג כפול של DNM3 וסמן התא ברורה ATP6V1B1)) זה שיקוף אלה שזוהו בתוך רקמת epididymal מקטעים. גרעין התא היו counterstained עם propidium יודיד (PI; אדום) או דאפי (כחול). הניסויים היו משוכפלות על חומר שלוש חיות, נציג immunofluorescence התמונות מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים אלה לשלב את השימוש של Bouin קבוע רקמת epididymal ולגופה פרפין הטבעה ופרוטוקולים סטנדרטיים אופטים. פתרון לשבועיים של Bouin כוללת תערובת של פורמלדהיד, חומצה picric, חומצה אצטית, עם כל רכיב יש פונקציה ספציפית ומשלימים. לפיכך, פורמלדהיד מגיב עם ראשי אמינים כדי ליצור חלבון חוצה קישורים, חומצה picric לאט חודר לרקמת ויוצרים מלחי, ומכאן קרישה של חלבונים בסיסי, לעומת זאת, חומצה אצטית במהירות חודר הרקמה וגורמת את קרישת חומצות גרעין. מאפיינים אלה משולבים שהביאו של Bouin כמו לשבועיים של בחירה עבור שימור פירוט מורפולוגי, השימוש בו הוא דיווח נרחב בספרות epididymal. עם זאת, הפתרון של Bouin אינה ללא המגבלות, אשר כוללים של הנטייה עבור קרינה פלואורסצנטית המושרה מקבע, פורמלדהיד המושרה cross-linking אשר ייתכן מסיכה אנטיגנים היעד.
פוטנציאל רקע זריחה מחייבת שימוש מחמירים שלילי הפקדים, אשר במחקרים שלנו כוללים העדרו של נוגדן ראשוני, העדרו של הנוגדן משני, בו זמינים ריאגנטים, השימוש העיקרי נוגדנים preabsorbed נגד פפטיד immunizing שממנה מופקות. פרטים של היישום של פקדים אלה הם דוגמה במחקר הקודם שלנו dynamin ביטוי DNM העכבר יותרת האשך21. באופן אידיאלי, תוצאות כאלה גם לאמת באמצעות רקמות נגזר ההסתרה חיות, עם זאת, החומר הזה הוא לא תמיד זמינים. המבקשים לסתור את הבעיה המשנית של אנטיגנים היעד צולבים או כימי שונה, יש צורך לעתים קרובות לבצע סוג של אנטיגן אחזור כדי לחשוף epitopes ששונו על ידי קיבוע ולשחזר ולכן הפוטנציאל שלהם על נוגדן איגוד. המתודולוגיה המשמש לאחזור תלוי משתנים רבים, כולל אנטיגן מטרה, נוגדנים, סוג הרקמה של השיטה של קיבעון. עם זאת, טכניקות אומץ באופן נרחב ביותר כוללים את היישום או ההחזרה בתיווך חום או הפרוטאוליטי אנטיגן המושרה. התכונות לשעבר כמו בהתקרבות המועדף בשל שיעור הצלחה גבוה יותר עבור שחזור immunoreactivity, עם הפרטים של משטרי חום ופתרונות אחזור שאנו מנצלים בדרך כלל תועד ב טבלה 1. אנחנו שים לב עם זאת, כי זה בהחלט לא רשימה ממצה של בסופו של דבר אופטימיזציה של אנטיגן לאחזור עבור כל שילוב המטרה/נוגדן חלבון נדרש מחקרים ראשוניים שימוש במטריצה של זמן, טמפרטורה, pH שילובים. שיקולים נוספים כוללים את הפוטנציאל לאחזור חום להפיק נזק לרקמות ו/או לגרום תיוג artefactual. לכן, בנוסף היישום של הפקדים שלילי תיעד לעיל, אנו משלבים גם באופן שגרתי פקדים חיובי ובו נוגדנים, כגון אנטי-Golgin-97, אשר מזהה organelles הסלולר ברורים.
המבקשים לקבוע אם חלבונים כגון אלה השייכים למשפחת DNM להגשים יתיר, בניגוד פונקציות משלימות, רקמה epididymal, אנחנו מצאנו אותה ללמוד לבצע ניסויים תיוג כפול כמו אלה מאויר באיורים איור 2B. אסטרטגיה זו כרוכה תיוג רציפים של רקמות מקטעים עם זוגות של נוגדנים הראשי (העולות מינים שונים) עקב נוגדנים משניים המתאים fluorophores מצומדת שונים. אולם, תכונה מבלבלים לעתים מתעוררת המבקשים לבצע מחקרים אלה תיוג כפול הוא בעיית אי התאימות של הפרוטוקולים אחזור אנטיגן לצורך תיוג אופטימלית עם כל נוגדן ראשוני. מגבלה זו נתקלה במקרה של שיתוף תיוג של DNM 2 ו- Golgin-97 ב העכבר caput יותרת האשך, מוביל אותנו להשתמש ברציפות מקטעים טורי (בניגוד באותו המקטע)21. עם זאת, גם גישות אלה שימושיים מאוד בהקשר של ומייחס חלבון ביטוי לסוג לתא מסוים בין אלה מיוצגים בהאפיתל epididymal pseudostratified. עם מטרה זו בראש, כללנו רשימה של סמני סוג התא נציג ודפוסי תפוצה שדווחה שלהם לאורכו של צנורית epididymal (טבלה 2). כאשר אדם רוצה ללכת מעבר סוג התא ולהתחיל לחקור את ההתפלגות subcellular של חלבונים היעד, השימוש של תיוג כפול עם סמנים אברון המוכרים, כגון Golgin-97, מציע יתרונות ברורים. לחלופין, היישום של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה במשולב עם תיוג immunogold נותרה השיטה של אפשרות בלוקאליזציה ultrastructural מפורט ואימות של צביעת דפוסי מושגת באמצעות immunofluorescence21 .
בין המגבלות שמציב המחקר של epididymosomes גודלם הקטן, הקושי בהשגת בכמויות מספקות עבור נקודת הקצה מפורט ניתוחים, במיוחד נפוץ בשימוש המעבדה מינים כגון בעכבר. עם זאת, על-ידי ניצול המחקרים החלוצית של סאליבן ועמיתיו38,39,40, הצלחנו לייעל את המתודולוגיה חזקים epididymosome בידוד מן העכבר דגם (ראה שלב 2). יש להדגיש, עם זאת, הצורך להטיל מחמירים כדי להעריך ופקדים המאפיינים הפיזיים של אוכלוסיות epididymosome מועשר41 עקב הזיהום הפוטנציאלי של spermatozoa, טיפות cytoplasmic ו/או נישא בדם exosomes ( ראה איור 4). למטרה זו, אנו משתמשים באופן שגרתי שילוב של: מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה (i) כדי להמחיש את גודל והטרוגניות של הכנת epididymosome, (ii) חישוב של החלקיקים הממוצע גודל והטרוגניות (iii) הריכוז epididymosomes על גבי 4 מיקרומטר אלדהיד/סולפט לייטקס ושרשרות תיוג פלורסנט של מזוהה סמני פני השטח exosome, כולל CD9, FLOT1, immunoblotting (iv) של epididymosomes מבודדים עם חבילה של נוגדנים מומלצת ניסיוני אימות של exosomes (למשל., anti-CD9, אנטי-FLOT1), כמו גם שליליות כמו הפקדים המתאימים אנטיגנים צריך להיות מוגבל spermatozoa (אנטי-IZUMO1), טיפות זרע cytoplasmic (אנטי-ALOX15) או דם (anti-HBB)22. אם סטנדרטים אלה מתקיימים, ואז ההכנות epididymosome מבודדים נתונות בקלות לשימוש ביישומי במורד הזרם, כולל הדגירה משותף עם spermatozoa ו/או מטען פרופיל מנתח22,42, אשר שניהם הן גישות רב-עוצמה לשיפור ההבנה שלנו על התפקיד של epididymosomes בוויסות epididymal זרע התבגרות1.
במחקר זה, אנו מתארים את היישום של העכבר מונצחים SV40 caput epididymal אפיתל (mECap18) תא קו, אשר אנחנו נעזרו ללמוד את מעורבותם של DNM ויסות פעילות הפרשה epididymal21 , כמו גם את ההשפעה של חשיפה לרעלים סביבתיים על הפיזיולוגיה epididymal43. תכונה חשובה של הקו תא mECap18 הוא להצגת פנוטיפי יציבות בין קטעים ותכונות אוכלוסיה נציג של שני תאים עיקריים וברור21,35,44. לעומת תרביות תאים epididymal הראשית, הקו תא mECap18 מציג גם עמידות בפני culturing בנסיוב עגל עוברית בינוני חינם, אשר מרחיב משך הזמן והטבע של התערבויות ניסיוני תאים אלה יכולים להיות חשופים, אך גם כאמא מתאוששת שפע גבוה של חלבונים על ידי המדיום ממוזגים. מגבלה של קו תא mECap18, אולם, היא כי זה יש תודה, ובכך עלול להגיב בצורה שונה להדגיש ו / או גירויים הקשורים החיסון לעומת זה של התא הראשי תרבויות או תאים אלה להציג בתוך vivo. עם מגבלה זו בראש, מומלץ להשוות בין התוצאות המתקבלות באמצעות תאים mECap18 ויוו תגובות במידת האפשר. לסיכום, אנו מתארים את הפרוטוקולים לסמן את השירות של הקו הסלולרי ככלי שבאמצעותו ולהתחיל ללמוד את הפונקציונליות של חלבונים היעד בתוך האשך caput. ואכן, בשילוב עם השימוש של מעכבי חלבון מסחרי ו/או כלי עריכת הגנום (כגון CRISPR-Cas9), שורת התאים mECap18 בעל פוטנציאל רב כדי לסייע בפתרון הבסיס מכניסטית של פונקציה epididymal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר את הבריאות הלאומיים ואת רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה פרויקט גרנט APP1103176 על התמיכה של עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
