Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Analys av Epididymal proteinsyntes och utsöndring

doi: 10.3791/58308 Published: August 25, 2018

Summary

Vi rapporterar här, immunofluorescens localizationen av dynamin att illustrera protokollen för påvisande av proteiner i paraffin-inbäddat mus epididymal sektioner och de av en förevigade epididymal cellinje (mECap18). Vi beskriver också protokoll för isolering av sekretoriska proteiner från både epididymal vätska och konditionerat cell media.

Abstract

Däggdjur bitestiklarna genererar en av de mest komplexa intraluminal vätskorna av något endokrin körtel för att stödja efter testikelcancer mognad och lagring av spermier. Sådan komplexitet uppstår på grund av den kombinera sekretoriska och absorptive aktiviteten av epitelceller lining. Här beskriver vi teknikerna för analys av epididymal proteinsyntes och utsöndringen genom att fokusera på familjen modell protein dynamin (DNM) mechanoenzymes; stora GTPases som har potential att reglera dubbelriktad membran människohandel händelser. För att studera proteinuttryck i epididymal vävnad beskriver vi robust metod för immunofluorescens märkning av målproteiner i paraffin-inbäddat sektioner och efterföljande detektion av den rumsliga fördelningen av dessa proteiner via immunofluorescens mikroskopi. Vi beskriver också optimerad metod för isolering och karakterisering av exosome som blåsor, känd som epididymosomes, som utsöndras till epididymal lumen att delta i kommunikationen med mognar spermierna. Som en kompletterande strategi beskriver vi också immunofluorescens detektion av målproteiner i en cellinje för SV40-förevigade mus caput epididymal epitelial (mECap18). Dessutom diskuterar vi verktyget av raden mECap18 cell som lämpliga in vitro- modell att utforska regleringen av epididymal sekretoriska aktivitet. För detta ändamål beskriver vi de culturing krav för underhåll av mECap18 cell linjen och användning av selektiva farmakologisk hämning regimer som kan påverka deras sekretoriska protein profil. Dessa utvärderas lätt via skörd av konditionerat odlingsmedium, koncentration av utsöndrade proteiner via triklorättiksyra/aceton utfällning och deras efterföljande analys via SDS-PAGE och immunoblotting. Vi hävdar att dessa kombinerade metoder är lämpliga för analys av alternativa epididymal protein mål som ett förspel till att bestämma deras funktionella roll i spermier mognad och/eller lagring.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Spermier av alla däggdjursarter förvärva potential att Visa framåt progressiv motilitet och att befrukta en äggcell under sin långvariga härkomst genom bitestiklarna, en högt specialiserad region av manliga extra testikelcancer kanalsystem, som kan ta 7-14 dagar att navigera (beroende på Art)1. På grund av extrema kondensation av det paternal kromatinet och avgivande av majoriteten av cytoplasman som medföljer cytodifferentiation av spermier i testiklarna, drivs deras efterföljande funktionell mognad uteslutande av deras interaktion med den epididymal mikromiljö. Denna miljö är, i sin tur skapat av sekretoriska och absorptive aktiviteten av de foder epididymal soma och visar en exceptionell nivå av segment-segmentet variant1. De mest aktiva segment när det gäller proteinsyntesen och sekretion är således de som ligger i den proximala delen av bitestiklarna (nämligen, caput och corpus)2. Denna aktivitet speglar den funktionella profilen av spermier, med celler första början att Visa kännetecknar funktionell kompetens (dvs., progressiv motilitet och förmågan att binda till syra-solubilized zona glykoproteiner) följande deras passage genom caput bitestiklarna3. Dessa funktionella attribut fortsätta att utveckla innan nå optimala nivåer som spermier når distala epididymal segmentet (cauda), vari de lagras i en quiescent stat i beredskap för utlösning. Bildandet och underhållet av denna sperma lagringsbehållare är också intimt knuten till foder epitel, som i cauda domineras av stark absorptive verksamhet4,5. Även om anatomiska skillnader har varit rapporterade6,7,8, verkar sådana regionaliseras arbetsfördelningen vara ett kännetecken av bitestiklarna som delas bland majoriteten av däggdjursarter studerade hittills, inklusive vår egen9,10. Faktiskt från ett kliniskt perspektiv, är det känt att epididymal dysfunktion är ett viktigt bidrag till etiologin av manlig faktor infertilitet11, vilket belyser vikten av att förstå regleringen av denna specialiserade vävnad.

Det är därför beklagligt att vår förståelse av epididymal fysiologi och de mekanismer som reglerar de sekventiella faserna av spermier mognad och lagring inom denna vävnad, återstår helt. Bland de bidragande faktorerna är begränsande framsteg i epididymal forskning övergripande komplexiteten i denna vävnad och kunskap om de mekanismer som utövar tillsyn över dess luminala mikromiljö. Anatomiskt, vet vi att bortom skillnaden av caput, corpus och cauda segment, bitestiklarna kan ytterligare uppdelas i flera zoner (figur 1A), varje avskilda genom septa12 och kännetecknas av diskreta profiler av genen och protein uttryck13,14,15,16,17,18. Faktiskt, på grundval av detaljerade transkriptionell profilering av segmentell genuttryck i bitestiklarna, så många som 6 och 9 distinkta epididymal zoner har rapporterats hos mus och råtta modellerna, respektive19,20. Sådan komplexitet förmodligen återspeglar sammansättningen av den epididymal soma, en pseudostratified epitel bestående av många olika celltyper; varje olika vad gäller överflöd, distribution och sekretoriska/absorptive verksamheten längs längden av tarmkanalen. Huvudsakliga celler är alltså överlägset den mest förekommande epididymal cell typ som utgör uppemot 80% av alla epitelceller. Följaktligen är huvudsakliga celler ansvariga för huvuddelen av epididymal protein biosyntes och sekretion5. Däremot är befolkningens klarcellig, som rankas som den näst vanligast förekommande celltypen inom den epididymal soma, primärt inblandade i selektiv absorption av luminala komponenter och försurning av denna mikromiljö5. Lägga till en annan nivå av komplexitet, utöva androgener och andra lumicrine faktorer av testikelcancer ursprung differentiell kontroll över var och en av dessa epididymal celltyper beroende på deras placering längs tarmkanalen.

Trots de begränsningar som införts av sådan komplexitet, betydande inbrytningar i fortsättningen göras till lösa den mekanistiska grunden för epididymal funktion. En nyckel till dessa studier har varit tillämpning av avancerad masspektrometri strategier att upprätta storskaliga inventeringar av de epididymal proteomet, tillsammans med detaljerade analyser av enskilda proteiner utvalda bland dessa inledande undersökningar. En illustration av detta tillvägagångssätt är vår senaste karakterisering av DNM familjen av mechanoenzymes i mus modell21. Vårt inledande intresse för DNM drevs av dess dubbelverkande i kopplingen av exo- och endocytotic processer. Bygga på dessa observationer, har vi kunnat visa att de tre kanoniska isoformerna av DNM (DNM1 - DNM3) är starkt uttryckt i mus bitestiklarna och lämpligt placerade för att uppfylla regulatoriska roller i protein sekretion och absorption21 . Dessutom kunde vi tydligt skilja varje DNM isoform på grundval av deras cellulära och sub cellulär lokalisering, vilket tyder på att de har kompletterande, i motsats till redundant, aktivitet inom den epididymal epitel21.

Här beskriver vi de experimentell metodik som används för studier av DNM uttryck i mus bitestiklarna med hopp om att denna information kommer att hitta bredare tillämpning i karakterisering av alternativa epididymal proteiner och därmed bidra till vår förståelse för funktionen av denna viktiga del av manliga genitalia. Specifikt, beskriver vi utvecklingen av robust metod för immunofluorescens märkning av målproteiner i paraffin-inbäddat epididymal sektioner och efterföljande detektion av den rumsliga fördelningen av dessa proteiner via immunofluorescens mikroskopi. Vi ytterligare dokumentera våra nyligen optimerad protokoll22 för isolering och karakterisering av epididymosomes; små exosome-liknande blåsor som utgör viktiga delar av epididymal sekretoriska profilen och verkar hålla en framträdande roll i att främja spermier mognad23. Som en kompletterande strategi beskriver vi också immunofluorescens detektion av målproteiner i en cellinje för förevigade mus caput epididymal epitelial (mECap18) och användningen av denna resurs som en modell att utforska regleringen av epididymal sekretoriska aktivitet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla experimentella rutiner som innefattar djurvävnad samling godkändes av den University of Newcastle's Animal Care och etikkommittén.

1. immunofluorescens färgning av Paraffin-inbäddat Epididymal avsnitten (figur 1 och 2)

  1. Omedelbart efter dödshjälpen för vuxna möss via CO2 inandning (schweiziska möss, över 8 veckor gamla), noggrant dissekera bitestiklarna (med kirurgisk sax och pincett) gratis överliggande bindväv och fett och fördjupa i Bouins fixativ Lösningen (> tio gånger volym/vävnad vikt) för övernattning fixering.
  2. Tvätta vävnaden med 70% etanol med 2 × förändringar dagligen för 2 dagar och sedan torkar genom graderade etanol (70%, 95% och 100%) som förberedelse för infiltration och bädda in ett paraffin-block.
  3. Avsnitt paraffin blocken med en tjocklek på 4-6 µm och montera på bilder i förberedelse för immunofluorescens färgning.
  4. I ett dragskåp, dewax i epididymal paraffin avsnitt genom att lägga till en tillräcklig mängd xylen Skjut burken helt fördjupa avsnittet vävnad (3 × 5 min varje gång).
  5. Rehydrera avsnitten vävnad genom nedsänkning i graderade etanol lösningar utspätt i renat H2O (100% etanol 5 min, 100% etanol 5 min, 90% etanol 1 min, 80% etanol 1 min, 70% etanol 1 min och 50% etanol 1 min).
  6. Tvätta i avsnitt i en bild burk en gång för 5 min med tillräcklig fosfatbuffrad saltlösning (PBS) helt fördjupa avsnittet hela vävnad (Följ dessa anvisningar för alla efterföljande tvättar).
  7. Dekantera lämpligt antigen retrieval lösning (dvs., 10 mmol/L natriumcitrat, 50 mmol/L Tris pH 10.5 eller alternativa antigen retrieval lösningar, beroende på att antigenet påvisas) till en objektglashållaren och mikrovågsugn till kokpunkten. Fördjupa glider in denna lösning och underkasta vävnadssnitt värme-inducerad antigen retrieval villkor optimerad för enskilda antikroppar (se tabell 1).
    Varning: Se till att bilderna är helt nedsänkt i antigen retrieval lösning under antigen hämtningsprocessen.
  8. Ta bort behållaren bild från mikrovågsugnen och svalna till rumstemperatur.
  9. Skölj glasen med PBS och använda en vätskeavvisande bild tuschpenna att spåra runt avsnittet vävnad.
  10. Placera glasen i en fuktad behållare (skapad av en fuktad vävnad vid basen av behållaren), och tillämpa blockerande lösning (3% BSA/PBS, tidigare filtreras genom ett 0,45 µm filter) för 1 h vid 37 ° C.
  11. Skölj bilderna en gång med PBS.
  12. Inkubera i avsnitt med lämplig primär antikropp utspätt till ett experimentellt optimerad koncentration i filtrerade 1% BSA/PBS vid 4 ° C över natten (1:60 för anti-DNM1, DNM2 och DNM3 antikroppar; 1: 100 för anti-ATP6V1B1 antikroppar, se tabellen av material antikropp information).
    Obs: för att skilja specifika från icke-specifik antikropp bindande, det är nödvändigt att införa stränga negativ (dvs., sekundär antikropp endast primär antikropp preabsorbed mot immuniseringsämnet peptid) och positiva kontroller24.
  13. Rewarm bilderna genom att placera i rumstemperatur i 30 min.
  14. Tvätta den diabilder 3 × med PBS på en skakande plattform (60 rpm) i 10 min varje.
  15. Inkubera i avsnitt med lämpliga sekundära antikroppar utspätt i 1% BSA/PBS (filtreras genom ett 0,45 µm filter) vid 37 ° C för 1 h (1: 400 utspädning för alla sekundära antikroppar, se Tabell för material för antikropp Detaljer).
    Varning: Håll behållaren bild i mörkret från detta steg framåt. För dubbel märkning, välja en kompatibel kombination av sekundära antikroppar (dvs., sekundära antikroppar måste ha tagits upp i olika arter).
  16. Tvätta den diabilder 3 × med PBS på en skakande plattform (60 rpm) i 10 min varje.
  17. Counterstain i avsnitt med propidium jodid (PI, 7.48 μmol/L) eller 4΄, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, 4,37 μmol/L) i 2 min i rumstemperatur att märka cellkärnan.
  18. Tvätta två gånger med PBS glasen på en skakande plattform (60 rpm) för 5 min varje.
  19. Montera avsnitten med 10% Mowiol 4-88 beredda i en lösning av 30% glycerol i 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) och 2.5% 1, 4 - diazabicyklo-(2.2.2)-oktan.
  20. Försegla på täckglaset med nagellack och lagra bilderna vid 4 ° C för framtida observation.
    Varning: Det rekommenderas att utföra bildtagning av bilderna så snart som praktiskt efter beredningen att undvika överdriven förlust av fluorescens.

2 isolering av Epididymosomes från mus Caput bitestiklarna (figur 3)

  1. Omedelbart efter dödshjälpen för vuxna möss via CO2 inandning (schweiziska möss över 8 veckor gamla), BEGJUTA deras kärlsystemet med PBS (pre värmas till 37 ° C) för att minimera blod kontaminering av epididymal vävnad.
    FÖRSIKTIGHET: blodplasma innehåller olika populationer av exosomes, som är av liknande storlek till epididymosomes25. Effekten av blod clearance från epididymal vävnad kan nås via inspektion av det första segmentet, ett högt vaskulariserad epididymal segment ligger proximalt segmentet caput (dvs., zon 1 i figur 1A)
  2. Noggrant dissekera bitestiklarna gratis överliggande fett och bindväv och skölj med modifierade Biggers, Whitten och Whittingham medium (BWW; pH 7,4, osmolalitet på 300 mmol/kg vatten26,27) för att minska eventuella för surface blod kontaminering.
  3. Blot epididymal vävnad att ta bort överflödigt material, dissekera caput bitestiklarna (dvs., zoner 2-5 i figur 1A) och överföring till en färsk petriskål (35 × 10 mm) innehållande BWW medium. Säkerställa att mängden medium är tillräcklig för den slutliga återvinningen.
    Obs: För 6 caput bitestiklar rekommenderas det att använda 1,1 mL av medium för att möjliggöra en återhämtning av ~ 900 µL, som sedan delas jämnt och appliceras ovanpå av 2 färdiga lutningar (se steg 2,9).
  4. Göra ett antal små snitt i caput vävnaden med ett rakblad. Inte skräda vävnaden och därmed undvika kontaminering av provet med överdriven cytosoliska innehållet. Inkubera plattan som innehåller vävnaden med mild omskakning vid 37 ° C i 30 min att släppa luminala innehållet.
  5. Filtrera den resulterande suspensionen genom 70 µm membran att ta bort det cellulära skräpet.
  6. Samla upp filtratet och underkasta detta successiva centrifugering steg vid 4 ° C med ökande hastighet för att eliminera cellulära skräp (dvs., 500 × g, 2 000 × g, 4000 × g, 8 000 × g, 5 min varje; 17.000 × g i 20 min, och slutligen 17.000 × g för en ytterligare 10 min eller tills ingen pellet bildas efter centrifugering).
    Varning: Det är viktigt att bedöma färgen på pelleten efter 500 × g centrifugering initsteget att säkerställa minimal blod kontaminering är närvarande. Kassera alla prover som visar denna pellet rosa färg.
  7. Förbereda diskontinuerligt iodixanol lutningar (bestående av 40%, 20%, 10%, 5% lager) genom att späda ut en täthet lutning medium (bestående av 60% (w/v) vattenhaltig iodixanol) med en lösning av 0,25 mol/L sackaros och 10 mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Förbereda lutningen i en ultracentrifugen tube (11 × 35 mm), med varje bråkdel av 450 µL (figur 3). Inspektera visuellt övertoningen efter tillämpningen av respektive fraktion att säkerställa att gränssnitten framgångsrikt bildas mellan varje lager före lastningen epididymal vätska provet. Förbered varje övertoning färska på dagen för användning, emellertid, spermamotilitet luminala vätska provet kan bevaras vid 4 ° C i upp till 2 h före lastning.
  9. Tillsätt försiktigt 450 µL epididymal luminala flytande suspension (motsvarande det insamlade materialet från caput av 3 bitestiklar) ovanpå för en enda övertoning.
  10. Ultracentrifugen Övertoningarna på 160.000 × g vid 4 ° C för 18 h.
    Varning: Eftersom denna centrifugering sker i mycket hög hastighet, alla ultracentrifugen rör måste vara parkopplad och balanserad just. Kontrollera rören för att säkerställa att de är fria från alla synliga skador som kan äventyra deras integritet.
  11. Ta försiktigt bort 12 lika fraktioner (vardera bestående av 185 µL) start från det översta lagret och framskrider mot botten av övertoningen. Poolen på motsvarande fraktioner som återhämtat sig från varje övertoning om tillämpligt (upp till två lutningar).
    Obs: Mus epididymosomes är mest högt berikad med fraktioner 9-1122, se figur 4 och diskussion.
  12. Efter återhämtningen och sammanslagning av fraktioner 9 – 11, späd i 2 mL PBS och ultracentrifugen proverna vid 100.000 × g vid 4 ° C för 3 h (13 × 56 mm rör) till pellet i epididymosomes.
    Varning: Eftersom epididymosome pelleten kan vara svårt att se, säkerställa att orienteringen av rören noteras som de är placerade i rotorn och markera röret för att indikera epididymosome pelleten förväntansfull position. Se till att varje rör innehåller en tillräcklig volym (dvs., överstiger 50% av sin totala kapacitet) att utesluta risken för tube kollaps.
  13. Försiktigt aspirera och kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten epididymosome.
  14. Bedöma epididymosome renhet (figur 4).
  15. Återsuspendera pelleten epididymosome till önskat medium enligt de nedströms applikation(er). Exempelvis används BWW medium allmänt för experiment som innefattar samtidig inkubering med spermier, alternativt ett lämpligt lyseringsbuffert inför upplösningen av det epididymal proteomet via SDS-PAGE.

3. immunofluorescens färgningen av mECap18 celler

  1. Beredning av sterila coverslips (ska genomföras i en cell kultur huva)
    1. Blötlägg coverslips (12 × 12 mm) i 70% etanol i 10 min och desinficera genom torkning under hög temperatur ovanför en etanol lampa.
    2. Cool täckglaset för 10 s innan du överför till en 12 väl platta.
    3. Använd steril poly-L-lysin lösning för att täcka täckglaset och nöja sig med 10 min i rumstemperatur.
    4. Kassera den poly-L-lysin lösningen och skölj täckglaset med steril H2O eller lämpligt medium.
  2. Beredning mECap18 celler
    1. Passage av alikvoter av 2 × 105 mECap18 celler i varje brunn av 12 väl plattan som innehåller coverslips.
    2. Odla cellerna med mECap18 cell medium (DMEM kompletteras med 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat, 1% penicillin/streptomycin och 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) innehållande 10% fostrets kalvserum (FBS) i en 37 ° C inkubator under en atmosfär 5% CO2 över natten.
    3. När cellerna följer täckglaset, kassera medium och skölj cellerna två gånger med PBS.
    4. Lägga till en tillräcklig mängd 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) utspätt i PBS att fördjupa det hela täckglaset och åtgärda cellerna i rumstemperatur i 15 min.
    5. Kassera PFA lösningen och skölj coverslips två gånger i PBS.
  3. Immunofluorescens färgning
    1. Permeabilize mECap18 celler genom nedsänkning i 0,1% Triton x-100 i PBS i 10 min.
    2. Skölj coverslips med PBS.
    3. Blockera mECap18 celler med 3% BSA och fortsätt med immunolabeling av celler utnyttja motsvarande protokoll till de som beskrivits för epididymal vävnadssnitt.

4. isolering av proteiner från luftkonditionerade cellodlingsmedium

  1. Samling av konditionerat cellodlingsmedium
    1. Passagen alikvoter av 4 × 105 mECap18 celler i varje brunn 6 väl platta med mECap18 cell medium kompletteras med 10% FBS för 24 h.
    2. Tvätta mECap18 celler tre gånger med mECap18 cell medium (beredd utan FBS) för att ta bort kvarvarande FBS och eventuella associerade protein föroreningar.
    3. Tillsätt 1,5 mL mECap18 cell medium (beredd utan FBS) till varje brunn och inkubera med mECap18 celler för 12 h i en 37° C inkubator under 5% CO2.
      Obs: mECap18 celler i detta steg kan bedömas för olika mål antigener enligt experimentell design.
    4. Efter 12 h inkubation, samla cell medium och centrifugera vid 2000 x g i 10 min att ta bort alla cellulära skräp.
      Obs: Inkubation varar kunna ändras i enlighet med experimentell design/endpoint bedömning och med hänsyn till cellens tolerans mot tillämpad behandling(ar). Det rekommenderas att anpassa tidpunkten för inkubation baserat på specifika experimentella regimer att säkerställa att optimalt resultat uppnås.
    5. Bedöma mECap18 cellviabilitet via tillämpningen av en standard trypan blå utslagning assay28. Kassera allt material där cellviabilitet har minskat under 90% att eliminera bias infördes genom proteiner som släppt från döda eller döende celler.
    6. Isolera proteiner från cell medium som följer eller bevara medium vid-80 ° C.
  2. Protein isolering (att utföras i dragskåp)
    1. Tillsätt 20% volym kylda 100% triklorättiksyra till 80% volym av konditionerat cell medium att fälla ut de proteiner som släppt från odlade mECap18 celler. Inkubera vid 4 ° C över natten med konstant blandning.
    2. Efter inkubering, pellet utfällda proteinet genom centrifugering (17, 000 × g, 4 ° C i ca 10 min).
      Obs: På grund av den begränsade mängden protein förväntas utsöndras till medium, det är möjligt att pelleten inte kommer att visualiseras enkelt efter centrifugering. Det är därför absolut nödvändigt att korrekt orientera röret före centrifugeringen och se till att inte störa den blivande pellet platsen under borttagning av supernatanten.
    3. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med kylda aceton innan den åter centrifugeringen (17, 000 × g, 4 ° C i ca 10 min).
    4. Försiktigt bort och kasta bort supernatanten innan lufttorkning någon kvarstående aceton i ett dragskåp.
    5. Återsuspendera pelleten protein i en lämplig utvinning buffert inför endpoint analys att upptäcka komplett sekretoriska protein profiler och/eller enskilda målproteiner (t.ex., SDS-PAGE, immunoblotting).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 och Figur 2 visar representativa resultat av immunofluorescens lokalisering av DNM i mus caput bitestiklarna. Var och en av de tre DNM-isoformerna undersökt display distinkta lokalisering profiler. Således kännetecknas DNM1 av relativt blygsamma diffusa märkning av epididymal cellerna i hela inledande segmentet och caput bitestiklarna (figur 2A). Den DNM2 isoformen upptäcktes däremot först i närheten av motstående basala och apikala gränsen av celler i det första segmentet, innan att flyttas till domänen supranukleär i celler inom segmentet närgränsande downstream caput (dvs., zoner 2-5) (figur 1B, C). Särskilt, men intensiteten i DNM2 märkning gradvis minskade mellan zoner 2 till 5 av caput bitestiklarna, ett resultat som i huvudsak speglar sekretoriska aktiviteten av dessa epididymal segment21 (figur 1B, C). Supranukleär märkning av DNM2 visades således därefter motsvara fördelningen av Golgi apparaten inom caput huvudsakliga celler21. Spermier som isolerats från samma epididymal region visade intensiv acrosomal märkning för DNM2 (figur 1 d). Som en varning, men upptäcktes motsvarande DNM2 märkning inte rutinmässigt på luminala spermier inom vår vävnadssnitt. Detta fenomen är den som vi har stött på flera tillfällen vid tillämpning av en rad antikroppar riktade olika epididymal/spermier antigener och förmodligen uppstår på grund av problem associerade med antigen presentation eller maskering i den paraffin-inbäddat vävnadssnitt. I vilket fall betonar sådana skillnader vikten av att bedriva parallella Immunofluorescerande märkning av isolerade spermier parallellt med epididymal vävnaden själv. Skiljer sig från både DNM1 och DNM2, upptäcktes den DNM3 isoformen främst i apikala domänen för ett litet antal caput epitelceller (figur 2B, gröna pilar), som visade sig motsvara klarcellig undergruppen av befolkningen av samtidig märkning med erkända klarcellig markören, ATP6V1B1 (figur 2B, röda pilar). På ett liknande sätt sammanfattas representativa markörer som har visat sig lämplig för att skilja de olika epididymal epiteliala celltyper i tabell 229,30,31 , 32 , 33 , 34.

Utöver beskrivningen av teknikerna för subcellulär lokalisering av proteiner som är bosatta inom epididymal epitel, här, rapportera vi också våra nyligen optimerad protokoll för studier av sekretoriska proteiner inkapslade i epididymosomes, små extracellulära blåsor som representerar en viktig komponent i den luminala miljön som är ansvarig för att stödja spermier mognad och lagring22. Kombinerat, ger steg 2 och figur 3 en detaljerad steg för steg beskrivning av den metod som används för isolering av höganrikat populationer av epididymosomes från mus caput epididymal vävnad. Noterbart är dock är dessa metoder lättillämpliga för isolering av alternativa populationer av epididymosomes med ursprung från mer distala epididymal segment. På grund av risken för kontaminering av proverna beskrev vi också stränga karakterisering protokollen som vi använder rutinmässigt för varje epididymosome beredning. Dessa inkluderar bedömning av storlek och heterogenitet folkens epididymosome med både högupplöst elektronmikroskopi och dynamiska ljusspridning tekniker. Tillsammans har vi också utnyttja immunoblotting strategier för att bedöma anrikningen av erkända extracellulära vesikler markörer och motsvarande avsaknad av proteiner som är karakteristiska för potentiella föroreningar (dvs., anti hemoglobin (HBB) som en markör för blod kontaminering och anti-arachidonate 15-lipoxygenas (ALOX15) och anti-IZUMO1 antikroppar som markörer av cytoplasmisk droppe och spermier kontaminering, respektive)22. Även om vi har funnit att föroreningarna är sällsynta, om de uppstår, kassera vi omedelbart epididymosome beredning.

Icke-överlappande localizationen av DNM isoformer i caput bitestiklarna föranledde ytterligare en undersökning av deras potentiella roller i regleringen av epididymal mikromiljö. För detta ändamål utnyttjades en förevigade mECap18 cellinje som en in vitro- modell för att studera epididymal cell sekretoriska aktivitet. Tidigare karakterisering av denna cellinje har visat att det hamnar en blandad cell befolkning, som fläckar positivt för antingen primära eller tydlig cell markörer. Dessutom har mECap18 celler också visat sig lämplig för rapportering fysiologiska profiler av epididymal genen och protein uttryck under olika in vitro- behandlingsregimer35. Före användning bedömdes DNM lokalisering i odlade mECap18 celler av lösa dessa på poly-L-lysin behandlade coverslips (figur 5A) och utsätter dem för immunofluorescens upptäckt. Konsekvent med distribution mönster registreras i caput epididymal vävnadssnitt, DNM1 upptäcktes under hela cytoplasman i mECap18 celler, medan DNM2 var koncentrerad inom domänen supranukleär av dessa celler och DNM3 präglades av diskreta Foci av membran färgning inom ett litet delpopulation (dvs., 11%) av mECap18 celler som var ATP6V1B1 positiva (figur 5B). Dessa uppgifter bekräftar nyttan av den mECap18 cell linjen som en värdefull resurs för att utreda DNM roll i regleringen av sekretoriska/absorptive epididymal cellaktivitet.

Därför beskriver steg 4 metoden för analys av mECap18 cell sekretoriska aktivitet; de tekniker som är i stort sett mottagliga för att bedöma effekterna av en rad olika experimentella förhållanden. I vår studie har tillämpat vi selektiv farmakologiska interventioner för att undertrycka aktiviteten av DNM1 och DNM2 före visualisering och kvantifiering av profilen av proteiner som släpps ut från mECap18 celler i konditionerat medium21. Ett viktigt inslag i denna analys var dock att se till att mECap18 celler har noggrant tvättas och odlade i avsaknad av FBS tillskott. Men sådan åtgärd var nödvändig för att hindra förorening av konditionerat medium med FBS härrör proteiner, bär det ändå risken för negativt påverkar mECap18 celltillväxt och/eller lönsamhet. Kontrollera denna möjlighet, noterade vi att raden mECap18 cell tolereras FBS fri kultur och införandet av DNM-hämmare för varaktigheten av vår inkubation fönster (dvs., 12 h). Faktiskt, under denna tid, cellernas viabilitet förblev över 90 procent i alla experimentella replikat. Detta tillvägagångssätt kan därför tjäna som en användbar proof-of-concept-strategi för att identifiera specifika epididymal proteiner funktion innan de bestämmer sig investeringar i gen manipulation strategier.

Värmen inducerad epitop hämtning lösning 10 mmol/L natriumcitrat 50 mmol/L Tris (pH 10.5)
Tid 3 min 3 min
6 min 6 min
9 min 9 min
12 min 12 min

Tabell 1 : Allmänna villkor för optimering av värme-inducerad antigen retrieval för användning med paraffin-inbäddat epididymal sektioner. Fixering processen kan vara problematiskt eftersom olika epitoper ofta kräver användning av olika fixering tekniker, vilket nödvändiggör att metodiken är optimerad för varje antigen.

Epitelial celltyp Distribution Markör Referenser (PMID)
Huvudsakliga cell Hela bitestiklarna AQP9 11027599, 17360690
Klarcellig Caput, corpus och cauda V-ATPases, CIC-5 19448084, 12475763
Basalcellscancer Hela bitestiklarna CLDN1 11159859, 21441423
Smala cell Inledande segmentet V-ATPases, CIC-5 19448084, 12475763

Tabell 2 : Representativa markörer lämplig för detektering av olika primära epididymal epitelial celltyper.

Figure 1
Figur 1: rumsliga uttryck för DNM 2 inom proximala mus bitestiklarna. (A) Schematisk modell av bitestiklarna som skildrar den uppdelning på mus bitestiklarna i 10 zoner fysiskt separerade septa som rapporterats av Turner och kollegor20. I denna modell, zon 1 motsvarar det första segmentet, zoner 2-5 motsvarar caput bitestiklarna, zoner 6-7 motsvarar corpus bitestiklarna och zoner 8-10 representerar cauda bitestiklarna. (B-C) Immunofluorescens lokalisering av DNM2 avslöjade zon-specifik distribution mönster (indikeras av vita pilspets och pil). Gränsen mellan zon 1 och 2 är avgränsas av en prickad linje eller betecknas med gula pilar. (D) DNM2 uttrycks också i den peri-acrosomal domänen av spermatozoa isolerade från caput bitestiklarna. Dock upptäcktes ingen sådan färgning rutinmässigt i luminala spermier inom motsvarande epididymal avsnitt. EP, epitelceller; l, lumen; Neg, endast sekundär antikropp-kontroll. Experiment replikerades material från tre djur och representativa immunofluorescens bilder presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: immunofluorescens detektion av DNM 1 och DNM 3 i mus caput bitestiklarna. (A) lokalisering av DNM136 undersöktes i mus caput bitestiklarna. (B) samtidig lokalisering av DNM336 och klarcellig markören, ATP6V1B137 i mus caput bitestiklarna. Denna analys bekräftade att båda DNM3 (gröna pilar) och ATP6V1B1 (röda pilar) bosatta i klarcellig undergruppen av befolkningen men Visa minimal sub cellulära överlappning. EP, epitelceller; int, interstitium; l, lumen; SP, spermier; Neg, endast sekundär antikropp-kontroll. Cellkärna var counterstained med DAPI (blå). Experiment replikerades material från tre djur och representativa immunofluorescens bilder presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk av isolering-protokoll som används för berikning av mus caput epididymosomes. Efter dissektion, är caput epididymal vävnad nedsänkt i en droplet BWW medium och anskäras för att släppa luminala innehållet. Luminala vätskan filtreras sedan genom ett 70 µm-membran och den resulterande suspensionen centrifugeras öka hastigheten för att pellets någon kvarstående cellfragment. Rensas suspensionen är sedan lastas på toppen av en diskontinuerlig täthetlutning (iodixanol lösning) och utsätts för övernattning ultracentrifugering. Epididymosomes partition till fraktioner 9-11, som sammanförs, tvättade via utspädning i PBS och återvände till den ultracentrifugen till pellet i epididymosomes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: bedömning av epididymosome renhet. Tolv lika fraktioner återfanns efter ultracentrifugering lutning och en alikvot av varje förberedda för (A) protein och RNA kvantifiering, (B) storlek heterogenitet bedömning med hjälp av dynamiska ljusspridning och (C). immunoblot analys av epididymosome markör fördelningen. Ytterligare karakterisering steg ingår (D) dual-märkning av epididymosomes koncentrerad till aldehyd/sulfat latex pärlor, (E) överföring elektronmikroskopi bedömning och (F) immunoblot bedömning av spermier (Spermier) och röda blodkroppar (RBC) kontaminering genom att använda anti-arachidonate 15-lipoxygenas (ALOX15, cytoplasmisk droppe/spermier kontaminering) eller anti hemoglobin (HBB, RBC kontaminering). Immunoblots var också utforskad med kända epididymosome Last (26S proteasom icke-ATPas reglerande subenhet 7, PSMD7; heat shock protein 90kDa beta medlem 1, HSP90B1; och beta tubulin, TUBB). Dessa data publicerades ursprungligen i vetenskapliga rapporter (PMID: 27549865) och har varit återges här med tillstånd av utgivaren, Springer natur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: immunofluorescens detektion av DNM isoformer i mECap18 celler avslöja distribution mönster att accord med de upptäckta i caput epididymal vävnad. (A) Schematisk av täckglas förberedelse för sterila mECap18 cellkultur. (B) representativa immunofluorescens bilder av DNM färgning avslöjade cellulära spridningsmönster (pilarna och inset (dubbel märkning av DNM3 och klarcellig markör ATP6V1B1)) som speglade de upptäckts inom epididymal vävnadssnitt. Cellkärna var counterstained med antingen propidium jodid (PI; röd) eller DAPI (blå). Experiment replikerades material från tre djur och representativa immunofluorescens bilder presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dessa studier ingår användning av Bouins fasta epididymal vävnad som hade utsatts för paraffin inbäddning och snittning standardprotokoll. Bouins fixativ lösningen består av en blandning av formaldehyd, pikrinsyra och ättiksyra, med varje komponent för att ha ett specifikt och kompletterande funktion. Således, formaldehyd reagerar med primära amines bildar protein tvärbindningar, pikrinsyra penetrerar sakta vävnaden bildar salter och därmed koagulation av grundläggande proteiner och omvänt, ättiksyra snabbt penetrerar vävnaden och orsakar koagulera nukleinsyror. Dessa kombinerade egenskaper har gett upphov till Bouins som ett fixativ för bevarandet av morfologisk information och dess användning är allmänt rapporterats i epididymal litteraturen. Bouins lösning är dock inte utan sina begränsningar, som inkluderar benägenheten för fixativ inducerad fluorescens och formaldehyd inducerad cross-linking som kan dölja målet antigener.

Potentialen för bakgrunden fluorescens nödvändiggör användning stränga negativa kontroller, som i våra studier inkluderar utelämnandet av den primär antikroppen, utelämnande av sekundär antikropp och, där det finns reagenser, användning av primära antikroppar preabsorbed mot immunizing peptiden som de genererades. Detaljer för tillämpningen av sådana kontroller exemplifieras i vår tidigare studie av dynamin DNM uttryck i mus bitestiklarna21. Helst sådana resultat bör också valideras genom användning av vävnad från knockout djur, dock detta material är inte alltid lätt tillgängliga. Söker motverka sekundära problemet av tvärbunden eller kemiskt modifierade mål antigener, är det ofta nödvändigt att utföra någon form av antigen retrieval för att demaskera epitoper ändras genom fixering och återupprätta deras potential för antikroppar bindande. Den metod för hämtning beror på många variabler, inklusive målet antigenet, antikropp, vävnadstyp och metoden för fixering. Men har de mest allmänt antagna teknikerna tillämpningen av antingen värme-medierad eller proteolytiska inducerad antigen retrieval. De tidigare funktionerna som våra gynnade tillvägagångssätt på grund av en större framgång för att återställa immunoreaktivitet, med detaljer av värme regimer och hämtning lösningar vi använder vanligen dokumenteras i tabell 1. Vi försiktighet dock att detta är ingalunda en uttömmande och slutligen optimering av antigen retrieval för varje protein mål/antikropp kombination kräver preliminära studier med hjälp av en matris av tid, temperatur och pH kombinationer. Ytterligare överväganden har potential att framkalla vävnadsskada eller orsaka tingsliga märkning hämtning av värme. Således, utöver tillämpningen av de negativa kontrollerna som dokumenterats ovan, vi också rutinmässigt införliva positiva kontroller featuring antikroppar, såsom anti-Golgin-97, som känner igen olika cellulära organeller.

I syfte att fastställa huruvida proteiner såsom de tillhörande familjen DNM uppfylla överflödig, i motsats till kompletterande, funktioner i epididymal vävnad, har vi funnit det särskilt informativ att utföra dubbel märkning experiment som de illustreras i figur 2B. Denna strategi omfattar sekventiell märkning av vävnadssnitt med par av primära antikroppar (uppvuxen i olika arter) följt lämpliga sekundära antikroppar konjugerad till olika fluorophores. En förbryllande funktion som ibland uppstår i syfte att utföra dessa dubbla märkning studier är dock de antigen retrieval protokoll som behövs för optimal märkning med varje primär antikropp oförenlighet. Denna begränsning påträffades vid samtidig märkning av DNM 2 och Golgin-97 i mus caput bitestiklarna, leder oss att använda på varandra följande seriella sektioner (i motsats till samma avsnitt)21. Något av dessa sätt är dock mycket användbar i samband med tillskriva proteinuttryck till en viss celltyp bland de som är företrädda i pseudostratified epididymal epitel. Med detta mål i åtanke, har vi inkluderat en lista över representativa cell typ markörer och deras rapporterade spridningsmönster längs längden av den epididymal tubuli (tabell 2). När man vill gå bortom celltyp och börja utforska subcellulär fördelningen av målprotein, erbjuder användning av dubbel märkning med erkända organell markörer, såsom Golgin-97, tydliga fördelar. Alternativt, tillämpningen av högupplöst elektronmikroskopi parallellt med immunogold märkning återstår metoden för val för detaljerad, ultrastrukturella lokalisering och validering av färgning mönster med hjälp av immunofluorescens21 .

Bland de begränsningar som utgörs av studier av epididymosomes är litenhet och svårigheten att få tillräckliga mängder för detaljerad slutpunkt analyser, särskilt i vanligen används laboratorium arter såsom musen. Dock genom att kapitalisera på de banbrytande studierna av Sullivan och medarbetare38,39,40, har vi kunnat optimera robust metod för epididymosome isolering från musen modell (se steg 2). Vi dock betona behovet av att införa stränga kontroller att bedöma och fysiska egenskaperna hos de berikade epididymosome populationer41 på grund av den potentiella föroreningen från spermier, cytoplasmiska droppar eller blodburna exosomes) (se figur 4). För detta ändamål använder vi rutinmässigt en kombination av: (i) högupplöst elektronmikroskopi att visualisera storlek och heterogena epididymosome beredning, (ii) beräkning av den genomsnittliga partikel storlek och heterogenitet (iii) koncentrationen av den epididymosomes på 4 µm aldehyd/sulfat latex pärlor och fluorescerande märkning av erkänt exosome yta markörer, inklusive CD9 och FLOT1, och (iv) immunoblotting av isolerade epididymosomes med en svit av antikroppar rekommenderas för experimentell validering av exosomes (t.ex., anti-CD9, anti-FLOT1), såväl som negativa kontroller motsvarande antigener som bör begränsas till spermier (anti-IZUMO1), spermier cytoplasmiska droppar (anti-ALOX15) eller blod (anti-HBB)22. Om dessa normer uppfylls då epididymosome förberedelserna isolerade är lätt mottagliga för användning i nedströms tillämpningar inklusive samtidig inkubering med spermier och/eller Last profilering analyserar22,42, vilka båda är kraftfulla metoder för att förbättra vår förståelse av rollen som epididymosomes i regleringen epididymal sperma mognad1.

I denna studie beskriver vi tillämpningen av en SV40-förevigade mus caput epididymal epitelial (mECap18) cell fodrar, som vi har använt för att studera DNM engagemang i regleringen av epididymal sekretoriska aktivitet21 samt effekterna av miljögifter på epididymal fysiologi43. Ett viktigt inslag i den mECap18 cell linjen är att den visar fenotypiska stabilitet mellan passager och funktioner en representativ population av både rektor och tydliga celler21,35,44. Jämfört med primär epididymal cellkulturer, visar mECap18 cell linjen också tolerans mot odling i fetalt kalvserum gratis medium, som utökar varaktighet och karaktär av experimentella insatser dessa celler kan utsättas för, samtidigt vara tillåtande att återvinna en högre överflöd av utsöndrade proteiner från luftkonditionerade medlet. En begränsning av mECap18 cell, är dock att det har gjorts odödlig och kan således svara annorlunda stress och / eller immunrelaterade stimuli jämfört att kulturer eller dessa celler primär cell lämna in vivo. Med denna begränsning i åtanke rekommenderas det att jämföra de resultat som erhålls med hjälp av mECap18 celler i vivo Svaren när det är möjligt. Sammanfattningsvis Markera de protokoll som vi beskriver nyttan av denna cellinje som ett verktyg att börja studera funktionaliteten hos målproteiner inom caput bitestiklarna. Faktiskt i kombination med användning av kommersiella proteinhämmare och editering verktyg (såsom CRISPR-Cas9) innehar den mECap18 cellen fodrar betydande potential för att lösa den mekanistiska grunden för epididymal funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet av Australien Project Grant APP1103176 till stöd för detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61, (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9, (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183, (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95, (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5, (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74, (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29, (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9, (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9, (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30, (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274, (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6, (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67, (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67, (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67, (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76, (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73, (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96, (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17, (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29, (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123, (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276, (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142, (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284, (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212, (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32, (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145, (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, (1), 46 (2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101, (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75, (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23, (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10, (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14, (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23, (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10, (8), e0135605 (2015).
Analys av Epididymal proteinsyntes och utsöndring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).More

Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter