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Developmental Biology

Análise da síntese proteica epidídimo e secreção

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58308

Summary

Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.

Abstract

O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.

Introduction

Os espermatozoides de todas as espécies de mamíferos adquirem o potencial para exibir motilidade progressiva e para fertilizar um óvulo durante a sua descida prolongada através do epidídimo, uma região altamente especializada do sistema masculino adesiva extra testicular, que pode 7-14 dias para navegar (dependendo da espécie)1. Devido a extrema condensação da cromatina a paterna e o derramamento da maioria do citoplasma que acompanha a cytodifferentiation de espermatozoides nos testículos, sua maturação funcional subsequente é conduzida exclusivamente por sua interação com o microambiente epidídimo. Neste meio é, por sua vez, criado pela atividade secretora e absorvente da soma de epidídimo forro e exibe um nível excepcional de variação de segmento-segmento1. Assim, os segmentos mais ativos em termos de síntese proteica e secreção são aqueles localizados na porção proximal do epidídimo (ou seja, o caput e corpus)2. Esta actividade espelha o perfil funcional de espermatozoides, com o início de primeira células para exibir marcas de competência funcional (i. e., motilidade progressiva e a capacidade de ligar a zona do ácido-solubilizado glicoproteínas) seguir seus passagem do caput epidídimo3. Esses atributos funcionais continuam a desenvolver-se antes de atingir os níveis ideais como o esperma alcançar o segmento distal epidídimo (cauda), onde eles são armazenados em estado quiescente em prontidão para a ejaculação. A formação e a manutenção deste reservatório de armazenamento de esperma está também intimamente ligada do epitélio de revestimento, que na cauda é dominado pela forte atividade de absorção4,5. Apesar de diferenças anatômicas foram relatados6,7,8, tal divisão regionalizada do trabalho parece ser uma característica do epidídimo que é compartilhado entre a maioria das espécies de mamíferos estudou até à data, incluindo a nossa própria9,10. Com efeito, do ponto de vista clínica, é conhecido que disfunção do epidídimo faz uma importante contribuição para a etiologia do fator masculino infertilidade11, destacando assim a importância de compreender o Regulamento deste tecido especializado.

Assim, é lamentável que o nosso entendimento da fisiologia do epidídimo e os mecanismos que regulam as fases sequenciais de maturação de espermatozoides e armazenamento dentro deste tecido, continuam a ser totalmente resolvido. Entre os fatores que contribuem, limitantes avanços na pesquisa do epidídimo são a complexidade geral deste tecido e conhecimento dos mecanismos que exercem o controlo regulamentar sobre seu microambiente luminal. Anatomicamente, sabemos que, para além da distinção de segmentos caput, corpo e cauda, epidídimo pode ser subdividido em várias zonas (figura 1A), cada um separados por septos12 e caracterizada por perfis distintos de gene/proteína expressão13,14,15,16,17,18. Com efeito, com base em detalhada transcriptional perfilamento segmental da expressão do gene no epidídimo, até 6 e 9 zonas epidídimo distintas têm sido relatadas em modelos do rato e do rato, respectivamente de19,20. Tal complexidade presumivelmente reflete a composição da soma do epidídimo, um epitélio pseudoestratificado composto por numerosos tipos de células diferentes; cada diferindo em relação a suas atividades de abundância, distribuição e secretora/absorção ao longo do comprimento do trato. Assim, as células principais são de longe a mais abundante epidídimo célula tipo que constituem mais de 80% de todas as células epiteliais. Assim, as células principais são responsáveis pela maior parte da proteína epidídimo biossíntese e secreção de5. Em contraste, a população de células claras, que classificar como o tipo de célula a segunda mais abundante dentro do epidídimo soma, está principalmente envolvida na absorção seletiva de componentes luminal e a acidificação deste microambiente5. Adicionar outra camada de complexidade, andrógenos e outros fatores de lumicrine de origem testicular exercem controle diferencial sobre cada um desses tipos de células do epidídimo, dependendo de seu posicionamento ao longo do trato.

Apesar das limitações impostas pelo tal complexidade, incursões significativas continuam a ser feito para resolver a base mecanicista da função do epidídimo. Uma chave para estes estudos tem sido a aplicação de estratégias avançadas espectrometria de massa para estabelecer inventários de larga escala de proteome o epidídimo, em conjunto com análises detalhadas das proteínas individuais, seleccionadas de entre essas pesquisas iniciais. Uma ilustração desta abordagem é nossa recente caracterização da família de mechanoenzymes no rato modelo21de DNM. Nosso interesse inicial em DNM foi alimentado por sua ação dupla no acoplamento de exo - e processos endocytotic. Baseando-se estas observações, fomos capazes de demonstrar que as três isoformas canônicas de DNM (DNM1 - DNM3) são altamente expressa no epidídimo de rato e adequadamente posicionadas para atender funções reguladoras na secreção de proteínas e absorção21 . Além disso, fomos capazes de diferenciar claramente cada isoform DNM com base em sua localização celular e sub celular, sugerindo que eles possuem complementares, em oposição à atividade redundante, dentro do epitélio do epidídimo21.

Aqui, descrevemos a metodologia experimental empregada para o estudo da expressão de DNM no epidídimo de rato com a esperança que esta informação será encontrar ampla aplicação na caracterização de proteínas epidídimo alternativas e, assim, contribuir para nossa compreensão da função desse elemento importante do aparelho reprodutor masculino. Especificamente, descrevemos o desenvolvimento da metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas seções epidídimo parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através de imunofluorescência microscopia. Documentamos ainda mais nossos protocolos recentemente otimizado22 para o isolamento e caracterização de epididymosomes; exossomo-como pequenas vesículas que constituem elementos-chave do epidídimo perfil secretora e parecem manter um papel de destaque na promoção de maturação do esperma23. Como uma abordagem complementar, descrevemos também a detecção de imunofluorescência de proteínas do alvo em uma linhagem de células do rato imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) e o uso deste recurso como um modelo com o qual deseja explorar o Regulamento do epidídimo a atividade secretora em vitro.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo a coleção de tecidos animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comitê de ética da Universidade de Newcastle.

1. imunofluorescência coloração das seções parafina epidídimo (figuras 1 e 2)

  1. Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (camundongos suíços, mais de 8 semanas de idade), dissecar cuidadosamente o epidídimo (utilizando tesouras cirúrgicas e uma pinça) livre de sobrejacente do tecido conjuntivo e gordura e mergulhe no fixador de Bouin solução (> 10 vezes o peso do volume/tecido) para fixação durante a noite.
  2. Lave o tecido com etanol a 70% com 2 × alterações diariamente por 2 dias e em seguida, desidrata-se através de classificados etanol (70%, 95% e 100%) em preparação para a infiltração e incorporação em um bloco de parafina.
  3. Seção os blocos de parafina em uma espessura de 4-6 µm e montagem nos slides em preparação para a mancha da imunofluorescência.
  4. Em uma coifa, dewax as secções de parafina epidídimo, adicionando uma quantidade suficiente de xileno na jarra de slide para imergir completamente a secção de tecido (3 × 5 min cada vez).
  5. Hidratar as secções de tecido pela imersão em soluções gradual do etanol diluído em purificado H2O (100% etanol 5 min, 5 min, 90% etanol 1 min, 80% de etanol 1 min, 70% de etanol 100% de etanol 1 min e 50% de etanol 1 min).
  6. Lave as seções em um frasco de slide uma vez por 5 min com suficiente salina tamponada fosfato (PBS) para imergir completamente a seção inteira de tecido (siga estas instruções para todas as lavagens subsequentes).
  7. Decantar a solução de recuperação de antígeno apropriado (i. e., 10 mmol/L citrato de sódio, 50 mmol/L Tris pH 10,5 ou da antígeno alternativos de recuperação ou mais soluções, dependendo do antígeno a ser detectado) em um porta-lâminas e microondas até ferver. Mergulhe os slides para esta solução e sujeita as secções de tecido para condições de recuperação de antígeno induzida por calor otimizadas para anticorpos individuais (ver tabela 1).
    Cuidado: Certifique-se que os slides estão totalmente imersos em solução de recuperação de antígeno durante o processo de recuperação de antígeno.
  8. Retire o recipiente de slide do microondas e esfriar a temperatura ambiente.
  9. Lave os slides com PBS e use uma caneta de marcador de slide líquido repelente para rastreamento em torno da seção de tecido.
  10. Coloque as lâminas em um recipiente umidificado (criado por um tecido umedecido na base do recipiente) e aplicar solução de bloqueio (3% BSA/PBS, previamente filtrada através de um filtro de 0,45 µm) para 1 h a 37 ° C.
  11. Enxágue as lâminas uma vez com PBS.
  12. Incubar as secções com anticorpo primário apropriado diluído a uma concentração experimentalmente otimizada no filtrado 1% BSA/PBS a 4 ° C durante a noite (1: 60 para anti-DNM1, DNM2 e DNM3 anticorpos; 1: 100 para o anticorpo anti-ATP6V1B1, ver tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo).
    Nota: Para distinguir específica de ligação do anticorpo específico, é necessário incluir rigoroso negativo (i. e., anticorpo secundário primário, único anticorpo preabsorbed contra Imunizar do peptide) e controlos positivos24.
  13. Reaquecer os slides, colocando-se à temperatura ambiente por 30 min.
  14. Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.
  15. Incubar as secções com anticorpo secundário apropriado, diluído em 1% BSA/PBS (filtrada através de um filtro de 0,45 µm) a 37 ° C por 1h (diluição de 1: 400 para todos os anticorpos secundários, consulte Tabela de materiais para obter detalhes de anticorpo).
    Atenção: Manter o recipiente do slide no escuro desta etapa em diante. Para a dupla rotulagem, escolher uma combinação compatível de anticorpos secundários (i. e., anticorpos secundários têm sido levantados em espécies diferentes).
  16. Lave os slides 3 × com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 10 min cada.
  17. Counterstain as seções com iodeto de propidium (PI, 7.48 μmol/L) ou 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) por 2 min à temperatura ambiente para rotular o núcleo da célula.
  18. Lave as lâminas duas vezes com PBS em uma plataforma de agitação (60 rpm) por 5 min cada.
  19. Montar as seções com Mowiol 4-88 preparada em uma solução de 30% de glicerol em 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) de 10% e 2,5% 1, 4 - diazabiciclo-(2.2.2)-octano.
  20. Selar a lamela com verniz das unhas e armazenar os slides a 4 ° C para observação futura.
    Atenção: É aconselhável realizar a imagem dos slides, logo que prático após o preparo para evitar a perda excessiva de fluorescência.

2 isolamento do Epididymosomes do Mouse Caput epidídimo (Figura 3)

  1. Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (mais de 8 semanas de idade de camundongos suíços), perfundir sua vasculatura com PBS (pré aquecido a 37 ° C) para minimizar a contaminação de sangue do tecido do epidídimo.
    Atenção: o plasma sanguíneo contém diversas populações de exosomes, que são de tamanho similar a epididymosomes25. A eficácia da liberação de sangue do tecido do epidídimo pode ser acessada através da inspeção do segmento inicial, um segmento altamente vascularizado e epidídimo localizado proximal ao segmento caput (i. e., zona 1 na figura 1A)
  2. Dissecar cuidadosamente o epidídimo livre de gordura sobrejacente e tecido conjuntivo e enxágue com meio Biggers, Whitten e Whittingham modificado (BWW; pH 7,4, osmolalidade de 300 mmol/kg água26,27) para reduzir qualquer potencial de superfície contaminação do sangue.
  3. Borre o epidídimo tecido para retirar o excesso mídia, dissecar o epidídimo caput (i. e., zonas de 2-5 na figura 1A) e transferir para um prato de Petri fresco (35 × 10mm) contendo meio BWW. Certifique-se de que a quantidade do meio é suficiente para a recuperação final.
    Nota: Para 6 caput epidídimos, é recomendável usar 1,1 mL do meio para permitir uma recuperação de ~ 900 µ l, que é então uniformemente dividida e aplicada em cima de 2 gradientes pré-preparadas (ver passo 2.9).
  4. Fazer um número de pequenas incisões no caput tecido com uma lâmina de barbear. Não picar o tecido e, assim, evitar contaminar a amostra com excessivo conteúdo citosólica. Incube a placa contendo o tecido com agitação suave a 37 ° C por 30 min liberar o conteúdo luminal.
  5. Filtre a suspensão resultante 70 µm membranas para remover os restos celulares.
  6. Recolher o filtrado e submeta este a etapas sucessivas de centrifugação a 4 ° C, com o aumento da velocidade para eliminar restos celulares (i. e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min cada; 17.000 × g por 20 min e finalmente 17.000 × g por um adicional 10 min ou até que nenhum sedimento é formado após centrifugação).
    Atenção: É importante para avaliar a cor da pelota após 500 × g centrifugação passo inicial para garantir a contaminação de sangue mínima está presente. Descarte qualquer amostras em que este sedimento exibe coloração rosa.
  7. Prepare-se descontínuo do iodixanol (composto por 40%, 20%, 10%, 5% camadas) diluindo um meio de gradiente de densidade (composta por 60% (p/v) aquosa iodixanol) com uma solução 0,25 mol/L sacarose e 10 mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Prepare o gradiente em um tubo se (11 × 35 mm), com cada fração de 450 µ l (Figura 3). Inspecione visualmente o gradiente após a aplicação de cada fração, para garantir que as interfaces com êxito são formadas entre cada camada antes de carregar a epidídimo amostra de fluido. Preparar cada gradiente fresco no dia do uso, no entanto, a amostra de fluido luminal epidídimo pode ser preservada a 4 ° C por até 2 h antes do carregamento.
  9. Adicione cuidadosamente 450 µ l de epidídimo luminal fluido suspensão (correspondente ao material coletado desde o caput 3 epidídimos) no topo de um gradiente simples.
  10. Se os gradientes a 160.000 × g a 4 ° C por 18 h.
    Atenção: Desde que esta centrifugação é conduzida em alta velocidade, todos os tubos se devem ser emparelhados e equilibrados precisamente. Verifique se os tubos para garantir que eles estão livres de danos visíveis, o que poderiam comprometer sua integridade.
  11. Remova cuidadosamente a 12 fracções iguais (cada um composto por 185 µ l) a partir da camada superior e progredindo em direção a parte inferior do gradiente. Reunir as fracções equivalentes recuperadas de cada gradiente se aplicável (até dois gradientes).
    Nota: O Mouse epididymosomes são mais altamente enriquecido em frações 9-11,22, ver Figura 4 e discussão.
  12. Após a recuperação e o pool de frações 9 – 11, diluir em 2 mL de PBS e se as amostras a 100.000 × g a 4 ° C por 3 h (13 × 56 mm tubo) para o epididymosomes de Pelotas.
    Atenção: Desde a pelota de epididymosome pode ser difícil de ver, certifique-se de que a orientação dos tubos é notar como eles são colocados em um rotor e marcam o tubo para indicar a posição expectante da pelota de epididymosome. Certifique-se de que cada tubo contém um volume suficiente (i. e., superior a 50% da capacidade total) para evitar o risco de colapso do tubo.
  13. Cuidadosamente, aspirar e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento de epididymosome.
  14. Avalie a pureza de epididymosome (Figura 4).
  15. Ressuspender o epididymosome no meio desejado de acordo com o aplicativo (s) a jusante. Por exemplo, meio BWW geralmente é usado para os experimentos envolvendo co incubação com espermatozoides ou, alternativamente, um tampão de Lise apropriado em preparação para a resolução do epidídimo proteome através de SDS-PAGE.

3. imunofluorescência coloração de células mECap18

  1. Preparação de lamelas estéril (para ser realizado em uma capa de cultura de células)
    1. Mergulhe as lamelas (12 × 12 mm) em etanol a 70% por 10 min e desinfectar por secagem sob a alta temperatura acima de uma lâmpada de etanol.
    2. Legal a lamela para 10 s antes de transferir para um prato bem 12.
    3. Aplica a solução estéril de poli-L-lisina para cobrir a lamela e se contentar com 10 min à temperatura ambiente.
    4. Descartar a solução de poli-L-lisina e enxaguar a lamela com estéril H2O ou médio.
  2. Células mECap18 de preparação
    1. Passagem as alíquotas de 2 × 105 mECap18 células em cada poço da placa bem 12 contendo as lamelas.
    2. Cultura de células com mECap18 celular médio (DMEM suplementado com 1% L-glutamina, piruvato de sódio 1%, 1% penicilina/estreptomicina e 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) com vitela fetal 10% soro (FBS) em uma incubadora de 37 ° C sob uma atmosfera de 5% CO2 durante a noite.
    3. Uma vez que as células aderirem a lamela, descartar o meio e enxágue as células duas vezes com PBS.
    4. Adicione uma quantidade suficiente de paraformaldeído 4% (PFA) diluída em PBS, mergulhe a lamela toda e corrigir as células à temperatura ambiente por 15 min.
    5. Descartar a solução PFA e enxágue as lamelas duas vezes em PBS.
  3. Mancha da imunofluorescência
    1. Permeabilize mECap18 células por imersão em 0,1% Triton X-100 em PBS por 10 min.
    2. Enxague as lamelas com PBS.
    3. Bloquear células mECap18 com 3% de BSA e proceder com immunolabeling de células utilizando protocolos equivalentes àquelas descritas para o epidídimo cortes histologicos.

4. isolamento de proteínas do meio de cultura celular condicionado

  1. Coleção de meio de cultura celular condicionado
    1. Alíquotas de passagem de 4 × 105 mECap18 células em cada poço de 6 bem a placa com meio de célula mECap18 suplementado com 10% FBS por 24 h.
    2. Lavar as células mECap18 três vezes com meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) para remover FBS residual e qualquer associado contaminantes de proteína.
    3. Adicione 1,5 mL de meio de celular mECap18 (preparado sem FBS) a cada poço e incubar com células mECap18 para 12h em uma incubadora de 37° C abaixo de 5% de CO2.
      Nota: mECap18 células neste passo podem ser avaliadas por antígenos alvo diferentes de acordo com o projeto experimental.
    4. Após a incubação de 12 h, colete o meio celular e centrifugar a 2.000 × g por 10 min remover todos os restos celulares.
      Nota: A duração da incubação é capaz de ser alterada de acordo com a avaliação do projeto experimental/ponto de extremidade e tendo em consideração a tolerância da célula de treatment(s) aplicada. Recomenda-se ajustar o tempo de incubação, com base em regimes experimentais específicos para assegurar que sejam alcançados resultados óptimos.
    5. Avalie a viabilidade de celular mECap18 através da aplicação de um padrão trypan azul exclusão do ensaio28. Descarte todo o material em que a viabilidade celular tem diminuído abaixo de 90% para eliminar o viés introduzido por proteínas libertadas de células mortas ou moribundas.
    6. Isolar proteínas do meio celular como segue ou preservar médio a-80 ° C.
  2. Isolamento da proteína (a ser realizado em uma coifa)
    1. Adicione 20% do volume de refrigerados ácido tricloroacético de 100% para 80% volume de meio de celular condicionados para precipitar as proteínas libertadas das células cultivadas mECap18. Incube a 4 ° C durante a noite com uma mistura constante.
    2. Após a incubação, pelota proteína precipitada por centrifugação (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
      Nota: Devido a quantidade limitada de proteína que esperava para ser secretado para o meio, é possível que o sedimento não ser facilmente visualizado após a centrifugação. Portanto, é imperativo para orientar o tubo antes da centrifugação e tome cuidado para não perturbar o local da pelota expectante durante a remoção do líquido sobrenadante corretamente.
    3. Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com acetona gelada antes da re-centrifugação a (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
    4. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante antes de secando qualquer acetona residual dentro de uma coifa.
    5. Resuspenda o pellet de proteína em um buffer de extração adequada em preparação para a análise de ponto de extremidade detectar a proteína secretora completa de perfis e/ou proteínas individuais do alvo (ex., SDS-PAGE, immunoblotting).

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Representative Results

Figura 1 e Figura 2 mostram resultados representativos de localização de imunofluorescência de DNM no epidídimo caput do mouse. Cada um das três isoformas DNM investigado exibir localização distintos perfis. Assim, DNM1 caracteriza-se por rotulagem difusa relativamente modesto das células epidídimo durante todo o epidídimo inicial do segmento e caput (Figura 2A). Por outro lado, a isoforma de DNM2 foi detectada pela primeira vez na proximidade da fronteira oposta de basal e apical das células no segmento inicial, antes sendo reposicionado ao domínio supranuclear em células dentro do segmento adjacente a jusante caput (i. e., zonas de 2-5) (Figura 1B, C). Nomeadamente, no entanto, a intensidade do DNM2 rotulagem gradualmente diminuiu entre as zonas 2 a 5 do caput epidídimo, um resultado que espelha essencialmente a atividade secretora destes segmentos epidídimo21 (Figura 1B, C). Nesse sentido, a rotulagem de supranuclear do DNM2 posteriormente foi mostrada para correspondem à distribuição do aparato de Golgi dentro de células principais caput21. Espermatozoide isolado de uma mesma região epidídimo mostrou intensa acrossomal rotulagem para DNM2 (Figura 1). Como uma advertência, no entanto, equivalente DNM2 rotulagem não foi rotineiramente detectado na luminal espermatozoides dentro de nossas seções de tecido. Este fenômeno é o que encontramos em várias ocasiões, ao aplicar uma variedade de anticorpos a antígenos diferentes epidídimo/esperma de direcionamento e presumivelmente surge devido a problemas associados com a apresentação de antigénios e/ou mascaramento na cortes de tecido de parafina. Em qualquer caso, tais diferenças enfatizam a importância da realização de rotulagem imunofluorescência paralela de espermatozoides isolados ao lado do próprio tecido epidídimo. Diferenciando-se da tanto DNM1 e DNM2, a isoforma de DNM3 foi detectada principalmente no domínio apical de um pequeno número de caput células epiteliais (Figura 2B, setas verdes), que foram mostrados para corresponder da subpopulação de células claras através da marcação de co com o marcador de células claras reconhecido, ATP6V1B1 (Figura 2B, setas vermelhas). De maneira semelhante, marcadores representativas que se mostraram adequados para diferenciar os tipos diferentes de células epiteliais epidídimo estão sumarizados na tabela 229,30,31 , 32 , 33 , 34.

Além da descrição das técnicas para a Localização subcellular das proteínas que residem dentro do epitélio do epidídimo, aqui, também relatamos nossos protocolos recentemente otimizados para o estudo de proteínas secretoras encapsulados em epididymosomes, pequenas vesículas extracelulares que representam um componente importante do meio de luminal responsável por apoiar o esperma de maturação e armazenamento22. Combinado, passo 2 e Figura 3 fornecem um relato passo a passo detalhado da metodologia utilizada para o isolamento das populações altamente enriquecidos de epididymosomes de tecido epidídimo de rato caput. Nomeadamente, no entanto, esses métodos são prontamente aplicáveis para o isolamento das populações alternativos de epididymosomes provenientes de segmentos mais distais de epidídimo. Devido ao potencial de contaminação dessas amostras, também descrevemos os protocolos rigorosos de caracterização que empregamos rotineiramente para cada preparação de epididymosome. Estes incluem a avaliação do tamanho e da heterogeneidade das populações epididymosome usando microscopia eletrônica de alta resolução e técnicas de espalhamento de luz dinâmica. Em conjunto, nós também utilizamos immunoblotting estratégias para avaliar o enriquecimento dos marcadores de vesículas extracelulares reconhecido e a ausência correspondente de proteínas que são característicos de contaminantes potenciais (i. e., anti-hemoglobina (HBB) como um marcador de contaminação de sangue e anti-arachidonate 15-lipoxigenase (ALOX15) e anticorpos anti-IZUMO1 como marcadores de gota citoplasmática e contaminação do esperma, respectivamente)22. Embora nós encontramos que os contaminantes são raros, se eles forem encontrados, descartar imediatamente a preparação de epididymosome.

A localização não-sobreposição de DNM isoformas no caput epidídimo solicitado uma investigação mais aprofundada das suas potenciais funções na regulação do microambiente epidídimo. Para este efeito, uma linha de celular imortalizado mECap18 foi utilizada como um modelo in vitro para estudar a atividade secretora das células epidídimo. Caracterização anterior desta linha celular tem mostrado que ele abriga uma população de células mistas, que mancha positivos para marcadores de qualquer célula principal ou clara. Além disso, as células mECap18 provaram também adequadas para relatar fisiológicas perfis de expressão de gene e proteína epidídimo sob diferentes em vitro tratamento regimes35. Antes da utilização, localização de DNM foi avaliada em células cultivadas mECap18 por fixando-se os em lamelas de tratados de poli-L-lisina (Figura 5A) e submetendo-os à detecção de imunofluorescência. Consistente com os padrões de distribuição registrados no caput histologicos epidídimo, DNM1 foi detectada em todo o citoplasma das células de mECap18, enquanto DNM2 estava concentrada dentro do domínio supranuclear destas células e DNM3 caracterizou-se por discreta focos de coloração dentro de um número pequeno subpopulação de membrana (i. e., 11%) das células mECap18 que foram ATP6V1B1 positivo (Figura 5B). Estes dados afirmam o utilitário da linha de celular mECap18 como um recurso valioso para investigar o papel da DNM na regulação da atividade secretora/absorção celular epidídimo.

Nesse sentido, a etapa 4 descreve a metodologia para a análise da atividade secretora das células mECap18; as técnicas que são amplamente favoráveis para avaliar o impacto de uma gama de diferentes condições experimentais. Em nosso estudo, nós aplicamos seletivas intervenções farmacológicas para suprimir a atividade de DNM1 e DNM2 antes a visualização e quantificação do perfil de proteínas liberada a partir de células mECap18 para condicionado médio21. Uma característica importante desta análise, no entanto, foi garantir que as células mECap18 cuidadosamente lavadas e cultivadas na ausência de suplementação FBS. Enquanto um passo tão foi essencial para evitar a contaminação do meio condicionado com proteínas derivadas de FBS, realiza, no entanto, o risco do atendedor de impacto negativo sobre o crescimento de células mECap18 e/ou viabilidade. Em controlar esta possibilidade, observou-se que a linha de celular mECap18 tolerada cultura livre FBS e a introdução dos inibidores DNM para a duração da nossa janela de incubação (i. e., 12 h). De fato, durante este tempo, viabilidade celular permaneceu acima de 90% em todas as réplicas experimentais. Essa abordagem, portanto, poderia servir como uma estratégia de prova de conceito útil para identificar a função das proteínas específicas do epidídimo antes de cometer a investimento em estratégias de manipulação genética.

Calor induzido por solução de recuperação de epítopo citrato de sódio de 10 mmol/L 50 mmol/L Tris (pH 10,5)
Tempo 3 min 3 min
6 min 6 min
9 min 9 min
12 min 12 min

Tabela 1 : Condições gerais para a otimização da recuperação do antígeno induzida por calor para o uso com parafina seções epidídimo. O processo de fixação pode ser problemático, como resumos diferentes muitas vezes requerem o uso de técnicas de fixação diferente, necessitando, assim, que a metodologia é otimizada para cada antigénio.

Tipo de célula epitelial Distribuição Marcador Referências (PMID)
Célula principal Epidídimo todo AQP9 11027599, 17360690
Células claras Caput, corpo e cauda V-ATPase, CIC-5 19448084, 12475763
Basocelular Epidídimo todo CLDN1 11159859, 21441423
Células estreitas Segmento inicial V-ATPase, CIC-5 19448084, 12475763

Tabela 2 : Marcadores representante adequados para a detecção de tipos de célula epitelial epidídimo primário diferente.

Figure 1
Figura 1: expressão espacial de 2 DNM dentro do epidídimo de rato proximal. (A) modelo esquemático do epidídimo retratando o particionamento sobre o epidídimo de rato em 10 zonas fisicamente separados septos, conforme relatado por Turner e colegas20. Neste modelo, zona 1 corresponde ao segmento inicial, zonas 2-5 correspondem ao epidídimo caput, zonas 6-7 correspondem ao epidídimo corpus e zonas 8-10 representam o cauda epidídimo. (B-C) Localização de imunofluorescência de DNM2 revelou padrões de distribuição específicas de zona (indicados pela seta e seta branca). A fronteira entre a zona 1 e 2 é demarcada por uma linha pontilhada ou indicada por setas amarelas. (D) DNM2 também é expresso no domínio do peri-acrossomal de espermatozoides isolado do epidídimo caput. No entanto, nenhuma mancha tão rotineiramente foi detectado no luminal espermatozoides dentro as seções correspondentes do epidídimo. EP, células epiteliais; l, lúmen; Neg, única controle anticorpo secundário. Experimentos foram replicados no material de três animais e imagens de imunofluorescência representativos são apresentadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: detecção de imunofluorescência de DNM 1 e 3 de DNM no epidídimo caput rato. (A) a localização do DNM136 foi examinada em epidídimo caput do mouse. (B) localização co de DNM336 e o marcador de células claras, ATP6V1B137 no epidídimo caput do mouse. Esta análise confirmou que os dois DNM3 (verde setas) e ATP6V1B1 (setas vermelhas) residem a subpopulação de células claras mas exibir sobreposição mínima de sub celular. EP, células epiteliais; int, interstício; l, lúmen; SP, esperma; Neg, única controle anticorpo secundário. Núcleo de células foram counterstained com DAPI (azul). Experimentos foram replicados no material de três animais e imagens de imunofluorescência representativos são apresentadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema de isolamento protocolos utilizados para o enriquecimento do rato caput epididymosomes. Após a dissecação, caput epidídimo tecido é imerso em uma gota de meio BWW e incisão para liberar o conteúdo luminal. O fluido luminal é então filtrado através de uma membrana de 70 µm e a suspensão resultante é centrifugada a aumentar a velocidade para quaisquer detritos de células residuais de Pelotas. A suspensão apurada é então carregada no topo de um gradiente de densidade descontínuos (solução de iodixanol) e submetida a ultracentrifugação durante a noite. Partição de Epididymosomes em frações 9-11, que são agrupados, lavado através de diluição em PBS e retornado para a se, para o epididymosomes de Pelotas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: avaliação da pureza de epididymosome. Doze fracções iguais foram recuperadas após a ultracentrifugação do gradiente e uma alíquota de cada preparado para proteína (A) e quantificação de RNA, (B) avaliação da heterogeneidade do tamanho usando espalhamento dinâmico de luz e (C). immunoblot análise da distribuição de marcador de epididymosome. Etapas de caracterização adicional incluíam (D) dual-rotulagem de epididymosomes concentrada-se em grânulos de látex aldeído/sulfato, (E) avaliação de microscopia eletrônica de transmissão e avaliação de immunoblot (F) de espermatozoides (Esperma) e contaminação de glóbulos vermelhos (RBC) usando anti-arachidonate 15-lipoxigenase (ALOX15, contaminação da gota citoplasmática/esperma) ou anti-hemoglobina (HBB, contaminação de RBC). Immunoblots também foram sondados com carga epididymosome conhecido (subunidade da regulamentação 7, PSMD7 não-ATPase da Proteassoma 26S; calor choque proteína 90kDa membro beta 1, HSP90B1; e beta tubulina, TUBB). Estes dados foram originalmente publicados em relatórios científicos (PMID: 27549865) e foram reproduzidas aqui com a permissão do editor, natureza de Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: deteção de imunofluorescência de isoformas DNM nas células mECap18 revelar distribuição padrões aquele acordo com aqueles detectados no caput tecido epidídimo. (A) esquemática da lamela de preparação para a cultura de pilha de estéril mECap18. (B) imagens de imunofluorescência representativa de DNM coloração padrões de distribuição de celulares reveladas (setas e inset (dupla rotulagem de DNM3 e marcador de células claras ATP6V1B1)) que aqueles detectado dentro de seções de tecido epidídimo espelhado. Núcleo de células foram counterstained com iodeto de propidium (PI; vermelho) ou DAPI (azul). Experimentos foram replicados no material de três animais e imagens de imunofluorescência representativos são apresentadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Estes estudos incorporaram o uso de tecido do Bouin fixo epidídimo que tinha sido submetido a incorporação de parafina e protocolos padrão de corte. Fixador solução de Bouin é composto por uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético, com cada componente tem uma função específica e complementar. Assim, formaldeído reage com aminas primárias para formar ligações cruzadas de proteína, ácido pícrico lentamente penetra o tecido formando sais e, portanto, coagulação das proteínas básicas e por outro lado, o ácido acético rapidamente penetra o tecido e faz com que a coagulação do ácidos nucleicos. Essas propriedades combinadas têm engendrado do Bouin como um fixador de escolha para a preservação de detalhes morfológicos e seu uso é amplamente divulgado na literatura epidídimo. No entanto, a solução de Bouin não é sem suas limitações, que incluem a propensão para fixador fluorescência induzida e para cross-linking formaldeído induzido, que pode mascarar antígenos alvo.

O potencial para fluorescência de fundo exige os uso rigorosos controles negativos, que em nossos estudos incluem a omissão do anticorpo primário, omissão do anticorpo secundário e, onde os reagentes estão disponíveis, o uso de anticorpos primários preabsorbed contra o peptídeo imunizante da qual eles foram gerados. Detalhes da aplicação de tais controles são exemplificados em nosso estudo anterior de expressão de DNM Dinamina no epidídimo de rato21. Idealmente, tais resultados também devem ser validados através da utilização de tecido derivado de animais nocaute, no entanto, este material não é prontamente disponível. Na busca combater o problema secundário de antígenos alvo reticulado ou quimicamente modificados, é frequentemente necessário realizar alguma forma de recuperação do antígeno para desmascarar epitopos alterados pela fixação e, assim, restaurar o seu potencial para o anticorpo ligação. A metodologia utilizada para a recuperação depende de muitas variáveis, incluindo o antígeno alvo, anticorpo, tipo de tecido e o método de fixação. No entanto, as técnicas mais adotadas apresentam a aplicação de qualquer recuperação de calor-mediada ou proteolíticas do antígeno induzida. O antigo apresenta como nossa abordagem favorecida devido a uma maior taxa de sucesso para restaurar imunorreatividade, com os detalhes dos regimes de calor e soluções de recuperação que utilizamos comumente sendo documentado na tabela 1. No entanto, alertamos que isto não é uma lista exaustiva e, finalmente, a otimização da recuperação do antígeno para cada combinação de destino/anticorpo da proteína requer estudos preliminares usando uma matriz de combinações de tempo, temperatura e pH. Considerações adicionais incluem o potencial de recuperação de calor provocar dano tecidual e/ou causar artefactual de rotulagem. Assim, além da aplicação dos controlos negativos documentado acima, incorporamos também rotineiramente controlos positivos com anticorpos, tais como anti-Golgin-97, que reconhecem as organelas celulares distintas.

Na busca de estabelecer se as proteínas tais como os pertencentes à família DNM cumprir redundantes, em vez de funções complementares, no tecido do epidídimo, encontrámo-lo particularmente informativo para realizar experiências etiquetas duas como aqueles ilustrado na Figura 2B. Esta estratégia envolve a rotulagem sequencial de seções do tecido com pares de anticorpos primários (criados em espécies diferentes) seguidos apropriado anticorpos secundarios conjugados para diferentes fluorophores. No entanto, uma característica de confundimento que ocasionalmente surge na busca realizar estes estudos rotulagem duas é a incompatibilidade dos protocolos de recuperação de antígeno necessária para a rotulagem ideal com cada anticorpo primário. Esta limitação foi encontrada no caso co rotulagem de 2 DNM e Golgin-97 no epidídimo caput do rato, nos leva a utilizar seções serial consecutivos (em oposição a mesma seção)21. No entanto, qualquer dessas abordagens são extremamente úteis no contexto de atribuir a expressão de proteínas para um tipo de célula específica entre as representadas no epitélio pseudoestratificado epidídimo. Com esse objetivo em mente, nós incluímos uma lista de marcadores do tipo de célula representativas e seus padrões de distribuição relatado ao longo do comprimento do túbulo epidídimo (tabela 2). Quando se quer ir além do tipo de célula e começar a explorar a distribuição subcelular de proteínas do alvo, o uso de rotulagem dupla com marcadores de organela reconhecidos, tais como Golgin-97, oferece vantagens distintas. Alternativamente, a aplicação da microscopia eletrônica de alta resolução em tandem com immunogold rotulagem continua a ser o método de escolha para localização ultra-estrutural detalhada e validação de coloração padrões alcançados usando a imunofluorescência21 .

Entre as limitações decorrentes do estudo de epididymosomes são seu pequeno tamanho e a dificuldade em obter quantidades suficientes para as análises detalhadas de ponto de extremidade, particularmente em comumente usadas espécies de laboratório como o mouse. No entanto, capitalizando sobre os estudos pioneiros de Sullivan e colegas38,39,40, nós fomos capazes de otimizar a metodologia robusta para isolamento de epididymosome do mouse modelo (consulte a etapa 2). Salientamos, no entanto, a necessidade de impor controles rigorosos para avaliar as características físicas e das populações epididymosome enriquecido41 devido a contaminação potencial de espermatozoides, gotículas citoplasmáticas e/ou transmitidas pelo sangue exosomes ( consulte a Figura 4). Para este efeito, utilizamos rotineiramente uma combinação de: (i) alta resolução microscopia eletrônica para visualizar o tamanho e a heterogeneidade da preparação epididymosome, (ii) o cálculo da média das partículas tamanho e heterogeneidade (iii) concentração do epididymosomes para 4 µm aldeído/sulfato látex grânulos e rotulagem fluorescente de reconhecido exossomo marcadores de superfície, incluindo CD9 e FLOT1, e (iv) immunoblotting de epididymosomes isolado com um conjunto de anticorpos recomendado para experimental validação de exosomes (EG., anti-CD9, anti-FLOT1), também como negativos controles correspondentes aos antígenos que devem ser restringidos aos espermatozoides (anti-IZUMO1), gotículas citoplasmática de espermatozoides (anti-ALOX15) ou sangue (anti-HBB)22. Se estas normas forem cumpridas, então as epididymosome preparações isoladas são prontamente acessível para uso em aplicações a jusante, incluindo co incubação com espermatozoides e/ou criação de perfil de carga analisa22,,42, ambos os quais são poderosas abordagens para melhorar a nossa compreensão do papel do epididymosomes na regulação de maturação de espermatozoides do epidídimo1.

Neste estudo, descrevemos a aplicação de uma rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) linha de células, que nós têm utilizado para estudar o envolvimento de DNM a regulação da atividade secretora epidídimo21 , bem como o impacto de tóxicos ambientais na fisiologia epidídimo43. Uma característica importante da linha de célula mECap18 é que ele exibe estabilidade fenotípica entre passagens e características de uma população representativa de ambas as células principais e claro21,35,44. Em comparação com as culturas de células primárias de epidídimo, a linha de celular mECap18 também exibe tolerância ao cultivo em soro fetal bezerro meio livre, que estende a duração e a natureza das intervenções experimentais, estas células pode ser exposto, embora também sendo permissiva de recuperar uma maior abundância de proteínas secretadas do meio condicionado. Uma limitação da linha da célula mECap18, no entanto, é que-tem sido imortalizado e pode, portanto, respondem de forma diferente ao estresse e /ou de estímulos relacionados ao imunológico comparado ao que de célula primária culturas ou essas células apresentam em vivo. Com essa limitação em mente, recomenda-se comparar os resultados obtidos utilizando células de mECap18 no vivo respostas sempre que possível. Em resumo, os protocolos que descrevemos realçar a utilidade desta linha de celular como uma ferramenta para começar a estudar a funcionalidade de proteínas do alvo dentro do epidídimo caput. Com efeito, em combinação com o uso de inibidores de proteína comercial e/ou ferramentas de edição do genoma (como CRISPR-Cas9), a linha de celular mECap18 detém um potencial considerável para ajudar a resolver a base mecanicista da função do epidídimo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores que gostaria de agradecer a nacionais de saúde e médico pesquisa Conselho de Austrália projeto Grant APP1103176 pelo apoio deste trabalho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

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References

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Análise da síntese proteica epidídimo e secreção
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Zhou, W., Sipilä, P., DeMore

Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

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