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Developmental Biology

Epididymal प्रोटीन संश्लेषण और स्राव का विश्लेषण

doi: 10.3791/58308 Published: August 25, 2018

Summary

यहां, हम dynamin के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण की रिपोर्ट के लिए तेल में प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल-एंबेडेड माउस epididymal वर्गों और एक अमर epididymal सेल लाइन (mECap18) के उन वर्णन । हम भी दोनों epididymal द्रव और वातानुकूलित सेल मीडिया से स्रावी प्रोटीन के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

स्तनधारी अधिवृषण के बाद वृषण परिपक्वता और शुक्राणु के भंडारण का समर्थन करने के लिए किसी भी अंत में स्रावी ग्रंथि के सबसे जटिल intraluminal तरल पदार्थ में से एक उत्पंन करता है । ऐसी जटिलता अस्तर उपकला कोशिकाओं के संयुक्त स्रावी और अवशोषण गतिविधि के कारण पैदा होती है. यहां, हम dynamin (DNM) mechanoenzymes के मॉडल प्रोटीन परिवार पर ध्यान केंद्रित करके epididymal प्रोटीन संश्लेषण और स्राव के विश्लेषण के लिए तकनीकों का वर्णन; बड़े GTPases कि द्वि-दिशात्मक झिल्ली तस्करी की घटनाओं को विनियमित करने की क्षमता है । epididymal ऊतक में प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए, हम आयल-एंबेडेड वर्गों में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और इन प्रोटीन के द्वारा स्थानिक वितरण के बाद का पता लगाने के लिए मजबूत कार्यप्रणाली का वर्णन इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी. हम भी अलगाव और बुलबुले की तरह exosome के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित पद्धति का वर्णन, epididymosomes, जो epididymal लुमेन में स्रावित कर रहे है के रूप में जाना जाता है परिपक्व शुक्राणु कोशिकाओं के साथ सेलुलर संचार में भाग लेने के लिए । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम भी एक SV40-अमर माउस कैपुट epididymal उपकला (mECap18) सेल लाइन में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने का वर्णन. इसके अलावा, हम mECap18 सेल लाइन की उपयोगिता के रूप में एक उपयुक्त इन विट्रो मॉडल जिसके साथ epididymal स्रावी गतिविधि के विनियमन का पता लगाने के लिए चर्चा । इस प्रयोजन के लिए, हम mECap18 सेल लाइन के रखरखाव के लिए संवर्धन आवश्यकताओं का वर्णन और चुनिंदा औषधीय अवरोधक परहेजों है कि उनके स्रावी प्रोटीन प्रोफ़ाइल को प्रभावित करने में सक्षम है का उपयोग करें । बाद आसानी से कंडीशन्ड संस्कृति माध्यम की कटाई के द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं, trichloroacetic एसिड के माध्यम से स्रावित प्रोटीन की एकाग्रता/एसीटोन वर्षण और एसडीएस के माध्यम से उनके बाद के विश्लेषण-पृष्ठ और immunoblotting । हम तर्क है कि इन संयुक्त तरीकों वैकल्पिक epididymal प्रोटीन लक्ष्य के विश्लेषण के लिए शुक्राणु परिपक्वता में अपने कार्यात्मक भूमिका निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है और/

Introduction

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सभी स्तनधारी प्रजातियों के शुक्राणु आगे प्रगतिशील गतिशीलता प्रदर्शित करने के लिए और अधिवृषण, पुरुष अतिरिक्त वृषण वाहिनी प्रणाली है, जो मई के एक अति विशिष्ट क्षेत्र के माध्यम से अपने लंबे समय तक वंश के दौरान एक डिंब निषेचन के लिए क्षमता प्राप्त ले 7-14 दिन नेविगेट करने के लिए (प्रजातियों पर निर्भर करता है)1। पैतृक क्रोमेटिन के चरम संघनित्र और कोशिका द्रव्य के बहुमत के छप्पर के कारण है कि परीक्षण के भीतर शुक्राणु के cytodifferentiation के साथ, उनके बाद कार्यात्मक परिपक्वता उनकी बातचीत के द्वारा विशेष रूप से संचालित है साथ epididymal microenvironment । इस वातावरण है, बारी में, अस्तर epididymal सोमा के स्रावी और अवशोषण गतिविधि के द्वारा बनाई गई है और खंड खंड भिंनता1का एक असाधारण स्तर प्रदर्शित करता है । इस प्रकार, प्रोटीन संश्लेषण और स्राव के संदर्भ में सबसे सक्रिय क्षेत्रों अधिवृषण के समीपस्थ भाग में स्थित उन हैं (अर्थात्, कैपुट और कोष)2. इस गतिविधि शुक्राणु के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल दर्पण, पहले कार्यात्मक क्षमता (यानी, प्रगतिशील गतिशीलता और एसिड को बांध करने की क्षमता-solubilized zona नच) की पहचान प्रदर्शित करने के लिए शुरू की कोशिकाओं के साथ उनके निंनलिखित कैपुट अधिवृषण3के माध्यम से पारित । इन कार्यात्मक विशेषताओं के रूप में शुक्राणु के बाहर epididymal खंड (cauda) तक पहुंचने के लिए इष्टतम स्तर तक पहुंचने से पहले विकसित करने के लिए जारी है, जिसमें वे हांक के लिए तत्परता में एक quiescent राज्य में जमा हो जाती है । गठन और इस शुक्राणु भंडारण जलाशय के रखरखाव भी परिचित अस्तर उपकला है, जो cauda में मजबूत अवशोषण गतिविधि4,5का प्रभुत्व है से बंधा है । हालांकि संरचनात्मक मतभेद6,7,8, श्रम के ऐसे क्षेत्रीय विभाजन रिपोर्ट किया गया है अधिवृषण कि स्तनधारी प्रजातियों के बहुमत के बीच साझा किया जाता है की एक विशेषता प्रतीत होता है हमारे अपने9,10सहित, आज तक का अध्ययन किया । वास्तव में, एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, यह ज्ञात है कि epididymal शिथिलता पुरुष कारक11बांझपन के एटियलजि के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान देता है, इस प्रकार इस विशेष ऊतक के विनियमन को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला ।

इसलिए यह अफसोस की बात है कि epididymal शरीर क्रिया विज्ञान की हमारी समझ है, और तंत्र है कि शुक्राणु परिपक्वता और इस ऊतक के भीतर भंडारण के क्रमिक चरणों को विनियमित, रहने के लिए पूरी तरह से हल हो । योगदान कारक के अलावा, epididymal अनुसंधान में अग्रिम सीमित इस ऊतक और तंत्र है कि अपनी चमकदार microenvironment पर विनियामक नियंत्रण डालती के ज्ञान की समग्र जटिलता है । Anatomically, हम जानते है कि कैपुट, कोष और cauda क्षेत्रों के भेद से परे, अधिवृषण आगे कई क्षेत्रों में विभाजित किया जा सकता है (आंकड़ा 1a), प्रत्येक सेपता12 द्वारा अलग और जीन के असतत प्रोफाइल/ अभिव्यक्ति१३,१४,१५,१६,१७,१८. दरअसल, अधिवृषण में खंड जीन अभिव्यक्ति की विस्तृत transcriptional रूपरेखा के आधार पर, के रूप में कई के रूप में 6 और 9 अलग epididymal क्षेत्रों माउस और चूहे के मॉडल में सूचित किया गया है, क्रमशः19,20। इस तरह की जटिलता संभवतः epididymal सोमा, एक pseudostratified उपकला कई अलग सेल प्रकार शामिल की संरचना को दर्शाता है; प्रत्येक उनके बहुतायत, वितरण और स्रावी/अवशोषण गतिविधियों के संबंध में पथ की लंबाई के साथ भिंन । इस प्रकार, प्रमुख कोशिकाओं द्वारा अब तक सबसे प्रचुर epididymal कोशिका प्रकार सभी उपकला कोशिकाओं के ८०% की ऊपर की ओर का गठन कर रहे हैं. तदनुसार, प्रमुख कोशिकाओं epididymal प्रोटीन के थोक के लिए जिंमेदार है और संश्लेषण5स्राव । इसके विपरीत, स्पष्ट सेल जनसंख्या, जो epididymal सोमा के भीतर दूसरी सबसे प्रचुर कोशिका प्रकार के रूप में रैंक, मुख्य रूप से चमकदार घटकों के चयनात्मक अवशोषण में शामिल है और इस microenvironment5के अंलीकरण । जटिलता का एक और स्तरीय जोड़ने, एण्ड्रोजन और वृषण मूल के अन्य lumicrine कारकों पथ के साथ उनकी स्थिति के आधार पर इन epididymal कोशिका प्रकार के प्रत्येक पर विभेदक नियंत्रण डालती.

ऐसी जटिलता द्वारा लगाए गए सीमाओं के बावजूद, महत्वपूर्ण सड़कों epididymal समारोह के यंत्रवत आधार को हल करने में किया जाना जारी है । इन अध्ययनों के लिए एक महत्वपूर्ण उंनत जन स्पेक्ट्रोमेट्री रणनीतियों के आवेदन के लिए epididymal proteome की व्यापक पैमाने पर सूची की स्थापना की गई है, मिलकर व्यक्तिगत इन प्रारंभिक सर्वेक्षणों के बीच से चयनित प्रोटीन का विस्तृत विश्लेषण के साथ । इस दृष्टिकोण का एक उदाहरण हमारे माउस मॉडल21में mechanoenzymes के DNM परिवार के हाल के लक्षण वर्णन है । हमारे DNM में प्रारंभिक ब्याज exo के युग्मन में अपनी दोहरी कार्रवाई के द्वारा ईंधन था-और endocytotic प्रक्रियाओं । इन टिप्पणियों पर निर्माण, हम प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि DNM के तीन विहित isoforms (DNM1-DNM3) अत्यधिक माउस अधिवृषण में व्यक्त कर रहे हैं और उचित रूप से प्रोटीन स्राव और अवशोषण में विनियामक भूमिकाओं को पूरा करने के लिए तैनात21 . इसके अलावा, हम स्पष्ट रूप से अपने सेलुलर और उप सेलुलर स्थानीयकरण के आधार पर प्रत्येक DNM isoform अंतर करने में सक्षम थे, इस प्रकार सुझाव है कि वे पूरक अधिकारी, के रूप में निरर्थक के खिलाफ, epididymal उपकला21के भीतर गतिविधि ।

यहां, हम प्रायोगिक अधिवृषण में DNM अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए कार्यरत पद्धति का वर्णन आशा है कि इस जानकारी के साथ वैकल्पिक epididymal प्रोटीन के लक्षण वर्णन में व्यापक आवेदन मिल जाएगा और इस तरह हमारे योगदान पुरुष प्रजनन पथ के इस महत्वपूर्ण तत्व के समारोह की समझ । विशेष रूप से, हम तेल-एंबेडेड epididymal वर्गों में लक्ष्य प्रोटीन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से इन प्रोटीन के स्थानिक वितरण के बाद का पता लगाने के लिए मजबूत पद्धति के विकास का वर्णन माइक्रोस्कोपी. हम आगे अलगाव और epididymosomes के लक्षण वर्णन के लिए अपने हाल ही में अनुकूलित प्रोटोकॉल22 दस्तावेज़; छोटे exosome-बुलबुले कि epididymal स्रावी प्रोफ़ाइल के प्रमुख तत्वों का गठन और शुक्राणु परिपक्वता23को बढ़ावा देने में एक प्रमुख भूमिका पकड़ प्रकट की तरह । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, हम भी एक नश्वर माउस कैपुट epididymal उपकला (mECap18) सेल लाइन और जिसके साथ epididymal के विनियमन का पता लगाने के लिए एक मॉडल के रूप में इस संसाधन के उपयोग में लक्ष्य प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने का वर्णन स्रावी गतिविधि इन विट्रो में

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Protocol

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सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं पशु ऊतक संग्रह शामिल है न्यूकैसल पशु देखभाल और नैतिकता समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस आयल-एंबेडेड Epididymal वर्गों के धुंधला (आंकड़े 1 और 2)

  1. सीओ2 साँस लेना (स्विस चूहों, 8 सप्ताह से अधिक पुराने) के माध्यम से वयस्क चूहों की इच्छामृत्यु के तुरंत बाद, ध्यान से काटना अधिवृषण (शल्य कैंची और चिमटी का उपयोग कर) से मुक्त कर दिया संयोजी ऊतक और वसा और Bouin के निर्धारण में विसर्जित समाधान (> दस बार रात निर्धारण के लिए मात्रा/
  2. 2 दिनों के लिए दैनिक परिवर्तन के साथ ७०% इथेनॉल के साथ ऊतक धो और फिर वर्गीकृत इथेनॉल (७०%, ९५% और घुसपैठ के लिए तैयारी में १००% और एक आयल ब्लॉक में embedding के माध्यम से निर्जलीकरण) ।
  3. धारा 4-6 µm की मोटाई पर आयल ब्लाकों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए तैयारी में स्लाइड पर माउंट ।
  4. एक धुएं डाकू में, स्लाइड जार करने के लिए पूरी तरह से ऊतक खंड (3 × 5 मिनट हर बार विसर्जित करने के लिए xylene की एक पर्याप्त राशि जोड़कर epididymal आयल वर्गों dewax) ।
  5. वर्गीकृत इथेनॉल समाधान में विसर्जन द्वारा ऊतक वर्गों rehydrat शुद्ध एच2ओ में पतला (१००% इथेनॉल 5 मिनट, १००% इथेनॉल 5 मिनट, ९०% इथेनॉल 1 मिनट, ८०% इथेनॉल 1 मिनट, ७०% इथेनॉल 1 मिनट, और ५०% इथेनॉल 1 मिनट) ।
  6. एक स्लाइड जार में एक बार पर्याप्त फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ 5 मिनट के लिए पूरी तरह से पूरे ऊतक अनुभाग में विसर्जित (सभी बाद बहाकर के लिए इन दिशाओं का पालन करें) वर्गों धो लो ।
  7. उचित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान (यानी, 10 mmol/l सोडियम साइट्रेट, ५० mmol/l Tris पीएच १०.५ या वैकल्पिक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान (ओं), antigen के आधार पर पाया जा करने के लिए) एक स्लाइड रैक और उबलते तक माइक्रोवेव में । इस समाधान में स्लाइड विसर्जित और ऊतक वर्गों के विषय के लिए गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति शर्तों व्यक्तिगत एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित ( 1 तालिकादेखें) ।
    चेतावनी: सुनिश्चित करें कि स्लाइड्स antigen पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया के दौरान antigen पुनर्प्राप्ति समाधान में पूरी तरह से डूबे हुए हैं ।
  8. स्लाइड कंटेनर को माइक्रोवेव से निकालें और कमरे के तापमान को ठंडा करें ।
  9. पंजाबियों के साथ स्लाइड कुल्ला और ऊतक अनुभाग के आसपास का पता लगाने के लिए एक तरल से बचाने वाली क्रीम मार्कर पेन का उपयोग करें ।
  10. एक humidified कंटेनर में स्लाइड प्लेस (कंटेनर के आधार पर एक गीला ऊतक के द्वारा बनाई गई), और अवरुद्ध समाधान लागू (3% BSA/पंजाब, पहले एक ०.४५ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) 1 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
  11. पंजाबियों के साथ स्लाइड एक बार कुल्ला ।
  12. फ़िल्टर 1% में एक प्रयोगात्मक अनुकूलित एकाग्रता के लिए पतला उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों की मशीन रात भर में 4 ° c BSA/रातोंरात (1:60 विरोधी के लिए DNM1, DNM2 और DNM3 एंटीबॉडी; विरोधी ATP6V1B1 एंटीबॉडी के लिए 1:100, सामग्री की तालिका देखें एंटीबॉडी विवरण के लिए) ।
    नोट: गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग से विशिष्ट अंतर करने के लिए, यह कड़े नकारात्मक (यानी, माध्यमिक एंटीबॉडी केवल, प्राथमिक एंटीबॉडी immunizing पेप्टाइड के खिलाफ अवशोषित) और सकारात्मक नियंत्रण24शामिल करने के लिए आवश्यक है ।
  13. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखकर स्लाइड को गर्म ।
  14. 10 मिनट प्रत्येक के लिए एक मिलाते हुए मंच (६० rpm) पर पंजाबियों के साथ स्लाइड 3 × धो लो ।
  15. उचित माध्यमिक 1% BSA में पतला एंटीबॉडी के साथ वर्गों की मशीन/(एक ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) 1 एच के लिए ३७ ° c में (सभी माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 1:400 कमजोर पड़ने, एंटीबॉडी विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।
    चेतावनी: इस कदम से आगे की स्लाइड कंटेनर को अंधेरे में रखें । दोहरी लेबलिंग के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी के एक संगत संयोजन का चयन (यानी, माध्यमिक एंटीबॉडी अलग प्रजातियों में उठाया गया है चाहिए).
  16. 10 मिनट प्रत्येक के लिए एक मिलाते हुए मंच (६० rpm) पर पंजाबियों के साथ स्लाइड 3 × धो लो ।
  17. Counterstain वर्गों के साथ propidium आयोडाइड (PI, ७.४८ μmol/l) या 4 ΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, ४.३७ μmol/एल) के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेल नाभिक लेबल ।
  18. 5 मिनट प्रत्येक के लिए एक मिलाते हुए मंच (६० rpm) पर पंजाबियों के साथ दो बार स्लाइड धो लो ।
  19. माउंट 10% Mowiol 4-88 ०.२ मॉल में 30% ग्लिसरॉल के समाधान में तैयार के साथ वर्गों/L Tris (पीएच ८.५) और २.५% 1, 4-diazabicyclo-( -8)-ऑक् सीजन ।
  20. नेल वार्निश के साथ coverslip सील और भविष्य अवलोकन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान ।
    सावधानी: यह प्रतिदीप्ति की अत्यधिक हानि से बचने के लिए तैयारी के बाद व्यावहारिक रूप में स्लाइड की इमेजिंग करने के लिए अनुशंसित है ।

माउस से Epididymosomes के 2 अलगाव कैपुट अधिवृषण (चित्रा 3)

  1. सह के माध्यम से वयस्क चूहों की इच्छामृत्यु के तुरंत बाद2 साँस लेना (स्विस चूहों पर 8 सप्ताह पुराना), perfuse के साथ अपने vasculature (पूर्व ३७ ° c करने के लिए गर्म) epididymal ऊतक के रक्त के संक्रमण को कम करने के लिए.
    चेतावनी: रक्त प्लाज्मा exosomes, जो epididymosomes25के समान आकार के होते है की विविध आबादी शामिल हैं । epididymal ऊतक से रक्त निकासी की प्रभावकारिता प्रारंभिक खंड के निरीक्षण के माध्यम से पहुँचा जा सकता है, एक उच्च संवहनी epididymal खंड कैपुट खंड के लिए समीपस्थ स्थित (यानी, 1 क्षेत्र में चित्र 1a)
  2. ध्यान से काटना वसा और संयोजी ऊतक के अधिवृषण मुक्त, और संशोधित बड़े, Whitten, और Whittingham मध्यम (BWW; पीएच ७.४, ३०० परासरणीयता के mmol/किलो पानी26,27) के साथ कुल्ला करने के लिए सतह के लिए किसी भी क्षमता को कम रक्त संदूषण ।
  3. दाग epididymal ऊतक अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए, काटना कैपुट अधिवृषण (यानी, 2-5 क्षेत्रों में चित्र 1a) और एक ताजा पेट्री डिश (३५ × 10 मिमी) BWW माध्यम से युक्त करने के लिए स्थानांतरण । सुनिश्चित करें कि मध्यम की मात्रा अंतिम वसूली के लिए पर्याप्त है ।
    नोट: 6 कैपुट epididymides के लिए, यह माध्यम के १.१ मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ~ ९०० µ एल की वसूली के लिए अनुमति देते हैं, जो तो समान रूप से विभाजित है और 2 पूर्व तैयार ढाल की लालबत्ती लागू (चरण २.९ देखें) ।
  4. एक उस्तरा ब्लेड के साथ कैपुट ऊतक में छोटे चीरा के एक नंबर बनाओ । ऊतक भरती नहीं है और इस तरह अत्यधिक cytosolic सामग्री के साथ नमूना दूषित से बचने । चमकदार सामग्री जारी करने के लिए 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर हल्के आंदोलन के साथ ऊतक युक्त प्लेट की मशीन ।
  5. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए ७० µm झिल्ली के माध्यम से परिणामी निलंबन फ़िल्टर ।
  6. इकट्ठा छानने का आदेश और सेलुलर मलबे को खत्म करने के क्रम में वृद्धि वेग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार केंद्रापसारक कदम करने के लिए इस विषय (यानी, ५०० × g, २,००० × g, ४,००० × g, ८,००० × g, 5 प्रत्येक मिनट; 20 मिनट के लिए १७,००० × जी , और अंत में १७,००० × g एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए या जब तक कोई गोली के बाद गठन किया है ।
    चेतावनी: यह ंयूनतम रक्त संदूषण सुनिश्चित करने के लिए प्रारंभिक ५०० × जी केंद्रापसारक कदम के बाद गोली के रंग का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है वर्तमान है । जिसमें इस गोली गुलाबी रंगाई प्रदर्शित करता है किसी भी नमूने त्यागें ।
  7. निरंतर iodixanol ग्रेडिएंट तैयार करना (४०% शामिल करना, 20%, 10%, 5% परतें) कमजोर द्वारा एक घनत्व ढाल मध्यम (शामिल ६०% (डब्ल्यू/वी) जलीय iodixanol) के समाधान के साथ ०.२५ मॉल/l सुक्रोज और 10 mmol/l Tris (पीएच ७.५) ।
  8. एक ultracentrifuge ट्यूब में ढाल तैयार (11 × ३५ mm), ४५० µ एल के प्रत्येक अंश के साथ (चित्रा 3) । नेत्रहीन प्रत्येक अंश के आवेदन के बाद ढाल का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि इंटरफेस सफलतापूर्वक प्रत्येक परत के बीच epididymal द्रव नमूना लदान से पहले का गठन कर रहे हैं । प्रत्येक ढाल के उपयोग के दिन पर ताजा तैयार है, तथापि, epididymal चमकदार द्रव नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है 2 के लिए ज लोड करने से पहले ।
  9. सावधानी epididymal चमकदार द्रव निलंबन के ४५० µ एल जोड़ने (3 epididymides के कैपुट से एकत्र सामग्री के लिए इसी) एक ढाल के लालबत्ती ।
  10. १६०,००० × g पर ग्रेडिएंट्स को 4 ° c में 18 ज के लिए Ultracentrifuge ।
    चेतावनी: चूंकि इस केंद्रापसारक बहुत उच्च गति से आयोजित किया जाता है, सभी ultracentrifuge ट्यूबों और बनती चाहिए संतुलित ठीक है । ट्यूबों की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे किसी भी दिखाई क्षति है कि उनकी अखंडता समझौता सकता से मुक्त कर रहे हैं ।
  11. धीरे 12 बराबर भागों को हटाने (प्रत्येक १८५ µ एल से मिलकर) ऊपरवाला परत से शुरू करने और ढाल के नीचे की ओर प्रगति । यदि लागू हो (दो ग्रेडिएंट तक), तो प्रत्येक ग्रेडिएंट से बराबर भिंन अंश को पूल करें ।
    नोट: माउस epididymosomes सबसे उच्च भागों में समृद्ध कर रहे हैं 9-1122, चित्रा 4 और चर्चा देखें.
  12. वसूली और 9 अंश के पूलिंग के बाद-11, पंजाब के 2 मिलीलीटर में पतला है, और 3 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १००,००० × जी में नमूनों ultracentrifuge (13 × ५६ mm ट्यूब) के लिए epididymosomes गोली ।
    चेतावनी: चूंकि epididymosome गोली देखने के लिए मुश्किल हो सकता है, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूबों के उंमुखीकरण के रूप में वे रोटर में रखा जाता है और मार्क ट्यूब epididymosome गोली की उंमीद की स्थिति को इंगित करने के लिए उल्लेख किया है । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब एक पर्याप्त मात्रा में शामिल है (यानी, अपनी कुल क्षमता का ५०% से अधिक) को ट्यूब पतन के जोखिम बाधा ।
  13. ध्यान से महाप्राण और epididymosome गोली परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  14. epididymosome शुद्धता (चित्रा 4) का आकलन करें ।
  15. बहाव आवेदन (ओं) के अनुसार वांछित माध्यम में epididymosome गोली resuspend । उदाहरण के लिए, BWW माध्यम आम तौर पर शुक्राणु के साथ सह-मशीन या वैकल्पिक रूप से proteome के माध्यम से epididymal एसडीएस के समाधान के लिए तैयारी में एक उचित lysis बफर-पृष्ठ शामिल प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है ।

3. mECap18 कोशिकाओं के दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. बाँझ coverslips की तैयारी (एक सेल संस्कृति हुड में आयोजित किया जा करने के लिए)
    1. coverslips सोख 10 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में (12 × 12 मिमी) और एक इथेनॉल लैंप के ऊपर उच्च तापमान के तहत सुखाने से संक्रमित ।
    2. एक 12 अच्छी थाली में स्थानांतरित करने से पहले 10 एस के लिए coverslip ठंडा ।
    3. coverslip को कवर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए बाँझ पाली-एल-lysine समाधान लागू करें ।
    4. पाली-L-lysine समाधान छोड़ें और coverslip को बाँझ एच2ओ या उपयुक्त माध्यम से कुल्ला करें ।
  2. तैयारी mECap18 कक्ष
    1. 2 × 10 अच्छी तरह से coverslips युक्त थाली के प्रत्येक कुआं में5 mECap18 कोशिकाओं के aliquots गद्यांश ।
    2. संस्कृति mECap18 सेल मध्यम के साथ कोशिकाओं (DMEM 1% के साथ पूरक-glutamine, 1% सोडियम पाइरूवेट, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और ५० μmol/L 5 α-androstan-17β-राजभाषा-3-oneC-IIIN) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FBS) युक्त एक वातावरण के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 5% सीओ2 रात भर ।
    3. एक बार कोशिकाओं coverslip का पालन करने के लिए, मध्यम त्यागें और पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं कुल्ला ।
    4. पूरे coverslip विसर्जित और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पंजाब में पतला 4% paraformaldehyde (पीएफए) की एक पर्याप्त राशि जोड़ें ।
    5. पीएफए समाधान छोड़ें और coverslips को दो बार पंजाबियों में कुल्ला करें ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. Permeabilize 10 मिनट के लिए पंजाब में ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० में विसर्जन द्वारा mECap18 कोशिकाओं ।
    2. coverslips को पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
    3. 3% BSA के साथ mECap18 कोशिकाओं को ब्लॉक और epididymal ऊतक वर्गों के लिए वर्णित उन लोगों के लिए समकक्ष प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं के immunolabeling के साथ आगे बढ़ना ।

4. वातानुकूलित कोशिका संस्कृति माध्यम से प्रोटीन का अलगाव

  1. वातानुकूलित कोशिका संस्कृति माध्यम का संग्रह
    1. 4 × 105 mECap18 कोशिकाओं के aliquots बीतने के साथ mECap18 सेल मध्यम के साथ 6 अच्छी प्लेट की एक अच्छी तरह से 24 घंटे के लिए 10% FBS के पूरक ।
    2. अवशिष्ट FBS और किसी भी संबद्ध प्रोटीन दूषित पदार्थों को निकालने के लिए mECap18 सेल मीडियम (FBS के बिना तैयार) के साथ तीन बार mECap18 कोशिकाओं को धोएं ।
    3. mECap18 सेल मध्यम के १.५ मिलीलीटर जोड़ें (FBS के बिना तैयार) के लिए एक अच्छी तरह से और एक 37 डिग्री सेल्सियस के तहत 5% सह2में 12 एच के लिए mECap18 कोशिकाओं के साथ गर्मी ।
      नोट: इस कदम पर mECap18 कोशिकाओं प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अलग लक्ष्य प्रतिजनों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।
    4. 12 एच मशीन के बाद, सेल मध्यम इकट्ठा और 10 मिनट के लिए २,००० × जी में सभी सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए केंद्रापसारक ।
      ध्यान दें: मशीन की अवधि के अनुसार प्रयोगात्मक डिजाइन/समापन बिंदु आकलन और सेल की सहनशीलता के विचार में लागू उपचार (ओं) के लिए बदल सकता है । यह विशेष प्रायोगिक परहेजों पर आधारित है कि इष्टतम परिणाम प्राप्त कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए मशीन के समय दर्जी की सिफारिश की है ।
    5. एक मानक trypan नीले अपवर्जन परख28के आवेदन के माध्यम से mECap18 सेल व्यवहार्यता का आकलन करें । मृत या मरणासन्न कोशिकाओं से जारी प्रोटीन द्वारा शुरू पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए सभी सामग्री में जो कोशिका व्यवहार्यता ९०% से नीचे गिरावट आई है त्यागें ।
    6. इस प्रकार के रूप में सेल माध्यम से प्रोटीन को अलग या संरक्षित मध्यम-८० ° c ।
  2. प्रोटीन अलगाव (एक धुएं डाकू में आयोजित किया जाना है)
    1. ठंडा १००% trichloroacetic एसिड की मात्रा के लिए वातानुकूलित कोशिका मध्यम के ८०% की मात्रा को जोड़ने के लिए प्रसंस्कृत mECap18 कोशिकाओं से जारी प्रोटीन हाला । लगातार मिश्रण के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    2. इस मशीन के बाद, गोली (17, 000 × जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के केंद्रापसारक द्वारा प्रोटीन उपजी ।
      नोट: के कारण प्रोटीन की सीमित मात्रा में मध्यम में स्रावित होने की उंमीद है, यह संभव है कि गोली आसानी से केंद्रापसारक के बाद visualized नहीं होगा । इसलिए यह जरूरी है कि सही ढंग से ट्यूब मालूम से पहले और देखभाल करने के लिए supernatant को हटाने के दौरान गर्भवती गोली स्थान परेशान नहीं ले ।
    3. supernatant त्यागें और दो बार ठंडा एसीटोन के साथ गोली धोने से पहले पुनः-केंद्रापसारक (17, 000 × जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) ।
    4. ध्यान से हटाने और हवा से पहले supernatant त्याग-एक धुएं हुड के भीतर किसी भी अवशिष्ट एसीटोन सूख ।
    5. अंतिम बिंदु विश्लेषण के लिए तैयार करने में एक उचित निष्कर्षण बफर में प्रोटीन गोली resuspend पूरा स्रावी प्रोटीन प्रोफाइल और/या व्यक्तिगत लक्ष्य प्रोटीन (जैसे, एसडीएस-पृष्ठ, immunoblotting) का पता लगाने के लिए ।

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Representative Results

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चित्रा 1 और चित्रा 2 दिखाएं प्रतिनिधि DNM के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण के परिणाम माउस में कैपुट अधिवृषण । तीन DNM isoforms में से प्रत्येक की जांच की अलग स्थानीयकरण प्रोफाइल प्रदर्शन । इस प्रकार, DNM1 प्रारंभिक क्षेत्र और कैपुट अधिवृषण (चित्रा 2a) भर में epididymal कोशिकाओं के अपेक्षाकृत मामूली फैलाना लेबलिंग की विशेषता है । इसके विपरीत, DNM2 isoform पहले प्रारंभिक क्षेत्र में कोशिकाओं के विरोध बेसल और शिखर सीमा के आसपास के क्षेत्र में पाया गया था, आसन्न बहाव कैपुट खंड के भीतर कोशिकाओं में supranuclear डोमेन की स्थिति होने से पहले (यानी, जोन 2-5) (चित्रा 1बी, सी) । विशेष रूप से, तथापि, DNM2 की तीव्रता लेबलिंग धीरे-2 क्षेत्रों के बीच कैपुट अधिवृषण, एक परिणाम है कि अनिवार्य रूप से इन epididymal खंडों21 (चित्रा 1बी, सी) के स्रावी गतिविधि दर्पण के 5 से कम है । तदनुसार, DNM2 के supranuclear लेबलिंग बाद में कैपुट प्रिंसिपल कोशिकाओं21के भीतर Golgi तंत्र के वितरण के अनुरूप दिखाया गया था । शुक्राणु एक ही epididymal क्षेत्र से पृथक DNM2 (चित्रा 1 डी) के लिए तीव्र acrosomal लेबलिंग दिखाया । एक चेतावनी के रूप में, तथापि, समकक्ष DNM2 लेबल नियमित रूप से हमारे ऊतक वर्गों के भीतर चमकदार शुक्राणु पर नहीं पाया गया । इस घटना को हम कई जब विभिंन epididymal/शुक्राणु एंटीजन लक्ष्यीकरण की एक श्रृंखला लागू करने के अवसरों पर का सामना करना पड़ा है और संभवतः प्रतिजन प्रस्तुति और/या में मास्किंग से जुड़े मुद्दों के कारण पैदा होती है आयल-एंबेडेड ऊतक वर्गों । किसी भी मामले में, इस तरह के मतभेदों को epididymal ऊतक के साथ ही अलग शुक्राणु के समानांतर immunofluorescent लेबलिंग के आयोजन के महत्व पर जोर । दोनों DNM1 और DNM2 से भिंन है, DNM3 isoform मुख्य रूप से शिखर उपकला कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के कैपुट डोमेन में पता चला था (चित्रा 2बी, हरे तीर), सह द्वारा स्पष्ट सेल उप जनसंख्या के अनुरूप करने के लिए दिखाए गए थे-लेबल मान्यता प्राप्त स्पष्ट सेल मार्कर के साथ, ATP6V1B1 (चित्रा बी., लाल तीर). एक समान तरीके से, प्रतिनिधि मार्करों कि अलग epididymal उपकला कोशिका प्रकार अंतर के लिए उपयुक्त साबित कर दिया है तालिका 229,30,31 में संक्षेप हैं , ३२ , ३३ , ३४.

epididymal उपकला के भीतर रहने वाले प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण के लिए तकनीक के वर्णन के अलावा, यहाँ, हम भी स्रावी प्रोटीन के भीतर समझाया के अध्ययन के लिए हमारे हाल ही में अनुकूलित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट epididymosomes, छोटे extracellular बुलबुले कि चमकीले वातावरण शुक्राणु परिपक्वता और भंडारण22के समर्थन के लिए जिंमेदार का एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं । संयुक्त, चरण 2 और 3 चित्रा माउस कैपुट epididymal ऊतक से epididymosomes के अत्यधिक समृद्ध आबादी के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया पद्धति के कदम खाते द्वारा एक विस्तृत कदम प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, तथापि, इन तरीकों को आसानी से अधिक बाहर epididymal क्षेत्रों से उद्भव epididymosomes की वैकल्पिक आबादी के अलगाव के लिए लागू कर रहे हैं । इन नमूनों की संदूषण के लिए क्षमता के कारण, हम भी कड़े लक्षण वर्णन प्रोटोकॉल है कि हम नियमित रूप से प्रत्येक epididymosome तैयारी के लिए रोजगार का वर्णन किया । इन दोनों उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और गतिशील प्रकाश बिखरने तकनीक का उपयोग कर epididymosome आबादी के आकार और विविधता का आकलन शामिल हैं । मिलकर, हम भी immunoblotting रणनीतियों का उपयोग करने के लिए मांयता प्राप्त extracellular पुटिका मार्करों और प्रोटीन की इसी अनुपस्थिति के संवर्धन का आकलन है कि संभावित संदूषणों की विशेषता है (यानी, विरोधी हीमोग्लोबिन (HBB) के रूप में एक रक्त संदूषण और विरोधी arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) और विरोधी IZUMO1 एंटीबॉडी के मार्कर के रूप में cytoplasmic छोटी बूंद और शुक्राणु संदूषण, क्रमशः)22के मार्कर । यद्यपि हमने पाया है कि संदूषण दुर्लभ हैं, यदि वे सामना कर रहे हैं, हम तुरंत epididymosome तैयारी त्यागें ।

कैपुट अधिवृषण में DNM isoforms के गैर-अतिव्यापी स्थानीयकरण epididymal microenvironment को विनियमित करने में उनकी संभावित भूमिकाओं की एक और जांच के लिए प्रेरित किया । इस प्रयोजन के लिए, एक अमर mECap18 सेल लाइन के रूप में एक इन विट्रो मॉडल epididymal सेल स्रावी गतिविधि का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया था । इस सेल लाइन के पिछले लक्षण वर्णन से पता चला है कि यह एक मिश्रित सेल जनसंख्या, जो या तो प्रधानाचार्य या स्पष्ट सेल मार्कर के लिए सकारात्मक दाग बंदरगाह । इसके अलावा, mECap18 कोशिकाओं को भी epididymal जीन और विभिंन इन विट्रो उपचार परहेजों के तहत प्रोटीन अभिव्यक्ति की शारीरिक प्रोफाइल रिपोर्टिंग के लिए उपयुक्त सिद्ध किया है३५। उपयोग करने से पहले, DNM स्थानीयकरण को इन पाली-एल-lysine इलाज coverslips (चित्रा 5) पर बसने और उंहें इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने के लिए विषय द्वारा संस्कृतिपूर्ण mECap18 कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया था । वितरण कैपुट epididymal ऊतक वर्गों में दर्ज पैटर्न के अनुरूप, DNM1 mECap18 कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य भर में पाया गया था, जबकि DNM2 इन कोशिकाओं के supranuclear डोमेन के भीतर केंद्रित था और DNM3 असतत द्वारा विशेषता थी एक छोटे उप जनसंख्या संख्या (यानी, mECap18 कोशिकाओं जो ATP6V1B1 सकारात्मक (चित्रा 5B) थे की 11% के भीतर झिल्ली धुंधलाना के घावों । इन आंकड़ों में mECap18 सेल लाइन की उपयोगिता के रूप में epididymal सेल स्रावी/अवशोषण गतिविधि को विनियमित करने में DNM की भूमिका की जांच के लिए एक मूल्यवान संसाधन की पुष्टि ।

तदनुसार, चरण 4 mECap18 सेल स्रावी गतिविधि के विश्लेषण के लिए पद्धति का वर्णन; तकनीक है जो मोटे तौर पर विभिंन प्रायोगिक स्थितियों की एक सीमा के प्रभाव का आकलन करने के लिए उत्तरदाई हैं । हमारे अध्ययन में, हमने DNM1 और DNM2 की गतिविधि को दबाने के लिए चुनिंदा औषधीय हस् तक्षेपों को लागू किया है और mECap18 कोशिकाओं से वातानुकूलित मध् य में जारी प्रोटीन के प्रोफ़ाइल का ठहराव। इस विश्लेषण की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, तथापि, यह सुनिश्चित करना है कि mECap18 कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोया और FBS पूरकता के अभाव में संस्कृति थे । Whilst इस तरह के एक कदम FBS व्युत्पंन प्रोटीन के साथ वातानुकूलित माध्यम के संदूषण बाधा आवश्यक था, यह फिर भी नकारात्मक mECap18 कोशिका विकास और/या व्यवहार्यता को प्रभावित करने के परिचर जोखिम वहन करती है । इस संभावना के लिए नियंत्रित करने में, हमने कहा कि mECap18 सेल लाइन सहन FBS मुक्त संस्कृति और हमारी गर्मी खिड़की की अवधि के लिए DNM अवरोधकों का परिचय (यानी, 12 ज) । दरअसल, इस समय पाठ्यक्रम पर, सेल व्यवहार्यता सभी प्रयोगात्मक प्रतिकृति में ९०% से ऊपर रह गया । इस दृष्टिकोण इसलिए एक उपयोगी सबूत की अवधारणा रणनीति के रूप में काम करने के लिए जीन हेरफेर रणनीतियों में निवेश करने से पहले विशिष्ट epididymal प्रोटीन के समारोह की पहचान सकता है ।

गर्मी प्रेरित epitope पुनर्प्राप्ति समाधान 10 mmol/एल सोडियम साइट्रेट ५० mmol/L Tris (pH १०.५)
समय 3 min 3 min
6 min 6 min
9 min 9 min
12 min 12 min

सारणी 1 : तेल-एंबेडेड epididymal वर्गों के साथ प्रयोग के लिए गर्मी प्रेरित प्रतिजन लाने के अनुकूलन के लिए सामांय शर्तें । निर्धारण की प्रक्रिया अलग epitopes के रूप में समस्याग्रस्त किया जा सकता है अक्सर विभिंन निर्धारण तकनीक के उपयोग की आवश्यकता होती है, जिससे necessitating कि कार्यप्रणाली प्रत्येक प्रतिजन के लिए अनुकूलित है ।

उपकला कोशिका प्रकार वितरण मार्कर सन्दर्भ (PMID)
प्राचार्य प्रकोष्ठ पूरे अधिवृषण AQP9 ११०२७५९९, १७३६०६९०
कक्ष साफ़ करें कैपुट, कॉर्पस और cauda वी-ATPases, सीआईसी-5 १९४४८०८४, १२४७५७६३
बेसल सेल पूरे अधिवृषण CLDN1 १११५९८५९, २१४४१४२३
संकीर्ण सेल आरंभिक सेगमेंट वी-ATPases, सीआईसी-5 १९४४८०८४, १२४७५७६३

सारणी 2 : प्रतिनिधि मार्करों विभिन्न प्राथमिक epididymal उपकला कोशिका प्रकार का पता लगाने के लिए उपयुक्त.

Figure 1
चित्रा 1: समीपस्थ माउस अधिवृषण के भीतर DNM 2 के स्थानिक अभिव्यक्ति । (एक) अधिवृषण के योजनाबद्ध मॉडल में माउस अधिवृषण पर विभाजन का चित्रण 10 क्षेत्रों शारीरिक रूप से अलग सेपता के रूप में टर्नर और सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट20। इस मॉडल में, क्षेत्र 1 प्रारंभिक खंड से संबंधित है, क्षेत्रों 2-5 कैपुट अधिवृषण करने के लिए संगत, क्षेत्र 6-7 के अनुरूप कॉर्प्स अधिवृषण और 8-10 क्षेत्रों cauda अधिवृषण प्रतिनिधित्व करते हैं । (बी-सी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण DNM2 का पता चला क्षेत्र-विशिष्ट वितरण पैटर्न (सफेद arrowhead और तीर द्वारा दर्शाया) । क्षेत्र 1 और 2 के बीच की सीमा एक डॉटेड रेखा या पीले तीरों द्वारा चिह्नित द्वारा demarcated है । (घ) DNM2 भी कैपुट अधिवृषण से पृथक शुक्राणु के पेरि-acrosomal डोमेन में व्यक्त की गई है. तथापि, ऐसा कोई दाग नियमित रूप से इसी epididymal वर्गों के भीतर चमकदार शुक्राणु में पता चला था । ep, उपकला कोशिकाओं; एल, लुमेन; नेग, माध्यमिक एंटीबॉडी ही नियंत्रण. प्रयोग तीन पशुओं और प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से सामग्री पर दोहराया गया प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: माउस कैपुट अधिवृषण में DNM 1 और DNM 3 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन । (क) DNM1३६ के स्थानीयकरण की जांच माउस कैपुट अधिवृषण में की गई थी. (ख) DNM3३६ का सह-स्थानीयकरण और स्पष्ट कक्ष मार्कर, माउस कैपुट अधिवृषण में ATP6V1B1३७ . इस विश्लेषण ने पुष्टि की है कि दोनों DNM3 (हरे तीर) और ATP6V1B1 (लाल तीर) स्पष्ट सेल उप जनसंख्या में रहते हैं, लेकिन कम उप सेलुलर ओवरलैप प्रदर्शित करते हैं । ep, उपकला कोशिकाओं; int, interstitium; एल, लुमेन; सपा, शुक्राणु; नेग, माध्यमिक एंटीबॉडी ही नियंत्रण. सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained थे । प्रयोग तीन पशुओं और प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से सामग्री पर दोहराया गया प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आइसोलेशन माउस कैपुट epididymosomes के संवर्धन के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध । विच्छेदन के बाद, कैपुट epididymal ऊतक BWW मध्यम और incised की एक छोटी बूंद में विसर्जित कर दिया है चमकदार सामग्री जारी करने के लिए । चमकदार द्रव तो एक ७० µm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर्ड है और परिणामी निलंबन के क्रम में किसी भी अवशिष्ट कोशिका मलबे गोली में वृद्धि वेग पर केंद्रापसारक है । साफ निलंबन तो एक सतत घनत्व ढाल (iodixanol समाधान) के ऊपर भरी हुई है और रात भर ultracentrifugation के अधीन । अंशों में Epididymosomes विभाजन 9-11, जो परित, पंजाब में कमजोर पड़ने के माध्यम से धोया और Epididymosomes गोली ultracentrifuge को लौट रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: epididymosome शुद्धता का आकलन । ढाल के ultracentrifugation के बाद बारह बराबर अंश बरामद किए गए और प्रत्येक के लिए तैयार की गई एक aliquot (ए) प्रोटीन और आरएनए ठहराव, (ख) आकार विविधता आकलन गतिशील प्रकाश कैटरिंग का उपयोग करके, और (ग) epididymosome मार्कर वितरण का immunoblot विश्लेषण । अतिरिक्त लक्षण वर्णन कदम शामिल (घ) एल्डिहाइड/सल्फेट लेटेक्स मोतियों पर epididymosomes केंद्रित की दोहरी लेबलिंग, (ङ) पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी आकलन, और (च) शुक्राणु का immunoblot आकलन (शुक्राणु) और लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) या तो विरोधी arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, cytoplasmic छोटी बूंद/शुक्राणु संदूषण) या विरोधी हीमोग्लोबिन (HBB, आरबीसी संदूषण) का उपयोग करके संदूषण । Immunoblots भी ज्ञात epididymosome कार्गो के साथ जांच की थी (26S proteasome गैर ATPase विनियामक उपइकाई 7, PSMD7; हीट शॉक प्रोटीन 90kDa बीटा सदस्य 1, HSP90B1; और बीटा tubulin, TUBB) । इन आंकड़ों को मूल रूप से वैज्ञानिक रिपोर्टों में प्रकाशित किया गया (PMID: २७५४९८६५) और प्रकाशक, स्प्रिंगर प्रकृति की अनुमति के साथ यहां reproduced किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: mECap18 कोशिकाओं में DNM isoforms के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने वितरण पैटर्न कि कैपुट epididymal ऊतक में पाया उन लोगों के साथ समझौते का पता चलता है. (क) बाँझ mECap18 कोशिका संस्कृति के लिए coverslip तैयारी की योजनाबद्ध. (ख) DNM के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों का पता चला सेलुलर वितरण पैटर्न (तीर और इनसेट (DNM3 और स्पष्ट सेल मार्कर ATP6V1B1 की दोहरी लेबलिंग)) कि epididymal ऊतक वर्गों के भीतर का पता लगाया उन दर्पण । कक्ष नाभिक या तो propidium आयोडाइड (PI; red) या DAPI (नीला) से counterstained थे । प्रयोग तीन पशुओं और प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से सामग्री पर दोहराया गया प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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ये अध्ययन है Bouin तय epididymal ऊतक कि आयल embedding और मानक अनुभाग प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था के उपयोग शामिल हैं । Bouin के निर्धारण समाधान formaldehyde, picric एसिड और एसिटिक एसिड का एक मिश्रण शामिल है, प्रत्येक घटक एक विशिष्ट और पूरक समारोह होने के साथ । इस प्रकार, formaldehyde प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए प्रोटीन पार के फार्म का लिंक, picric एसिड धीरे ऊतक के गठन लवण और इसलिए बुनियादी प्रोटीन और इसके विपरीत के जमावट प्रवेश, एसिटिक एसिड तेजी से ऊतक प्रवेश और जमावट का कारण बनता है न्यूक्लिक एसिड होता है । इन संयुक्त संपत्तियों रूपात्मक विस्तार के संरक्षण के लिए पसंद के एक निर्धारण के रूप में दिनोंदिन Bouin है और इसका इस्तेमाल व्यापक रूप से epididymal साहित्य में सूचित किया है । हालांकि, Bouin समाधान अपनी सीमाओं के बिना नहीं है, जो निर्धारण प्रेरित प्रतिदीप्ति के लिए और formaldehyde प्रेरित पार-जोड़ने जो मुखौटा लक्ष्य एंटीजन मई के लिए प्रवृत्ति शामिल हैं ।

पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति आवश्यक के लिए क्षमता का उपयोग करें कड़े नकारात्मक नियंत्रण है, जो हमारे अध्ययन में प्राथमिक एंटीबॉडी की चूक, माध्यमिक एंटीबॉडी की चूक और शामिल हैं, जहां रिएजेंट उपलब्ध हैं, प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग immunizing पेप्टाइड से जो वे उत्पंन किए गए थे के खिलाफ अवशोषित । ऐसे नियंत्रणों के आवेदन का विवरण हमारे पिछले अध्ययन में dynamin DNM अभिव्यक्ति के माउस अधिवृषण21में उदाहरण हैं. आदर्श रूप में, इस तरह के परिणाम भी नॉकआउट पशुओं से व्युत्पंन ऊतक के उपयोग के माध्यम से मान्य किया जाना चाहिए, तथापि, यह सामग्री हमेशा आसानी से उपलब्ध नहीं है । के लिए पार से द्वितीयक समस्या का मुकाबला करने की मांग में जुड़े या रासायनिक संशोधित लक्ष्य प्रतिजनों, यह अक्सर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के कुछ फार्म का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है क्रम में epitopes द्वारा बदल निर्धारण और इस तरह एंटीबॉडी के लिए अपनी क्षमता को बहाल बाइंडिंग. कार्यप्रणाली के लिए प्रयोग किया जाता है़ लक्ष्य प्रतिजन, एंटीबॉडी, टिशू टाइप, और निर्धारण की विधि सहित कई चरों पर निर्भर करता है. हालांकि, सबसे व्यापक रूप से अपनाया तकनीक या तो गर्मी की मध्यस्थता या proteolytic प्रेरित प्रतिजन पुनः प्राप्ति के आवेदन सुविधा । immunoreactivity बहाल करने के लिए एक उच्च सफलता दर के कारण हमारे इष्ट दृष्टिकोण के रूप में पूर्व सुविधाएं, गर्मी परहेजों और पुनर्प्राप्ति समाधान हम आमतौर पर उपयोग के विवरण के साथ 1 तालिका में प्रलेखित किया जा रहा है । हम सावधानी हालांकि, कि इस से कोई एक विस्तृत सूची का मतलब है और अंततः प्रत्येक प्रोटीन लक्ष्य के लिए प्रतिजन पुनः प्राप्ति के अनुकूलन/एंटीबॉडी संयोजन प्रारंभिक समय, तापमान, और पीएच संयोजन के एक मैट्रिक्स का उपयोग कर अध्ययन की आवश्यकता है । अतिरिक्त विचार गर्मी लाने के लिए संभावित ऊतक क्षति और/या कारण artefactual लेबल के लिए लाना शामिल है । इस प्रकार, ऊपर प्रलेखित नकारात्मक नियंत्रण के आवेदन के अलावा, हम भी नियमित रूप से इस तरह के विरोधी के रूप में एंटीबॉडी की विशेषता, सकारात्मक नियंत्रण शामिल Golgin-९७, जो अलग सेलुलर organelles पहचान.

स्थापित करने के लिए कि क्या इस तरह के DNM परिवार से संबंधित उन के रूप में प्रोटीन की मांग बेमानी, के रूप में पूरक का विरोध किया, epididymal ऊतक में कार्य, हम इसे विशेष रूप से उन लोगों के रूप में दोहरी लेबलिंग प्रयोगों प्रदर्शन जानकारीपूर्ण पाया है चित्रा बीमें सचित्र । इस रणनीति प्राथमिक एंटीबॉडी के जोड़े के साथ ऊतक वर्गों के अनुक्रमिक लेबलिंग शामिल (विभिन्न प्रजातियों में उठाया) विभिन्न fluorophores के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित पीछा किया. हालांकि, एक विशेषता है कि कभी कभार इन दोहरी लेबलिंग अध्ययन करने की मांग में उठता है antigen पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इष्टतम लेबलिंग के लिए आवश्यक की असंगति है । यह सीमा DNM के सह लेबलिंग के मामले में सामना करना पड़ा था 2 और Golgin-९७ माउस कैपुट अधिवृषण में, हमारे लगातार धारावाहिक वर्गों का उपयोग करने के लिए अग्रणी (के रूप में एक ही अनुभाग के खिलाफ)21. फिर भी, इन तरीकों के या तो pseudostratified epididymal उपकला में प्रतिनिधित्व उन लोगों के बीच एक विशेष कोशिका प्रकार के लिए ascribing प्रोटीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में अत्यंत उपयोगी होते हैं. मन में इस लक्ष्य के साथ, हम epididymal tubule की लंबाई के साथ प्रतिनिधि सेल प्रकार मार्करों और उनके रिपोर्ट वितरण पैटर्न की एक सूची शामिल है ( 2तालिका ) । जब एक के लिए सेल प्रकार से परे जाने के लिए और लक्ष्य प्रोटीन के उपसेलुलर वितरण का पता लगाने के लिए शुरू इच्छाओं, ऐसे Golgin-९७ के रूप में मांयता प्राप्त organelle मार्करों के साथ दोहरी लेबलिंग का उपयोग करते हैं, अलग लाभ प्रदान करता है । वैकल्पिक रूप से, immunogold लेबलिंग के साथ मिलकर उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन विस्तृत ultrastructural स्थानीयकरण और धुंधला पैटर्न के सत्यापन के लिए पसंद की विधि बनी हुई है इम्यूनोफ्लोरेसेंस 21 का उपयोग कर हासिल .

epididymosomes के अध्ययन से उत्पंन सीमाओं के अलावा उनके छोटे आकार और विस्तृत अंत बिंदु विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने की कठिनाई, विशेष रूप से आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला प्रजातियों में ऐसे माउस के रूप में कर रहे हैं । हालांकि, सुलिवान और सहयोगियों३८,३९,४०के अग्रणी अध्ययन पर कैपिटल द्वारा, हम गया है माउस मॉडल से epididymosome अलगाव के लिए मजबूत पद्धति का अनुकूलन करने में सक्षम (2 कदम देखें) । हम तनाव करते हैं, तथापि, के लिए कड़े नियंत्रण थोपने की जरूरत समृद्ध epididymosome आबादी४१ शुक्राणु, cytoplasmic बूंदों और/या रक्त जनित exosomes से संभावित संदूषण के कारण का मूल्यांकन करने के लिए और शारीरिक विशेषताओं ( चित्रा 4देखें) । इस प्रयोजन के लिए, हम नियमित रूप से का एक संयोजन का उपयोग करें: (i) उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी आकार और epididymosome तैयारी के विविधता कल्पना, (द्वितीय) मतलब कण आकार और विविधता की गणना (iii) एकाग्रता की epididymosomes पर 4 µm एल्डिहाइड/सल्फेट लेटेक्स मोती और मांयता प्राप्त exosome सतह मार्करों की फ्लोरोसेंट लेबलिंग, CD9 और FLOT1 सहित, और (iv) प्रयोगात्मक के लिए अनुशंसित एंटीबॉडी के एक सुइट के साथ अलग immunoblotting के epididymosomes exosomes की मांयता (जैसे, विरोधी CD9, विरोधी FLOT1), साथ ही साथ नकारात्मक नियंत्रण प्रतिजनों कि शुक्राणु (विरोधी IZUMO1), शुक्राणु cytoplasmic बूंदों (विरोधी ALOX15), या रक्त (विरोधी HBB) के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए के लिए इसी22। यदि इन मानकों से मुलाकात कर रहे हैं, तो epididymosome तैयारियां अलग शुक्राणु के साथ सह-मशीन सहित बहाव अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए आसानी से उत्तरदाई है और/या कार्गो रूपरेखा विश्लेषण22,४२, दोनों जिनमें से epididymal शुक्राणु1परिपक्वता को विनियमित करने में epididymosomes की भूमिका की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं ।

इस अध्ययन में, हम एक SV40-अमर माउस कैपुट epididymal उपकला (mECap18) सेल लाइन है, जो हम DNM epididymal गतिविधि21 के विनियमन में स्रावी की भागीदारी के साथ ही प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया है के आवेदन का वर्णन epididymal फिजियोलॉजी४३पर पर्यावरणीय विषालु । mECap18 सेल लाइन की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि यह मार्ग के बीच phenotypic स्थिरता प्रदर्शित करता है और दोनों प्रिंसिपल और स्पष्ट कोशिकाओं21,३५,४४के एक प्रतिनिधि जनसंख्या सुविधाएं । प्राथमिक epididymal सेल संस्कृतियों की तुलना में, mECap18 सेल लाइन भी भ्रूण बछड़ा सीरम मुक्त माध्यम है, जो अवधि और प्रयोगात्मक हस्तक्षेप इन कोशिकाओं को उजागर किया जा सकता है की प्रकृति का विस्तार में संवर्धन को सहिष्णुता प्रदर्शित करता है, whilst भी जा रहा है वातानुकूलित माध्यम से स्रावित प्रोटीन की एक उच्च बहुतायत उबरने के स्वतंत्र । mECap18 सेल लाइन की एक सीमा है, तथापि, यह है कि यह अमर हो गया है और इस प्रकार तनाव और/या प्रतिरक्षा से संबंधित उत्तेजनाओं के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया कर सकते है कि प्राथमिक सेल संस्कृतियों या vivo मेंमौजूद उन कोशिकाओं की तुलना में । मन में इस सीमा के साथ, यह mECap18 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए vivo प्रतिक्रियाओं में जब भी संभव प्राप्त परिणामों की तुलना करने के लिए सिफारिश की है. संक्षेप में, प्रोटोकॉल हम वर्णन एक उपकरण है जिसके साथ कैपुट अधिवृषण के भीतर लक्ष्य प्रोटीन की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए शुरू करने के लिए के रूप में इस सेल लाइन की उपयोगिता पर प्रकाश डाला । वास्तव में, वाणिज्यिक प्रोटीन अवरोधकों और/या जीनोम-संपादन उपकरण (जैसे CRISPR-Cas9) के उपयोग के साथ संयोजन में, mECap18 सेल लाइन epididymal समारोह के यंत्रवत आधार को हल करने में मदद करने के लिए काफी क्षमता रखती है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस काम के समर्थन के लिए नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल ऑफ ऑस्ट्रेलिया प्रोजेक्ट ग्रांट APP1103176 को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

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References

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Epididymal प्रोटीन संश्लेषण और स्राव का विश्लेषण
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Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).More

Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

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