Summary
هنا، نحن تقرير توطين الفلورة دينامين لتوضيح البروتوكولات للكشف عن البروتينات في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين الماوس وتلك الخلية البربخيه مخلدة خط (mECap18). ونحن أيضا وصف البروتوكولات من أجل عزل البروتينات الافرازية من السوائل البربخيه وخلية مكيفة وسائل الإعلام.
Abstract
البربخ الثدييات يولد واحد من السوائل intraluminal أعقد من أي الغدة الصماء بغية دعم الخصية بعد نضوج وتخزين المني. وينشأ هذا التعقيد نظراً لنشاط الخلايا الظهارية بطانة افرازية والاستيعابية مجتمعة. هنا، يمكننا وصف تقنيات لتحليل البروتين البربخيه وإفراز بالتركيز على نموذج الأسرة البروتين من ميتشانوينزيميس دينامين (الإدارة)؛ جتباسيس الكبيرة التي لديها إمكانات لتنظيم الاتجار الأحداث غشاء ثنائي الاتجاه. لدراسة التعبير البروتين في الأنسجة البربخيه، يمكننا وصف منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عن طريق مجهر الفلورة. ونحن أيضا وصف المنهجية الأمثل لعزل وتوصيف اكسوسومي مثل حويصلات، المعروفة باسم ابيديديموسوميس، وهي تفرز في التجويف البربخيه للمشاركة في الاتصالات بين الخلايا مع نضوج الخلايا المنوية. كنهج تكميلي، يصف لنا أيضا كشف الفلورة البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب خلد SV40 ماوس. وعلاوة على ذلك، فإننا نناقش الأداة خط الخلية mECap18 كنموذج مناسب في المختبر لاستكشاف تنظيم نشاط افرازي البربخيه معها. لهذا الغرض، يصف لنا تثقيف متطلبات الصيانة خط الخلية mECap18 واستخدام أنظمة انتقائية تثبيط الدوائية القادرة على التأثير على بروتين افرازي الشخصية. سهولة تقييم هذه الأخيرة عن طريق الحصاد مكيفة الثقافة المتوسطة، وتركيز البروتينات يفرز عن طريق ترسيب حمض التريكلوروسيتيك/الأسيتون وتحليلها لاحقاً عبر الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting. نؤكد أن هذه الأساليب مجتمعة مناسبة لتحليل الأهداف البديلة البروتين البربخيه تمهيدا لتحديد دورها الوظيفي في نضوج الحيوانات المنوية و/أو تخزين.
Introduction
المني من جميع أنواع الثدييات اكتساب القدرة على عرض الحركة التقدمية إلى الأمام وتسميد البويضة خلال تلك النسب المطول عن طريق البربخ، منطقة متخصصة للغاية من النظام الذكور مجرى الهواء خارج الخصية، التي قد 7-14 يوما للتنقل (تبعاً للأنواع الأحيائية)1. بسبب التكثيف الشديد من الكروماتين الأب وسفك معظم السيتوبلازم الذي يصاحب سيتوديفيرينتييشن المني في الخصيتين، مدفوعة نضج الفنية اللاحقة حصرا بتفاعلها مع المكروية البربخيه. هذا الوسط، يخلق بدوره، بنشاط سوما البربخيه بطانة افرازية والاستيعاب ويعرض مستوى استثنائي من تباين الجزء-الجزء1. وهكذا، الجزء الأكثر نشاطا من حيث البروتين وإفراز تلك الواقعة في الجزء الأقرب من البربخ (أي نصيب الفرد والاحضار)2. هذا النشاط يعكس الشخصية الوظيفية للمني، مع بداية أول الخلايا لعرض السمات المميزة للاختصاص الوظيفي (أي.، الحركة التقدمية، والقدرة على ربط حمض سولوبيليزيد زونا glycoproteins) التالية على المرور عبر البربخ نصيب3. هذه السمات الفنية مواصلة تطوير قبل الوصول إلى المستويات المثلى كما الحيوانات المنوية تصل إلى الجزء البربخيه القاصي (كودا)، حيث يتم تخزينها في حالة هادئة في الاستعداد للقذف. تكوين وصيانة هذا الخزان في تخزين الحيوانات المنوية يرتبط ارتباطاً وثيقا أيضا ظهارة بطانة، التي يهيمن عليها النشاط الاستيعابية قوية4،5في كودا. رغم الاختلافات التشريحية عنها6،،من78، يبدو أن هذه الشعبة أقاليميا للعمل سمة من سمات البربخ مشترك بين معظم أنواع الثدييات ودرس بالتاريخ، بما في ذلك الخاصة بنا9،10. في الواقع، من وجهة نظر سريرية، فمن المعروف أن الخلل البربخيه يجعل مساهمة هامة إلى المسببات عامل الذكور العقم11، ومن ثم تسليط الضوء على أهمية فهم تنظيم هذه الأنسجة المتخصصة.
ولذلك فمن المؤسف أن فهمنا البربخيه علم وظائف الأعضاء، والآليات التي تنظم مراحل متتابعة لنضوج الحيوانات المنوية وتخزينها داخل هذا النسيج، لا يزال يتم حلها بالكامل. من بين العوامل المساهمة، هي تحد من التقدم في البحوث البربخيه الشاملة تعقد هذا النسيج ومعرفة الآليات التي تمارس التحكم به المكروية لومينال التنظيمية. تشريحيا، ونحن نعلم أن وراء تمييز شرائح نصيب والاحضار وكاودا، يمكن تقسيم في البربخ كذلك إلى عدة مناطق (الشكل 1A)، كل فصل بواسطة سيبتا12 وتتميز بالتشكيلات الجانبية منفصلة من الجينات/البروتين التعبير13،،من1415،16،،من1718. في الواقع، على أساس مفصلة النسخي التنميط التعبير الجيني القطاعي في البربخ وأبلغ ما يصل إلى 6 و 9 مناطق البربخيه متميزة في نماذج الماوس وفار، على التوالي19،20. هذا التعقيد يفترض أن يعكس تكوين سوما البربخيه، ظهارة بسيودوستراتيفيد تتألف من العديد من أنواع الخلايا المختلفة؛ كل اختلاف فيما يتعلق بأنشطتها الوفرة والتوزيع والافرازيه/الاستيعاب على طول المسالك. وهكذا، هي الخلايا الرئيسية حتى الآن الأكثر وفرة خلية البربخيه نوع التي تشكل ما يزيد عن 80 في المائة من كافة الخلايا الظهارية. وبناء على ذلك، الخلايا الرئيسية المسؤولة عن الجزء الأكبر من البروتين البربخيه الحيوي وإفراز5. وفي المقابل، السكان الخلية واضحة، وهي مرتبة حسب نوع الخلية الثانية الأكثر وفرة داخل سوما البربخيه، أساسا تشارك في انتقائية امتصاص مكونات لومينال وتحمض هذا المكروية5. إضافة مستوى آخر من التعقيد، الاندروجين وغيرها من العوامل لوميكريني من أصل الخصية تمارس سيطرة التفاضلية على كل نوع من أنواع هذه الخلية البربخيه اعتماداً على تحديد المواقع على طول المسالك.
على الرغم من القيود التي تفرضها هذه الدرجة من التعقيد، تواصل نجاحات كبيرة إلى حل أساس الميكانيكية للدالة البربخيه. مفتاح لهذه الدراسات تم تطبيق استراتيجيات متقدمة الطيف الكتلي لإنشاء قوائم جرد واسعة النطاق من البروتين البربخيه، بالترادف مع تحليلات مفصلة للبروتينات الفردية يختارون من بين هذه الدراسات الأولية. مثال على هذا النهج هو لدينا توصيف الأخيرة لعائلة ميتشانوينزيميس في نموذج الفأر21ازدحاما. كان يغذيها اهتمامنا الأولى ازدحاما العمل المزدوج في الاقتران أكسو-والعمليات اندوسيتوتيك. وبناء على هذه الملاحظات، كنا قادرين على إثبات أن isoforms المتعارف عليه ثلاثة من ازدحاما (DNM1-DNM3) أعرب عن درجة عالية في البربخ الماوس والمتمركزة على النحو المناسب للوفاء بأدوار تنظيمية في إفراز البروتين وامتصاص21 . وعلاوة على ذلك، كنا قادرين على التمييز بوضوح كل isoform ازدحاما على أساس بهم التعريب الخلوية ودون الخلوية، مما يشير إلى أن لديهم متكاملة، بدلاً من نشاط زائدة عن الحاجة، داخل ظهارة البربخيه21.
وهنا، يمكننا وصف المنهجية التجريبية المستخدمة لدراسة التعبير ازدحاما في البربخ الماوس مع الأمل في أن هذه المعلومات سوف تجد تطبيقها على نطاق أوسع في توصيف البروتينات البربخيه البديلة والمساهمة بالتالي في موقعنا فهم وظيفة هذا العنصر الهام من المسالك التناسلية الذكور. على وجه التحديد، يمكننا وصف وضع منهجية قوية لوسم الفلورة البروتينات المستهدفة في الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين والكشف عن اللاحقة للتوزيع المكاني لهذه البروتينات عبر الفلورة الفحص المجهري. ونحن كذلك الوثيقة بروتوكولات مؤخرا الأمثل لدينا22 لعزل وتوصيف ابيديديموسوميس؛ حويصلات اكسوسومي مثل الصغيرة التي تشكل العناصر الرئيسية للشخصية الافرازية البربخيه والاحتفاظ بدور بارز في تعزيز نضوج الحيوانات المنوية23على ما يبدو. كنهج تكميلي، ونحن أيضا وصف الفلورة الكشف عن البروتينات المستهدفة في خط خلية الظهارية البربخيه (mECap18) نصيب مخلدة ماوس واستخدام هذا المورد كنموذج لاستكشاف تنظيم البربخيه نشاط افرازي في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على جمع الأنسجة الحيوانية جامعة نيوكاسل للعناية بالحيوان ولجنة الأخلاقيات.
1-الفلورة تلطيخ الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين (الشكلان 1 و 2)
- مباشرة بعد القتل الرحيم للفئران الكبار عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 (الفئران السويسرية، ما يزيد على 8 أسابيع من العمر)، بعناية تشريح البربخ (باستخدام المقص الجراحي وملاقط) مجاناً تغمر الأنسجة الضامة والدهون وتزج في مثبت في بوين الحل (> عشرة إضعاف حجم/الأنسجة الوزن) للتثبيت بين عشية وضحاها.
- تغسل الأنسجة مع الإيثانول 70% مع التغييرات × 2 يوميا لمدة يومين ويذوي ثم عن طريق الإيثانول متدرج (70%، 95% و 100%) استعدادا لعمليات التسلل وتضمينها في كتلة بارافين.
- الفرع كتل البارافين في سمك من 4-6 ميكرون وجبل على الشرائح استعدادا لتلطيخ الفلورة.
- في غطاء دخان، دو الفروع البربخيه البارافين بإضافة كمية كافية من زيلين نفط لجره الشريحة تماما تزج قسم الأنسجة (3 × 5 دقيقة في كل مرة).
- ترطيب أقسام الأنسجة بالانغماس في حلول الإيثانول متدرج المخفف في تنقية ح2س (الإيثانول 100% 5 دقيقة، الإيثانول 100% 5 دقيقة، الإيثانول 90% 1 دقيقة، الإيثانول 80% 1 دقيقة، الإيثانول 70% 1 دقيقة، والإيثانول 50% 1 دقيقة).
- أغسل المقاطع في جرة شريحة مرة واحدة لمدة 5 دقائق مع كافية الفوسفات مخزنة المالحة (بي بي سي) تزج تماما المقطع كامل الأنسجة (اتبع هذه التوجيهات لجميع يغسل اللاحقة).
- صب حل استرجاع مستضد المناسبة (أي.، 10 سترات الصوديوم mmol/لتر أو mmol/لتر pH تريس 10.5 اﻷض استرجاع مستضد البديلة، اعتماداً على مستضد يتم الكشف عن 50) إلى حامل الشرائح والميكروويف حتى الغليان. تزج الشرائح في هذا الحل، ورهنا بأقسام الأنسجة الناجمة عن الحرارة مستضد استرجاع الظروف الأمثل لأجسام الفردية (انظر الجدول 1).
تنبيه: تأكد من أن الشرائح تكون مغمورة تماما في حل استرجاع مستضد أثناء عملية استرداد مستضد. - إزالة الحاوية الشريحة من الميكروويف وباردة بدرجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني واستخدام قلم ماركر شريحة سائل طارد لتتبع حول المقطع الأنسجة.
- ضع الشرائح في وعاء هوميديفيد (الذي أنشأته ترطب أنسجة في قاعدة الحاوية)، وتطبيق حظر الحل (3% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني، سابقا تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) ح 1 في 37 درجة مئوية.
- شطف الشرائح مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الفروع مع جسم الأساسي المناسب المخفف بتركيز أمثل تجريبيا في المصفاة 1% لجيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (1:60 لمكافحة--DNM1، DNM2، و DNM3 الأجسام المضادة؛ 1: 100 للأجسام المضادة-ATP6V1B1، انظر "الجدول للمواد" للحصول على تفاصيل جسم).
ملاحظة: لتمييز محددة من جسم غير محددة ملزمة، من الضروري أن تشمل السلبية الصارمة (أي.، جسم الثانوي الأساسي فقط، وجسم بريابسوربيد ضد تحصين الببتيد) و24من عناصر إيجابية. - ريوارم الشرائح عن طريق وضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أغسل × الشرائح 3 مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق.
- احتضان الفروع مع جسم الثانوي المناسب المخفف في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (التي تمت تصفيتها من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر) في 37 درجة مئوية ح 1 (تخفيف 1: 400 لجميع الأجسام المضادة الثانوية، انظر الجدول للمواد لتفاصيل جسم).
تنبيه: إبقاء الحاوية الشريحة في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا. لوضع العلامات المزدوجة، اختر مجموعة متوافقة من الأجسام المضادة الثانوية (أي.، الأجسام المضادة الثانوية يجب أن أثيرت في الأنواع المختلفة). - أغسل × الشرائح 3 مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق.
- كونتيرستين الأقسام مع يوديد propidium (PI، 7.48 μmol/لتر) أو 4΄، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 4.37 μmol/لتر) لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسمية نواة الخلية.
- يغسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني على منصة تهز (60 لفة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
- تحميل المقاطع بنسبة 10% على استعداد موويول 4-88 في حل والغليسيرول 30% في 0.2 mol/L تريس (pH 8.5) و 2.5% 1، 4--ديازابيسيكلو--(2.2.2)-أوكتان.
- ختم ساترة مع مسمار الورنيش وتخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية للمراقبة مستقبلا.
تنبيه: من المستحسن القيام تصوير الشرائح أقرب وقت ممكن عمليا بعد إعداد لتجنب فقدان المفرط للأسفار.
2 عزل ابيديديموسوميس من البربخ نصيب الماوس (الشكل 3)
- مباشرة بعد القتل الرحيم للفئران الكبار عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 (الفئران السويسرية القديمة أكثر من 8 أسابيع)، نتخلل بهم المفرج مع برنامج تلفزيوني (قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) للتقليل من تلوث الدم البربخيه الأنسجة.
تنبيه: تحتوي بلازما الدم على السكان متنوعة من اكسوسوميس، وذات حجم مماثل إلى ابيديديموسوميس25. كفاءة إزالة الدم من الأنسجة البربخيه يمكن الوصول إليها عن طريق التفتيش على الجزء الأول، يقع قطعة البربخيه vascularized العالية الدانية للجزء المتعلق بنصيب الفرد (أي.، المنطقة 1 في الشكل 1A) - تشريح البربخ خالية من الدهون السطحية والنسيج الضام، وشطف مع المعدل المتوسط بيجيرس ويتون ويتنجهام (BWW؛ ودرجة الحموضة 7.4، أوسمولاليتي من 300 ميللي مول/كغ المياه26،27) بعناية للحد من أي احتمال للسطح تلوث الدم.
- لطخة الأنسجة البربخيه لإزالة الوسائط الزائدة، وتشريح البربخ نصيب الفرد (أي.، مناطق 2-5 في الشكل 1A) ونقل إلى طبق بتري طازجة (35 × 10 مم) التي تحتوي على BWW المتوسطة. ضمان أن يبلغ متوسطة كافية للاسترداد النهائي.
ملاحظة: ل 6 نصيب ابيديديميديس، من المستحسن استخدام 1.1 مل المتوسط للسماح باسترداد ~ 900 ميليلتر، ثم يتم بالتساوي تقسيم وتطبق فوق 2 التدرجات المعدة مسبقاً (راجع الخطوة 2.9). - جعل عدد من شقوق صغيرة في الأنسجة نصيب مع شفرة حلاقة. لا تخطر على الأنسجة وبالتالي تجنب تلويث العينة مع محتويات سيتوسوليك المفرطة. احتضان اللوحة التي تحتوي على الأنسجة بالانفعالات معتدل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للإفراج عن محتويات لومينال.
- تصفية بتعليق ما ينجم عن ذلك من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لإزالة الحطام الخلوية.
- جمع فيلتراتي ورهنا بهذه الخطوات المتعاقبة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية مع زيادة السرعة من أجل إزالة الحطام الخلوية (أي.، 500 × ز2,000 × ز× 4,000 ز، 8,000 × ز،، 5 دقيقة كل؛ 000 17 × ز لمدة 20 دقيقة، وأخيراً 17,000 × ز 10 دقائق إضافية أو حتى يتم تشكيل لا بيليه بعد الطرد المركزي).
تنبيه: من المهم تقييم لون بيليه بعد خطوة الطرد المركزي ز 500 × أولية للتأكد من تلوث الدم الحد الأدنى الحالي. تجاهل أي عينات الذي يعرض هذا بيليه التلون الوردي. - إعداد التدرجات إيوديكسانول متقطع (تضم 40%، 20%، 10%، 5% الطبقات) بإضعاف كثافة متوسطة متدرجة (التي تضم 60% (w/v) مائي إيوديكسانول) مع حل 0.25 mol/L السكروز و 10 ملمول/لتر تريس (درجة الحموضة 7.5).
- إعداد التدرج في أنبوب أولتراسينتريفوجي (11 × 35 ملم)، مع كل جزء من 450 ميليلتر (الشكل 3). فحص التدرج بصريا بعد تطبيق كل جزء لضمان أن الواجهات تتشكل بنجاح بين كل طبقة قبل تحميل عينة السائل البربخيه. إعداد كل الطازجة التدرج في يوم الاستخدام، ومع ذلك، يمكن الحفاظ على عينة السائل لومينال البربخيه عند 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 حاء قبل التحميل.
- إضافة 450 ميليلتر البربخيه لومينال السوائل تعليق (المقابلة للمواد التي تم جمعها من نصيب فرد ابيديديميديس 3) قمة التدرج واحدة بعناية.
- أولتراسينتريفوجي التدرجات في × 160,000 ز في 4 درجات مئوية عن ح 18.
تنبيه: حيث يجري هذا الطرد المركزي بسرعة عالية جداً، جميع ultracentrifuge الأنابيب يجب إقران ومتوازنة تماما. فحص الأنابيب التأكد من أنها خالية من أي ضرر مرئية التي يمكن أن تهدد سلامتهم. - إزالة بلطف الكسور تساوي 12 (يتألف كل منهما من 185 ميليلتر) بدءاً من الطبقة العلوية وتتقدم باتجاه الجزء السفلي من التدرج. تجمع الكسور يعادل تعافي من كل التدرج إذا أمكن (التدرجات يصل إلى اثنين).
ملاحظة: انظر الماوس ابيديديموسوميس هي الأكثر التخصيب في22من الكسور 9-11، الرقم 4 ، والمناقشة. - بعد الانتعاش وتجميع الكسور 9 – 11، يؤدي إلى تمييع العينات في 100,000 × ز في 4 درجات مئوية عن 3 ح (13 × 56 ملم أنبوب) بيليه ابيديديموسوميس إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني، وأولتراسينتريفوجي.
تنبيه: حيث يمكن أن يكون من الصعب على انظر بيليه ابيديديموسومي، ضمان أن يلاحظ اتجاه الأنابيب كما أنها توضع في الدوار ووضع علامة على أنبوب للإشارة إلى موقف بيليه ابيديديموسومي الحوامل. التأكد من أن كل أنبوب يحتوي على وحدة تخزين كافية (أي.، تتجاوز 50 في المائة قدرتها الإجمالية) يحول دون خطر انهيار أنبوب. - نضح وتجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه ابيديديموسومي بعناية.
- تقييم نقاء ابيديديموسومي (الشكل 4).
- ريسوسبيند بيليه ابيديديموسومي في المتوسط المطلوب وفقا التطبيق (التطبيقات) المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، يستخدم عادة BWW المتوسطة للتجارب التي تنطوي على الحضانة المشتركة مع المني، أو كبديل مؤقت تحلل مناسبة استعدادا لحل البروتين البربخيه عبر الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
3-الفلورة Staining من الخلايا mECap18
- إعداد كوفيرسليبس عقيمة (التي تجري بغطاء ثقافة خلية)
- نقع كوفيرسليبس (12 × 12 مم) في الإيثانول 70% لمدة 10 دقائق وتعقيمها قبل التجفيف تحت درجة حرارة عالية أعلاه مصباح إيثانول.
- كول ساترة لمدة 10 ق قبل نقل إلى لوحة جيدا 12.
- تطبيق الحل بولي-L-يسين العقيمة لتغطية ساترة وتسوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل الحل بولي-L-يسين وشطف ساترة مع العقيم ح2س أو مناسبة متوسطة.
- إعداد mECap18 الخلايا
- ممر مختبرين 2 × 105 mECap18 الخلايا في كل بئر 12 لوحة جيدا التي تحتوي على كوفيرسليبس.
- الثقافة الخلايا مع mECap18 خلية متوسطة (دميم وتستكمل مع 1% ل الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1%، 1% البنسلين/ستربتوميسين، و 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/لتر) تحتوي على العجل الجنين 10% مصل (FBS) في حاضنة 37 درجة مئوية تحت الغلاف الجوي 5% CO2 بين عشية وضحاها.
- وبمجرد الخلايا التمسك ساترة، تجاهل المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- أضف كمية كافية من 4% بارافورمالدهيد (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني أن تزج أكمله ساترة وإصلاح الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- تجاهل حل منهاج عمل بيجين وشطف كوفيرسليبس مرتين في برنامج تلفزيوني.
- تلوين الفلورة
- بيرميبيليزي الخلايا mECap18 بالانغماس في 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
- أشطف كوفيرسليبس مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة الخلايا mECap18 مع جيش صرب البوسنة 3%، والمضي قدما في إيمونولابيلينج خلايا التي تستخدم بروتوكولات مكافئة لتلك الموصوفة للفروع البربخيه الأنسجة.
4-عزل البروتينات من الخلية مكيفة الثقافة المتوسطة
- جمع خلية مكيفة الثقافة المتوسطة
- لوحة مختبرين مرور من5 × 10 4 mECap18 الخلايا في كل بئر من 6 جيدا مع mECap18 الخلية المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS ح 24.
- يغسل خلايا mECap18 ثلاث مرات مع mECap18 الخلية المتوسطة (أعدت دون FBS) لإزالة بقايا FBS وأي المرتبطة الملوثات البروتين.
- إضافة 1.5 مل من mECap18 الخلية المتوسطة (أعدت دون FBS) لكل بئر واحتضان مع خلايا mECap18 ح 12 في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.
ملاحظة: يمكن تقييم الخلايا mECap18 في هذه الخطوة المستضدات المستهدفة المختلفة وفقا للتصميم التجريبي. - بعد حضانة ح 12، جمع الخلية المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 × ز لمدة 10 دقيقة لإزالة جميع الأنقاض الخلوية.
ملاحظة: مدة حضانة المرض قادرة على تغيير وفقا لتقييم التصميم التجريبي/نقطة النهاية، واعتبار التسامح للخلية إلى treatment(s) التطبيقية. من المستحسن لتكييف توقيت الحضانة استناداً إلى أنظمة تجريبية محددة ضمان تحقيق النتائج المثلى. - تقييم جدوى خلية mECap18 عن طريق تطبيق مقايسة استبعاد معيار تريبان الأزرق28. تجاهل جميع المواد التي انخفض بقاء الخلية أقل من 90 في المائة للقضاء على التحيز القائم على الأخذ بالبروتينات أطلق سراحهم من الخلايا ميتة أو محتضرة.
- عزل البروتينات من الخلية المتوسطة كما يلي أو الحفاظ على المتوسط في-80 درجة مئوية.
- عزل بروتين (تجري بغطاء دخان)
- إضافة 20% حجم مبردة حمض التريكلوروسيتيك 100% إلى 80% حجم الخلية مكيفة المتوسطة ويعجل بالبروتينات أطلق سراحهم من الخلايا mECap18 مثقف. تبني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الخلط المستمر.
- بعد الاحتضان، بيليه بروتين سرع بالطرد المركزي (17، 000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
ملاحظة: نظراً لكمية محدودة من البروتين ومن المتوقع أن يكون يفرز في المتوسط، فإنه من الممكن أن بيليه سوف لا تصور بسهولة بعد الطرد المركزي. ولذلك من الضروري توجيه الأنبوب قبل الطرد المركزي والحرص على عدم تعكير موقع بيليه الحوامل أثناء إزالة المادة طافية بشكل صحيح. - تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مرتين مع الأسيتون المبرد قبل الطرد المركزي إعادة (17، 000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق).
- بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية قبل التجفيف أي الأسيتون المتبقية داخل غطاء دخان.
- ريسوسبيند بيليه البروتين في مخزن مؤقت لاستخراج مناسبة استعدادا لتحليل نقطة النهاية للكشف عن ملامح بروتين افرازي كاملة و/أو البروتينات المستهدفة الفردية (على سبيل المثال-، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، إيمونوبلوتينج).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 و الشكل 2 النتائج ممثلة لتوطين الفلورة ازدحاما في البربخ نصيب الماوس. بالتحقيق في كل من isoforms ازدحاما ثلاثة ملامح متميزة ومسلم عرض. وهكذا، يتسم DNM1 بوسم منتشر متواضعة نسبيا من الخلايا البربخيه طوال البربخ الجزء ونصيب الأولى (الشكل 2A). على النقيض من ذلك، إيسوفورم DNM2 اكتشف لأول مرة محيط الحدود القاعدية وقمي المتعارضة للخلايا في الجزء الأول، قبل أن يجري إعادة تحديد موضعها إلى المجال سوبرانوكلير في الخلايا داخل الجزء المتاخمة لها نصيب المتلقين للمعلومات (أي.، 2-5 مناطق) (الشكل 1ب، ج). جدير بالذكر أن بيد انخفضت كثافة DNM2 وسم تدريجيا بين مناطق 2 إلى 5 من نصيب البربخ، نتيجة أساسا يعكس نشاط افرازي من هذه القطع البربخيه21 (الشكل 1ب، ج). تبعاً لذلك، العلامات سوبرانوكلير من DNM2 كان سيظهر فيما بعد لتتوافق مع توزيع جهاز غولجي داخل الخلايا الرئيسية نصيب21. أظهر المني معزولة من نفس المنطقة البربخيه وسم أكروسومال مكثفة ل DNM2 (الشكل 1). كتحذير، إلا أن وسم DNM2 يعادل لم يتم بشكل روتيني الكشف عن في المني لومينال داخل أقسام الأنسجة لدينا. هذه الظاهرة هي واحدة وقد واجهنا في عدة مناسبات عند تطبيق مجموعة من الأجسام المضادة لاستهداف المستضدات المختلفة البربخيه/الحيوانات المنوية، ويفترض أن ينشأ بسبب القضايا المرتبطة بالعرض التقديمي مستضد و/أو إخفاء في أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين. على أي حال، هذه الاختلافات تؤكد أهمية إجراء وسم إيمونوفلوريسسينت موازية للمني معزولة جنبا إلى جنب مع الأنسجة البربخيه نفسها. يختلف عن كل من DNM1 و DNM2، تم اكتشاف DNM3 isoform أساسا في المجال قمي من عدد صغير من نصيب الخلايا الظهارية (الشكل 2ب، والأسهم الخضراء)، التي عرضت لتتوافق مع السكان الفرعية خلية واضح بالمشاركة وضع العلامات مع علامة الخلية واضحة معترف بها، ATP6V1B1 (الشكل 2B، الأسهم الحمراء). بطريقة مماثلة، وعلامات التمثيلية التي ثبت أنها مناسبة للتفريق بين أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية البربخيه يرد في الجدول 229،،من3031 , 32 , 33 , 34.
بالإضافة إلى وصف للتقنيات للتعريب سوبسيلولار البروتينات المقيمين داخل ظهارة البربخيه، هنا، نحن أيضا تقرير لدينا البروتوكولات الأمثل مؤخرا لدراسة البروتينات الافرازية مغلفة داخل ابيديديموسوميس، حويصلات خارج الخلية الصغيرة التي تمثل عنصرا هاما في الوسط لومينال مسؤولة عن دعم22نضوج وتخزين الحيوانات المنوية. جنبا إلى جنب، الخطوة 2 و الشكل 3 تقديم عرض مفصل خطوة بخطوة للمنهجية المستخدمة لعزل السكان العالي التخصيب من ابيديديموسوميس من الماوس نصيب البربخيه الأنسجة. جدير بالذكر أن هذه الأساليب غير سهولة المطبقة لعزل السكان البديل من ابيديديموسوميس التي تنشأ من شرائح البربخيه القاصي أكثر. نظراً لإمكانية تلوث هذه العينات، كما وصف البروتوكولات توصيف الصارمة التي نتبعها بشكل روتيني لكل إعداد ابيديديموسومي. وهذه تشمل تقييم حجم وعدم تجانس السكان ابيديديموسومي باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني ذات الدقة العالية وتقنيات ديناميكية تشتت الضوء. جنبا إلى جنب، نستخدم أيضا استراتيجيات إيمونوبلوتينج لتقييم في إثراء علامات حويصلة المعترف بها خارج الخلية وغياب المناظرة من البروتينات التي سمة مميزة للملوثات المحتملة (أي.، المضادة الهيموغلوبين (سداسي البروم ثنائي الفينيل) علامة تلوث الدم ومكافحة--أراتشيدوناتي 15-ليبوكسيجيناسي (ALOX15) والأجسام المضادة IZUMO1 كعلامات الحبرية هيولى وتلوث الحيوانات المنوية، على التوالي)22. على الرغم من أننا وجدنا أن الملوثات نادرة، إذا كانت تواجه، ونحن فورا تجاهل إعداد ابيديديموسومي.
الترجمة غير متداخلة من isoforms ازدحاما في البربخ نصيب المطالبة مزيد من تحقيق لأدوارهم المحتملة في تنظيم المكروية البربخيه. ولهذا الغرض، استخدمت خط خلية mECap18 مخلدة كنموذج في المختبر لدراسة نشاط الخلية البربخيه الافرازية. وصف هذا خط الخلية السابقة أظهرت أنه يأوي عدد خلايا مختلطة، الذي وصمة عار إيجابية بالنسبة لعلامات الخلية الرئيسية أو واضحة أما. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الخلايا mECap18 أيضا مناسبة للإبلاغ عن الملامح الفسيولوجية لتعبير الجينات والبروتين البربخيه تحت مختلفة في المختبر معاملة الأنظمة العلاجية35. قبل الشروع في الاستخدام، قيمت التعريب ازدحاما في الخلايا المستزرعة mECap18 قبل تسوية هذه على بولي-L-يسين كوفيرسليبس المعالجة (الشكل 5A) وإخضاعها لكشف الفلورة. تتفق مع أنماط التوزيع المسجلة في أقسام الأنسجة البربخيه نصيب الفرد، DNM1 تم الكشف عن في جميع أنحاء السيتوبلازم للخلايا mECap18، بينما كان DNM2 مركزة داخل المجال سوبرانوكلير لهذه الخلايا وقد تميزت DNM3 منفصلة البؤر غشاء تلطيخ ضمن عدد سكان الفرعية صغيرة (أي.، 11 في المائة) خلايا mECap18 التي كانت ATP6V1B1 الإيجابية (الشكل 5 (ب)). تؤكد هذه البيانات الأداة خط الخلية mECap18 موردا قيماً للتحقيق في دور الإدارة في تنظيم نشاط الخلية البربخيه الافرازية/الاستيعاب.
وبناء على ذلك، وصف الخطوة 4 منهجية لتحليل mECap18 نشاط الخلية الافرازية؛ التقنيات التي قابلة على نطاق واسع لتقييم أثر مجموعة من الظروف التجريبية المختلفة. وفي دراستنا، طبقنا التدخلات الدوائية الانتقائي لقمع نشاط DNM1 و DNM2 قبل التصور والتقدير الكمي للتشكيل الجانبي البروتينات أطلق سراحهم من الخلايا mECap18 في المتوسط مكيفة21. ومع ذلك، كان سمة هامة من هذا التحليل، ضمان دقة غسلها ومثقف في غياب مكملات FBS mECap18 الخلايا. بينما كانت هذه خطوة ضرورية للحيلولة دون تلوث المتوسط مكيفة مع البروتينات المشتقة FBS، وهو مع ذلك يحمل المخاطر المصاحبة للتأثير سلبا على نمو الخلايا mECap18 و/أو البقاء. في السيطرة على هذه الإمكانية، ولاحظنا أن الخط الخليوي mECap18 التسامح مع الثقافة الحرة FBS وإدخال مثبطات ازدحاما طوال مدة الحضانة نافذة لدينا (أي.، ح 12). وفي الواقع، خلال هذا الوقت، ظلت بقاء الخلية أعلى من 90% في جميع replicates التجريبية. ولذلك يمكن أن يكون هذا النهج استراتيجية الإثبات مفهوم مفيدة لتحديد وظيفة البروتينات البربخيه محددة قبل الالتزام بالاستثمار في استراتيجيات التلاعب بالجينات.
| الحرارة الناجمة عن حل استرجاع حانمه | سترات الصوديوم 10 ملمول/لتر | 50 mmol/لتر تريس (pH 10.5) |
| الوقت | 3 دقيقة | 3 دقيقة |
| 6 دقيقة | 6 دقيقة | |
| 9 دقيقة | 9 دقيقة | |
| 12 دقيقة | 12 دقيقة |
الجدول 1 : الشروط العامة للاستغلال الأمثل لاسترجاع مستضد الناجمة عن الحرارة للاستخدام مع الفروع البربخيه جزءا لا يتجزأ من البارافين. عملية التثبيت يمكن أن تكون أشكالاً مختلفة [ابيتوبس] غالباً ما تتطلب استخدام تقنيات التثبيت المختلفة، مما يستدعي أن المنهجية هو الأمثل لكل مستضد.
| نوع من الخلايا الظهارية | التوزيع | علامة | المراجع (PMID) |
| الخلية الرئيسية | كله البربخ | AQP9 | 11027599، 17360690 |
| خلية واضح | نصيب، الإحضار وكودا | الخامس-ATPases، وزارة الجنسية والهجرة-5 | 19448084، 12475763 |
| الخلايا القاعدية | كله البربخ | CLDN1 | 11159859، 21441423 |
| خلية ضيقة | الجزء الأول | الخامس-ATPases، وزارة الجنسية والهجرة-5 | 19448084، 12475763 |
الجدول 2 : الممثل علامات مناسبة للكشف عن أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية البربخيه الأولية.
رقم 1: التعبير المكاني 2 ازدحاما داخل البربخ الماوس الدانية. (أ) نموذج تخطيطي البربخ يصور التقسيم في البربخ الماوس إلى 10 مناطق فعلياً فصل سيتا كما أفاد تيرنر وزملائك20. في هذا النموذج، المنطقة 1 يتوافق مع الجزء الأول، 2-5 مناطق تناظر البربخ نصيب، مناطق 6-7 وتناظر البربخ الإحضار والمناطق 8-10 تمثل البربخ كودا. (ب-ج) تعريب الفلورة DNM2 كشف أنماط التوزيع الخاصة بالمنطقة (المشار إليها بالسهم والسهم الأبيض). رسمت بخط منقط الحدود بين المنطقة 1 و 2 أو النطاق المرمز إليه بواسطة الأسهم الصفراء. (د) تعرب DNM2 أيضا في مجال المني معزولة عن البربخ نصيب المناطق المحيطة أكروسومال. ومع ذلك، لا تلطيخ هذه تم اكتشاف بشكل روتيني في المني لومينال داخل الفروع البربخيه المقابلة. الجيش الشعبي، والخلايا الظهارية؛ l، والتجويف؛ الراتب، مراقبة الأجسام المضادة الثانوية فقط. تم تكرار التجارب في المواد من الحيوانات ثلاثة ويتم عرض الصور التمثيلية الفلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الكشف عن الفلورة ازدحاما 1 و 3 ازدحاما في البربخ نصيب الماوس. (أ) إضفاء الطابع المحلي على DNM136 بحثت في البربخ نصيب الماوس. (ب) الترجمة المشارك DNM336 وعلامة الخلية واضحة، ATP6V1B137 في البربخ نصيب الماوس. وأكدت هذا التحليل أن كلا DNM3 (الأسهم الخضراء) و ATP6V1B1 (الأسهم الحمراء) يقيمون في السكان الفرعية خلية واضح ولكن عرض التراكب الخلوية دون الحد الأدنى. الجيش الشعبي، والخلايا الظهارية؛ int، إينتيرستيتيوم؛ l، والتجويف؛ ليرة سورية، الحيوانات المنوية؛ الراتب، مراقبة الأجسام المضادة الثانوية فقط. وقد كونتيرستينيد نواة الخلية مع DAPI (أزرق). تم تكرار التجارب في المواد من الحيوانات ثلاثة ويتم عرض الصور التمثيلية الفلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التخطيطي لعزل البروتوكولات المستخدمة لتخصيب اليورانيوم للماوس نصيب ابيديديموسوميس. بعد التشريح، منغمسين في معالجة تجميعية متوسطة BWW نصيب البربخيه الأنسجة وقطعي للإفراج عن محتويات لومينال. ثم يتم تصفية السائل لومينال عبر غشاء ميكرومتر 70 وهو فصل تعليق الناتجة في زيادة السرعة من أجل بيليه أي حطام الخلايا المتبقية. هو تعليق المطهرة ثم تحميلها فوق التدرج كثافة متقطع (محلول إيوديكسانول) وإخضاعها تنبيذ فائق بين عشية وضحاها. قسم ابيديديموسوميس إلى كسور 9-11، التي يتم تجميعها، غسلها عن طريق التخفيف في برنامج تلفزيوني وعادوا إلى ultracentrifuge بيليه ابيديديموسوميس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تقييم للنقاء ابيديديموسومي. تم انتشال الكسور تساوي اثنا عشر بعد تنبيذ فائق التدرج وقاسمه كل استعداد للبروتين (أ) والحمض النووي الريبي الكمي، (ب) حجم تقييم التغايرية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي، و (ج). التحليل إيمونوبلوت ابيديديموسومي ماركر التوزيع. وتشمل الخطوات توصيف إضافية (د) العلامات المزدوجة من ابيديديموسوميس تتركز على الخرز مطاط ألدهيد/سلفات، (ه) نقل الميكروسكوب الإلكتروني تقييم، وتقييم immunoblot (و) من المني (الحيوانات المنوية) وخلايا الدم الحمراء (RBC) التلوث باستخدام مكافحة--أراتشيدوناتي 15-ليبوكسيجيناسي (ALOX15، وتلويث هيولى الحبرية/الحيوانات المنوية) أو الهيموغلوبين المضادة (سداسي البروم ثنائي الفينيل، تلوث ربك). كما تم سبر إيمونوبلوتس مع الشحن المعروفة ابيديديموسومي (26S بروتوزوم ATPase غير تنظيمية فرعية 7، PSMD7؛ والحرارة صدمة 90kDa البروتين بيتا الأعضاء 1، HSP90B1؛ وبيتا tubulin، توب). ونشرت هذه البيانات أصلاً في "التقارير العلمية" (PMID: 27549865) وقد استنسخ هنا بإذن الناشر، "الطابع سبرينغر". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: كشف الفلورة من isoforms ازدحاما في الخلايا mECap18 تكشف عن أنماط التوزيع تكون متوافقة مع تلك التي اكتشفت في الأنسجة البربخيه نصيب الفرد. (أ) التخطيطي لإعداد ساترة لثقافة الخلية mECap18 العقيمة. (ب) صور الفلورة الممثل ازدحاما تلطيخ أنماط التوزيع الخلوية كشفت (الأسهم واقحم (وسم المزدوج DNM3 وعلامة واضحة خلية ATP6V1B1)) التي تعكس تلك التي اكتشفت داخل الفروع البربخيه الأنسجة. وقد كونتيرستينيد نواة الخلية مع يوديد propidium (PI؛ الأحمر) أو DAPI (أزرق). تم تكرار التجارب في المواد من الحيوانات ثلاثة ويتم عرض الصور التمثيلية الفلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدرجت هذه الدراسات استخدام الأنسجة في بوين البربخيه الثابتة التي تعرضت لتضمين البارافين والبروتوكولات القياسية تقطيع. الحل مثبت في بوين تضم خليط من فورمالدهايد وحمض البكريك وحمض الخليك، مع كل مكون من مكونات لها وظيفة محددة ومتكاملة. وهكذا، والفورمالديهايد يتفاعل مع الأمينات الأولية لتشكيل متقاطعة البروتين وحمض البكريك ببطء يخترق الأنسجة تشكيل أملاح وبالتالي سرعة تخثر البروتينات الأساسية، وعلى العكس من ذلك، حمض الخليك تخترق الأنسجة ويسبب تخثر الدم من الأحماض النووية. أحدثت هذه الخصائص مجتمعة في بوين كمثبِّت للاختيار للحفاظ على التفاصيل المورفولوجية واستعماله ويقال على نطاق واسع في الأدب البربخيه. بيد أن الحل في بوين ليس دون حدوده، التي تشمل الميل ل fluorescence المستحث مثبت وفورمالدهايد التي يسببها العابرة للربط الذي قد يخفي المستضدات المستهدفة.
يتطلب إمكانات fluorescence الخلفية استخدام السلبية الضوابط الصارمة، منها في دراساتنا إغفال جسم الأولية، إغفال جسم الثانوية، والتي تتوفر فيها الكواشف، استخدام الأجسام المضادة الأولية بريابسوربيد ضد الببتيد تحصين من التي تم إنشاؤها. ومن الأمثلة على تفاصيل تطبيق هذه الضوابط في دراستنا السابقة دينامين التعبير ازدحاما في البربخ الماوس21. ومن الناحية المثالية، ينبغي أيضا المصادقة على هذه النتائج من خلال استخدام أنسجة مشتقة من الحيوانات بالضربة القاضية، ولكن هذه المواد ليست دائماً متاحة بسهولة. في سعيها للتصدي لمشكلة ثانوية المستضدات المستهدفة cross-linked أو معدلة كيميائيا، من الضروري كثيرا أن أداء بعض أشكال استرجاع مستضد بغية كشف [ابيتوبس] تم تعديلها من قبل التثبيت وهكذا استعادة قدرتها على جسم ملزمة. المنهجية المستخدمة لاسترجاع تعتمد على العديد من المتغيرات، بما في ذلك مستضد المستهدفة وجسم ونوع النسيج وطريقة التثبيت. ومع ذلك، ميزة التقنيات المعتمدة على نطاق واسع الأكثر تطبيق أما استرجاع مستضد المستحث بوساطة الحرارة أو بروتيوليتيك. الميزات السابقة نهجنا يفضل نظراً لارتفاع معدل نجاح لاستعادة إيممونوريكتيفيتي، مع التفاصيل المتعلقة بأنظمة الحرارة وحلول استرجاع نستخدم عادة يجري توثيقه في الجدول 1. ونحذر بيد أن هذه ليست بأي حال قائمة حصرية، وفي نهاية المطاف يتطلب الاستغلال الأمثل لاسترداد antigen لكل تركيبة البروتين المستهدف/جسم الدراسات الأولية باستخدام مصفوفة تركيبات الوقت ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة. وتشمل الاعتبارات الإضافية إمكانية استرجاع الحرارة الحصول على تلف الأنسجة و/أو يتسبب في وضع العلامات أرتيفاكتوال. وهكذا، بالإضافة إلى تطبيق الضوابط السلبية الموثقة أعلاه، ندمج بشكل روتيني أيضا عناصر إيجابية تتميز بالأجسام المضادة، مثل مكافحة-جولجين-97، التي تعترف العضيات الخلوية متميزة.
في السعي إلى تحديد ما إذا كانت البروتينات مثل أولئك الذين ينتمون إلى أسرة ازدحاما الوفاء زائدة عن الحاجة، بدلاً من مهام متكاملة، في الأنسجة البربخيه، وجدنا أنه مفيدة خاصة القيام بتجارب وضع العلامات مزدوجة مثل تلك ويوضح الشكل 2. وتتضمن هذه الاستراتيجية العلامات متتابعة من أقسام الأنسجة مع أزواج الأجسام الأولية (التي أثيرت في الأنواع المختلفة) تتبع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة fluorophores يضاف إلى مختلف. ميزة الخلط الذي ينشأ أحياناً في السعي لإجراء هذه الدراسات وضع العلامات المزدوجة غير عدم توافق مستضد استرجاع البروتوكولات اللازمة لوضع العلامات الأمثل مع كل جسم الأولية. تمت مصادفة هذا القيد في حالة وصفها المشترك 2 ازدحاما وجولجين-97 في البربخ نصيب الماوس، مما يؤدي بنا استخدام المقاطع المسلسل على التوالي (بدلاً من الجزء نفسه)21. ومع ذلك، أي من هذين النهجين مفيدة للغاية في سياق يرجع التعبير البروتين إلى نوع خلية معينة بين تلك الممثلة في ظهارة البربخيه بسيودوستراتيفيد. مع هذا الهدف في الاعتبار، أدرجنا قائمة بعلامات نوع الخلية الممثل وأنماط توزيع المبلغ على طول أنبوب البربخيه (الجدول 2). عند أحد يود أن يذهب إلى أبعد من نوع الخلية والبدء في استكشاف سوبسيلولار توزيع البروتينات المستهدفة، ويتيح استخدام التسمية المزدوجة مع علامات عضية المعترف بها، مثل جولجين-97، مزايا واضحة. وبدلاً من ذلك، يظل تطبيق الاستبانة الميكروسكوب الإلكتروني في جنبا إلى جنب مع وضع العلامات immunogold الأسلوب المفضل للتعريب ultrastructural مفصلة والتحقق من الصحة لتلطيخ أنماط تحقيقه باستخدام الفلورة21 .
بين التقييدات التي يفرضها دراسة ابيديديموسوميس بصغر حجمها وصعوبة الحصول على كميات كافية لإجراء تحليلات تفصيلية نقطة نهاية، لا سيما في عادة تستخدم الأنواع المختبر مثل الماوس. ومع ذلك، بالاستفادة من الدراسات الرائدة سوليفان والزملاء38،،من3940، تمكنا من تحسين منهجية قوية لعزل ابيديديموسومي من الماوس نموذج (راجع الخطوة 2). ونؤكد، مع ذلك، الحاجة إلى فرض ضوابط صارمة لتقييم والخصائص المادية ل السكان ابيديديموسومي المخصب41 بسبب التلوث المحتملة من المني، قطرات هيولى و/أو المنقولة بالدم اكسوسوميس ( انظر الشكل 4). لهذا الغرض، ونحن بشكل روتيني استخدام تركيبة من: الميكروسكوب الإلكتروني (ط) عالية الدقة لتصور حجم والتباين في إعداد ابيديديموسومي، (ثانيا) حساب الجسيمات متوسط الحجم وعدم التجانس (ثالثا) التركز سلمت ابيديديموسوميس على 4 ميكرومتر ألدهيد/سلفات مطاط الخرز ووسم الفلورسنت من علامات السطح اكسوسومي، بما في ذلك CD9 و FLOT1، وأوصت immunoblotting (رابعا) من ابيديديموسوميس معزولة مع مجموعة من الأجسام المضادة للتجريبية التحقق من صحة اكسوسوميس (مثلاً.، CD9 المضادة، ومكافحة--FLOT1)، وكذلك سلبية الضوابط المقابلة لمولدات المضادات التي ينبغي أن تقتصر على المني (مكافحة--IZUMO1)، والحيوانات المنوية قطرات هيولى (مكافحة--ALOX15)، أو الدم (مكافحة-سداسي البروم ثنائي الفينيل)22. إذا كان الوفاء بهذه المعايير، ثم التحضير ابيديديموسومي معزولة بسهولة قابلة للاستخدام في تطبيقات المتلقين للمعلومات بما في ذلك الحضانة المشتركة مع المني و/أو البضائع التنميط ويحلل42من22،، اللذين نهج قوية لتعزيز فهمنا لدور ابيديديموسوميس في تنظيم نضوج الحيوانات المنوية البربخيه1.
في هذه الدراسة، يصف لنا تطبيق على الماوس خلد SV40 نصيب خط الخلية البربخيه الظهارية (mECap18)، الذي نحن قد استخدمت لدراسة مشاركة ازدحاما في تنظيم نشاط افرازي البربخيه21 ، فضلا عن تأثير سميات البيئية في الفسيولوجيا البربخيه43. سمة هامة لخط الخلية mECap18 أن يعرض الاستقرار المظهرية بين الممرات وملامح سكان تمثيلاً لكل الخلايا الرئيسية وواضح21،35،44. مقارنة الثقافات الخلية البربخيه الأولية، كما يعرض السطر خلية mECap18 التسامح لاستزراع في مصل العجل الجنين يمكن أن يتعرض المتوسطة الحرة، التي تمتد لمدة وطبيعة التدخلات التجريبية هذه الخلايا، في حين يجري أيضا تسمح باستعادة وفرة أعلى من البروتينات يفرز من المتوسط مكيفة. تحديد خط الخلية mECap18، غير أن ذلك قد تم تخليد وهكذا قد يستجيب بشكل مختلف التأكيد على و/أو المحفزات المتصلة بجهاز المناعة مقارنة بأن الثقافات أو تلك الخلايا الحالية من الخلية الابتدائية فيفو. مع هذا القيد في الاعتبار، يوصي بمقارنة النتائج المتحصل عليها باستخدام الخلايا mECap18 للردود في فيفو كلما كان ذلك ممكناً. وباختصار، تسليط الضوء على البروتوكولات يصف لنا فائدة هذا الخط خلية كأداة للبدء في دراسة الأداء الوظيفي للبروتينات المستهدفة داخل البربخ نصيب معها. في الواقع، في تركيبة مع استعمال مثبطات البروتين التجاري و/أو أدوات تحرير الجينوم (مثل كريسبر-Cas9)، خط الخلية mECap18 يحمل إمكانات كبيرة للمساعدة على حل أساس الميكانيكية للدالة البربخيه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويود المؤلفون الاعتراف بالصحة الوطنية والطبية أبحاث المجلس من أستراليا المشروع منحة APP1103176 لدعم هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
