Summary
Qui, segnaliamo la localizzazione di immunofluorescenza della dinamina per illustrare i protocolli per il rilevamento delle proteine nelle sezioni dell'epididimo paraffina-incastonato del mouse e quelli di una linea di cellulari immortalizzate epididimaria (mECap18). Inoltre descriviamo i protocolli per l'isolamento delle proteine secretorie da sia fluido epididimario e media condizionato delle cellule.
Abstract
L'epididimo mammiferi genera uno dei fluidi intraluminale più complessi di qualsiasi ghiandola endocrina al fine di sostenere la maturazione post-testicolare e la conservazione degli spermatozoi. Tale complessità presenta dovuto l'attività secretiva e assorbente combinata delle cellule epiteliali di rivestimento. Qui, descriviamo le tecniche per l'analisi della sintesi proteica dell'epididimo e secrezione focalizzando l'attenzione sulla famiglia delle proteine modello della dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasi grandi che hanno il potenziale per regolare gli eventi traffico di membrana bi-direzionale. Per lo studio dell'espressione proteica in tessuto epididimario, descriviamo solida metodologia per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio nelle sezioni di paraffina e la successiva rilevazione della distribuzione spaziale di queste proteine tramite microscopia di immunofluorescenza. Inoltre descriviamo la metodologia ottimizzata per l'isolamento e la caratterizzazione di esosomi come vescicole, noto come epididymosomes, che sono secreti nel lume dell'epididimo di partecipare a comunicazione intercellulare con la maturazione delle cellule dello sperma. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza delle proteine bersaglio in una linea cellulare di SV40-immortalato mouse caput epididimario epiteliali (mECap18). Inoltre discutiamo l'utilità della linea cellulare mECap18 come un modello adatto in vitro con cui esplorare il regolamento di attività secretiva dell'epididimo. Per questo scopo, si descrivono i requisiti coltura per il mantenimento della linea cellulare mECap18 e l'uso di regimi di inibizione farmacologica selettiva che sono in grado di influenzare il loro profilo di proteine secretorie. Questi ultimi sono prontamente valutati tramite raccolta del medium condizionato di cultura, la concentrazione di proteine secrete tramite precipitazione di acido tricloroacetico/acetone e la loro successiva analisi tramite SDS-PAGE e immunoblotting. Sosteniamo che questi metodi combinati sono adatti per l'analisi dei bersagli proteici epididimaria alternativo come un preludio alla determinazione del loro ruolo funzionale in maturazione degli spermatozoi e/o deposito.
Introduction
Gli spermatozoi di tutte le specie di mammiferi acquisiscono il potenziale per visualizzare avanti motilità progressiva e di fecondare un ovulo durante la loro discesa prolungata attraverso l'epididimo, una regione altamente specializzata del sistema del maschio condotto extra-testicolari, che possono prendere 7-14 giorni per navigare (a seconda della specie)1. A causa della estrema condensazione della cromatina paterna e lo spargimento della maggior parte del citoplasma che accompagna il cytodifferentiation degli spermatozoi all'interno dei testicoli, la loro successiva maturazione funzionale è guidato esclusivamente dalla loro interazione con il microambiente dell'epididimo. Questo ambiente è, a sua volta, creato dall'attività secretiva e assorbente del soma epididimaria fodera e visualizza un livello eccezionale di segmenti variazione1. Così, i segmenti più attivi in termini di sintesi delle proteine e secrezione sono quelli situati nella parte prossimale dell' epididimo (vale a dire, il caput e corpus)2. Questa attività rispecchia il profilo funzionale degli spermatozoi, con l'inizio primo di celle per visualizzare i tratti distintivi di competenza funzionale (cioè., motilità progressiva e la capacità di legarsi a zona acido-solubilizzato glicoproteine) seguente loro passaggio attraverso l' epididimo caput3. Questi attributi funzionali continuano a svilupparsi prima di raggiungere i livelli ottimali come lo sperma raggiunge il segmento distale dell'epididimo (cauda), in cui sono memorizzati in stato di quiescenza nella prontezza per eiaculazione precoce. La formazione e la manutenzione di questo serbatoio di immagazzinaggio dello sperma è anche intimamente legata all'epitelio di rivestimento, che nella cauda è dominato dalla forte attività assorbente4,5. Anche se le differenze anatomiche sono stati segnalati6,7,8, tale divisione regionalizzata del lavoro sembra essere una caratteristica dell'epididimo che è condivisa tra la maggior parte delle specie di mammiferi studiato fino ad oggi, compreso il nostro9,10. Infatti, da un punto di vista clinico, è noto che la disfunzione dell'epididimo dà un importante contributo all'eziologia del fattore maschio sterilità11, evidenziando così l'importanza della comprensione della regolazione di questo tessuto specializzato.
È quindi deplorevole che la nostra comprensione della fisiologia dell'epididimo e i meccanismi che regolano le fasi sequenziale di maturazione degli spermatozoi e archiviazione all'interno di questo tessuto, rimangono per essere completamente risolto. Tra i fattori di contributo, limitanti avanzamenti nella ricerca dell'epididimo sono la complessità di questo tessuto e la conoscenza dei meccanismi che esercitano il controllo normativo sopra suo microambiente luminale. Anatomicamente, sappiamo che di là della distinzione dei segmenti caput, corpus e cauda, l'epididimo può essere ulteriormente suddivisi in diverse zone (Figura 1A), ciascuno separati da setti12 e caratterizzata da profili discreti di proteina/del gene espressione13,14,15,16,17,18. Infatti, sulla base di dettagliate profiling trascrizionale dell'espressione genica segmentale nell'epididimo, oltre 6 e 9 zone distinte dell'epididimo sono stati segnalati nei modelli di topo e di ratto, rispettivamente19,20. Tale complessità presumibilmente riflette la composizione del soma dell'epididimo, un epitelio pseudostratified composto da numerosi tipi cellulari differenti; ogni diverse rispetto alle loro attività di abbondanza, distribuzione e secretiva/assorbente lungo la lunghezza del tratto. Così, le cellule principali sono di gran lunga la più abbondante dell'epididimo cella tipo che costituisce verso l'alto di 80% di tutte le cellule epiteliali. Di conseguenza, le cellule principali sono responsabili per la maggior parte della proteina dell'epididimo biosintesi e secrezione5. Al contrario, la popolazione di cellule chiare, che si allineano come il tipo di cella secondo più abbondante all'interno del soma dell'epididimo, è principalmente coinvolti in assorbimento selettivo di luminal componenti e l'acidificazione di questo microambiente5. Aggiunta di un altro livello di complessità, androgeni e altri fattori di lumicrine di origine testicolare esercitano controllo differenziale su ciascuno di questi tipi di cellule dell'epididimo a seconda del loro posizionamento lungo il tratto.
Nonostante le limitazioni imposte da tale complessità, incursioni significative continuano a essere trasformato in risoluzione la base meccanicistica della funzione dell'epididimo. Una chiave per questi studi è stata l'applicazione di strategie avanzate spettrometria di massa per stabilire gli inventari di larga scala del proteoma dell'epididimo, in tandem con analisi dettagliate delle singole proteine scelti fra queste indagini iniziali. Un'illustrazione di questo approccio è la nostra recente caratterizzazione della famiglia DNM di mechanoenzymes nel modello del mouse21. Il nostro interesse iniziale in DNM è stato alimentato da sua duplice azione nell'accoppiamento di exo - ed endocitosi processi. Basandosi su queste osservazioni, siamo stati in grado di dimostrare che le tre isoforme di canoniche di DNM (DNM1 - DNM3) sono altamente espressi nell'epididimo del mouse e posizionate in modo appropriato per soddisfare i ruoli regolatori in proteina secrezione e assorbimento21 . Inoltre, siamo stati in grado di distinguere chiaramente ciascuna isoforma DNM sulla base della loro localizzazione cellulare e subcellulare, suggerendo così che possiedono complementari, al contrario di attività ridondanti, all'interno l' epitelio dell'epididimo21.
Qui, descriviamo la metodologia sperimentale impiegata per lo studio dell'espressione di DNM nell'epididimo del mouse con la speranza che queste informazioni saranno trovare ampia applicazione nella caratterizzazione delle proteine dell'epididimo alternativi e contribuire così alla nostra comprensione della funzione di questo importante elemento del tratto riproduttivo maschio. In particolare, descriviamo lo sviluppo di una metodologia robusta per l'etichettatura di immunofluorescenza di proteine bersaglio in paraffina sezioni dell'epididimo e il successivo rilevamento della distribuzione spaziale di queste proteine tramite immunofluorescenza microscopia. Documentiamo ulteriormente il nostro recentemente ottimizzato protocolli22 per l'isolamento e la caratterizzazione di epididymosomes; piccole vescicole di esosomi-come che costituiscono gli elementi chiave del profilo secretivo dell'epididimo e sembrano tenere un ruolo di primo piano nella promozione di maturazione degli spermatozoi23. Come un approccio complementare, descriviamo anche la rilevazione di immunofluorescenza di proteine bersaglio in una linea cellulare di topo immortalizzate caput epididimario epiteliali (mECap18) e l'uso di questa risorsa come un modello con cui esplorare il regolamento di epididimaria l'attività secretiva in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali riguardanti la raccolta di tessuto animale sono state approvate dal comitato di etica e cura degli animali dell'Università di Newcastle.
1. immunofluorescenza delle sezioni dell'epididimo paraffina (figure 1 e 2)
- Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti tramite inalazione di CO2 (topi svizzeri, oltre 8 settimane di vita), accuratamente sezionare l'epididimo (utilizzando forbici e pinzette) gratuita di sovrastante del tessuto connettivo e grasso e immergere nel fissativo del Bouin soluzione (> dieci volte il peso volume/tessuto) per la fissazione durante la notte.
- Lavare il tessuto con etanolo al 70% con 2 × cambi al giorno per 2 giorni e poi disidratare attraverso graduale etanolo (70%, 95% e 100%) in preparazione per l'infiltrazione e l'incorporamento in un blocco di paraffina.
- Sezione i blocchi di paraffina con uno spessore di 4-6 µm e Monte sugli scivoli in preparazione per colorazione di immunofluorescenza.
- In una cappa, Sparaffinatura le sezioni di paraffina epididimaria aggiungendo una quantità sufficiente di xilene per il vaso di diapositiva per immergere completamente la sezione di tessuto (3 × 5 minuti ogni volta).
- Reidratare le sezioni di tessuto tramite l'immersione in soluzioni graduali etanolo diluito in purificato H2O (etanolo 100% 5 min, 100% etanolo 5 min, 90% etanolo 1 min, 1 min, etanolo al 70% di etanolo di 80% 1 min e 50% etanolo 1 min).
- Lavare le sezioni in un barattolo di diapositiva una volta per 5 min con sufficiente tamponato fosfato salino (PBS) per immergere completamente l'intero tessuto sezione (seguire queste indicazioni per tutti i successivi lavaggi).
- Decantare la soluzione per lo smascheramento dell'antigene appropriato (cioè., 10 mmol/L sodio citrato, 50 mmol/L Tris pH 10,5 o antigene alternativi recupero soluzione/i, a seconda l'antigene per essere rilevato) in un portavetrini e forno a microonde fino a ebollizione. Immergere i vetrini in questa soluzione e le sezioni di tessuto sono soggetti alle condizioni di recupero calore-indotta dell'antigene ottimizzate per singoli anticorpi (Vedi tabella 1).
Attenzione: Accertarsi che le diapositive sono completamente immersi nella soluzione di smascheramento dell'antigene durante il processo di recupero dell'antigene. - Rimuovere il contenitore di diapositiva dal forno a microonde e raffreddare a temperatura ambiente.
- Sciacquare i vetrini con PBS e utilizzare un pennarello liquido-repellente diapositiva traccia intorno alla sezione di tessuto.
- Porre i vetrini in un contenitore umidificato (creato da un tessuto umido alla base del contenitore) e applicare la soluzione bloccante (3% BSA/PBS, precedentemente filtrata attraverso un filtro da 0,45 µm) per 1 h a 37 ° C.
- Sciacquare le diapositive una volta con PBS.
- Incubare le sezioni con appropriato anticorpo primario diluito ad una concentrazione sperimentalmente ottimizzata nel filtrato 1% BSA/PBS a 4 ° C durante la notte (1: 60 per anti-DNM1, DNM2 e DNM3 anticorpi; 1: 100 per l'anticorpo anti-ATP6V1B1, Vedi tabella materiali per i dettagli dell'anticorpo).
Nota: Per distinguere specifico da anticorpi non specifici, è necessario includere rigorosa negativo (cioè., anticorpo secondario primario, unico anticorpo preabsorbed contro immunizzare peptide) e controlli positivi24. - Riscaldare le diapositive mettendo a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare il × di diapositive 3 con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 10 minuti ciascuno.
- Incubare le sezioni con anticorpo secondario appropriato diluito in 1% BSA/PBS (filtrata attraverso un filtro da 0,45 µm) a 37 ° C per 1 h (diluizione di 1: 400 per tutti gli anticorpi secondari, Vedi Tabella materiali particolari anticorpi).
Attenzione: Tenere il contenitore di scivolo al buio da questo punto in poi. Per l'etichettatura dual, scegliere una combinazione compatibile di anticorpi secondari (cioè., anticorpi secondari devono sono stati sollevati in specie diverse). - Lavare il × di diapositive 3 con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 10 minuti ciascuno.
- Colorante di contrasto le sezioni con ioduro di propidio (PI, 7.48 μmol/L) o 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) per 2 min a temperatura ambiente per etichettare il nucleo delle cellule.
- Lavare i vetrini due volte con PBS su una piattaforma d'agitazione (60 giri) per 5 minuti ciascuno.
- Montare i profili con Mowiol 4-88 preparati in una soluzione di 30% glicerolo in 0,2 mol/L di Tris (pH 8.5) del 10% e 2.5% 1, 4 - diazabiciclo-(2.2.2)-ottano.
- Sigillare il coprioggetto con smalto e archiviare le diapositive a 4 ° C per l'osservazione futura.
Attenzione: Si consiglia di eseguire l'imaging delle diapositive appena possibile dopo la preparazione per evitare un'eccessiva perdita di fluorescenza.
2 isolamento di Epididymosomes da Mouse Caput epididimo (Figura 3)
- Immediatamente dopo l'eutanasia dei topi adulti tramite inalazione di CO2 (topi svizzeri oltre 8 settimane di vita), irrorare il loro sistema vascolare con PBS (pre-riscaldato a 37 ° C) per ridurre al minimo la contaminazione di sangue del tessuto epididimario.
Attenzione: il plasma sanguigno contiene diverse popolazioni di esosomi, che sono di dimensioni simili al epididymosomes25. L'efficacia della clearance di sangue dal tessuto epididimario sono accessibili tramite l'ispezione del segmento iniziale, un segmento epididimario altamente vascularized trova prossimale al segmento caput (cioè., zona 1 in Figura 1A) - Accuratamente sezionare l'epididimo gratuitamente sovrastante grasso e tessuto connettivo e risciacquare con modificata medio Biggers, Whitten e Whittingham (BWW; pH 7.4, osmolalità di 300 mmol/kg acqua26,27) per ridurre qualsiasi potenziale di superficie contaminazione del sangue.
- Asciugare il tessuto epididimario di rimuovere supporti in eccesso, sezionare caput epididimo (cioè., zone 2-5 in Figura 1A) e trasferimento in una capsula Petri fresco (35 × 10mm) contenenti BWW mezzo. Assicurarsi che la quantità del mezzo sia sufficiente per il recupero finale.
Nota: Per 6 caput epididimi, si consiglia di utilizzare 1,1 mL di terreno per consentire un recupero di ~ 900 µ l, che è poi uniformemente diviso e applicato in cima di 2 gradienti pre-preparati (Vedi punto 2.9). - Fare una serie di piccole incisioni nel tessuto caput con una lama di rasoio. Non tritare il tessuto e quindi evitare di contaminare il campione con eccessivo contenuto citosolico. Incubare la piastra che contiene il tessuto con lieve agitazione a 37 ° C per 30 min rilasciare il contenuto luminale.
- Filtrare la sospensione risultante attraverso 70 µm membrane per rimuovere i detriti cellulari.
- Raccogliere il filtrato e questo soggetto a passaggi successivi centrifugazione a 4 ° C con l'aumento di velocità al fine di eliminare i detriti cellulari (cioè., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min ciascuna; 17.000 × g per 20 minuti e infine 17.000 × g per altri 10 minuti o fino a quando non pellet è formata dopo la centrifugazione).
Attenzione: È importante valutare il colore della pallina dopo il passo di centrifugazione iniziale di 500 × g per garantire anima minima contaminazione è presente. Scartare qualsiasi esempi in cui questo pellet Visualizza colorazione rosa. - Preparare discontinuo di iodixanol (composto da 40%, 20%, 10%, 5% strati) diluendo un mezzo di gradiente di densità (composto da 60% (p/v) di iodixanol acquosa) con una soluzione di saccarosio di 0,25 mol/L e 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
- Preparare il gradiente in un tubo di ultracentrifuga (11 × 35 mm), con ogni frazione di 450 µ l (Figura 3). Ispezionare visivamente il gradiente dopo l'applicazione di ogni frazione per assicurare che le interfacce sono formate con successo fra ogni strato prima di caricare il campione fluido epididimario. Preparare ogni sfumatura fresco il giorno di utilizzo, tuttavia, il campione di fluido luminal dell'epididimo può essere conservato a 4 ° C per 2 h prima dell'imbarco.
- Aggiungere con cautela 450 µ l di epididimaria luminal sospensione fluido (corrispondente al materiale raccolto da caput di 3 epididimi) sulla cima di una singola sfumatura.
- Ultracentrifuga le pendenze a 160.000 × g a 4 ° C per 18 h.
Attenzione: Poiché questa centrifugazione viene condotta a velocità molto elevata, tutti ultracentrifuga tubi devono essere accoppiati e bilanciati con precisione. Verifica le provette per assicurare che essi siano privi di danni visibili che possano compromettere la loro integrità. - Rimuovere delicatamente 12 frazioni uguali (ciascuno composto da 185 µ l) a partire dal livello più alto e procedendo verso la parte inferiore della sfumatura. Piscina le frazioni equivalenti recuperate da ogni sfumatura, se applicabile (fino a due pendenze).
Nota: Mouse epididymosomes sono più altamente arricchito in frazioni 9-1122, Vedi Figura 4 e discussione. - Dopo il recupero e la messa in comune delle frazioni 9 – 11, diluire in 2 mL di PBS e ultracentrifuga i campioni alle 100.000 × g a 4 ° C per 3 h (13 × 56 mm tubo) a pellet il epididymosomes.
Attenzione: Poiché il pellet di epididymosome può essere difficile da vedere, accertarsi che l'orientamento dei tubi è noto come essi sono collocati nel rotore e contrassegnare il tubo per indicare la posizione in grande aspettativa del pellet epididymosome. Garantire che ogni tubo contiene un volume sufficiente (cioè., supera il 50% della sua capacità totale) per escludere il rischio di collasso del tubo. - Attentamente aspirare e scartare il supernatante senza disturbare il pellet epididymosome.
- Valutare la purezza di epididymosome (Figura 4).
- Risospendere il pellet di epididymosome in mezzo desiderato secondo le applicazioni a valle. Per esempio, BWW mezzo è generalmente usato per gli esperimenti che coinvolgono co-incubazione con spermatozoi o, in alternativa, un buffer di lisi appropriato in preparazione per la risoluzione del proteoma dell'epididimo tramite SDS-PAGE.
3. immunofluorescenza colorazione delle cellule mECap18
- Preparazione dei vetrini coprioggetto sterili (da effettuarsi in un cappuccio di cultura cellulare)
- Immergere i vetrini coprioggetti (12 × 12 mm) in etanolo al 70% per 10 min e disinfettare con l'essiccazione ad alta temperatura sopra una lampada di etanolo.
- Raffreddare il coprioggetto per 10 s prima di trasferire in un piatto ben 12.
- Applicare la soluzione sterile di poli-L-lisina per coprire il vetrino coprioggetto e accontentarsi di 10 min a temperatura ambiente.
- Scartare la soluzione di poli-L-lisina e sciacquare il vetrino coprioggetto con sterile H2O o del caso medio.
- Cellule di mECap18 di preparazione
- Passaggio le aliquote delle 2 cellule di mECap185 × 10 in ciascun pozzetto della piastra ben 12 contenente i coprioggetti.
- Coltura delle cellule con mECap18 cellulare medio (DMEM completate con 1% L-Glutammina, piruvato di sodio 1%, 1% di penicillina/streptomicina e 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) contenente 10% siero fetale di vitello (FBS) in un incubatore a 37 ° C in un atmosfera 5% CO2 durante la notte.
- Una volta che le cellule aderiscono al vetrino coprioggetto, eliminare il terreno e sciacquare le cellule due volte con PBS.
- Aggiungere una quantità sufficiente di paraformaldeide al 4% (PFA) diluita in PBS per immergere il vetrino coprioggetto intero e fissare le cellule a temperatura ambiente per 15 min.
- Scartare la soluzione PFA e sciacquare i vetrini coprioggetti due volte in PBS.
- Colorazione di immunofluorescenza
- Permeabilize mECap18 cellule mediante immersione in 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 min.
- Sciacquare i vetrini coprioggetti con PBS.
- Bloccare le cellule mECap18 con 3% BSA e procedere con immunolabeling di cellule che utilizzano protocolli equivalenti a quelle descritte per le sezioni di tessuto epididimario.
4. isolamento delle proteine dal mezzo di coltura cellulare condizionato
- Collezione di mezzo di coltura cellulare condizionato
- Le aliquote di passaggio di 4 cellule di mECap185 × 10 in ciascun pozzetto di 6 piastra bene con mECap18 mezzo di cellulare supplementato con 10% FBS per 24 h.
- Lavare le cellule mECap18 tre volte con mezzo di cellulare mECap18 (preparato senza FBS) per rimuovere residui FBS e qualsiasi associato contaminanti di proteina.
- Aggiungere 1,5 mL di medium di cellulare mECap18 (preparato senza FBS) ad ogni pozzetto e incubare con cellule mECap18 per 12 h in un incubatore a 37° C inferiore al 5% di CO2.
Nota: mECap18 cellule in questa fase possono essere valutate per gli antigeni di destinazione diverso secondo il disegno sperimentale. - Dopo 12 h di incubazione, raccogliere il medium cellulare e centrifugare a 2.000 × g per 10 min rimuovere tutti i detriti cellulari.
Nota: La durata dell'incubazione è in grado di essere modificati in conformità con la valutazione sperimentale di progettazione/endpoint e in considerazione di tolleranza della cella di trattamento applicato. Si consiglia di personalizzare i tempi di incubazione basato su regimi sperimentali specifici per garantire il raggiungimento di risultati ottimali. - Valutare mECap18 la vitalità cellulare tramite l'applicazione di un saggio di esclusione standard trypan blu28. Eliminare tutto il materiale in cui attuabilità delle cellule è diminuita inferiore al 90% per eliminare la discriminazione introdotta da proteine rilasciate da cellule morte o moribonde.
- Isolare proteine da medium cellulare come indicato di seguito o preservare medio a-80 ° C.
- Isolamento di proteine (da effettuarsi in una cappa aspirante)
- Aggiungere 20% del volume di refrigerati acido tricloroacetico al 100% a 80% del volume di medium condizionato delle cellule per precipitare le proteine rilasciate dalle cellule coltivate mECap18. Incubare a 4 ° C durante la notte con miscelazione costante.
- Dopo l'incubazione, pellet proteine precipitate mediante centrifugazione (17, 000 × g, 4 ° C per 10 min).
Nota: A causa della limitata quantità di proteina prevista per essere secreto nel mezzo, è possibile che il pellet non sarà facilmente visibili dopo la centrifugazione. È quindi imperativo correttamente orientare il tubo prima della centrifugazione e fare attenzione a non per disturbare la posizione della pallina in grande aspettativa durante la rimozione del surnatante. - Scartare il surnatante e lavare la pallina due volte con acetone refrigerate prima la ri-centrifugazione (17, 000 × g, 4 ° C per 10 min).
- Rimuovere con cautela e scartare il surnatante prima di essiccamento ad aria qualsiasi residuo acetone all'interno di una cappa aspirante.
- Risospendere il pellet di proteina in un tampone di estrazione appropriato in preparazione per l'analisi dell'endpoint rilevare profili proteina secretoria completa e/o proteine target individuali (ad es., SDS-PAGE, immunoblotting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1 e Figura 2 mostrano risultati rappresentativi della localizzazione di immunofluorescenza di DNM nell'epididimo caput del mouse. Ognuna delle tre isoforme DNM studiati i profili di visualizzazione localizzazione distinta. Così, DNM1 è caratterizzato da modesta etichettatura diffusa delle cellule dell'epididimo in tutto il segmento e caput dell'epididimo iniziale (Figura 2A). Al contrario, l'isoforma DNM2 è stato rilevato nei pressi della frontiera avversaria basale e apicale delle cellule nel segmento iniziale, prima di essere riposizionato al dominio supranuclear nelle cellule all'interno del segmento adiacente caput a valle (cioè., zone 2-5) (Figura 1B, C). Tuttavia, l'intensità di DNM2 etichettatura gradualmente diminuite considerevolmente, tra zone da 2 a 5 dell'epididimo caput, un risultato che rispecchia essenzialmente l'attività secretiva di questi segmenti dell'epididimo21 (Figura 1B, C). Di conseguenza, l'etichettatura supranuclear di DNM2 successivamente è stato indicato per corrispondere alla distribuzione dell'apparato di Golgi all'interno di cellule principali caput21. Gli spermatozoi isolati dalla stessa regione dell'epididimo ha mostrato intenso acrosomiali etichettatura per DNM2 (Figura 1). Come un avvertimento, tuttavia, etichettatura DNM2 equivalente non è stato regolarmente rilevato il luminal spermatozoi all'interno delle nostre sezioni di tessuto. Questo fenomeno è quello che abbiamo incontrato in diverse occasioni quando l'applicazione di una gamma di anticorpi antigeni differenti dell'epididimo/sperma di targeting e presumibilmente si pone a causa di problemi connessi con la presentazione dell'antigene e/o mascheratura nella sezioni di tessuto paraffina-incastonato. In ogni caso, tali differenze sottolineano l'importanza di condurre etichettatura immunofluorescente parallela degli spermatozoi isolati accanto a quella del tessuto epididimario stessa. Diverse da DNM1 sia DNM2, l'isoforma DNM3 pricipalmente è stato rilevato nel dominio apicale di un piccolo numero di caput cellule epiteliali (Figura 2B, frecce verdi), che sono state indicate corrispondono alla sottopopolazione di cellule chiare da co-etichettatura con il marcatore di cellule chiare riconosciuto, ATP6V1B1 (Figura 2B, frecce rosse). In modo simile, gli indicatori rappresentativi che si sono rivelati adatti per la differenziazione dei tipi differenti delle cellule epiteliali dell'epididimo sono riassunti nella tabella 229,30,31 , 32 , 33 , 34.
Oltre alla descrizione delle tecniche per la localizzazione subcellulare delle proteine che risiedono all'interno dell'epitelio dell'epididimo, qui, segnaliamo anche nostri protocolli recentemente ottimizzati per lo studio delle proteine secretorie incapsulati all'interno di epididymosomes, piccole vescicole extracellulari che rappresentano una componente importante del milieu luminal responsabile del supporto di maturazione e conservazione dello sperma22. Combinato, passaggio 2 e Figura 3 fornire un resoconto dettagliato di passo per passo della metodologia utilizzata per l'isolamento delle popolazioni altamente arricchiti di epididymosomes da tessuto epididimario di caput del mouse. In particolare, tuttavia, questi metodi sono facilmente applicabili per l'isolamento delle popolazioni alternativi di epididymosomes provenienti da segmenti più distali dell'epididimo. A causa del potenziale per contaminazione di questi campioni, abbiamo descritto anche i protocolli di caratterizzazione rigorose che impieghiamo ordinariamente per ogni preparazione di epididymosome. Questi includono la valutazione delle dimensioni e l'eterogeneità delle popolazioni epididymosome utilizzando la microscopia elettronica ad alta risoluzione e tecniche di dispersione della luce dinamica. In tandem, inoltre utilizziamo strategie di immunoblotting per valutare l'arricchimento degli indicatori riconosciuti delle vescicole extracellulari e la corrispondente assenza delle proteine che sono caratteristici di potenziali contaminanti (cioè., anti-emoglobina (HBB) come un indicatore di contaminazione sanguigna e anti-arachidonato 15-lipossigenasi (ALOX15) e gli anticorpi anti-IZUMO1 come indicatori della gocciolina citoplasmatica e contaminazione di sperma, rispettivamente)22. Anche se abbiamo trovato che i contaminanti sono rari, se vengono rilevati, scartiamo immediatamente la preparazione di epididymosome.
La localizzazione non sovrapposte delle isoforme DNM nell'epididimo caput richiesto un'ulteriore indagine del loro potenziale ruolo nel regolare il microambiente dell'epididimo. Per questo scopo, una linea di cellule immortalizzate mECap18 viene utilizzata come un modello in vitro per studiare l'attività secretiva delle cellule dell'epididimo. Descrizione precedente di questa cellula ha mostrato che ospita una popolazione di cellule miste, che macchia positive per entrambi i marcatori delle cellule principali o chiaro. Inoltre, le cellule mECap18 hanno anche dimostrato adatte per la segnalazione fisiologici profili di espressione genica e proteica dell'epididimo sotto diversi in vitro i regimi di trattamento35. Prima dell'uso, localizzazione di DNM è stata valutata in cellule coltivate mECap18 sedimentazione questi su vetrini coprioggetti trattati di poli-L-lisina (Figura 5A) e sottoponendoli a rilevazione di immunofluorescenza. Coerente con i modelli di distribuzione registrati in sezioni di tessuto epididimario caput, DNM1 è stato rilevato durante il citoplasma delle cellule di mECap18, mentre DNM2 era concentrata all'interno del dominio di supranuclear di queste cellule e DNM3 è stato caratterizzato da discreti i fuochi della membrana macchiatura entro un numero di piccola popolazione (cioè., 11%) delle cellule mECap18 che erano ATP6V1B1 positivo (figura 5B). Questi dati confermano l'utilità della linea cellulare mECap18 come una risorsa preziosa per investigare il ruolo di DNM nel regolare l'attività secretiva/assorbente delle cellule dell'epididimo.
Di conseguenza, passaggio 4 descrive la metodologia per l'analisi dell'attività secretiva delle cellule di mECap18; le tecniche che sono largamente favorevoli per valutare l'impatto di una gamma di diverse condizioni sperimentali. Nel nostro studio, abbiamo applicato gli interventi farmacologici selettivi per sopprimere l'attività di DNM1 e DNM2 prima la visualizzazione e quantificazione del profilo delle proteine rilasciata dalle cellule mECap18 condizionata media21. Una caratteristica importante di questa analisi, tuttavia, era per assicurare che le cellule mECap18 sono stati accuratamente lavate e coltivate in assenza del completamento di FBS. Mentre un tale passo era essenziale per escludere la contaminazione del medium condizionato con FBS derivato proteine, trasporta tuttavia il supervisore rischio di compromettere la crescita delle cellule di mECap18 e/o vitalità. Nel controllo per questa possibilità, abbiamo notato che la linea cellulare mECap18 tollerato FBS cultura libera e l'introduzione degli inibitori DNM per tutta la durata della nostra finestra di incubazione (cioè., 12h). Infatti, durante questo tempo, attuabilità delle cellule è rimasta superiore al 90% in tutte le repliche sperimentali. Questo approccio potrebbe quindi servire come un'utile strategia di proof-of-concept per identificare la funzione delle proteine specifiche dell'epididimo prima di impegnarsi in investimenti in strategie di manipolazione genica.
| Riscaldare la soluzione di smascheramento dell'epitopo indotto | 10 mmol/L sodio citrato | 50 mmol/L Tris (pH 10,5) |
| Tempo | 3 min | 3 min |
| 6 min | 6 min | |
| 9 min | 9 min | |
| 12 min | 12 min |
Tabella 1 : Condizioni generali per l'ottimizzazione di ricupero indotto dal calore dell'antigene per l'uso con paraffina sezioni epididimaria. Il processo di fissazione può essere problematico come epitopi diversi richiedono spesso l'uso di tecniche di fissaggio diversi, rendendo quindi necessario che la metodologia sia ottimizzata per ogni antigene.
| Tipo delle cellule epiteliali | Distribuzione | Marcatore | Riferimenti (PMID) |
| Cellule principali | Intero epididimo | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Cellule chiare | Caput, corpus e cauda | V-ATPasi, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Delle cellule basali | Intero epididimo | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Cella stretta | Segmento iniziale | V-ATPasi, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Tabella 2 : Rappresentante marcatori adatti per la rilevazione dei tipi delle cellule epiteliali dell'epididimo primario diverso.
Figura 1: espressione spaziale di DNM 2 all'interno dell'epididimo prossimale mouse. (A) modello schematico di epididimo raffigurante il partizionamento su epididimo del mouse in 10 zone fisicamente separati setti come riportato da Turner e colleghi20. In questo modello, zona 1 corrisponde al segmento iniziale, zone 2-5 corrispondono a caput epididimo, zone 6-7 corrispondono a epididimo corpus e zone 8-10 rappresentano l'epididimo di cauda. (B-C) Localizzazione di immunofluorescenza di DNM2 ha rivelato i modelli di distribuzione di zona specifica (indicati dalla freccia e freccia bianca). Al confine tra la zona 1 e 2 è delimitato da una linea punteggiata o indicato da frecce gialle. (D) DNM2 inoltre è espresso nel dominio della peri-acrosomiali degli spermatozoi isolato dall'epididimo caput. Tuttavia, nessuna colorazione ordinariamente è stata rilevata in luminal spermatozoi all'interno delle sezioni corrispondenti dell'epididimo. EP, cellule epiteliali; l, lumen; Neg, controllo solo anticorpo secondario. Gli esperimenti sono stati replicati sul materiale da tre animali e immagini rappresentative di immunofluorescenza sono presentati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rilevamento di immunofluorescenza di DNM 1 e DNM 3 nell'epididimo del mouse caput. (A) la localizzazione di DNM136 è stata esaminata nell'epididimo caput del mouse. (B) co-localizzazione di DNM336 e il marcatore di cellule chiare, ATP6V1B137 nell'epididimo caput del mouse. Questa analisi ha confermato che entrambi DNM3 (frecce verdi) e ATP6V1B1 (frecce rosse) risiedono nella sub-popolazione cellule chiare ma visualizzazione minima si sovrappongono sub-cellulare. EP, cellule epiteliali; int, interstizio; l, lumen; SP, sperma; Neg, controllo solo anticorpo secondario. Nuclei delle cellule erano controcolorati con DAPI (blu). Gli esperimenti sono stati replicati sul materiale da tre animali e immagini rappresentative di immunofluorescenza sono presentati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: schematico di protocolli di isolamento utilizzati per l'arricchimento del mouse caput epididymosomes. Dopo la dissezione, tessuto epididimario caput è immerso in una goccia di mezzo BWW e incise per rilasciare il contenuto luminale. Il luminal fluido viene poi filtrato attraverso una membrana µm 70 e la sospensione risultante viene centrifugata ad aumentare la velocità al fine di pellet eventuali detriti residua della cellula. La sospensione sgomberata è poi caricata sulla cima di un gradiente di densità discontinua (iodixanol soluzione) e sottoposti a ultracentrifugazione durante la notte. Partizione di Epididymosomes in frazioni 9-11, che si sono riuniti, lavati tramite diluizione in PBS e tornò a ultracentrifuga a pellet il epididymosomes. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: valutazione della purezza epididymosome. Dodici frazioni uguali sono state recuperate dopo l'ultracentrifugazione della sfumatura e un'aliquota di ciascun preparato per proteina (A) e quantificazione di RNA, (B) valutazione di eterogeneità le dimensioni utilizzando diffusione dinamica della luce e (C). analisi di immunoblot di distribuzione indicatore epididymosome. Caratterizzazione di ulteriori passaggi inclusi (D) dual-etichettatura di epididymosomes concentrata sui granuli di lattice aldeide/solfato, (E) trasmissione microscopia elettronica valutazione e (F) valutazione di immunoblot degli spermatozoi (Sperma) e globuli rossi (RBC) contaminazione utilizzando anti-arachidonato 15-lipossigenasi (ALOX15, gocciolina citoplasmatica/sperma contaminazione) o dell'anti-emoglobina (HBB, contaminazione di RBC). Immunoblots erano anche sondato con carico noto epididymosome (subunità regolatoria di 26S proteasoma non-ATPasi 7, PSMD7; calore shock proteina 90kDa membro beta 1, HSP90B1; e beta tubulina, TUBB). Questi dati sono stati originariamente pubblicati in relazioni scientifiche (PMID: 27549865) e sono stati riprodotti qui con il permesso dell'editore, Springer natura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: individuazione di immunofluorescenza delle isoforme DNM in mECap18 cellule rivelano distribuzione modelli tale accordo con quelle rilevate in tessuto epididimario caput. (A) schematica del vetrino coprioggetto preparazione per la coltura cellulare mECap18 sterile. (B) immagini rappresentative di immunofluorescenza di DNM modelli di distribuzione cellulare rivelata (frecce e inserto (doppia etichettatura del DNM3 e cellule chiare segno ATP6V1B1)) che rispecchiava quelle rilevate all'interno delle sezioni di tessuto epididimario di macchiatura. Nuclei delle cellule erano controcolorati con ioduro di propidio (PI; rosso) o DAPI (blu). Gli esperimenti sono stati replicati sul materiale da tre animali e immagini rappresentative di immunofluorescenza sono presentati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questi studi incorporato l'uso del tessuto epididimario fisso di Bouin che era stati sottoposti a protocolli standard di sezionamento e di inclusione in paraffina. Soluzione fissante di Bouin comprende una miscela di formaldeide, acido picrico e acido acetico, con ogni componente con una funzione specifica e complementare. Così, formaldeide reagisce con le ammine primarie per formare legami incrociati della proteina, acido picrico penetra lentamente il tessuto formando sali e quindi la coagulazione delle proteine basiche e viceversa, acido acetico rapidamente penetra il tessuto e provoca la coagulazione del acidi nucleici. Queste proprietà combinate hanno generato di Bouin come fissativo di scelta per la conservazione del dettaglio morfologico e il suo utilizzo è ampiamente segnalato nella letteratura dell'epididimo. Tuttavia, la soluzione di Bouin non è priva di limiti, che comprendono la propensione per fluorescenza indotta fissativo e per formaldeide indotta cross-linking che può mascherare gli antigeni bersaglio.
Il potenziale per fluorescenza di fondo richiede l'uso rigorosi controlli negativi, che nei nostri studi comprendono l'omissione dell'anticorpo primario, omissione dell'anticorpo secondario e, dove i reagenti sono disponibili, l'uso di anticorpi primari preabsorbed contro il peptide immunitario da cui sono stati generati. Dettagli dell'applicazione di tali controlli sono esemplificati nel nostro precedente studio dell'espressione di DNM dinamina nell' epididimo del mouse21. Idealmente, tali risultati devono essere convalidati anche attraverso l'uso di tessuto derivato da animali knockout, tuttavia, questo materiale non è sempre facilmente disponibile. Nel cercare di contrastare il problema secondario di antigeni bersaglio reticolato o chimicamente modificate, è spesso necessario eseguire qualche forma di ricupero dell'antigene al fine di smascherare epitopi alterati tramite la fissazione e ristabilire così il loro potenziale per l'anticorpo associazione. La metodologia utilizzata per il recupero dipende da numerose variabili, tra cui l'antigene bersaglio, anticorpo, tipo di tessuto e il metodo di fissazione. Tuttavia, le tecniche più largamente adottate dispongono l'applicazione di entrambi ricupero di calore-mediata o proteolitico indotto dell'antigene. L'ex caratteristiche come il nostro approccio favorito a causa di un più alto tasso di successo per il ripristino di immunoreactivity, con i dettagli dei regimi di calore e delle soluzioni di recupero che utilizziamo comunemente essere documentato nella tabella 1. Cautela, tuttavia, che questo non è un elenco esaustivo e in ultima analisi, l'ottimizzazione di ricupero dell'antigene per ogni combinazione di destinazione/anticorpo proteina richiede studi preliminari utilizzando una matrice di combinazioni di tempo, temperatura e pH. Considerazioni aggiuntive includono il potenziale per il recupero di calore provocare danni ai tessuti e/o causare artefactual etichettatura. Così, oltre all'applicazione dei controlli negativi documentato sopra, incorporiamo anche regolarmente controlli positivi con anticorpi, ad esempio anti-Golgin-97, che riconoscono gli organelli cellulari distinti.
Nel cercare di stabilire se le proteine come quelli appartenenti alla famiglia DNM soddisfano ridondanti, al contrario di funzioni complementari, in tessuto epididimario, lo abbiamo trovato particolarmente istruttiva per eseguire esperimenti doppi etichettatura come quelli illustrato nella Figura 2B. Questa strategia comporta etichettatura sequenziale delle sezioni del tessuto con coppie di anticorpi primari (alzati dentro specie diverse) seguite appropriati anticorpi secondari coniugati a diversi fluorofori. Tuttavia, una caratteristica confusione che occasionalmente si pone nel cercare di eseguire questi studi d'etichettatura dual è l'incompatibilità tra i protocolli di recupero dell'antigene necessari per etichettatura ottimale con ogni anticorpo primario. Questa limitazione è stata rilevata nel caso di co-etichettatura di DNM 2 e Golgin-97 nell'epididimo caput del mouse, che ci porta a utilizzare le sezioni di serie consecutivi (in contrasto con la stessa sezione)21. Tuttavia, uno di questi approcci sono estremamente utile nel contesto di ascrivere l'espressione della proteina in un tipo di cellula particolare tra quelli rappresentati nel pseudostratificato epitelio dell'epididimo. Con questo obiettivo in mente, abbiamo incluso un elenco di indicatori di tipo di rappresentante delle cellule e sui modelli di distribuzione segnalati lungo la lunghezza del tubulo epididimario (tabella 2). Quando si vuole andare oltre il tipo di cella e iniziare a esplorare la distribuzione subcellulare delle proteine bersaglio, l'uso della doppia etichettatura con marcatori organello riconosciuto, ad esempio Golgin-97, offre vantaggi distinti. In alternativa, l'applicazione di microscopia elettronica ad alta risoluzione in tandem con l'etichettatura di immunogold rimane il metodo di scelta per la localizzazione ultrastrutturale dettagliato e validazione di modelli mediante immunofluorescenza21 di macchiatura .
Tra le limitazioni posate dallo studio di epididymosomes sono le loro piccole dimensioni e la difficoltà di ottenere una quantità sufficiente per analisi dettagliate punto finale, in particolare comunemente utilizzato specie di laboratorio come il mouse. Tuttavia, capitalizzando gli studi pionieristici di Sullivan e colleghi38,39,40, siamo stati in grado di ottimizzare solida metodologia per epididymosome isolamento dal mouse modello (vedi passo 2). Sottolineiamo, tuttavia, la necessità di imporre controlli rigorosi per valutare e caratteristiche fisiche del epididymosome arricchito popolazioni41 a causa della potenziale contaminazione da spermatozoi, goccioline citoplasmatiche e/o ematica esosomi ( vedere la Figura 4). Per questo scopo, utilizziamo ordinariamente una combinazione di: (i) ad alta risoluzione microscopia per visualizzare la dimensione e l'eterogeneità della preparazione epididymosome, (ii) calcolo della media delle particelle dimensione ed eterogeneità (iii) concentrazione della epididymosomes su 4 granuli di lattice aldeide/solfato di µm e Contrassegno fluorescente dei riconosciuti da esosomi, marcatori di superficie, tra cui CD9 e FLOT1, e (iv) immunoblotting di epididymosomes isolato con una suite di anticorpi raccomandati per sperimentale convalida degli esosomi (ad es., anti-CD9, anti-FLOT1), controlli pure come negativi corrispondenti agli antigeni che dovrebbero essere limitati agli spermatozoi (anti-IZUMO1), gocce di sperma citoplasmico (anti-ALOX15) o sangue (anti-HBB)22. Se sono rispettate tali norme, quindi i preparativi epididymosome isolati sono facilmente trattabili per uso nelle applicazioni a valle, tra cui co-incubazione con gli spermatozoi e/o carico profilatura analizza22,42, entrambi i quali sono potenti approcci per migliorare la nostra comprensione del ruolo di epididymosomes nella regolazione di maturazione degli spermatozoi epididimari1.
In questo studio, descriviamo l'applicazione di una linea cellulare del mouse SV40-immortalato caput epididimario epiteliali (mECap18), che abbiamo utilizzato per studiare il coinvolgimento di DNM nella regolazione dell'attività secretiva dell'epididimo21 , nonché l'impatto delle tossici ambientali su fisiologia epididimaria43. Una caratteristica importante della linea cellulare mECap18 è che visualizza stabilità fenotipica tra passaggi e caratteristiche una popolazione rappresentativa di entrambe le cellule principali e chiara21,35,44. Rispetto alle colture primarie di cellule dell'epididimo, la linea cellulare mECap18 Visualizza anche la tolleranza a coltura nel siero fetale di vitello mezzo libero, che si estende la durata e la natura degli interventi sperimentali di queste cellule può essere esposto, pur essendo anche permissiva di recuperare una maggiore abbondanza di proteine secrete dal medium condizionato. Una limitazione della linea cellulare mECap18, tuttavia, è che esso è stato immortalato e può così rispondere in modo diverso allo stress e / o stimoli immuno-correlati rispetto a che di cellula primaria culture o quelle cellule presentano in vivo. Con questa limitazione in mente, si consiglia di confrontare i risultati ottenuti usando le cellule di mECap18 a in vivo le risposte quando possibile. In sintesi, i protocolli che descriviamo evidenziano l'utilità di questa linea cellulare come uno strumento con cui iniziare a studiare la funzionalità delle proteine target all'interno di caput epididimo. Infatti, in combinazione con l'uso di inibitori della proteina commerciale e/o strumenti di modifica del genoma (ad esempio CRISPR-Cas9), la linea cellulare mECap18 detiene un grande potenziale per contribuire a risolvere la base meccanicistica della funzione dell'epididimo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare il National Health and Medical Research Consiglio di Australia progetto Grant APP1103176 per il supporto di questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
