Summary
在这里, 我们描述了两个细胞外囊泡分离方案, 超滤离心和超离心与密度梯度离心, 从小鼠支气管肺泡灌洗液样品中分离细胞外囊泡。用两种方法对小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡进行了定量和表征。
Abstract
细胞外囊泡 (ev) 是新发现的亚细胞成分, 在生理和病理状态下的许多生物信号功能中起着重要作用。由于每种技术固有的限制, ev 的隔离仍然是这一领域的主要挑战。采用密度梯度离心法的微分超离心法是一种常用的方法, 被认为是电动汽车隔离的黄金标准程序。然而, 此过程是耗时的, 劳动密集型的, 一般会导致低可扩展性, 这可能不适合小体积样品, 如支气管肺泡灌洗液。证明了超滤离心分离方法简单、时间高效、省力, 但具有较高的回收率和纯度。我们建议这种隔离方法可以是一种替代方法, 适用于电动汽车隔离, 特别是小批量生物样品。
Introduction
外质体是 ev 的最小子集, 直径为 50–200 nm, 在各种信令过程1、2、3、4、5中具有多种生物功能。它们主要通过通过脂类、蛋白质和核酸等货物分子促进细胞间的交流来控制细胞和组织的稳态.电动汽车研究的一个关键步骤是隔离过程。有或没有密度梯度离心 (dgc) 的差动超离心 (uc) 被认为是黄金标准法, 但这种方法存在很大的局限性, 包括 ev 回收率低和可扩展性低 10,11,12、将其最佳利用限制在较大体积的样品中, 如细胞培养上清液或高外体细胞生产样品。其他方法的优点和缺点, 如超滤或色谱仪排除尺寸、珠子或柱的免疫亲和力分离以及微流体, 都有很好的描述, 现代补充程序已经发展到克服并最大限度地减少每种方法中的技术限制 11、12、13、14、15。其他研究表明, 在过滤单元中使用纳米多孔膜的超滤离心 (ufc) 是一种替代技术, 可提供与 uc 方法16、17、18 相当的纯度。这种技术可以被认为是一种替代的隔离方法。
支气管肺泡灌洗液 (balf) 含有在不同呼吸条件下具有多种生物功能的ev19、20、21、22.研究 bal 衍生的 ev 带来了一些挑战, 由于在人类的支气管镜检查程序的侵入性, 以及有限的大量灌洗液回收。在小动物, 如小鼠, 只有几毫升可以恢复在正常的肺条件下, 更不知道在发炎或纤维化的肺 23。因此, 收集足够数量的 balf, 用于通过差动超离心进行电动汽车隔离, 用于下游应用可能是不可行的。然而, 分离正确的 ev 种群是研究电动汽车生物学功能的关键因素。在完善的电动汽车隔离方法中, 效率和功效之间的微妙平衡仍然是一个挑战。
在目前的研究中, 我们证明了一种离心超滤方法, 利用 100 kda 分子量截止 (mwco) 纳米膜过滤单元, 适用于小体积生物样品, 如 balf。该技术简单、高效, 具有较高的纯度和可扩展性, 可支持对 balf 衍生 ev 的研究。
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Protocol
动物的利用和所有动物程序得到了塞达西奈医疗中心 (csmc) 机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准。
1. 小鼠支气管肺泡灌洗液 (valf) 的采集和制备
- balf 系列
- 用氯胺酮 (300 mgkg) 和 xylazine (30 mg kg) 的鸡尾酒对小鼠进行安乐死, 然后通过腹膜内途径进行颈椎脱位。
- 将 22 g 血管造影剂插入气管。将含有1毫升 (ml) 冰凉的杜尔贝科磷酸盐缓冲液盐水 (dpbs) 的胰岛素注射器连接在一起, 并通过血管导管将1毫升的 dbps 注入两个肺。
- 慢慢地取出注射器柱塞, 以取回 balf, 并将 balf 分放入一个50毫升的锥形管中。把酒吧放在冰上。
- 重复步骤1.1.2 和 1.1.3 3倍 (每个鼠标共 4倍)。
注: 通常每毫升注入约0.8 毫升。此外, 还可以对单个小鼠执行以下步骤 (即balf 的3毫升), 但汇集多个 balf 样本将允许隔离更大的电动汽车, 以便在下游实验中保持一致性。
- balf 准备
- 池 balf 从25只小鼠, 并将其分为两个相等的集合 (~ 35 毫升/aliquot)。
- 在 400x g, 4°c 离心 balf 5分钟, 以清除细胞和其他细胞碎片, 并收集上清液。
- 将上清液离心为 1500 x 克, 4°c 10分钟, 以清除细胞碎片。收集上清液并继续执行 ev 隔离步骤。
2. 小鼠支气管肺泡灌洗液细胞外囊的分离
注: 在本研究中, 两种 ev 隔离技术, 即用于从 valf 中分离 ev 的 ufc 和带有浮力的超离心。下面介绍了每种方法的详细协议。
-
超滤离心 (ufc) 浓缩方法
注: 此方法是从前面描述的协议10修改的。- 通过0.2μm 无菌注射器过滤器, 将上清液从台阶1.2.3 过滤, 并将过滤后的 balf 保持在冰上。
注: 这是一个大小排除步骤, 通过该步骤, 只收集小于200纳米的囊泡。 - 用无菌 dpbs 平衡 100 kda mwco 离心过滤装置 10分钟, 在4°c 下以 1, 500 x 克离心离心装置 10分钟, 以丢弃 dpbs。
注意: 过滤装置中的膜与 dpbs 平衡后, 必须始终保持膜的湿润, 直到使用该设备。 - 在过滤单元中, 从步骤 2.1.1, 在 3, 000 x g 的速度填充过滤单元15毫升, 在4°c 下, 以30分钟的速度填充过滤器。流动的 balf 可以丢弃或收集到一个单独的规范管中, 并存储在-80°c, 供将来使用。
- 对剩余的0.2μm 过滤的 balf 重复步骤2.1.3。
注: 从最初的起始体积为35毫升, 用了三次离心时间才使 valf ev 充分浓缩。这导致了1-1.5 毫升的重新定位。 - 用14毫升无菌 dpbs 重复轻轻移液清洗再适应。将过滤装置以 3, 000 x 克的速度离心, 在4°c 下离心 30分钟, 以去除 dpbs 并浓缩 ev 还原剂。
- 通过将移液器插入过滤装置的底部并使用侧向扫动提取样品, 从过滤装置中收集浓缩的 balf 衍生 ev, 以确保完全恢复。
- 在-80°c 下倾斜 balf 衍生的电动车, 并将其存储在-80°c, 以便进一步进行粒子定量和表征 (参见步骤 3)。
- 通过0.2μm 无菌注射器过滤器, 将上清液从台阶1.2.3 过滤, 并将过滤后的 balf 保持在冰上。
-
浮力密度梯度离心 (dgc) 的超离心 (uc)
注: 以下协议是从前面描述的协议24修改的。- 使用超离心机将上清液从步骤2.1.1 转移到37毫升的超离心管中, 并在4°c 下以 10, 000 x g 的速度将样品离心30分钟。以 100, 000 x 克的温度, 在4°c 下收集上清液和离心机60分钟。在对 ev 颗粒进行离心时, 为步骤2.2.3 制备不同浓度的浮力密度梯度缓冲液 (表 1)。
- 丢弃上清液, 并在200μl 的 dpbs 中重新悬挂 ev 颗粒。
- 将 ev 悬浮液与50% 碘氧醇工作溶液的300μl 混合 (表 1), 并将其转移到15毫升的超离心管中。在50% 碘化剂-ev 混合物悬架之上, 按顺序按底部到顶部的顺序分层以下缓冲溶液: 30% 碘醇 (4.5 ml)、25% 碘氧醇 (3 毫升)、15% 碘沙诺 (2.5 ml) 和5% 碘沙诺 (6 毫升)。离心机在 100, 000 x 克, 4°c 下230分钟。
注: 浮力密度梯度是基于碘沙诺结垢的百分比, 其浓度最高 (50%), 底部为最低浓度 (5%)。为了产生不同浓度的碘沙诺, 将不同数量的均质培养基 (表 1) 与工作溶液 (50% 碘沙诺) 混合。 - 收集15% 和25% 的分数, 并在无菌 dpbs 稀释它们, 使体积达到15毫升。将它们转移到 100, 000 x 克、4°c 的新型小型超离心管和离心机上, 时间60分钟。
- 丢弃上清液, 并在50μl 无菌 dpbs 中重新悬浮 ev 颗粒, 以便进一步表征。
3. 细胞外囊化物的定量
注: balf 派生的电动车恢复收益率用两个指标进行量化。
- 纳米粒子跟踪分析 (nta) 测量
- 在 dpbs 的1毫升中, 将 ev 样品稀释在1:200–1:500 处, 并将样品装入胰岛素注射器中。将样品注射器连接到注射器泵, 并开始测量颗粒数量和大小 (参见材料表)。
- 将所有样品测量的摄像机电平设置为 14, 将检测阈值设置为1。每个样本记录了5个重复测量, 在30秒内有 1, 500个帧, 两次读取之间的延迟为20秒。合并和平均数据, 以获得最终的浓度和大小报告。
注: 为了准确捕获所有粒子, 请根据需要调整相机电平以可视化所有粒子, 并在每个实验中对所有样品测量使用类似的设置。
- 蛋白质定量
注: 双链酸 (bca) 蛋白检测方法是测定 balf 衍生 ev 的蛋白质浓度。- 在1x 裂解缓冲液中对 ev 样品进行溶解。
- 通过测量板式读取器中560纳米的吸收率, 使用比色检测, 根据 bca 标准协议量化 balf 衍生的 ev 中的蛋白质含量。
4. 检测双细胞外细胞外囊
注: 常用的外显子体表面标记蛋白 (tsg101、cd63、cd81 和 cd9) 用于通过 sds-page 和免疫印迹和流式细胞术分析验证 ev 恢复情况。
- sds-page 和免疫印迹
- 用吸墨纸缓冲液 (硫酸十二烷基锂) 和 50 mm 二硫醇 (dtt) 在 1.6 ml 管中溶解每个样品中等量的 ev 蛋白。在70°c 下加热样品10分钟。
- 将步骤4.1.1 的样品装入4-12% 的 bis-tris + 丙烯酰胺凝胶, 并运行电泳 (150 伏, 35 ma) 35分钟。
- 使用干式转移法将蛋白质转移到硝化纤维素膜。
- 用5% 脱脂牛奶封堵膜 60分钟, 在室温下摇晃 (rt)。
- 在4°c 的情况下, 用 ev 表面蛋白标记抗体--肿瘤易感性基因 101 (tsg101), 在 5% bsa 中稀释5°c 时对膜进行培育, 在4°c 下摇晃一夜。
- 第二天, 在 tbst 缓冲液中清洗膜 3倍, 每次 10分钟, 并在1:5000 稀释60分钟的情况下, 用抗兔 igg (hrp 挂钩抗体) 孵育。
- 在 tbst 缓冲液中清洗膜 3倍, 每次10分钟。利用化学发光 hrp 抗体检测试剂和图像开发膜 (参见成像系统材料表)。
- 流式细胞仪
- 在49μl 的 peb 染色缓冲液中稀释 balf 衍生的 ev (pbs + 5 mm edta + 0.5% bsa, 通过0.1μm 注射器滤膜过滤)。
- 将以下各项抗体添加到每个样本中: 1) 大鼠抗小鼠 pe cd63 抗体 (每次反应100纳克);2) 大鼠抗小鼠 pe cd81 (500 纳克);3) 大鼠抗鼠 fitc cd9 (200 纳克)。在4°c 下孵化, 在黑暗中摇晃60分钟。
- 用450μl 膜过滤 peb 染色缓冲液稀释样品, 并对样品进行流式细胞术分析 (见材料表)25。
- 调整流式细胞仪设置, 如下所示: 1) 在超圆记录 (hlog) 上设置所有通道;2) 将 ssc 上的触发器设置为 4;3) 关闭辅助触发器。在低速设置中运行示例, 并在每个样本中获取至少 10, 000个事件。
- 使用分析软件 (参见材料表) 对每个样本执行低细胞学数据分析。
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Representative Results
我们在同一天使用 ufc 和 uc-dgc 隔离方法从鼠标 balf 执行 ev 隔离。ufc 方法大约需要 2.5-3小时, 而 uc-dgc 技术需要8小时的处理时间。这不包括缓冲区和试剂制备时间。应当指出, 其他一些任务可以在长离心期内执行。然而, 整个过程持续了近一整天的 uc-dgc 隔离技术。
与 uc-dgc ev (17.67±7.8 nm,图 1b) 相比, ufc 方法分离出的正常小鼠的 balf 衍生 ev 显示出更小的尺寸和更均匀的尺寸分布 (148.8±1.1 nm,图 1a)。与 uc-dgc 隔离 (29.4±18.4 对 0.5±0.1 x 10 个粒子) 相比, ufc 技术的总颗粒数量增加了六倍 ;p & lt; 0.05;表 2和 图 1c)。ufc ev 的总蛋白回收率 (以μg 为) 也较高 (3, 136 ± 1, 860 对73.7 ±38.3 微克; p & lt; 0.05 ; 表 2和图 1d)。因此, ufc 具有时间和投入效率, 并提供了更高的 ev 产量。
为了进一步表型描述碱性 ev 群, 我们通过流式细胞仪检测了常见的外源表面蛋白标记 cd63、cd9 和 cd81 的存在性, 并通过免疫印迹法检测了 tsg101。通过流式细胞仪分析, 我们证明了 ufc ev 和 uc-dgc ev 都表示 cd63 (图 2a-2c )、cd9 (图 2d-2f) 和 cd81 (图 2g-2i )。cd63、cd9 和 cd81 的几何均值表达 (gMFI) 被量化, 这两个条件之间没有统计上的差异 (图 3a-3f )。
接下来, 我们通过免疫印迹检查了另一个 ev 蛋白标记 tg101。我们表明, 20μg 的 ufc 流经 (ufc-ft) 样品不含 tsg101 蛋白, 这表明 ufc 隔离技术有效地选择并保留了来自 balf 样品的 ev 群 (图 4)。当从 valf-ev 样品中加载等量的总蛋白 (20μg) 时, 我们发现 ufc ev 表示的 tsg101 水平高于 uc-dgc ev (图 4)。我们还表明, ufc-ev 蛋白的纯度是可以接受的, 通过一个单一的分离蛋白带证明。
对于所有的结果, 学生的t测试都用于两组比较。结果以平均值±sem (均值的标准误差) 的形式给出, p & lt; 0.05 被认为是显著的。
图 1: 小鼠支气管肺泡灌洗液 (balf) 的超滤离心, 显示出比超离心和密度梯度离心小鼠 balf 衍生的 ev 更均匀大小的分布, 并有显著提高总颗粒计数和蛋白质含量.用纳米颗粒跟踪分析 (nta) 测定了 ev 颗粒大小的分布, 用双氯酸法测定了其总蛋白质含量。(a) ufc-balf ev 的 nta 尺寸分布图。(b) uc-dgc-balf ev 尺寸分布图。(c) nta 的总颗粒数 (平均值±sem x 1010个粒子; * p & lt; 0.05)。(d) 总蛋白质含量 (微克, * p & lt; 0.05)。这些数据来自三个独立的实验。ufc: 超滤离心;uc-dgc: 密度梯度离心;电动车: 细胞外囊泡;sd: 标准偏差;conc: 集中。请点击这里查看此图的较大版本.
图2:murin 支气管肺泡灌洗液衍生的 ev 通过超滤离心和密度梯度离心法超离心表达了四通道蛋白 cd63、cd9 和 cd81.显示的是被 ufc 和 uc-d商用g 隔离技术染色呈阳性的 ev 的百分比, 用伪彩色图说明, 用于 (a-c ) pe-cd63、(d-f ) fit-cd9 和 ( g-i ) pe-cd9. 这些数据来自三个独立的实验。ufc = 超滤离心;uc-dgc = 密度梯度离心超离心;ev = 细胞外囊泡;ssc-a = 侧面散射分析;pe = 植物菊酯;fitc = 荧光素异硫氰酸酯。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 超滤离心分离的小鼠支气管肺泡灌洗液衍生的 ev 表达了类似荧光密度的四他辛蛋白与超离心分离的电动车.(a和d)pe-cd63 + 染色 ev 的直方图和几何均值表达 (gMFI)。(b和e) fitc-cd9+染色电动车的直方图和 gMFI。(c和f) pe-cd81+染色电动车的直方图和 gMFI。这些数据来自三个独立的实验。ufc: 超滤离心;uc-dgc = 密度梯度离心超离心;电动车: 细胞外囊泡;ssc-a: 侧向散射分析;pe: 植物菊酯;fitc: 荧光素异硫氰酸酯。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 用超滤离心分离的小鼠支气管肺泡灌洗液衍生的 ev, 用密度梯度离心法表达了外生体表面蛋白 tsg101.该面板显示了 tsg101 抗体 (47 kda) 的小鼠 balf 衍生 ev 的免疫印迹。ufc = 超滤离心;uc-dgc = 密度梯度离心超离心;ev = 细胞外囊泡;ft = 流经;tsg = 肿瘤易感基因。请点击这里查看此图的较大版本.
| 工作溶液碘沙诺 (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| 工作解决方案 (ml)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| 均质化介质 (ml)* * | 18 | 14 | 10 | 8 |
表 1: 浮力密度梯度缓冲器.本表给出了用于纯化用超离心技术分离的小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡种群的每个梯度溶液的组成和缓冲比。* 工作溶液为50% 碘氧酚 (25 毫升密度梯度介质 [见材料表] + 5 ml 稀释剂溶液 [ph 7.4 的 0.25 m 蔗糖 + 120 mm hepes + 0.9 m ncl])。* * 均质化介质 (ph 值7.4 为 0.25 m 蔗糖 + 20 mm hepes + 150 mm ncl)
| 方法 | 起始音量 (毫升) | nta* (x108μl) | 总颗粒量 ( x10 10) | 蛋白金 ( μgμl) | 总蛋白质§ (微克) |
| Ufc | 35 | 7.69±2。6 | 29.4±18。4 | 3。7 | 3, 136±1860 |
| uc-dgc | 35 | 0.5±0.05 | 0.5±0。1 | 0。6 | 73.7±38。3 |
表 2: 超滤离心分离方法提供了一种高小鼠支气管肺泡灌洗液流衍生囊泡的产率.用纳米粒子跟踪分析 (nta) 测定了颗粒浓度和总颗粒计数。采用双氯酸蛋白法测定蛋白质浓度和蛋白质总量。* balf ev 的颗粒浓度 (三个独立实验的平均值±sem x10 8/升)。·balf ev 的总粒子 (平均±sem x 1010个粒子来自三个独立的实验)。金balf ev 的蛋白质浓度 (三个独立实验的平均±semμgμμμl)。§balf ev 的总蛋白 (三个独立实验的平均值±sem mg)。
ufc: 超滤离心;uc-dgc: 密度梯度离心;conc: 集中;nta: 纳米粒子跟踪分析;sem: 均值的标准误差。
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Discussion
在过去的几十年里, 科学家们已经解开了 ev 在细胞稳态中的意义。更重要的是, ev 通过生物活性货物分子 1、21、22、26、27调节相邻和远的细胞, 在许多疾病过程中发挥着重要作用,28,29,30. 这一领域的未来发展和进步深深依赖可靠和有效的方法, 这些方法不仅能识别和分离电动汽车种群的正确子集, 而且还能保护其在下游应用中的生物功能10,11,14,31. 在目前的研究中, 我们介绍了一种从小鼠双壳中分离 ev 的纳米膜超滤离心法。与其他报道一致, 我们表明, ufc 简单, 具有较高的回收率和纯度, 因此, 适用于小生物样本 10,17, 18,32.
uc-dgc 是常用的, 被认为是电动汽车隔离的黄金标准技术, 因为它提供高度纯化的 ev 颗粒10,14。但是, 此方法在技术上繁琐、耗时、劳动密集型, 并且可扩展性较低。新开发的基于微流体的技术克服了这些限制, 但这种方法需要进一步验证, 才能作为替代方法33,34完全实现。因此, 迫切需要在不影响样品纯度和可扩展性的情况下适应这些困难的适当方法, 特别是对于小体积生物流体。
我们证明了采用纳米膜过滤装置的 ufc 对来自 balf 样品的 ev 分离是有效的。这里的研究结果突出了 ufc 程序相对于金本位 uc-dgc 方法的优越性, 因为它简单, 可扩展性更高。以超滤为基础的方法已被广泛采用, 从各种生物标本中分离出 ev: 尿液35、细胞调节培养基17和胎儿牛血清 36。另一种采用超滤作为平台的基于模块化尺寸的 ev 隔离技术是 exosome 完全隔离芯片 (exosome)31。该方法也适用于小样本尺寸的试样。在使用 ufc 技术时, 需要考虑过滤材料和纳米膜的孔径等几个因素, 因为它们可能会影响回收的 ev 的性能。例如, 不同类型的滤膜导致不同的与 ev 相关的 rna 恢复产量从尿液 18。在这项研究中, 我们表明, 再生纤维素 (rc) 与 10 kda mwco 提供了最高的 mrna 表达 nop10, ost4, snrpg 和 tomm7 相比, 水龙 10 kda, 或聚醚磺酮 (pes) 10 kda 18.我们进一步证明, 10 kda 的 rc 有更高的视网膜 ev 回收率比 100 kda。另一些人对受隔离技术类型影响的尿 ev 货物内容物进行了定性37。我们的研究表明, 100 kda mwco rc 膜提供了一个令人满意的 balf 衍生 ev 产量的优势, 在更少的不需要的蛋白质在视网膜由于较大的 mwco。
研究表明, 与 uc-dgc ev 相比, ufc ev 的尺寸和尺寸分布较小, 分布较大。与 uc 技术常见的叶泡聚集可以解释 uc-dgc ev38的维度异质性。我们通过检测 ev 膜蛋白 tsg101、cd63、cd9 和 cd81 来评估 balf 衍生的 ev 纯度, 这证实了在修饰体中存在外显子。我们和其他人还使用 tem 来演示 ufcev35、39、40、41的形态。刘等人使用类似的超滤方法分离出电动车, 与超离心分离的电动车相比, 蛋白质组和转录谱相似 31.因此, 我们描述了一种使用 100 kda 的 mwco 再生纤维素膜的超滤离心方法, 作为一种适用于小型生物流体样品 (如支气管肺泡灌洗液) 的电动汽车隔离方法。
使用这种 ufc 方法从生物流体中分离 ev 的关键步骤包括初始纳米多孔膜0.2μm 过滤, 以确保富集颗粒在体外尺寸范围内, 并避免施加额外的力, 这可以损伤或变形外显子形态和结构10,42。ev 可以粘附在滤膜上, 从而降低可扩展性。因此, 样品的体积不应超过每种类型的过滤单元的建议量。我们选择使用再生纤维素, 它提供了更高的 mrna 产量从尿衍生的 ev18。所使用的滤膜类型可以改变电动车的回收率和类型。最后, 尽管 100 kda 的 mwco 应该消除生物流体中的大部分蛋白质, 但观察到一些大于 100 kda 或蛋白质聚集的蛋白质污染物 43.在这种情况下, 清洗步骤对于最大限度地减少 ev 和蛋白质聚集至关重要。此外, 必须适当控制功能研究, 以便充分解释结果, 因为非 eve 相关的蛋白质将存在于 ufc ev 中。
我们的结论是, ufc 是一种替代方法, 对于小型或大型样本的 ev 隔离是可行的。目前可用的微过滤装置最多可容纳15毫升的样品。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 nhlbi龙湾国家卫生研究院颁发 hl103868 (至 p. c.) 和 hl137076 (至 p. c.)、美国心脏协会援助奖 (至 p. c.) 和塞缪尔·奥辛综合癌症研究协会 (pc) 的支持。我们要对塞达西奈医疗中心的施密特心脏研究所表示高度赞赏, 该研究所为我们提供了一台用于电动车纳米粒子跟踪分析的纳米视觉机器。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
