Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske ved hjælp af en ultrafiltrering centrifugering teknik

doi: 10.3791/58310 Published: November 9, 2018

Summary

Her beskriver vi to ekstracellulære vesikel isolation protokoller, ultrafiltrering centrifugering og ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering, at isolere ekstracellulære vesikler fra murine bronchoalveolar lavage flydende prøver. De ekstracellulære vesikler afledt af murine bronchoalveolar lavage væske ved begge metoder er kvantificeret og karakteriseret.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EVs) er nyligt opdagede subcellulært komponenter, der spiller en vigtig rolle i mange biologiske signalering funktioner under fysiologiske og patologiske stater. Isolering af evt fortsætter med at være en stor udfordring på dette område, på grund af begrænsninger iboende til hver teknik. Den differentierede ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering metode er et almindeligt anvendte tilgang og anses for at være den gyldne standard procedure for EV isolation. Men denne fremgangsmåde er tidskrævende, arbejdskrævende, og generelt resulterer i lav skalerbarhed, der ikke kan være egnet til små-volumen prøver såsom bronchoalveolar lavage væske. Vi påvise, at en ultrafiltrering centrifugering isolation metode er simpel og tid - og labor-effektive endnu giver en høj inddrivelse udbytte og renhed. Vi foreslår, at denne isolation metode kunne være en alternativ tilgang, der er egnet til EV isolation, særlig for små-volumen biologiske prøver.

Introduction

Exosomes er den mindste delmængde af evt, 50-200 nm i diameter, og har flere biologiske funktioner på tværs af en bred vifte af signalering processer1,2,3,4,5. De regulerer cellulær og væv homøostase primært ved at lette intercellulær kommunikation gennem cargo molekyler såsom lipider, proteiner og nukleinsyrer6,7,8,9 . Et kritisk trin i EV forskning er isoleret proces. Differential ultracentrifugering (UC), med eller uden tæthed gradient centrifugering (DGC), betragtes som guldstandarden tilgang, men denne metode indebærer væsentlige begrænsninger, herunder ineffektive EV genfindingsprocent og lav skalerbarhed10 , 11 , 12, at begrænse sine bedste udnyttelse til større volumen prøver, såsom celle kultur supernatanten eller høj exosome produktion prøver. Fordele og ulemper ved andre metoder, såsom størrelse udelukkelse af ultrafiltrering eller kromatografi, immunoaffinity isolation af perler eller kolonner og mikrofluidik, er godt beskrevet, og moderne supplerende procedurer er blevet udviklet til overvinde og minimere tekniske begrænsninger i hver tilgang11,12,13,14,15. Andre har vist, at en ultrafiltrering centrifugering (UFC) med en nanoporous membran i filterenhed er en alternativ teknik, der giver tilsvarende renhed til en UC metode16,17,18. Denne teknik kunne betragtes som en af metoderne alternativ isolering.

Bronchoalveolar lavage væske (BALF) indeholder evt, som besidder mange biologiske funktioner i forskellige luftvejssygdomme19,20,21,22. At studere BALF-afledte evt indebærer nogle udfordringer på grund af invasiv af bronkoskopi procedure hos mennesker, såvel som et begrænset antal lavage væske opsving. I lille laboratoriedyr som mus, kun et par milliliter kan inddrives i normal lunge betingelser, endnu mindre i betændte eller fibrotisk lungerne23. Derfor kan indsamle et tilstrækkeligt antal BALF for EV isolation af en differentieret ultracentrifugering for downstream-programmer ikke være muligt. Isolere korrekte EV populationer er imidlertid en afgørende faktor for at studere EV biologiske funktioner. Den fine balance mellem effektivitet og virkning fortsat en udfordring i veletablerede EV isolation metoder.

I denne aktuelle undersøgelse viser vi, at en centrifugal ultrafiltrering tilgang, udnytter en 100 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) nanomembrane filterenhed, er egnet til små-volumen biologiske modellen som BALF. Denne teknik er enkel, effektiv og giver høj renhed og skalerbarhed til støtte for studiet af BALF-afledte evt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Udnyttelsen af dyr og alle animalske procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).

1. murine Bronchoalveolar Lavage væske (BALF) indsamling og forberedelse

  1. BALF samling
    1. Aflive mus med en cocktail af ketamin (300 mg/kg) og xylazin (30 mg/kg) via ruten intraperitoneal efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Indsæt en 22 G angiocatheter i luftrøret. Vedhæfte en insulin sprøjte indeholdende 1 mL (mL) af iskold sterile Dulbecco fosfat buffer saltvand (DPBS) og indgyde 1 mL af Kønskirtler i begge lunger gennem angiocatheter.
    3. Langsomt trække sprøjten stemplet for at hente BALF og se bort fra BALF ind i en 50 mL konisk rør. Holde BALF på is.
    4. Gentag trin 1.1.2 og 1.1.3 3 x (4 x i alt i hver mus).
      Bemærk: Ca. 0,8 mL hentes generelt per milliliter instillation. Også, de følgende trin kan udføres for individuelle mus (dvs.3 mL af BALF), men samle flere BALF prøver vil tillade isolering af et større parti af elbiler for konsistens i downstream eksperimenter.
  2. BALF forberedelse
    1. Pool BALF fra 25 mus og opdele den i to lige sæt (~ 35 mL pr. alikvot).
    2. Der centrifugeres BALF på 400 x g, ved 4 ° C i 5 min, for at fjerne celler og andre celleaffald og indsamle supernatanten.
    3. Der centrifugeres supernatanten ved 1.500 x g, ved 4 ° C i 10 min, hvis du vil fjerne celle debris. Indsamle supernatanten og gå videre til EV isolation trin.

2. isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske

Bemærk: I denne undersøgelse, to EV isolation teknikker, nemlig UFC og ultracentrifugering med livlig bruges til at isolere evt fra BALF. Detaljerede protokollen af hver metode er beskrevet nedenfor.

  1. Ultrafiltrering centrifugering (UFC) berigelse metode
    Bemærk: Denne metode blev ændret fra en tidligere beskrevne protokol10.
    1. Filtrer supernatanten fra trin 1.2.3 gennem en 0,2 μm steril sprøjte filter og holde den filtrerede BALF på is.
      Bemærk: Dette er en størrelse udstødelse trin hvorved kun blærer mindre end 200 nm er indsamlet.
    2. Reagensglasset 100 kDa MWCO centrifugal filterenhed med steril DPBS for 10 min. centrifugeres den centrifugale enhed på 1.500 x g i 10 min. ved 4 ° C for at skille sig af med DPBS.
      Forsigtig: Når membranen i filter enhed er ekvilibreres med DPBS, membranen skal holdes våde på hele tiden indtil enheden bruges.
    3. Fylde filterenhed med 15 mL BALF prøve fra trin 2.1.1 og centrifugeres ved 3.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. Gennemstrømnings-BALF kan kasseres eller indsamlet i en separat kanoniske rør og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug.
    4. Gentag trin 2.1.3 for de resterende 0,2 µm-filtreret BALF.
      Bemærk: Det tog tre gentagelser af centrifugations til tilstrækkeligt koncentrere BALF evt fra den oprindelige start volumen af 35 mL. Dette resulterede i 1 – 1,5 mL af retentatet.
    5. Vask retentatet med 14 mL sterilt DPBS af et forsigtigt pipettering gentagne gange. Der centrifugeres filterenhed på 3.000 x g, ved 4 ° C i 30 min, at fjerne DPBS og koncentrere sig EV retentatet.
    6. Indsamle de koncentrerede BALF-afledte evt fra enhedens filter ved at indsætte en pipette ind i bunden af enheden filter og trække eksemplet bruger en side til side fejende bevægelse til at sikre total recovery.
    7. Alikvot BALF-afledte evt og gemme dem på-80 ° C for yderligere partikel kvantificering og karakterisering (Se trin 3).
  2. Ultracentrifugering (UC) med stigende tæthed gradient centrifugering (DGC)
    Bemærk: Følgende protokol blev ændret fra den tidligere beskrevne protokol24.
    1. Overføre supernatanten fra trin 2.1.1 ind i en 37 mL ultracentrifuge rør og centrifugeres prøve på 10.000 x g i 30 min. ved 4 ° C ved hjælp af ultracentrifuge. Indsamle supernatanten og centrifugeres ved 100.000 x g, ved 4 ° C i 60 min. Mens EV pellets er centrifugeres, forberede trin 2.2.3 forskellige koncentrationer af livlig tæthed gradient buffere (tabel 1).
    2. Supernatanten og resuspend EV pellets i 200 μl af DPBS.
    3. Bland EV suspension med 300 μL af 50% iodixanol brugsopløsning (tabel 1) og overføre det til 15 mL ultracentrifuge tube. På toppen af 50% iodixanol-EV blanding suspension, sekventielt lag følgende bufferopløsning i rækkefølgen fra bunden til toppen: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% af iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2.5 mL) og 5% iodixanol (6 mL). Der centrifugeres ved 100.000 x g, ved 4 ° C til 230 min.
      Bemærk: Livlig tæthed farveforløb er baseret på procent af iodixanol skalering med den højeste koncentration (50%) i bunden til den laveste koncentration (5%) øverst. Du kan generere forskellige koncentrationer af iodixanol ved var forskellige mængder af homogenisering medium (tabel 1) blandet med brugsopløsning (50% iodixanol).
    4. Indsamle 15% og 25% brøkdel og udvande dem i sterile DPBS at bringe op for lydstyrken til 15 mL. Overføre dem til en ny lille ultracentrifuge rør og centrifugeres ved 100.000 x g, ved 4 ° C i 60 min.
    5. Supernatanten og resuspend EV pellets i 50 μl sterilt DPBS for yderligere karakterisering.

3. ekstracellulære vesikel kvantificering

Bemærk: BALF-afledte evt opsving udbytte er quantitated med to målinger.

  1. Nanopartikel tracking analyse (NTA) måling
    1. Fortynd EV prøven på 1:200 – 1: 500 i 1 mL DPBS og belastning prøve ind en insulin sprøjten. Tillægger en sprøjten pumpe en prøve sprøjte og begynde at måle partikel tal og størrelse (Se Tabel af materialer).
    2. Indstille niveauet kamera på 14 og påvisningsgrænsen på 1 for alle stikprøve målinger. Fem gentagne målinger med 1.500 rammer i 30 s blev registreret for hver enkelt prøve med en forsinkelse på 20 s mellem læsninger. Kombinere og gennemsnitlige data for endelige koncentration og størrelse rapporter.
      Bemærk: For nøjagtig registrering af alle partikler, justere kameraet som hensigtsmæssigt at visualisere alle partikler og bruge lignende indstillinger for alle stikprøve målinger i hvert forsøg.
  2. Protein kvantificering
    Bemærk: Bicinchoninic syre (BCA) protein assay blev brugt til at måle proteinkoncentration BALF-afledte evt.
    1. Solubilize EV prøver i 1 x lysisbuffer.
    2. Kvantificere mængden af protein i BALF-afledte evt pr. BCA standardprotokol med kolorimetrisk detektion ved måling af absorbans ved 560 nm i en pladelæseren.

4. påvisning af BALF-afledte ekstracellulære vesikler

Bemærk: Almindeligt kendte exosome overflade markør proteiner (TSG101, CD63, CD81 og CD9) blev brugt til at kontrollere EV inddrivelser af SDS-PAGE og immunoblotting og flow flowcytometri analyse.

  1. SDS-PAGE og immunoblotting
    1. Opløse et tilsvarende beløb af EV proteiner af hver prøve med en blotting loading bufferen (lithium dodecyl sulfat) og 50 mM dithiothreitol (DTT) i en 1,6 mL tube. Opvarme prøverne ved 70 ° C i 10 min.
    2. Indlæse prøverne fra trin 4.1.1 i en 4 – 12% Bis-Tris Plus acrylamid gel og køre elektroforese (150 volt, 35 mA) i 35 min.
    3. Overføre proteiner til en nitrocellulose membran ved hjælp af en tør overførselsmetode.
    4. Blokere membran med 5% skummetmælk til 60 min, vuggende ved stuetemperatur (RT).
    5. Inkuber membran med et antistof mod et EV overflade protein markør, Tumor modtagelighed gen 101 (TSG101), på 1: 500 fortynding i 5% BSA i Tris-bufferet saltvand Tween-20 (TBST) ved 4 ° C, vuggende natten over.
    6. Den næste dag, vaske membran 3 x 10 min hver vask, i TBST buffer, og der inkuberes det med anti-kanin IgG, en HRP-linked antistof ved 1:5,000 fortynding i 60 min på RT.
    7. Vaske membran 3 x 10 min hver vask, i TBST buffer. Udvikle membran med kemiluminescens HRP antistof påvisning reagens og billede (Se Tabel af materialer til imaging system).
  2. Flowcytometri
    1. Fortynd BALF-afledte evt i 49 μL PEB farvning buffer (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, filtreret gennem en 0,1 μm sprøjte filter membran).
    2. Tilføje hver af følgende antistoffer i hver enkelt prøve: 1) rat anti-mus PE CD63 antistof (100 ng per reaktion); 2) rotte anti-mus PE CD81 (500 ng); 3) rotte anti-mus FITC CD9 (200 ng). Der inkuberes ved 4 ° C, vuggende for 60 min. i mørke.
    3. Fortynd prøver med 450 μL af membran-filtreret PEB farvning buffer og forbehold flow flowcytometri analyse af prøverne (Se Tabel af materialer)25.
    4. Justere flow forskellige indstillinger som følger: 1) sæt alle kanaler på hyper log (hlog); 2) sæt på aftrækkeren på SSC på 4; 3) slukke den sekundære udløser. Køre prøverne i en lav hastighed indstilling og erhverve mindst 10.000 begivenheder i hver prøve.
    5. Udføre lav flowcytometri dataanalyse i hver prøve ved hjælp af analysesoftwaren (Se Tabel af materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi udførte EV isolation fra mus BALF ved hjælp af UFC og UC-DGC isolation metoder på samme dag. Metoden UFC kræves ca. 2.5-3 h, UC-DGC teknik kræves 8 h behandlingstid. Dette ikke omfatte buffere og reagens forberedelsestid. Det skal bemærkes, at nogle andre opgaver kan udføres i perioderne, lang centrifugering. Ikke desto mindre varede hele proceduren næsten en hel dag for UC-DGC isolation teknik.

BALF-afledte evt fra normale mus isoleret af metoden UFC vises en mindre størrelse og en mere ensartet størrelse distribution (148.8 ± 1.1 nM, figur 1A) i forhold til UC-DGC evt (176.7 ± 7,8 nM, figur 1B). UFC teknik havde en dyb 65-fold større samlede partikel tæller i forhold til UC-DGC isolation (29.4 ± 18,4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 partikler; p < 0,05; Tabel 2 og figur 1 c). Total protein opsving (i µg) af UFC evt var også højere (3,136 ± 1,860 vs. 73,7 ± 38,3 µg; p < 0,05; Tabel 2 og figur 1 d). Således UFC er tid - og indsats-effektive og giver en højere EV udbytte.

For at yderligere karakterisere fænotype BALF-afledte EV populationer, undersøgte vi tilstedeværelsen af almindeligt kendte exosome overflade protein markører: CD63, CD9 og CD81 ved flowcytometri og TSG101 af immunoblotting. Ved hjælp af flow flowcytometri analyse, vi viste at UFC evt og UC-DGC evt udtrykt CD63 (figur 2A -2 C), CD9 (figur 2D -2F), og CD81 (figur 2 g -2I). Geometriske middelværdi udtryk (gMFI) CD63, CD9 og CD81 var kvantificerede og ikke statistisk forskellig mellem de to betingelser (figur 3A -3F).

Næste, undersøgte vi en anden EV protein markør, TSG101, af immunoblotting. Vi viste, at de 20 µg UFC gennemstrømning (UFC-FT) stikprøven ikke indeholdt TSG101 proteiner, tyder på, at UFC isolation teknik effektivt valgt og bevaret befolkningens EV fra BALF prøve (figur 4). Når lige store mængder af total protein (20 µg) fra BALF-EV prøven blev indlæst, fandt vi, at UFC evt gav udtryk for en højere grad af TSG101 end UC-DGC evt (figur 4). Vi viste også, at renheden af UFC-EV protein var acceptabel, demonstreret af en enkelt isoleret protein band.

Alle resultater, Student's t-test blev anvendt til to-gruppe sammenligning. Resultaterne er præsenteret som betyder ± SEM (standard fejl af middelværdien), og p < 0,05 blev betragtet som væsentlig.

Figure 1
Figur 1: ultrafiltrering centrifugering af murine bronchoalveolar lavage væske (BALF)-afledte evt viste en mere homogen størrelse fordeling end ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering af murine BALF-afledte evt og havde en betydeligt højere samlede partikel count og protein indhold. Fordelingen af EV partikelstørrelser blev målt af nanopartikel tracking analyse (NTA), og den samlede proteinindhold blev målt ved bicinchoninic syre assay. (A) UFC-BALF evt-NTA størrelse distribution graf. (B) UC-DGC-BALF evt-størrelse distribution graf. (C) samlede partikel Tæl i NTA (betyde ± SEM x 1010 partikler; * p < 0,05). (D) samlede proteinindhold (i µg, * p < 0,05). Dataene blev afledt fra tre uafhængige forsøg. UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC: ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering; Evt: ekstracellulære blærer; SD: standard afvigelse; Conc: koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Murine bronchoalveolar lavage væske-afledte evt isoleret ved ultrafiltrering centrifugering og ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering metoder udtrykt tetraspanin proteiner, CD63, CD9 og CD81. Vist er procenter af evt farves positive af UFC og UC-DCG isolation teknikker, illustreret af pseudocolor grunde, for (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9, og (G - jeg) PE-CD9. Dataene stammer fra tre uafhængige forsøg. UFC = ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering; Evt = ekstracellulære blærer; SSC-A = side scatter analyse; PE = phycoerythrin; FITC = fluorescein isothiocyanat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ultrafiltrering centrifugering-isolerede murine bronchoalveolar lavage væske-afledte evt udtrykt en lignende fluorescerende tæthed af tetraspanin proteiner til ultracentrifugering-isoleret evt. (A og D) Histogram og geometriske middelværdi udtryk (gMFI) af PE-CD63+-farves evt. (B og E) Histogram og gMFI af FITC-CD9+-farves evt. (C og F) Histogram og gMFI af PE-CD81+-farves evt. Disse data er afledt fra tre uafhængige forsøg. UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering; Evt: ekstracellulære blærer; SSC-A: side scatter analyse; PE: phycoerythrin; FITC: fluorescein isothiocyanat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Murine bronchoalveolar lavage væske-afledte evt isoleret ved ultrafiltrering centrifugering og ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering metoder udtrykt exosome overflade proteiner, TSG101. Dette panel viser immunoblotting af murine BALF-afledte evt til TSG101 antistof (47 kDa). UFC = ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering; Evt = ekstracellulære blærer; FT = gennemstrømnings; TSG = tumor modtagelighed genet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Arbejder løsning Iodixanol (%) 5 15 25 30
Brugsopløsning (mL)* 2 6 10 12
Homogenisering medium (mL)* 18 14 10 8

Tabel 1: livlig tæthed gradient buffere. Denne tabel giver sammensætning og buffer forholdet mellem hver gradient løsning, der blev brugt til at rense murine bronchoalveolar lavage væske-afledte ekstracellulære vesikel populationer isoleret af ultracentrifugering teknik. * Brugsopløsning var 50% iodixanol (25 mL af tæthed gradient medium [Se Tabel af materialer] + 5 mL fortynder opløsning [pH 7,4 0,25 M saccharose + 120 mM HEPES + 0,9 M NaCl]). ** Homogenisering medium (pH 7,4 0,25 M saccharose + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)

Metoder Start volumen (mL) NTA* (x 108/μL) Total partikler(x1010) Protein konc (µg/µL) Samlede proteiner§ (µg)
UFC 35 7.69 ± 2.6 29.4 ± 18,4 3.7 3,136 ± 1860
UC-DGC 35 0,5 ± 0,05 0,5 ± 0,1 0,6 73.7 ± 38,3

Tabel 2: ultrafiltrering centrifugering isolation metode forudsat en høj murine bronchoalveolar lavage væske-afledte ekstracellulære vesikel udbytte. Partikel koncentration og samlede partikel tæller blev målt ved nanopartikel tracking analyse (NTA). Proteinkoncentration og samlede mængde protein blev målt ved en bicinchoninic syre protein assay. * BALF evt-partikel koncentration (gennemsnit ± SEM x 108/μL fra tre uafhængige forsøg).  BALF evt-samlede partikel (gennemsnit ± SEM x 1010 partikler fra tre uafhængige forsøg).  BALF evt-proteinkoncentration (gennemsnit ± SEM µg/µL fra tre uafhængige forsøg). § BALF evt-total protein (gennemsnit ± SEM mg fra tre uafhængige forsøg).
UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC: ultracentrifugering med tæthed gradient centrifugering; Conc: koncentration; NTA: nanopartikel tracking analyse; SEM: standard fejl af middelværdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de seneste årtier, har forskere skilles ude betydninger af elbiler i cellulære homøostase. Endnu vigtigere, spille evt store roller i mange sygdomsprocesser af modulerende nærliggende og fjern celler gennem deres bioaktive cargo molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. fremtidige udvikling og avancement på dette område er dybt afhængige af pålidelige og effektive metoder, der ikke kun identificere og adskille rette delmængder af EV befolkninger, men også bevare deres biologiske funktioner for downstream applikationer 10 , 11 , 14 , 31. i den aktuelle undersøgelse, vi beskrev en nanomembrane ultrafiltrering centrifugering (UFC) metode til at isolere evt fra mus BALF. I overensstemmelse med andre rapporter viste vi at UFC er enkel og resulterer i en høj inddrivelse udbytte og renhed og, derfor, er velegnet til små biologiske prøver10,17,18,32 .

UC-DGC er almindeligt anvendt og anses for at være guldstandarden teknik for EV isolation, fordi det giver højt oprenset EV partikler10,14. Men denne metode er teknisk besværligt, tidskrævende, arbejdskrævende, og har lav skalerbarhed. De nyudviklede mikrofluidik-baserede teknikker overvinde disse begrænsninger, men denne tilgang kræver yderligere validering, før det kan gennemføres fuldt ud som en alternativ metode33,34. Således er passende metoder, at imødekomme disse vanskeligheder uden at kompromittere den renhed og skalerbarhed af prøver hårdt behov, især for små-volumen biologiske væske.

Vi viste, at UFC ved hjælp af et nanomembrane filter enhed var effektive for EV isolation fra BALF enheder. Resultaterne præsenteres her fremhæve overlegenhed af UFC procedure i forhold til guldstandarden UC-DGC metode på grund af sin enkelhed og større skalerbarhed. Ultrafiltrering-baseret tilgang er blevet udbredt for at isolere EV fra en bred vifte af biologiske prøver: urin35, celle-aircondition media17og føtal bovint serum36. De andre modulære størrelse-baserede EV isolation teknik, der bruger ultrafiltrering som en platform er exosome total isolation chip (eksotiske)31. Denne metode er også velegnet til små stikprøvestørrelse enheder. Et par faktorer, såsom filtermateriale og porestørrelse af nanomembranes, skal tages i betragtning ved hjælp af UFC teknik, fordi de kan påvirke egenskaberne for gendannede evt. For eksempel, resulterede forskellige typer af filter membraner i forskellige EV-associerede RNA opsving udbytter fra urin18. I denne undersøgelse, vi viste at celluloseregenerater (RC) med en 10 kDa MWCO forudsat det højeste mRNA udtryk for NOP10, OST4, SNRPG, og TOMM7 i forhold til Hydrosart 10 kDa eller polyethersulfone (PES) 10 kDa18. Vi viste yderligere, at RC med 10 kDa havde en højere retentatet EV opsving end de 100 kDa. Andre har karakteriseret urin evt fragt indhold, der blev påvirket af typen af isolation teknikker37. Vores undersøgelse viste, at 100-kDa MWCO RC membran forudsat en tilfredsstillende BALF-afledte EV udbytte med fordel af langt mindre uønskede proteiner i retentatet på grund af det større MWCO.

Denne undersøgelse viste, at størrelser og størrelse distribution af UFC evt var mindre og mere ensartet fordelt end dem af UC-DGC evt. Vesikel sammenlægning, som er fælles med UC teknikker, kan forklare dimension heterogenitet af UC-DGC evt-38. Vi vurderet BALF-afledte EV renhed ved at afsløre EV Membranproteiner TSG101, CD63, CD9 og CD81, der bekræfter tilstedeværelsen af exosomes i retentates. Vi og andre har også brugt TEM for at demonstrere morfologi af UFC evt-35,39,40,41. Liu et al. anvendte en lignende ultrafiltrering-baseret tilgang til at isolere evt, og i forhold til evt isoleret af ultracentrifugering, proteom og transkriptom profiler var lignende31. Dermed, vi beskriver en ultrafiltrering centrifugering metode ved hjælp af en celluloseregenerater membran med en MWCO af 100 kDa som en alternativ EV isolation metode, der er egnet til små biologiske væske prøver såsom bronchoalveolar lavage væske.

De kritiske trin ved hjælp af denne UFC tilgang til at isolere evt fra biologiske væske omfatter indledende nanoporous membran 0,2 µm filtrering for at sikre, at de berigede partikler i rækken exosomal størrelse og undgåelse af yderligere aktiveringskraft, der kan skade eller deformere exosome-morfologi og strukturer10,-42. Evt kan overholde filtrering membran, som resulterer i lavere skalerbarhed. Volumen af prøven bør derfor ikke overstige den anbefalede mængde i hver type filterenhed. Vi valgte at bruge folier af celluloseregenerater, som gav en højere mRNA udbytte fra urinbaserede evt-18. Typen af filter membraner bruges kan ændre opsving udbytte og type af evt. Endelig, selv om en MWCO af 100 kDa bør fjerne fleste af proteiner i biologiske væsker, nogle protein forurenende stoffer, der var større end 100 kDa eller protein aggregater blev observeret43. I dette tilfælde er en vask skridt afgørende for at minimere EV og protein sammenlægning. Derudover skal funktionelle studier korrekt kontrolleres for at fuldt fortolke resultaterne, som ikke-EV-associerede proteiner vil være til stede i UFC evt.

Vi konkludere, at UFC er en alternativ tilgang, der er muligt for EV isolation for små - eller større-volumen prøver. I øjeblikket tilgængelige mikrofilter enheder kan rumme op til 15 mL af prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Arbejdet er støttet af NHLBI/NIH tilskud HL103868 (til PC) og HL137076 (til PC), den amerikanske hjerte sammenslutning licensbetaling (til PC) og Samuel Oschin omfattende Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (til PC). Vi vil gerne give udtryk for vores store påskønnelse Smidt Heart Institute på Cedars-Sinai Medical Center, der giver os en Nanosight maskine for EV nanopartikel tracking analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20 G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany -
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA -
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK - To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany -
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA -
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285, (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21, (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126, (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113, (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9, (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6, (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87, (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7, (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7, (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7, (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23, (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67, (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72, (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77, (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78, (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11, (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16, (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12, (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292, (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82, (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7, (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120, (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4, (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6, (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, (6), 1985-1991 (1999).
Isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske ved hjælp af en ultrafiltrering centrifugering teknik
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).More

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter