Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58310

Summary

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind neu entdeckte subzelluläre Komponenten, die in vielen biologischen Funktionen während physiologische und pathologische Zustände signalisieren eine wichtige Rolle spielen. Die Isolation der EVs nach wie vor eine große Herausforderung in diesem Bereich aufgrund von Einschränkungen für jede Technik. Die differentielle Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung-Methode ist eine häufig verwendete Ansatz und gilt als der Goldstandard-Verfahren für EV Isolation. Dieses Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, arbeitsintensiv, und in der Regel führt zu niedrigen Skalierbarkeit, die möglicherweise nicht geeignet für kleinvolumige Proben wie alvéolaire Lavage-Flüssigkeit. Wir zeigen, dass eine Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert Methode einfach ist und doch Zeit und Arbeit-effiziente eine hohe Rückgewinnung Ausbeute und Reinheit bietet. Wir schlagen vor, diese Isolationsmethode ein alternativer Ansatz sein könnte, der sich für EV Isolation, besonders für kleinvolumige biologischen Proben eignet.

Introduction

Exosomen sind die kleinste Teilmenge des EFD, 50 – 200 nm im Durchmesser, und haben mehrere biologische Funktionen über eine Vielzahl von Prozessen1,2,3,4,5-Signalisierung. Sie regieren Mobilfunk- und Gewebe Homöostase in erster Linie durch Erleichterung der interzellulären Kommunikation durch Ladung Moleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren6,7,8,9 . Ein entscheidender Schritt in der EV-Forschung ist die Isolierung-Prozess. Differenzielle Ultrazentrifugation (UC), mit oder ohne Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC), gilt als des Goldstandard Ansatzes, aber diese Methode trägt wesentliche Einschränkungen, wie ineffizient EV Wiederfindungsraten und geringe Skalierbarkeit10 , 11 , 12, einschränken, seine beste Auslastung zu größeren Volumen Proben, wie Zelle Kultur überstand oder hohe Exosom Produktion Proben. Die vor- und Nachteile von anderen Methoden, wie z. B. Größe Ausgrenzung durch Ultrafiltration oder Chromatographie, Immunoaffinitäts Isolierung von Perlen oder Spalten und Mikrofluidik, sind gut beschrieben und moderne ergänzende Verfahren wurden entwickelt, um einen zu überwinden Sie und minimieren Sie technische Einschränkungen in jedem Ansatz11,12,13,14,15. Andere haben gezeigt, dass eine Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) mit einem nanoporösen Membran in der Filtereinheit ist eine alternative Technik, die vergleichbare Reinheit eine UC-Methode16,17,18liefert. Diese Technik könnte als eine der alternativen Isolierung Methoden betrachtet werden.

Alvéolaire Lavage-Flüssigkeit (BALF) enthält EVs, die zahlreiche biologische Funktionen in verschiedenen Atemwegserkrankungen19,20,21,22besitzen. Studieren BALF abgeleitet EVs bringt einige Herausforderungen aufgrund der Invasivität der Bronchoskopie Verfahren beim Menschen, sowie eine begrenzte Anzahl von Lavage Fluid Erholung. Im kleinen Labortiere wie Mäuse nur wenige Milliliter im normalen Lungenerkrankungen zurückgewonnen werden, noch weniger entzündeten oder fibrotische Lungen23. Infolgedessen kann das Sammeln einer ausreichenden Menge an BALF EV Isolation durch eine differenzierte Ultrazentrifugation für downstream-Anwendungen nicht möglich sein. Richtige EV Bevölkerung zu isolieren ist jedoch ein entscheidender Faktor für das Studium EV biologischer Funktionen. Das empfindliche Gleichgewicht zwischen Effizienz und Effektivität nach wie vor eine Herausforderung in etablierten EV Isolationsmethoden.

In dieser aktuellen Studie zeigen wir, dass ein zentrifugale Ultrafiltration Ansatz, unter Verwendung einer 100 kDa Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Nanomembrane Filtereinheit, für kleinvolumige biologische Proben wie BALF geeignet ist. Diese Technik ist einfach, effizient und sorgt für hohe Reinheit und Skalierbarkeit zur Unterstützung der Studie des EFD BALF abgeleitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Die Nutzung von Tieren und alle tierischen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) am Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) genehmigt.

(1) murinen alvéolaire Lavage Fluid (BALF) Sammlung und Aufbereitung

  1. BALF Sammlung
    1. Einschläfern Sie Mäuse mit einem Cocktail von Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) über die intraperitoneale Route gefolgt von zervikale Dislokation.
    2. Legen Sie eine 22 G Angiocatheter in der Luftröhre. Fügen Sie eine Insulin-Spritze mit 1 mL (mL) der eiskalten sterile Dulbecco Phosphat Puffer Kochsalzlösung (DPBS) und vermitteln Sie 1 mL DBPS in beiden Lungen durch die Angiocatheter zu.
    3. Ziehen Sie langsam den Spritzenkolben zum Abrufen von BALF und die BALF in ein 50 mL konische Röhrchen zu verzichten. Halten Sie die BALF auf Eis.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 3 x (4 X insgesamt in jedem Mausklick).
      Hinweis: Etwa 0,8 mL wird in der Regel pro Milliliter Instillation abgerufen. Auch die folgenden Schritte können für individuelle Mäuse (d.h.3 mL BALF) durchgeführt werden, aber die Isolierung eines größeren Batches von EVs aus Konsistenzgründen in nachgeschalteten Experimente ermöglicht Bündelung mehrerer BALF Proben.
  2. BALF Vorbereitung
    1. Bündeln Sie BALF aus 25 Mäuse zu und teilen sie in zwei gleiche Sätze (~ 35 mL pro aliquoten).
    2. Zentrifugieren Sie BALF bei 400 X g bei 4 ° C für 5 min, um Zellen und anderen zellularen Rückstand zu entfernen und den Überstand zu sammeln.
    3. Zentrifugieren des Überstands bei 1.500 x g bei 4 ° C für 10 min, um Zelle Ablagerungen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand zu und fahren Sie mit der EV-Isolierung-Schritten.

2. Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid

Hinweis: In dieser Studie, zwei EV Isolierungstechniken verwendet nämlich UFC und Ultrazentrifugation mit lebhaften, EVs aus BALF zu isolieren. Das ausführliche Protokoll der einzelnen Methoden wird nachfolgend beschrieben.

  1. Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) Bereicherung Methode
    Hinweis: Diese Methode wurde von einem zuvor beschriebenen Protokoll10geändert.
    1. Filtern Sie den Überstand von Schritt 1.2.3 durch einen 0,2 μm sterile Spritze Filter und halten Sie die gefilterten BALF auf Eis.
      Hinweis: Dies ist eine Abstufung der Ausgrenzung wobei nur Bläschen kleiner als 200 nm werden gesammelt.
    2. Equilibrate 100 kDa MWCO zentrifugale Filtereinheit mit sterilen DPBS für 10 min. Zentrifugen zentrifugale Einheit bei 1.500 x g für 10 min bei 4 ° C um die DPBS zu verwerfen.
      Achtung: Sobald die Membran in das Filter-Gerät mit DPBS equilibriert, muss die Membran gehalten werden nass in alle Zeit, bis das Gerät verwendet wird.
    3. Füllen Sie die Filtereinheit mit 15 mL BALF Probe aus Schritt 2.1.1 und Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Durchströmten BALF kann verworfen oder in einem separaten kanonische Rohr gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.1.3 für die verbleibenden 0,2 µm filtriert BALF.
      Hinweis: Es hat drei Wiederholungen des Centrifugations BALF EVs aus dem ursprünglichen Start Volumen von 35 mL ausreichend zu konzentrieren. Dies führte zu 1 – 1,5 mL Retentat.
    5. Waschen Sie das Retentat mit 14 mL sterile DPBS durch ein sanft Pipettieren wiederholt. Zentrifugieren Sie die Filtereinheit an 3.000 x g bei 4 ° C für 30 min, des DPBS entfernen und die EV Retentat konzentrieren.
    6. Sammeln Sie die konzentrierte BALF abgeleitet EVs aus dem Filter-Gerät durch Einfügen einer Pipette in die Unterseite des Geräts Filter und Aberkennung der Probe mit einer Seite zur anderen geschwungenen Bewegung um totale Erholung zu gewährleisten.
    7. Aliquot der EVs BALF abgeleitet und bei-80 ° C für weitere Teilchen Quantifizierung und Charakterisierung (siehe Schritt 3) zu speichern.
  2. Ultrazentrifugation (UC) mit Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC)
    Hinweis: Das folgende Protokoll wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll24geändert.
    1. Den Überstand von Schritt 2.1.1 in ein 37-mL Ultrazentrifugen Rohr übertragen und Zentrifugieren der Probe bei 10.000 x g für 30 min bei 4 ° C mit Ultrazentrifugen. Sammeln Sie die überstand und Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 60 Minuten. Während die EV-Pellets zentrifugiert werden, bereiten Sie Schritt 2.2.3 unterschiedliche Konzentrationen der Dichte-Gradienten-Puffer (Tabelle 1).
    2. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der EV-Pellets in 200 μl des DPBS.
    3. Mischen Sie die EV-Aufhängung mit 300 μl Arbeitslösung 50 % Iodixanol (Tabelle 1) und auf 15 mL Ultrazentrifugen Rohr übertragen. Auf die 50 % Iodixanol-EV Mischung Suspension, sequenziell Schicht folgende Pufferlösung in der Reihenfolge von unten nach oben: 30 % Iodixanol (4,5 mL), 25 % des Iodixanol (3 mL), 15 % Iodixanol (2,5 mL) und 5 % Iodixanol (6 mL). Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 230 min..
      Hinweis: Die Dichte-Gradienten basiert auf den Prozentsatz der Iodixanol Skalierung mit der höchsten Konzentration (50 %) an der Unterseite, die niedrigste Konzentration (5 %) an der Spitze. Um unterschiedliche Konzentrationen von Iodixanol zu erzeugen, wurden verschiedene Mengen von Homogenisierung Medium (Tabelle 1) mit funktionierende Lösung (50 % Iodixanol) gemischt.
    4. Sammeln Sie die 15 % und 25 % Anteil und in sterilen DPBS bringen die Lautstärke auf 15 mL zu verdünnen. Übertragen Sie sie auf eine neue kleine Ultrazentrifugen Rohr- und Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 60 Minuten.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der EV-Pellets in 50 μL der sterilen DPBS zur weiteren Charakterisierung.

(3) extrazelluläre Vesikel Quantifizierung

Hinweis: BALF abgeleitet EVs Erholung Ertrag ist mit zwei Metriken quantitated.

  1. Nanopartikel, die tracking-Analyse (NTA) Messung
    1. Die EV-Probe bei 1: 200 verdünnen – 1: 500 in 1 mL des DPBS und Belastung der Probe in einer Insulin-Spritze. Legen Sie eine Probe-Spritze auf eine Spritzenpumpe und zur Messung der Partikelanzahl und Größe (siehe Tabelle der Materialien) beginnen.
    2. 1 für alle Probemessungen der Kameraebene 14 und der Nachweisgrenze festgesetzt. Fünf sich wiederholende Messungen mit 1.500 Bilder in 30 s wurden für jede Probe mit einer Verzögerung von 20 s zwischen mal gelesen. Verbinden und die Daten für endgültige Konzentration und Größe Berichte im Durchschnitt.
      Hinweis: Für die genaue Erfassung aller Teilchen, der Pegel Kamera gegebenenfalls alle Partikel zu visualisieren und ähnliche Einstellungen für alle Probemessungen in jedem Experiment.
  2. Protein Quantifizierung
    Hinweis: Die Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay diente zur Messung der Proteinkonzentration der EVs BALF abgeleitet.
    1. Lösen Sie die EV-Proben in 1 X Lyse Puffer.
    2. Quantifizieren Sie die Menge an Protein in BALF abgeleitet EVs pro BCA Standardprotokoll mit kolorimetrischen Erkennung durch Messung der Extinktion bei 560 nm in einem Teller-Reader.

4. Nachweis von BALF abgeleiteten extrazellulären Vesikel

Hinweis: Allgemein bekannten Exosom Oberfläche Marker-Proteine (TSG101, CD63, CD81 und CD9) wurden zur EV Rückforderungen zu überprüfen durch SDS-PAGE und Immunoblotting und Flow Cytometry Analyse.

  1. SDS-PAGE und immunoblotting
    1. Auflösen einer gleichen Menge von EV Proteine jeder Probe mit ein Blot-Puffer (Lithium-Dodecyl-Sulfat) und 50 mM Dithiothreitol (DTT) in einem 1,6 mL Röhrchen werden geladen. Erwärmen Sie die Proben bei 70 ° C für 10 min.
    2. Die Proben aus 4.1.1 Schritt zu einem 4 – 12 % Bis-Tris Plus Acrylamid Gel laden und Ausführen von Elektrophorese (150 Volt, 35 mA) für 35 Minuten.
    3. Transfer-Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer trockenen Transfermethode.
    4. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Magermilch für 60 min bei Raumtemperatur (RT) rocken.
    5. Inkubieren Sie die Membran mit einem Antikörper zu einer EV Oberfläche Protein Marker, Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), 1: 500 Verdünnung in 5 % BSA in Tris gepufferte Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) bei 4 ° C über Nacht rocken.
    6. Am nächsten Tag waschen die Membran 3 x 10 min jeweils in TBST Puffer, waschen und mit Anti-Kaninchen IgG, ein HRP-linked Antikörper bei 1:5,000 Verdünnung für 60 min bei RT inkubieren
    7. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min jeweils waschen in TBST Puffer. Entwickeln Sie die Membran mit Chemilumineszenz HRP Antikörper-Erkennung-Reagenz und Bild (siehe Tabelle der Materialien für imaging-System).
  2. Durchflusszytometrie
    1. Verdünnen Sie BALF abgeleitet EVs in 49 μL der PEB Färbung Puffer (PBS + 5 mM EDTA + 0,5 % BSA, gefiltert durch eine Spritze-Filtermembran 0,1 μm).
    2. Jedes der folgenden Antikörper in jeder einzelnen Probe hinzufügen: 1) Ratte-Anti-Maus-PE CD63-Antikörper (100 ng pro Reaktion); (2) Ratte Anti-Maus PE CD81 (500 ng); (3) Ratte Anti-Maus FITC CD9 (200 ng). Bei 4 ° C, Schaukeln für 60 Minuten im Dunkeln inkubieren.
    3. Verdünnen Sie die Proben mit 450 μL der Membran gefiltert PEB Färbung Puffer und Proben zu Flow-Zytometrie-Analyse zu unterziehen (siehe Tabelle der Materialien)25.
    4. Passen Sie die Flow Cytometer Einstellungen wie folgt: 1) stellen alle Kanäle auf hyper-Protokoll (Hlog); (2) setzen Sie den Trigger auf SSC 4; (3) Schalten Sie die sekundäre Auslöser. Die Proben in eine langsame Einstellung laufen und mindestens 10.000 Veranstaltungen in jeder Probe zu erwerben.
    5. Niedrige Zytometrie Datenanalyse in jeder Probe mit Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wir führten EV Isolation aus Maus BALF Methoden UFC und UC-DGC Isolierung am selben Tag. Die UFC-Methode benötigt ca. 2,5-3 h, während die UC-DGC-Technik 8 h Verarbeitungszeit erforderlich. Dies beinhaltete nicht Puffern und Reagenz Vorbereitungszeit. Es sei darauf hingewiesen, dass einige andere Aufgaben während der Zentrifugation lange Perioden durchgeführt werden konnte. Die gesamte Prozedur dauerte jedoch fast einen ganzen Tag für die UC-DGC-Isolierung-Technik.

BALF abgeleitet EVs von normalen Mäusen isoliert von der UFC-Methode angezeigt eine kleinere Größe und eine gleichmäßigere Größenverteilung (148.8 ± 1,1 nM, Abb. 1A) im Vergleich zu UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, Abbildung 1 b). Die UFC-Technik hatte eine profunde 65-fold größere Partikel insgesamt zählt im Vergleich zu UC-DGC Isolierung (29,4 ± 18,4 vs. 0,5 ± 0,1 x 1010 Partikel; p < 0,05; Tabelle 2 und Abbildung 1). Die Gesamt-Protein Erholung (µg) der UFC EVS war auch höher (3.136 ± 1.860 vs. 73,7 ± 38,3 µg; p < 0,05; Tabelle 2 und Abbildung 1). So UFC ist Zeit und Aufwand effizient und bietet eine höhere Ausbeute der EV.

Um weitere phänotypisch BALF abgeleitet EV Bevölkerung charakterisieren, untersuchten wir die Anwesenheit von allgemein bekannten Exosom Oberfläche Protein-Marker: CD63, CD9 und CD81 durch Durchflusszytometrie und TSG101 durch Immunoblotting. Mit Flow-Zytometrie-Analyse, wir gezeigt, dass UFC EVs und UC-DGC EVs CD63 ausgedrückt (Abbildung 2A -2 C), CD9 (Abb. 2D -2F), und CD81 (Abbildung 2 -2I). Der geometrische Mittel Ausdruck (gMFI) von CD63, CD9 und CD81 war quantifizierte und nicht statistisch anders zwischen den zwei Bedingungen (Abbildung 3A -3F).

Als nächstes haben wir einen weiteren EV Protein Marker, TSG101, durch Immunoblotting geprüft. Wir zeigten, dass die 20 µg der UFC durchströmten (UFC-FT) Probe enthielt nicht TSG101 Proteine, was darauf hindeutet, dass die UFC Isolation Technik effizient ausgewählt und die EV-Bevölkerung aus dem BALF-Beispiel (Abbildung 4 erhalten). Wenn gleiche Mengen von Gesamt-Protein (20 µg) aus der BALF-EV-Probe geladen wurde, fanden wir, dass UFC EVs ein höheres Maß an TSG101 als UC-DGC EVs (Abbildung 4) ausgedrückt. Wir zeigten auch, dass die Reinheit des UFC-EV Protein akzeptabel, von einer einzigen isolierten Protein-Band unter Beweis gestellt.

Für alle Ergebnisse, der Student t-Test für zwei-Gruppenvergleich verwendet wurde. Die Ergebnisse werden als ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) bedeuten, und p < 0,05 galt als bedeutende.

Figure 1
Abbildung 1: Ultrafiltration Zentrifugieren murine alvéolaire Lavage Fluid (BALF)-abgeleitete EVs demonstriert eine homogenere Größenverteilung haben als Ultrazentrifugation mit Dichte Gradienten Zentrifugieren murine BALF abgeleitet EVS und hatte eine deutlich höhere total Count und Protein Partikelgehalt. Die Verteilung der Partikelgrößen EV wurde durch Nanopartikel tracking-Analyse (NTA) gemessen, und der Gesamtproteingehalt wurde durch die Bicinchoninic Säure Assay gemessen. (A) UFC-BALF EFD NTA Größe Verteilungsdiagramm. (B) UC-DGC-BALF EVs Größe Verteilungsdiagramm. (C) insgesamt Partikelzählung von NTA (meine ± SEM X 1010 Partikel; * p < 0,05). (D) Gesamtproteingehalt (in µg, * p < 0,05). Die Daten wurden von drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. UFC: Ultrafiltration Zentrifugation; UC-DGC: Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung; EFD: extrazelluläre Vesikeln; SD: Standardabweichung; Konz: Konzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Murine alvéolaire Lavage Flüssigkeit abgeleitet EVs durch Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert und Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Methoden ausgedrückt Tetraspanin Proteine CD63, CD9 und CD81. Gezeigt werden Prozentsätze des EFD gefärbt positiv von der UFC und UC-DCG Isolationstechniken, illustriert von Pseudofarben Grundstücke (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9, undG - IchPE-CD9. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. UFC = Ultrafiltration Zentrifugation; UC-DGC = Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung; EFD = extrazelluläre Vesikeln; SSC-A = Side Scatter Analyse; PE = Phycoerythrin; FITC = Fluorescein erfolgt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert murinen alvéolaire Lavage Fluid-abgeleitete EVs ausgedrückt eine ähnliche fluoreszierende Dichte von Tetraspanin Proteine Ultrazentrifugation isoliert EVs. (A und D) Histogramm und geometrischen Mittelwert Ausdruck (gMFI) von PE-CD63+-EVs gebeizt. (B und E) Histogramm und gMFI der FITC-CD9+-EVs gebeizt. (C und F) Histogramm und gMFI von PE-CD81+-EVs gebeizt. Diese Daten werden von drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. UFC: Ultrafiltration Zentrifugation; UC-DGC = Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung; EFD: extrazelluläre Vesikeln; SSC-A: Side Scatter Analyse; PE: Phycoerythrin; FITC: Fluorescein erfolgt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Murine alvéolaire Lavage Flüssigkeit abgeleitet EVs durch Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert und Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung Methoden ausgedrückt das Exosom Oberfläche Protein, TSG101. Dieses Panel zeigt die Immunoblotting der murinen BALF abgeleitet EVs für den TSG101 Antikörper (47 kDa). UFC = Ultrafiltration Zentrifugation; UC-DGC = Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung; EFD = extrazelluläre Vesikeln; FT = Durchfluss; TSG = Tumor Anfälligkeit gen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Arbeitende Lösung Iodixanol (%) 5 15 25 30
Arbeitslösung (mL)* 2 6 10 12
Homogenisierung Medium (mL)* 18 14 10 8

Tabelle 1: Dichte-Gradienten-Puffer. Diese Tabelle gibt die Zusammensetzung und Puffer-Verhältnis jeder Farbverlauf Lösung, die verwendet wurde, um murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeit abgeleiteten extrazellulären Vesikel Populationen durch Ultrazentrifugation Technik isoliert zu reinigen. * Die Arbeitslösung war 50 % Iodixanol (25 mL Dichte Gradienten Medium [siehe Tabelle der Materialien] + 5 mL diluent Lösung [pH 7.4 0,25 M Saccharose + 120 mM HEPES + 0,9 M NaCl]). ** Homogenisierung Medium (pH 7.4 von 0,25 M Saccharose + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)

Methoden Ab Volumen (mL) NTA* (x 10-8-/μL) TotalPartikel (X1010) Protein Conc (µg/µL) Insgesamt Proteine§ (µg)
UFC 35 7.69 ± 2,6 29,4 ± 18,4 3.7 3.136 ± 1860
UC-DGC 35 0,5 ± 0,05 0,5 ± 0,1 0,6 73,7 ± 38,3

Tabelle 2: die Ultrafiltration Zentrifugation isoliert Methode bereitgestellt, eine hohe murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeit abgeleiteten extrazellulären Vesikel Ausbeute. Die Partikelkonzentration und total Partikelzählung wurden durch Nanopartikel tracking-Analyse (NTA) gemessen. Die Proteinkonzentration und Gesamtbetrag des Proteins wurden durch ein Bicinchoninic sauren Protein Assay gemessen. * BALF EVs Partikelkonzentration (Mittelwert ± SEM X 108/μL aus drei unabhängigen Experimenten).  BALF EVs insgesamt Partikel (Mittelwert ± SEM x 1010 Partikel von drei unabhängigen Experimenten).  BALF EVs Proteinkonzentration (Mittelwert ± SEM µg/µL aus drei unabhängigen Experimenten). § BALF EVs Gesamt-Protein (Mittelwert ± SEM mg aus drei unabhängigen Experimenten).
UFC: Ultrafiltration Zentrifugation; UC-DGC: Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung; Konz: Konzentration; NTA: Nanopartikel tracking-Analyse; SEM: Standardfehler des Mittelwerts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler die Bedeutungen der EVs in zelluläre Homöostase entwirrt. Noch wichtiger ist, spielen die EVs Hauptrollen in vielen Krankheitsprozessen durch Modulation der benachbarten und weit entfernten Zellen durch ihre Ladung bioaktiven Moleküle1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. zukünftige Entwicklung und Fortschritt in diesem Bereich grundlegend verlassen sich auf zuverlässige und effiziente Methoden, die nicht nur erkennen und korrigieren Teilmengen der EV Bevölkerung aber auch die Erhaltung ihrer biologischen Funktionen für downstream-Anwendungen 10 , 11 , 14 , 31. in der aktuellen Studie beschrieben wir eine Nanomembrane Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) Methode zur EVs von Maus BALF zu isolieren. In Übereinstimmung mit anderen Berichten haben wir gezeigt, dass UFC einfach ist und zu einer hohen Ausbeute und Reinheit führt und eignet sich somit für kleine biologische Proben10,17,18,32 .

UC-DGC wird häufig verwendet und gilt als der Goldstandard-Technik für EV Isolation weil es hochgereinigte EV Partikel10,14bietet. Aber diese Methode ist technisch umständlich, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und hat geringe Skalierbarkeit. Die neu entwickelten Mikrofluidik-basierten Techniken, diese Grenzen überwinden, aber dieser Ansatz erfordert weitere Validierung, bevor es vollständig als eine alternative Methode33,34umgesetzt werden kann. Daher sind geeignete Methoden, die diese Schwierigkeiten unterbringen, ohne die Reinheit und die Skalierbarkeit der Proben bitter nötig, besonders für kleinvolumige biologischen Flüssigkeit.

Wir bewiesen, dass UFC mit einem Nanomembrane Filter Gerät effektiv für die EV-Isolierung aus BALF Proben war. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die Überlegenheit des UFC-Verfahrens im Vergleich zu den Goldstandard UC-DGC Methode wegen seiner Einfachheit und höhere Skalierbarkeit. Die Ultrafiltration basierenden Ansatz geworden weit angenommen, um EV aus einer Vielzahl von biologischen Proben isolieren: Urin35, Zelle konditioniertes Medien17und fötalen Rinderserum36. Die andere modulare Größe-basierte EV Isolation Technik, die Ultrafiltration als Plattform verwendet ist Exosom totaler Isolation Chip (exotische)31. Diese Methode eignet sich auch für kleine Stichprobengröße Exemplare. Einige Faktoren, wie z. B. Filtermaterial und die Porengröße der Nanomembranes müssen berücksichtigt werden, wenn die UFC-Technik zu verwenden, da sie die Eigenschaften des wiederhergestellten EFD zu beeinträchtigen. Verschiedene Arten von Filtermembranen führte beispielsweise unterschiedliche EV-assoziierter RNA Erholung Erträge aus Urin18. In dieser Studie zeigten wir, dass regenerierte Zellulose (RC) mit einer 10 kDa MWCO den höchsten Ausdruck der mRNA von NOP10, OST4, SNRPG und TOMM7 im Vergleich zu Hydrosart 10 kDa oder Polyethersulfone (PES) 10 kDa18. Wir zeigte weiter, dass die RC mit 10 kDa eine höhere Retentat EV Erholung als 100 kDa hatte. Andere haben Urin EVs Fracht Inhalte gekennzeichnet, die durch die Art der Isolierung Techniken37betroffen waren. Unsere Studie zeigte, dass die 100-kDa MWCO RC Membran eine zufriedenstellende BALF abgeleitet EV-Ausbeute mit den Vorteil, viel weniger unerwünschte Proteine in das Retentat aufgrund der größeren MWCO zur Verfügung gestellt.

Diese Studie zeigte, dass die Größen und Größenverteilung der UFC EVs kleiner und mehr homogen verteilten als jene des UC-DGC EFD. Vesikel-Aggregation, die gemeinsam mit UC-Techniken ist, kann die Dimension Heterogenität der UC-DGC EVs38erklären. Wir beurteilen BALF abgeleitet EV Reinheit durch den Nachweis der Membranproteine EV TSG101, CD63, CD9 und CD81, das bestätigt das Vorhandensein von Exosome in der Retentates. Wir und andere haben auch TEM verwendet, um die Morphologie des UFC EVs35,39,40,41zu demonstrieren. Liu Et Al. verwendet einen ähnlichen Ultrafiltration-basierten Ansatz, um EVs zu isolieren und im Vergleich zum EFD durch Ultrazentrifugation isoliert die Proteomik und transkriptomischen Profile wurden ähnliche31. So beschreiben wir eine Ultrafiltration Zentrifugation Methode eine regenerierte Zellulose-Membran mit einer MWCO von 100 kDa als alternatives EV Isolation Verfahren, das für kleine biologische flüssige Proben wie alvéolaire Lavage Fluid geeignet ist.

Die entscheidenden Schritte mit diesem UFC-Ansatz, um EVs aus biologischen Flüssigkeit zu isolieren sind die ersten nanoporöse 0,2 µm Membranfiltration um sicherzustellen, dass die angereicherten Partikel im Größenbereich der Exosomal und die Vermeidung von zusätzlichen Kraftaufwand können beschädigt oder verformt die Exosom Morphologie und Strukturen10,42. EFD können die Filtration Membran führt zu geringeren Skalierbarkeit einhalten. Daher sollte das Volumen der Probe die empfohlene Menge in jede Art von Filtereinheit nicht überschreiten. Wir entschieden uns für regenerierte Zellulose zu verwenden, die eine höhere Ausbeute der mRNA von Urin abgeleitet EVs18zur Verfügung gestellt. Die Art der verwendeten Filtermembranen kann die Wiederherstellung Ertrag und Art der EVs verändern. Schließlich, obwohl eine MWCO von 100 kDa die Mehrheit der Proteine in den biologischen Flüssigkeiten beseitigen sollten, wurden einige Protein-Verunreinigungen, die größer als 100 kDa oder Protein-Aggregate waren43beobachtet. In diesem Fall ist ein Waschschritt kritisch, EV und Protein Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus müssen funktionelle Studien richtig um vollständig interpretieren die Ergebnisse kontrolliert werden, wie EV-assoziierte Proteine in der UFC-EVs anwesend sein werden.

Wir schließen, dass UFC ein alternativer Ansatz für EV Isolation für kleine oder größere Mengen möglich ist. Die derzeit verfügbaren Mikrofilter Einheiten bietet Platz für bis zu 15 mL Proben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Arbeit wird von der NHLBI/NIH räumt HL103868 (P.C.) und HL137076 (für PC), American Heart Association Beihilfe (für PC) und Samuel erste umfassende Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (für PC) unterstützt. Wir möchten unsere große Smidt Heart Institute im Cedars-Sinai Medical Center danken, die uns eine Nanosight Maschine für EV Nanopartikel tracking-Analyse bietet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20 G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany -
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA -
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK - To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany -
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA -
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Tags

Immunologie und Infektion Ausgabe 141 extrazelluläre Vesikel Exosomen Ultrafiltration Zentrifugation Ultrazentrifugation Isolation Technik alvéolaire Lavage-Flüssigkeit
Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parimon, T., Garrett III, N. E.,More

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter