Summary
כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.
Abstract
חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם מרכיבים subcellular שהתגלתה לשחק תפקידים חשובים רבים ביולוגית איתות פונקציות במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בידודו של EVs ממשיכה להיות אתגר גדול בתחום זה, בשל מגבלות מהותי כל טכניקה. Ultracentrifugation דיפרנציאלי בשיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות היא גישה נפוץ והוא נחשב להיות ההליך תקן הזהב לבידוד EV. עם זאת, הליך זה גוזלת זמן, עתירי עבודה, ותוצאות בדרך כלל מדרגיות נמוכה, אשר ייתכן שלא יתאים לדוגמאות בנפח מצומצם כמו נוזל שטיפה bronchoalveolar. נדגים שיטה בידוד אולטראפילטרציה צנטריפוגה היא פשוטה וזה ואת העבודה-היעילה עדיין מספקת תשואה גבוהה טוהר. אנו מציעים כי שיטה זו בידוד יכול להיות גישה חלופית מתאימה לבידוד EV, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות בנפח מצומצם.
Introduction
Exosomes המשנה הקטן ביותר של EVs, 50 – 200 ננומטר בקוטר, יש מספר תפקודים ביולוגיים על פני מערך מגוון של איתות תהליכים1,2,3,4,5. הם חלים על הומאוסטזיס הסלולר ורקמות בעיקר על ידי הקלת תקשורת המערכת באמצעות מטען מולקולות כמו שומנים, חלבונים וחומצות גרעין6,7,8,9 . צעד קריטי במחקר EV הוא תהליך בידוד. Ultracentrifugation דיפרנציאלית (UC), עם או בלי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC), נחשב הגישה תקן זהב, אך שיטה זו נושאת מגבלות הגדולות, כולל המחירים לא יעיל של שחזור EV, מדרגיות נמוכה10 , 11 , 12, זה להגביל את הניצול הטוב ביותר כדי דגימות נפח גדול יותר, כגון תא תרבות exosome supernatant או גבוהה ייצור דגימות. היתרונות והחסרונות של שיטות אחרות, כגון גודל הדרה אולטראפילטרציה או כרומטוגרפיה, בידוד immunoaffinity על-ידי חרוזים או עמודות ולאחר מיקרופלואידיקה, מתוארים היטב, נהלים משלימה המודרנית פותחו כדי להתגבר על ולצמצם את מגבלות טכניות כל גישה11,12,13,14,15. אחרים הראו כי צנטריפוגה אולטראפילטרציה (UFC) עם קרום nanoporous ביחידה מסנן הוא טכניקה חלופית המספק טוהר דומות ל UC שיטת16,17,18. טכניקה זו יכולה להיחשב באחת השיטות בידוד חלופי.
נוזל שטיפה Bronchoalveolar (BALF) מכיל EVs שקיימים מספר תפקודים ביולוגיים שונים מערכת הנשימה תנאים19,20,21,22. לומדת EVs BALF-derived כרוך כמה אתגרים בשל invasiveness של ההליך ברונכוסקופיה אצל בני אדם, כמו גם כמות מוגבלת של שחזור נוזל שטיפה. בחיות מעבדה קטנה כגון עכברים, רק כמה מיליליטר ניתן לשחזר בתנאי ריאות רגילה, אפילו פחות הריאות מודלק או שהותירה23. כתוצאה מכך, איסוף כמות מספקת של BALF EV בידוד על ידי ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור יישומי הזרם לא יכול להיות ריאלי. אולם, בידוד אוכלוסיות EV הנכון הוא גורם מכריע ללמוד תפקודים ביולוגיים EV. האיזון העדין בין היעילות ומועילות ימשיך להיות אתגר בשיטות בידוד ומבוססת EV.
במחקר הנוכחי, נדגים כי בגישה אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, ניצול 100 kDa משקל מולקולרי ניתוק (MWCO) nanomembrane מסנן יחידה, מתאים בנפח מצומצם דגימה ביולוגית כגון BALF. טכניקה זו פשוטה, יעילה, ומספק טוהר גבוהה ומדרגיות לתמוך המחקר של EVs נגזר BALF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניצול בעלי החיים ואת כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות (IACUC) בבית Cedars-Sinai רפואי במרכז (CSMC).
1. מאתר Bronchoalveolar שטיפה נוזל (BALF) אוסף והכנות
- אוסף BALF
- המתת חסד עכברים עם קוקטייל של קטאמין (300 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג) דרך המסלול בקרום הבטן ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- הכנס angiocatheter 22 גרם לתוך קנה הנשימה. צירוף של מזרק אינסולין המכיל 1 מיליליטר (מ"ל) מאגר פוספט תמיסת מלח הקר Dulbecco סטרילי של (DPBS), להחדיר 1 מ"ל של DBPS לתוך שתי הריאות דרך angiocatheter.
- לסגת לאט על הבוכנה מזרק כדי לאחזר BALF לוותר על BALF לתוך צינור חרוטי 50-mL. שמור את BALF על הקרח.
- חזור על שלבים 1.1.2 ו 1.1.3 3 x (4 x סה כ כל עכבר).
הערה: כ 0.8 מ ל מאוחזר באופן כללי למיליליטר של החדרה. בנוסף, ניתן לבצע את הפעולות הבאות עבור עכברים בודדים (קרי, 3 מ"ל של BALF), אך צירוף מספר דוגמאות BALF יאפשר את הבידוד של אצווה גדול יותר של EVs עקביות בניסויים במורד הזרם.
- הכנה BALF
- הבריכה BALF של עכברים 25, מחלקים אותו שתי קבוצות שוות (~ 35 מ לכל aliquot).
- Centrifuge את BALF ב 400 x g, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, כדי להסיר תאים ופסולת סלולר אחרות ולאסוף את תגובת שיקוע.
- Centrifuge את תגובת שיקוע ב g 1,500 x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי להסיר שאריות תאים. לאסוף את תגובת שיקוע והמשך אל השלבים בידוד EV.
2. בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר
הערה: במחקר זה, טכניקות בידוד 2 EV, כלומר UFC ultracentrifugation עם קליל להשתמש כדי לבודד EVs מן BALF. פרוטוקול מפורט של כל אחת מהשיטות המתוארות להלן.
-
שיטת העשרה צנטריפוגה (UFC) אולטראפילטרציה
הערה: שיטה זו שונה מן הפרוטוקול שתואר לעיל10.- לסנן את תגובת שיקוע מהשלב 1.2.3 דרך מסנן סטרילי מזרק μm 0.2 ולשמור את BALF מסוננים על קרח.
הערה: זהו צעד אי-הכללה של גודל לפיה רק שלפוחית קטנה יותר 200 ננומטר נאספים. - Equilibrate יחידת צנטריפוגלי מסנן 100 kDa MWCO עם DPBS סטרילי עבור 10 דקות צנטריפוגה יחידת צנטריפוגלי ב g 1,500 x 10 דקות ב 4 ° C כדי למחוק את DPBS.
התראה: ברגע הקרום במכשיר מסנן הוא equilibrated עם DPBS, הקרום חייב להישמר רטובה כל הזמן עד המכשיר משמש. - תמלא את יחידת מסנן עם 15 מ"ל מדגם BALF מהשלב 2.1.1 צנטריפוגה ב 3,000 x g למשך 30 דקות ב 4 º C. BALF זרימה דרך יכולה להיות שנמחקו או נאספים לתוך צינור הקנוני נפרד ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- חזור על צעד 2.1.3 BALF הנותרים מיקרומטר-מסוננים 0.2.
הערה: זה לקח שלוש חזרות של centrifugations להתרכז מספיק של EVs BALF מאמצעי האחסון המוצא המקורי של 35 מ. כתוצאה מכך 1 – 1.5 מ ל retentate. - לשטוף את retentate עם 14 מ של DPBS סטרילי מאת בעדינות pipetting שוב ושוב. Centrifuge יחידת מסנן ב g x 3000, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי להסיר את DPBS וכדי לרכז את retentate EV.
- לאסוף את EVs BALF-derived מרוכז המכשיר מסנן על-ידי הוספה של pipettor לתוך החלק התחתון של המכשיר מסנן פורש את הדגימה באמצעות תנועה גורף מצד לצד כדי להבטיח התאוששות מוחלטת.
- Aliquot EVs BALF-derived ואחסן אותם ב- 80 ° C עבור עוד חלקיק כימות ואפיון (ראה שלב 3).
- לסנן את תגובת שיקוע מהשלב 1.2.3 דרך מסנן סטרילי מזרק μm 0.2 ולשמור את BALF מסוננים על קרח.
-
Ultracentrifugation (UC) עם צפיפות קליל הדרגתיות צנטריפוגה (DGC)
הערה: להלן כללי התנהגות שונה מן הפרוטוקול שתואר לעיל24.- להעביר את תגובת שיקוע מהשלב 2.1.1 לתוך צינור ultracentrifuge 37-mL, centrifuge את הדגימה ב g 10,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge. לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בעוד כדורי EV הם centrifuged, להתכונן צעד 2.2.3 ריכוזים שונים של מאגרי הדרגתיות צפיפות קליל (טבלה 1).
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי EV ב 200 μL של DPBS.
- לערבב את המתלים EV עם 300 μL של הפתרון עובד 50% iodixanol (טבלה 1), להעביר אותו הצינור ultracentrifuge 15 mL. מעל 50% iodixanol-EV תערובת ההשעיה, ברצף שכבה של בופר הבאים לפי הסדר מלמטה למעלה: 30% iodixanol (4.5 מ ל), 25% של iodixanol (3 מ ל), iodixanol 15% (2.5 מ ל) iodixanol 5% (6 מ"ל). צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 ° C 230 דקות.
הערה: מעבר הצבע צפיפות קליל מבוסס על אחוז iodixanol קנה מידה עם הריכוז הגבוה ביותר (50%) בתחתית כדי הריכוז הנמוך ביותר (5%) בחלק העליון. ליצירת ריכוזים שונים של iodixanol, כמויות שונות של המגון בינוני (טבלה 1) היו מעורבים עם הפתרון עובד (50% iodixanol). - לאסוף את השבר 15% ו- 25% ו לדלל אותם ב DPBS סטרילי כדי להביא את הווליום עד 15 מ"ל. מעבירים צינור קטן ultracentrifuge חדש, צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend EV כדורי ב- 50 μL של DPBS סטרילי עבור אפיון נוסף.
3. חוץ-תאית שלפוחית כמת
הערה: התשואה שחזור EVs BALF, נגזר quantitated עם שני מדדים.
- ננו-חלקיק מעקב מדידה ניתוח (נ)
- לדלל את הדגימה EV-1:200 – שבערך ב 1 מ"ל של DPBS, טען המדגם לתוך מזרק אינסולין. לצרף מזרק מדגם מזרק משאבה ולהתחיל למדוד את מספרי החלקיקים ואת גודל (ראה טבלה של חומרים).
- הגדר את רמת המצלמה-14 והסף זיהוי של כל המדידות לדוגמה ב- 1. חמש מדידות חוזרות עם מסגרות 1,500 ב 30 s הוקלטו כל דגימה, באיחור של 20 s בין פעולות הקריאה. לשלב, הנתונים עבור ריכוז סופי ודוחות בגודל ממוצע.
הערה: עבור לכידת מדויק של כל החלקיקים, להתאים את רמת המצלמה לפי הצורך לדמיין כל החלקיקים הגדרות דומות ולהשתמש למדידות מדגם כל ניסוי.
- חלבון כמת
הערה: חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו חלבון שימש כדי למדוד את ריכוז חלבון EVs נגזר BALF.- Solubilize הדגימות EV במאגר פירוק x 1.
- לכמת את כמות חלבון EVs BALF-derived לכל פרוטוקול סטנדרטי BCA באמצעות זיהוי ערכי צבע מוחלטים על ידי מדידה של ספיגת-560 nm, קורא את הצלחת.
4. זיהוי של BALF, נגזר שלפוחית חוץ-תאית
הערה: חלבונים סמן משטח מה שנקרא exosome (TSG101, CD63, CD81 ו CD9) שימשו כדי לוודא EV ושחזורים מרחביות-דף ולאחר immunoblotting הזרימה cytometry וניתוח.
- מרחביות-דף ו- immunoblotting
- להמיס כמות שווה של EV חלבונים של כל דגימה עם טעינת מאגר (ליתיום dodecyl סולפט) ו- 50 מ מ dithiothreitol (DTT) צינור 1.6 mL סופג. מחממים את הדגימות-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לטעון את הדגימות מהשלב 4.1.1 לתוך 4 – 12% Bis-טריס פלוס אקרילאמיד ג'ל ולהפעיל אלקטרופורזה (150 וולט, 35 mA) למשך 35 דקות.
- העברת החלבונים קרום ניטרוצלולוזה באמצעות שיטת העברה יבש.
- לחסום את הקרום עם 5% חלב כחוש במשך 60 דקות, נדנדה בטמפרטורת החדר (RT).
- דגירה הקרום עם נוגדן ל סמן חלבון משטח EV, הגידול הרגישות ג'ין 101 (TSG101), בדילול שבערך ב- BSA 5% ב באגירה טריס מלוחים Tween-20 (TBST) ב 4 ° C, מתנדנד בין לילה.
- למחרת, לשטוף את הקרום 3 x, 10 דקות כל אחד, מאגר TBST, וקונטה דגירה זה עם הארנב אנטי איג, נוגדן HRP-מקושרים, ב 1:5,000 דילול עבור 60 דקות ב- RT.
- לשטוף את הקרום 3 x, 10 דקות כל אחד לשטוף, במאגר TBST. לפתח הקרום עם chemiluminescent ריאגנט לזיהוי נוגדנים HRP ותמונה (ראה טבלה של חומרים עבור מערכת הדמיה).
- Cytometry זרימה
- לדלל נגזר BALF EVs ב 49 μL של PEB מכתים מאגר (PBS + EDTA 5 מ מ + 0.5% BSA, מסונן דרך קרום מסנן מזרק 0.1 μm).
- להוסיף את כל הנוגדנים הבאים לתוך כל דגימה בודדת: 1) עכבר עכבר אנטי PE CD63 נוגדנים (100 ng לכל תגובה); 2) עכבר עכבר אנטי PE CD81 (500 ng); 3) עכבר אנטי-עכבר FITC CD9 (200 ng). דגירה ב 4 ° C, נדנדה עבור 60 דקות בחושך.
- לדלל את הדגימות עם 450 μL של ממברנה-מסוננים PEB מכתים מאגר ונושא את הדגימות לניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים)25.
- התאם את ההגדרות cytometer תזרים כדלקמן: 1) להגדיר את כל הערוצים ב- hyper יומן (hlog); 2) שוכן על ההדק על האס-4; 3) לבטל את הגורם המשני. הפעל את הדגימות באווירה במהירות נמוכה של רכוש לפחות 10,000 אירועים בכל מדגם.
- לבצע ניתוח נתונים cytometry נמוך בכל מדגם באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו EV בידוד מן העכבר BALF באמצעות שיטות בידוד UFC, UC-DGC באותו יום. השיטה UFC נדרש כ 2.5-3 h, ואילו הטכניקה UC-DGC נדרש 8 שעות של זמן העיבוד. זה לא כללו buffers וריאגנט זמן הכנה. יצוין, כי היתה אפשרות לבצע מספר משימות אחרות בתקופות ארוכות צנטריפוגה. ובכל זאת, כל ההליך נמשך כמעט יום שלם UC-DGC בידוד הטכניקה.
EVs BALF, נגזר מן עכברים רגילה מבודדים בשיטת UFC מוצג גודל קטן יותר, התפלגות גודל אחיד (148.8 ± 1.1 ננומטר, איור 1A) בהשוואה ל- UC-DGC EVs (nM 176.7 ± 7.8, איור 1B). הטכניקה UFC הייתה עמוקה של החלקיקים הכולל גדול 65-fold נחשב בהשוואה ל- UC-DGC בידוד (29.4 ± 18.4 לעומת 0.5 ± 0.1 x 1010 חלקיקים; p < 0.05; בטבלה 2 , איור 1C). השבת הכוללת חלבון (ב µg) EVs UFC היה גם גבוה יותר (± 1,860 3,136 לעומת 73.7 µg ± 38.3; p < 0.05; בטבלה 2 , איור 1D). לפיכך, UFC הוא זמן, מאמץ-יעיל ומספק תשואה גבוהה יותר EV.
נוסף phenotypically לאפיין אוכלוסיות נגזר BALF EV, בדקנו הנוכחות של מה שנקרא exosome הדם שלה: CD63, CD9 ו- CD81 על ידי cytometry זרימה, TSG101 על ידי immunoblotting. באמצעות ניתוח cytometry זרימה, הפגנו UFC EVs וגם UC-DGC EVs מבוטא CD63 (איור 2A -2 C), CD9 (איור דו-ממדי -2F), ו- CD81 (איור 2G -2I). הביטוי הגאומטרי (gMFI) של CD63, CD9, CD81 היה כימות ו לא שונה סטטיסטית בין שני התנאים (איור 3 א -3F).
בשלב הבא, נבחנו אחר EV סמן חלבון, TSG101, על-ידי immunoblotting. הראינו כי µg 20 המדגם UFC זרימה דרך (UFC-FT) אינה מכילה חלבונים TSG101, רומז כי הטכניקה בידוד UFC ביעילות שנבחרו, נשמר האוכלוסייה EV מדגם BALF (איור 4). כאשר שווה בכמות החלבון הכולל (20 µg) מדגם BALF-EV היה טעון, מצאנו כי UFC EVs הביעו רמה גבוהה יותר של TSG101 מאשר UC-DGC EVs (איור 4). גם הראנו כי הטוהר של חלבון UFC-EV היה מקובל, הפגינו על ידי להקה אחת חלבון מבודד.
עבור כל התוצאות, הסטודנט t-מבחן שימש עבור שתי קבוצות השוואה. התוצאות מוצגות אומר SEM ± (שגיאת התקן של הממוצע), p < 0.05 נחשב משמעותי.
איור 1: אולטראפילטרציה צנטריפוגה של נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar (BALF)-EVs נגזר הפגינו התפלגות גודל יותר הומוגנית יותר ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי של EVs BALF-derived מאתר והיה ספירת חלקיקים הכולל גבוה משמעותית ותוכן חלבון. התפלגות גודל החלקיקים EV נמדדה על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ), תכולת החלבון הכולל של נמדדה על ידי וזמינותו חומצה bicinchoninic. '(א) UFC-BALF EVs נ גרף התפלגות גודל. גרף התפלגות גודל של EVs (B) UC-DGC-BALF. ספירת חלקיקים הכולל (C) על ידי נ (זאת אומרת ± SEM x 1010 חלקיקים; * p < 0.05). תכולת החלבון הכולל (D) (ב- µg, * p < 0.05). הנתונים היו נגזר 3 ניסויים עצמאית. UFC: אולטראפילטרציה צנטריפוגה; UC-DGC: ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי; EVs: שלפוחית חוץ-תאית; SD: סטיית תקן; ריכוז או משחק: ריכוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שטיפה bronchoalveolar מאתר נוזל נגזר EVs מבודדת על ידי צנטריפוגה אולטראפילטרציה והביע ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות שיטות חלבונים tetraspanin CD63, CD9, CD81. המוצגים באחוזים של EVs מוכתמות. חיובי UFC, UC-DCG טכניקות בידוד, מאויר על ידי חלקות מדומה, עבור (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9, (G - אני) PE-CD9. הנתונים נגזרות 3 ניסויים עצמאית. UFC = אולטראפילטרציה צנטריפוגה; UC-DGC = ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי; EVs = שלפוחית חוץ-תאית; האס-א' = הצד פיזור ניתוח; PE = phycoerythrin; FITC = fluorescein isothiocyanate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שטיפה בודדים צנטריפוגה bronchoalveolar מאתר אולטראפילטרציה נוזל נגזר EVs הביע צפיפות פלורסנט דומה של חלבונים tetraspanin EVs בודדים ultracentrifugation. (A ו- D) היסטוגרמה הביטוי הגאומטרי (gMFI) של PE-CD63+-צבעונית EVs. (B ו- E) היסטוגרמה, gMFI של FITC-CD9+-צבעונית EVs. (C ו- F) היסטוגרמה, gMFI של PE-CD81+-צבעונית EVs. נתונים אלה נגזרות 3 ניסויים עצמאית. UFC: אולטראפילטרציה צנטריפוגה; UC-DGC = ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי; EVs: שלפוחית חוץ-תאית; האס-ת לצד פיזור ניתוח; PE: phycoerythrin; FITC: fluorescein isothiocyanate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שטיפה bronchoalveolar מאתר נוזל נגזר EVs מבודדת על ידי צנטריפוגה אולטראפילטרציה והביע ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות שיטות החלבון משטח exosome, TSG101. לוח זה מראה את immunoblotting של EVs מאתר BALF, נגזר על הנוגדן TSG101 (47 kDa). UFC = אולטראפילטרציה צנטריפוגה; UC-DGC = ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי; EVs = שלפוחית חוץ-תאית; רגל = זרימה דרך; TSG = גידול הרגישות ג'ין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון עבודה Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| הפתרון עובד (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| המגון בינוני (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
טבלה 1: מאגרי הדרגתיות צפיפות קליל. טבלה זו מעניקה יחס הרכב ואת מאגר של כל פתרון הדרגתי אשר שימש לטהר bronchoalveolar מאתר שטיפה נגזר נוזל חוץ-תאי שלפוחית אוכלוסיות מבודדות בטכניקת ultracentrifugation. הפתרון עובד היה 50% iodixanol (25 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות [ראה טבלה של חומרים] + 5 מ של פתרון diluent [pH 7.4 של 0.25 M סוכרוז + 120 מ מ HEPES + 0.9 M NaCl]). * * המגון בינוני (pH 7.4 של 0.25 M סוכרוז + 20 מ מ HEPES + 150 מ מ NaCl)
| שיטות | הפעלת אמצעי האחסון (mL) | נ* (x 108/μL) | סה כ חלקיקיםא (x1010) | חלבון ריכוז או משחק‡ (µg/µL) | חלבונים סה כ§ (µg) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29.4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0.5 ± 0.05 | 0.5 ± 0.1 | 0.6 | 73.7 ± 38.3 |
בטבלה 2: שיטת בידוד צנטריפוגה אולטראפילטרציה סיפקה תשואה גבוהה bronchoalveolar מאתר שטיפה נגזר נוזל חוץ-תאי שלפוחית. ריכוז החלקיקים ואת ספירת חלקיקים הכולל נמדדו על ידי ננו-חלקיק מעקב ניתוח (נ). ריכוז חלבון ואת הסכום הכולל של חלבון נמדדו על ידי assay חלבון חומצה bicinchoninic. * ריכוז החלקיקים של EVs BALF (זאת אומרת ± SEM x 108/μL מ 3 ניסויים עצמאית). א החלקיקים הכולל של EVs BALF (זאת אומרת ± SEM x 10 חלקיקים10 מ 3 ניסויים עצמאית). ‡ ריכוז החלבון של EVs BALF (זאת אומרת ± SEM µg/µL מ 3 ניסויים עצמאית). § חלבון הכולל של EVs BALF (זאת אומרת ± SEM מ ג מ 3 ניסויים עצמאית).
UFC: אולטראפילטרציה צנטריפוגה; UC-DGC: ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתי; ריכוז או משחק: ריכוז; נ: ננו-חלקיק מעקב ניתוח; SEM: שגיאת התקן של הממוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב העשורים האחרונים, מדענים יש פרם את חשיבות של EVs בהומאוסטזיס הסלולר. וחשוב מכך, EVs לשחק תפקידים עיקריים בתהליכים רבים של המחלה על ידי להתכוונן תאים שכנים ומרוחק דרך שלהם מטען ביואקטיביות מולקולות1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. העתיד בפיתוח וקידום בתחום זה עמוקות לסמוך על אמינות ועל שיטות יעיל לא רק לזהות ולהפריד לתקן קבוצות משנה של אוכלוסיות EV, אך גם לשמר שלהם תפקודים ביולוגיים עבור יישומים במורד הזרם 10 , 11 , 14 , 31. במחקר הנוכחי, אנו המתואר nanomembrane אולטראפילטרציה צנטריפוגה (UFC) שיטה לבודד EVs מכל עכבר BALF. אברו עם דוחות אחרים, הראינו כי UFC הוא פשוט תוצאות תשואה גבוהה, טוהר, לכן הוא מתאים דגימות ביולוגיות קטן10,17,18,32 .
UC-DGC משמש בדרך כלל, נחשבת הטכניקה תקן זהב עבור EV בידוד מכיוון שהוא מספק נקיים במיוחד EV חלקיקים10,14. עם זאת, שיטה זו הוא מסורבל מבחינה טכנית, גוזלת זמן, עתירי עבודה, ויש מדרגיות נמוך. גישה זו דורשת יותר אימות לפני זה יכול להיות מיושם באופן מלא כמו33,שיטה חלופית34מבוסס מיקרופלואידיקה שפיתחו שיטות להתגבר על מגבלות אלה. לכן, שיטות המתאימות להכיל הקשיים הללו מבלי לסכן את הטוהר ואת המדרגיות של דגימות מאוד נחוצים, במיוחד עבור נוזלים ביולוגיים בנפח מצומצם.
להדגים כי UFC באמצעות התקן מסנן nanomembrane היה יעיל עבור EV הבידוד של דגימות BALF. הממצאים שהוצגו כאן להדגיש את העליונות של ההליך UFC לעומת תקן הזהב שיטה UC-DGC בשל הפשטות שלה מדרגיות גבוהה יותר. הגישה מבוססת-אולטראפילטרציה יש אימצו אותו באופן נרחב כדי לבודד EV ממגוון רחב של דגימות ביולוגיות: שתן35, ממוזגים תאים מדיה17ו עוברית סרום שור36. אחרות מודולרי המבוססת על גודל EV בידוד הטכניקה המשתמשת אולטראפילטרציה כפלטפורמה היא exosome בידוד מוחלט שבב (אקזוטיים)31. שיטה זו מתאימה גם דגימות בגודל מדגם קטן. מספר גורמים, כגון מסנן חומר ואת גודל הנקבוביות nanomembranes, צריכים לקחת בחשבון בעת שימוש בטכניקה UFC שעשויים להשפיע על המאפיינים של EVs התאושש. לדוגמה, סוגים שונים של מסנן ממברנות הביא EV-הקשורים RNA שונים שחזור היבול של שתן18. במחקר זה, הראינו כי regenerated תאית (RC) עם kDa 10 MWCO סיפקה את הביטוי mRNA הגבוהה של NOP10, OST4, SNRPG, TOMM7 בהשוואה kDa Hydrosart 10, או polyethersulfone (פסי) kDa 1018. עוד יותר להדגים שיש RC עם 10 kDa החלמה EV retentate גבוה יותר מאשר kDa 100. אחרים שאפיינו התוכן מטען EVs שתן שהושפעו על ידי הסוג של בידוד טכניקות37. המחקר שלנו הראה קרום MWCO RC 100-kDa סיפקה תשואה משביעת רצון נגזר BALF EV עם היתרון של חלבונים ובטח לא רצויים ב retentate עקב MWCO גדולים יותר.
מחקר זה הראה כי גדלים והפצה בגודל של UFC EVs היו קטנים יותר ומבוזר יותר homogeneously מאשר אלה של EVs UC-DGC. מצבור שלפוחית, אשר נפוצה עם טכניקות UC, עשוי להסביר את הטרוגניות ממד של EVs UC-DGC38. אנחנו העריכו נגזר BALF EV טוהר על ידי גילוי החלבונים ממברנה EV TSG101, CD63, CD9 ו CD81, אשר מאשר את הנוכחות של exosomes, retentates. אנחנו ואחרים גם השתמשו TEM להפגין המורפולוגיה של40,4139,35,UFC EVs. ליו. et al. נעשה שימוש בגישה דומה מבוסס-אולטראפילטרציה לבודד EVs והיו, בהשוואה ל- EVs מבודדת על ידי ultracentrifugation, הפרופילים פרוטיאומיה מבנית, transcriptomic דומה31. לפיכך, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה אולטראפילטרציה באמצעות קרום תאית regenerated MWCO של 100 kDa כאמצעי בידוד חלופי EV מתאים קטנים דגימות נוזל ביולוגיות כגון נוזל שטיפה bronchoalveolar.
השלבים קריטיים באמצעות גישה זו UFC לבודד EVs מ נוזלים ביולוגיים כוללים nanoporous הראשונית ממברנה 0.2 µm סינון כדי להבטיח כי החלקיקים מועשר הטווח גודל ' exosomal ', הסר כל הפעלת כוח נוספים שיכולים נזק או לעוות את exosome מורפולוגיה ומבנים10,42. EVs יכול לדבוק ממברנה סינון, דבר המתבטא מדרגיות התחתון. לכן, היקף המדגם לא יעלה את הכמות המומלצת בכל אחד מסוגי יחידת מסנן. בחרנו להשתמש מחדש תאית, אשר סיפקה תשואה mRNA גבוה משתן-derived EVs18. הסוג של ממברנות המסנן המשמש יכול לשנות את התשואה שחזור והסוג של EVs. לבסוף, אף-על-פי MWCO של 100 kDa ששולל את הרוב המכריע של חלבונים בנוזלים ביולוגיים, כמה מזהמים חלבון כי היו גדולים יותר מאשר 100 אגרגטים חלבון או kDa נצפו43. במקרה זה, צעד כביסה חיוני כדי למזער את צבירת EV וחלבון. יתר על כן, מחקרים פונקציונלי חייבים להיות כראוי מבוקרים על מנת לפרש באופן מלא את התוצאות, כמו חלבונים שאינם EV-הקשורים יהיה נוכח EVs UFC.
אנו מסיקים כי UFC היא גישה אלטרנטיבית זה ריאלי עבור EV לבידוד דגימות קטן או גדול יותר-נפח. היחידות מיקרו-מסנן זמין כעת יכול להכיל עד 15 מ"ל של דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמכת על ידי את NHLBI/NIH מענקים HL103868 (P.C.) ו HL137076 (כדי P.C.), את האמריקאי הלב האגודה מענק הסיוע (כדי P.C.) את פרס מחקר סמואל Oschin מקיף סרטן המכון (SOCCI) סרטן ריאות (כדי P.C.). ברצוננו להביע הערכה גדולה מכון הלב Smidt במרכז הרפואי Cedars-Sinai המספק לנו מכונה Nanosight EV nanoparticle מעקב ניתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
