Summary
ここでは、2 つ小胞細胞の隔離のプロトコル、遠心限外濾過とマウスの気管支肺胞洗浄液のサンプルから細胞小胞を分離する密度勾配遠心法と遠心をについて説明します。両法によりマウスの気管支肺胞洗浄液由来細胞の小胞は定量化され、特徴付けられます。
Abstract
細胞小胞 (Ev) は、通知機能を生理学的および病理学的状態の間に多くの生物学的に重要な役割を果たす新たに発見された細胞レベル下のコンポーネントです。EVs の分離は、各テクニックに固有の制限のため、この分野で主要な挑戦を続けています。密度勾配遠心法で差動遠心は一般的に使用されるアプローチと EV 分離のゴールド スタンダード プロシージャと見なされます。ただし、この手順は、時間のかかる、労働集約的で、一般的に気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルが適さない場合があります低レベルの拡張性の結果します。限外ろ過遠心分離法は簡単な時間と労働効率の良い高回収率と純度をまだ提供して示す.この分離方法は特に少量試料のための EV 分離に適している方法でされる可能性を提案します。
Introduction
エクソソームは、EVs を, 直径 50-200 nm の最小サブセット、シグナリング プロセス1,2,3,4、5の多様なアレイにまたがって複数の生物学的機能を持っています。彼らは主に脂質、蛋白質および核酸6,7,8,9 など貨物分子を介して細胞間コミュニケーションを促進することで細胞およびティッシュの恒常性を支配します。.EV 研究の 1 つの重要なステップは、分離プロセスです。差動遠心 (UC)、密度勾配遠心法 (DGC) の有無は金標準的なアプローチが、この方法には非効率的な EV 回収率と低いスケーラビリティ10などを含む、主要な制限事項,11,12、それは細胞培養上清または高エキソソーム生産試料などの大きなボリューム サンプルへ最高の利用を制限します。利点と限外ろ過、クロマトグラフィー、ビーズや、列ごとマイクロ流体、immunoaffinity 分離サイズ排除など、他の方法の不利な点はよく記述されているとする現代の補足的な手順が開発されて克服し、各アプローチ11,12,の13,14,15の技術的制限を最小限に抑えます。他は UC のメソッド16,17,18に匹敵する純度を提供する代替手法であるフィルター ユニットのナノポーラス膜の限外ろ過遠心分離 (UFC) 示されています。この手法は、代替の分離方法の一つとして考えられます。
気管支肺胞洗浄液 (BALF) では、さまざまな呼吸器の条件19,20,21,22に多数の生物学的機能を持つ EVs が含まれます。BALF 派生 EVs が伴います洗浄回収の限られた量と同様に、ヒトでは、気管支鏡検査手順の侵襲によるいくつかの課題を勉強しています。マウスなどの小型実験動物、数ミリリットルのみ正常肺条件で回復することができます、炎症や線維化肺23より。その結果、下流用差動遠心による BALF の EV の分離のための十分な量を収集できないことがあります。ただし、正しい EV 集団を分離は、EV の生物学的機能を研究するための重要な要因です。効率と効果の微妙なバランスは、よく確立された EV 分離方法に挑戦を続けています。
この現在の調査を示す 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) ナノ膜フィルター ユニットを利用した遠心限外濾過法アプローチは BALF など少量の生体試料に適している.この手法は、簡単に効率的と高純度および BALF 由来の電気自動車の研究をサポートするための拡張性を提供します。
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Protocol
動物の使用率および動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイ医療センター (CSMC) でによって承認されました。
1. マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) コレクションと準備
- BALF コレクション
- ケタミン (300 mg/kg) と頚部転位によって腹腔内経路を介してキシラジン (30 mg/kg) のカクテルとマウスを安楽死させます。
- 22 G 血管カテーテルを気管に挿入します。氷冷滅菌ダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水 (DPBS) の 1 ミリリットル (mL) を含むインスリン注射器を接続し、血管カテーテルを通って両方の肺に DBP の 1 mL を植え付けます。
- BALF を取得し、50 mL の円錐管に、BALF を分注シリンジのプランジャーをゆっくりと撤回します。氷の上の BALF を維持します。
- 1.1.2 と 1.1.3 の手順を繰り返します (各マウスの合計で 4 x) x 3。
注: 約 0.8 mL 注入の 1 ミリリットルあたり取得一般的に。また、個々 のマウス (すなわちBALF の 3 mL)、次の手順を実行することができますが、下流の実験で EVs の一貫性を保つのための大きなバッチの分離は、複数の BALF サンプルのプールします。
- BALF 準備
- 25 マウスからの BALF のプール、2 つの等しいセット (因数あたり 〜 35 mL) に分割します。
- 遠心分離機 400 × g、5 min のための 4 ° c で BALF の細胞と他の細胞の残骸を削除し、上清を収集します。
- 1,500 × g、10 分、4 ° c で上清を遠心分離機、細胞の残骸を削除します。上清を収集し、EV の分離手順に進みます。
2. マウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離
注: この研究では、2 台の EV 隔離技法には、すなわち UFC と浮力で遠心分離する使用 EVs BALF から。各メソッドの詳細なプロトコルを説明します。
-
限外ろ過 (UFC) 遠心分離濃縮法
注: このメソッドは、前述のプロトコル10から変更されました。- 0.2 μ m の滅菌注射器フィルター ステップ 1.2.3 から上澄みをフィルター処理して、氷の上のフィルターの BALF。
注: これはサイズ排除ステップという 200 より小さい小胞だけ nm が収集されます。 - 10 分 4 ° C で 10 分間遠心する 1,500 × g で遠心ユニット滅菌 DPBS 100 kDa MWCO 遠心ろ過ユニットを平衡、DPBS を破棄します。
注意: フィルター デバイスの膜は、DPBS と平衡に達したが、一度膜保たれなければならないウェット デバイスが使用されるまでのすべての時間で。 - 2.1.1 のステップから BALF サンプル 15 mL でフィルター ユニットと 3,000 x g で 4 ° C で 30 分間遠心を埋めるフロースルー BALF は破棄されまたは別の標準的な管に集め、将来使用するため-80 ° C で保存することができます。
- 残り 0.2 μ m フィルター BALF の 2.1.3 のステップを繰り返します。
注: 十分に 35 mL の開始元のボリュームから BALF EVs を集中する遠心の 3 つの繰り返しをかかった。これは 1-1.5 mL 未透過で起因しました。 - によって、繰り返しピペッティング優しく 14 ml 滅菌 DPBS の未透過を洗います。30 分、4 ° C での 3,000 x g でフィルター ユニットを遠心分離機、DPBS を削除し、EV 非透過を集中します。
- 総回復を確保するため、サイド ・ ツー ・ サイド動きを使用してサンプルを出し入れフィルター デバイスの下部に、pipettor をすることにより、フィルター デバイスから集中 BALF 派生 EVs を収集します。
- 因数 BALF 派生 EVs-80 ° C (手順 3. を参照) さらに粒子定量化及び評価のために格納します。
- 0.2 μ m の滅菌注射器フィルター ステップ 1.2.3 から上澄みをフィルター処理して、氷の上のフィルターの BALF。
-
浮揚性の密度勾配遠心法 (DGC) で遠心 (UC)
注: 次のプロトコルは、前述のプロトコル24から変更されました。- 2.1.1 のステップから 37 mL 遠心チューブに上清を転送および超遠心機を使用しての 4 ° C で 30 分間、10,000 × g でサンプルを遠心分離します。清と 4 ° C, 60 分で、100,000 × g で遠心分離を収集します。EV のペレットは、遠心分離、ステップ 2.2.3 の浮揚性の密度勾配バッファー (表 1) の異なる濃度を準備します。
- 上澄みを廃棄し、200 μ L の DPBS で EV ペレットを再懸濁します。
- 50 %iodixanol 作業ソリューション (表 1) の 300 μ L と EV の懸濁液を混合し、15 mL 遠心管にそれを転送します。50% iodixanol EV 混合サスペンション上に順番に層下部から上部への順序で次のバッファー ソリューション: 30 %iodixanol (4.5 mL) iodixanol (3 mL)、15 %iodixanol (2.5 mL)、および 5 %iodixanol (6 mL) の 25%。230 分の 4 ° C で、100,000 × g で遠心します。
注: 浮揚性の密度勾配が下部上部に最低濃度 (5%) に最高濃度 (50%) とスケーリング iodixanol の割合に基づいています。Iodixanol の異なる濃度を生成するには、実用的なソリューション (50 %iodixanol) 混ぜ均質媒体 (表 1) の様々 な量。 - 15% と 25% の割合を収集し、15 mL にボリューム アップさせる滅菌 DPBS でそれらを希釈します。新しい小型超遠心機チューブと 60 分のための 4 ° C で、100,000 × g で遠心分離機に転送します。
- 上澄みを廃棄し、さらに特性評価のための滅菌の DPBS の 50 μ L で EV ペレットを再懸濁します。
3. 細胞小胞の定量化
注: BALF 派生 EVs 回復収量は 2 つの指標を量的に表わされます。
- ナノ粒子追跡測定分析 (国税庁)
- 1: 200 で EV サンプルを希釈-DPBS と負荷インスリン注射器にサンプルの 1 mL の 1: 500。サンプル シリンジをシリンジ ポンプに接続し、粒子数とサイズ (材料の表を参照) を測定し始めます。
- すべてのサンプルの測定を 1 14 と検出のしきい値でカメラのレベルを設定します。30 で 1,500 フレームの反復測定値 5 s は 20 の遅延で、各サンプルの記録された読み取りの間 s。組み合わせて、最終濃度とサイズの報告のデータを平均します。
注: 正確なすべての粒子をキャプチャするすべての粒子を視覚化し、同様の設定を使用して、各実験ではすべてのサンプル測定のために適切なカメラのレベルを調整します。
- プロテインの定量
注: ビシンコニン酸 (BCA) の蛋白質の試金は BALF から派生した EVs のタンパク質濃度の測定に使用されました。- 1 x 換散バッファーの EV サンプルを可溶化します。
- 560 で吸光度を測定することにより比色検出を使用して BCA 標準プロトコルごと BALF から派生した EVs の蛋白質の量を定量化するプレート リーダーで nm。
4. BALF 由来細胞の小胞の検出
注: 通称エキソソーム表面のマーカー蛋白質 (TSG101 や CD63、CD81、CD9) SDS ページとイムノブロットおよび流れの cytometry による EV のリカバリを確認する使用されました。
- SDS-PAGE および免疫ブロット
- あぶらとり読み込みバッファー (リチウム dodecyl 硫酸塩) と 1.6 mL チューブの 50 mM ジチオトレイトール (DTT) で各サンプルの EV 蛋白質の同量を溶解します。70 ° c 10 分のサンプルを加熱します。
- 4-12% に加えて、Bis トリス アクリルアミドゲル ステップイン 4.1.1 からサンプルをロードし、電気泳動の実行 (150 v、35 mA) 35 分。
- 乾式転写法による硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。
- 60 分、常温 (RT) ロッキング 5% スキムミルクと膜をブロックします。
- 5 %bsa でトリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20 (TBST) 一晩揺動、4 ° c で 1: 500 希釈で EV 表面タンパク質マーカー、腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) への抗体と膜を孵化させなさい。
- 次の日、洗って膜 3 x、10 分それぞれ TBST バッファーで洗うし、反ウサギ IgG、室温 60 分 1:5,000 希釈で、HRP リンク抗体とインキュベート
- 3 膜を洗浄する x、10 分 TBST バッファーで、それぞれを洗います。化学発光 HRP 抗体検出試薬とイメージ (イメージング システムの材料の表を参照) を持つ膜を開発します。
- フローサイトメトリー
- BALF から派生した EVs の能の両面染色バッファー (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %bsa、0.1 μ m のシリンジ フィルター膜濾過) 49 μ L で希釈します。
- それぞれの個々 のサンプルに次の抗体の各追加: 1) ラット抗マウス PE CD63 抗体 (100 ng の反応あたり);2) ラット抗マウス PE CD81 (500 ng);3) ラット抗マウス FITC CD9 (200 ng)。暗闇の中で 60 分間揺動、4 ° C で孵化させなさい。
- 染色バッファー膜フィルターの能の両面の 450 μ L のサンプルを希釈し、フローサイトメトリー解析のサンプルを対象 (材料の表を参照)25。
- 次のように流れの cytometer 設定を調整する: 1) ハイパー ログ (hlog); すべてのチャンネルを設定2) セット 4; で SSC のトリガー3) セカンダリ トリガーをオフにします。低速設定でサンプルを実行し、各サンプルの少なくとも 10,000 のイベントを取得します。
- 解析ソフトウェアを使用して各サンプルの低フローサイトメトリー分析を実行 (材料の表を参照してください)。
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Representative Results
マウス BALF から EV 分離を行った同じ日に UFC と UC DGC の分離方法を使用して。UFC メソッドは、UC DGC テクニック必要な処理時間の 8 時間に対し、約 2.5-3 h を必要しました。これはバッファーと試薬の準備時間を含んでいませんでした。遠心分離の長い期間の間にいくつか他のタスクを実行できる可能性がありますをそれに留意されたいです。それにもかかわらず、全体の手順は、ほぼ UC DGC 分離技術の全体の日続いた。
UFC 法による分離された通常のマウスからの EVs の BALF の派生には、小さいサイズと UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM、図 1 b) と比較して、均一サイズ分布 (148.8 ± 1.1 nM、図 1 a) が表示されます。UFC テクニックあった深遠な 65-fold より大きい総粒子カウント UC DGC 分離 (29.4 ± 18.4対0.5 ± 0.1 × 1010粒子と比較した場合p < 0.05;表 2と図 1)。UFC EVs の (μ g) で合計タンパク質の回収も高かった (± 38.3 μ g対73.7 3,136 ± 1,860; p < 0.05;表 2と図 1のような)。したがって、UFC は時間および努力効率的です EV より高い利回りを提供しています。
さらに EV の BALF の派生集団を特徴付ける表現型、通称エキソソーム表面蛋白質のマーカーの存在を調べた: CD63 と CD9、フローサイトメトリーによる CD81 とイムノブロット TSG101。フローサイトメトリー解析を使用して、UFC EVs と UC DGC EVs の両方が CD63 を表明を行った (図 2 a -2 C)、CD9 (図 2 D -2F) と CD81 (図 2 -2 i)。CD63 と CD9、CD81 の幾何学的平均式 (gMFI) 定量化され、ない 2 つの条件間で有意差 (図 3 a -3F)。
次に、別の EV 蛋白質のマーカー、TSG101、イムノブロットを調べた。UFC 分離法の検討が効率的に選択し、BALF サンプル (図 4) から EV の人口を保持ことを示唆している (UFC フィート) サンプル フローを UFC の 20 μ g に TSG101 蛋白質が含まれていないことをとしました。BALF EV サンプルからの総蛋白質 (20 μ g) の同量が読み込まれた UFC EVs が UC DGC EVs (図 4) よりも高い TSG101 を表明したことが判明しました。また、UFC EV 蛋白質の純度は、単一の隔離された蛋白質バンドによって示される、受諾可能だったことを示した。
結果がすべて、スチューデントのt-テストは 2 つのグループの比較のため使用されました。± SEM (平均の標準誤差) を意味するように結果が表示されます、 p < 0.05 が重要と考えられていた。
図 1: マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) の限外ろ過遠心分離-派生 EVs マウス BALF から派生した EVs の密度勾配遠心法と遠心よりもより均一なサイズ分布を示したし、していた、全粒子数とタンパク質含有量が高くします。EV 粒子サイズの分布をナノ粒子追跡 (NTA) の分析によって測定したし、ビシンコニン酸法による総たんぱく量を測定しました。(A) UFC BALF EVs の NTA サイズ分布グラフ。(B) UC DGC BALF EVs のサイズ分布グラフ。国税庁によって (C) 全粒子数 (平均 ± SEM x 1010粒子 * p < 0.05)。(D) 総たんぱく量 (μ g で * p < 0.05)。データは、3 つの独立した実験から派生しました。UFC: 限外ろ過遠心分離;密度勾配遠心法; と UC DGC: 遠心EVs を: 細胞小胞;SD: 標準偏差;Conc: 濃度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスの気管支肺胞洗浄液派生した EVs 遠心限外濾過によって分離し、密度勾配遠心法と遠心表現 tetraspanin 蛋白質 CD81、CD9、CD63 。EVs の割合を (A ~ C) の擬似カラー プロットに示されている、UFC と UC DCG 分離技術による肯定的なステンド グラスを示す PE CD63、(D - F) FITC CD9、および (G -私) PE CD9。データは、3 つの独立した実験から派生します。UFC = 限外ろ過遠心分離;UC DGC 密度勾配遠心法; と遠心を =Ev = 細胞小胞;SSC A = 側の散布図の分析;PE = フィコエ リスリン;FITC 蛍光イソチオシアネートを =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 限外ろ過遠心分離されたマウスの気管支肺胞洗浄液派生した EVs EVs の遠心分離する tetraspanin 蛋白質の同じような蛍光密度を表現します。(AとD)PE CD63+のヒストグラムと幾何平均の式 (gMFI)-EVs を染色します。(BおよびE) ヒストグラムと FITC CD9+の gMFI-EVs を染色します。(CおよびF) ヒストグラムと PE CD81+の gMFI-EVs を染色します。これらのデータは、3 つの独立した実験から派生します。UFC: 限外ろ過遠心分離;UC DGC 密度勾配遠心法; と遠心を =EVs を: 細胞小胞;SSC a: 側の散布図の分析;PE: のフィコエ リスリン;FITC: かに。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: マウスの気管支肺胞洗浄液派生した EVs 遠心限外濾過によって分離し、密度勾配遠心法と遠心表現エキソソーム表面蛋白質、TSG101.このパネルは、TSG101 抗体 (47 kDa) マウス BALF から派生した EVs のイムノブロットを示しています。UFC = 限外ろ過遠心分離;UC DGC 密度勾配遠心法; と遠心を =Ev = 細胞小胞;FT フロースルー; =TSG 腫瘍感受性遺伝子を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 作業ソリューション Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| 実用的なソリューション (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| 均質媒体 (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
表 1: 浮揚性の密度勾配バッファーします。このテーブルは、遠心法による分離されたマウス肺胞洗浄液由来細胞小胞集団を浄化するために使用された各グラデーション ソリューションの構成とバッファーの比を与えます。* 実用的なソリューションだった 50 %iodixanol (密度勾配媒体の 25 mL [材料表を見る] + 5 mL の希釈溶液 [pH 7.4 0.25 M ショ糖 + 120 mM HEPES 0.9 M の NaCl])。* * 均質媒体 (0.25 M ショ糖 20 mM HEPES + 150 mM の NaCl の pH 7.4)
| メソッド | 開始量 (mL) | 国税庁* (x 10 の8/μL) | 粒子†を合計 (x1010) | タンパク質濃度‡ (μ g/μ L) | 総蛋白§ (μ g) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29.4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC DGC | 35 | 0.5 ± 0.05 | 0.5 ± 0.1 | 0.6 | 73.7 ± 38.3 |
表 2: 限外ろ過遠心分離法が高いマウス肺胞洗浄液由来細胞小胞収量を提供します。粒子濃度と全粒子数は、ナノ粒子の追跡 (国税庁) の分析によって測定しました。ビシンコニン酸蛋白質の試金による蛋白と蛋白の総量を測定しました。* BALF EVs の粒子濃度 (平均 ± SEM x 108/μL 3 つの独立した実験から)。†BALF EVs の全粒子 (平均 ± SEM × 1010粒子 3 つの独立した実験から)。‡BALF EVs の蛋白濃度 (平均 ± SEM μ g/μ L 3 つの独立した実験から)。§BALF EVs の総蛋白 (3 つの独立した実験から平均 ± SEM mg)。
UFC: 限外ろ過遠心分離;密度勾配遠心法; と UC DGC: 遠心Conc: 濃度;国税庁: ナノ粒子追跡の分析;SEM: 平均の標準誤差です。
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Discussion
過去数十年間、科学者は生体のホメオスタシスの EVs の意義を解明しています。EVs がその生理活性貨物分子1,21,22,26,27を近隣や遠くの細胞を調節することによって多くの病気プロセスに大きな役割を果すより重要なは、,28,29,30未来の開発し、この分野の進歩は深く信頼性に頼ると識別し分離だけでなく効果的な方法 EV 人口のサブセットを修正がまた下位アプリケーションにその生物学的機能を維持する。10,11,14,31. 現在の研究では、マウス BALF から EVs を分離するナノ膜限外ろ過 (UFC) 遠心分離法について述べる。他のレポートで、示した、UFC は簡単で、結果の高い回収率と純度で、したがって、小さい試料10,17,18,32 に適して.
UC DGC は一般的に使用される、高純度 EV 粒子10,14を提供するため EV 分離のゴールド スタンダード テクニックであると見なされます。ただし、このメソッドでは、技術的に面倒な時間のかかる、労働集約的で、低いスケーラビリティ。新開発のマイクロ流体技術は、これらの制限を克服するが、代替法33,34として完全に実装することができます前にさらなる検証にこのアプローチが必要です。したがって、少量の生物学的流体の特に、純度とサンプルのスケーラビリティを損なうことがなくこれらの困難に対応する適切なメソッドが痛んで必要です。
ナノ膜フィルター デバイスを使用して UFC は BALF の標本から EV 分離に有効であると示しました。成果をここで発表は、そのシンプルさと高い拡張性により UC DGC 法のゴールド スタンダードと比較して UFC プロシージャの優位性を強調表示します。限外ろ過ベースのアプローチは、さまざまな生体試料から EV を分離する広く普及して: 尿35、セル付きメディア17、およびウシ胎児血清36。その他モジュラー サイズ ベース EV 分離技術プラットフォームとして限外濾過を使用するはエキソソーム総分離チップ (エキゾチック)31です。このメソッドは、小さなサンプル サイズの標本にも適していますフィルター材料など、いくつかの要因と、ナノの気孔のサイズは、回復した EVs のプロパティに影響を与える可能性がありますので、UFC を用いたときに考慮する必要があります。たとえば、フィルター膜の種類は尿18から別の EV 関連 RNA 回収率で起因しました。本研究で示した再生セルロース (RC) 10 kDa MWCO で提供される NOP10、OST4、SNRPG の最も高い mRNA の発現と TOMM7 比較 Hydrosart 10 kDa、または 10 kDa18ポリエーテルサルホン (PES)。我々 はさらに 10 kDa と RC が 100 kDa より高い未透過 EV 回復を持っていたことを示した。他の人が分離テクニック37の種類によって影響を受けた尿 Ev 貨物内容を特徴付けられます。100 kDa MWCO RC 膜提供未透過大きい MWCO のためにはるかに少ない不要な蛋白質の利点と満足のいく BALF 派生 EV 収量であることが分かった。
この研究は、サイズと UFC EVs のサイズ分布が小さく、UC DGC EVs のそれらよりもっと均等に分布を示した。UC のテクニックと共通である小胞凝集は、UC DGC EVs38の寸法の不均一性を説明するかもしれない。TSG101 や CD63、CD9、retentates でエクソソームの存在を裏付ける CD81 EV 膜タンパク質を検出することにより EV の BALF 由来の純度を評価しました。私たちと他の人はまた UFC EVs35,39,40,41の形態を示すため TEM を使用しています。劉らが EVs を分離する限外濾過による同様のアプローチを使用され、EVs 超遠心法による分離と比較して、プロテオーム、トランスクリプトームのプロファイルと同様31。したがって、気管支肺胞洗浄液など小さな試料流体に適している別の EV の分離方法として 100 kDa の MWCO と再生セルロース膜を用いた限外ろ過遠心分離法について述べる。
生物学的流体から EVs を分離するこの UFC のアプローチを使用する重要なステップは、濃縮の粒子を exosomal サイズの範囲とすることができます追加の力を適用する回避で確実に初期ナノポーラス膜 0.2 μ m ろ過損傷または変形エキソソームの形態と構造10,42。EVs は、結果より低いスケーラビリティ、ろ過膜に付着できます。したがって、サンプル量はフィルター ユニットの種類ごとに推奨される量を超えない。我々 は尿由来 EVs18から歩留まり mRNA を定めた再生セルロースを使用しました。使用されるフィルター膜の種類は、回復収量と EVs の種類を変更できます。最後に、100 kDa の MWCO は、生体試料中のタンパク質の大部分を排除する必要があります、にもかかわらず 100 kDa タンパク質や集計よりも大きいいくつかの蛋白質の汚染物は43を認められました。この場合、洗浄工程は EV やタンパク質凝集を最小限に抑えるために重要です。また、EV-関連付けられている蛋白質は UFC Ev であるとは、完全に結果を解釈するために機能研究を正しく制御する必要があります。
UFC が小さなまたは大きなボリュームのサンプルの EV 分離可能です別の方法であることが分かった。現在利用可能なマイクロ フィルター ユニットは、15 mL のサンプルまでを収容可能です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
仕事をサポートするには、(PC) へ NHLBI/NIH 助成金 HL103868 と HL137076 (PC) へ、(PC の場合) にアメリカ心臓協会費と (パソコン) にサミュエル ・ オシン包括的がん研究所 (SOCCI) 肺がん研究賞を受賞。EV ナノ粒子追跡の分析のための Nanosight マシンを提供してくれますヒマラヤスギ シナイ医療センターで Smidt 心研究所に大感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
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