Summary
여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.
Abstract
Extracellular 소포 (EVs)는 많은 생물학 기능 생리 및 병리학 상태 동안 신호에 중요 한 역할을 하는 새로 발견된 된 subcellular 요소입니다. EVs의 각 기법에 기본 제한으로 인해이 분야에서 주요 도전 되 고 있습니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 차동 ultracentrifugation 일반적으로 사용 되는 방식 이며, EV 격리에 대 한 표준 절차로 간주 됩니다. 그러나,이 절차 시간이, 노동 집약, 그리고 일반적으로 bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 볼륨 샘플에 적합 하지 않을 수 있습니다 낮은 확장성에서 결과. 한 원심 분리 방법 간단 하 고 시간 및 노동 효율 아직 제공 높은 복구 수율 및 순도 설명 합니다. 우리는이 격리 방법 EV 격리, 작은 볼륨 생물학 견본을 위해 특히 적합 한 대체 접근 될 수 있는 제안 합니다.
Introduction
Exosomes는 EVs, 50-200 nm 직경에서의 작은 하위 집합 그리고 신호 처리1,2,3,,45의 다양 한 배열을 통해 여러 생물 학적 기능을가지고. 그들은 주로 지질, 단백질 및 핵 산6,,78,9 등 화물 분자 세포 통신을 촉진 하 여 세포와 조직의 항상성 적용 . EV 연구에서 하나의 중요 한 단계는 격리 프로세스입니다. 차동 ultracentrifugation (UC), 또는 밀도 그라데이션 원심 (DGC) 없이 황금 표준 접근 방식으로 간주 됩니다 하지만이 방법은 비효율적 EV 복구 속도 낮은 확장성10 를 포함 하 여 주요 제한 사항 , 11 , 12, 그 큰 볼륨 샘플, 셀 문화 표면에 뜨는 또는 높은 exosome 생산 표본 등의 최고의 사용률을 제한합니다. 적용 또는 크로마토그래피, immunoaffinity 격리 구슬 또는 열 및 마이크로, 크기 배제 같은 다른 방법의 장단점은 잘 설명 하 고 현대 보충 절차 개발 되었습니다. 극복 하 고 각 접근11,12,13,,1415에 기술적 한계를 최소화 합니다. 다른 필터 단위에서 성공 막으로 한 원심 (UFC) UC 방법16,,1718에 비해 순도 제공 하는 대체 기법입니다 나타났습니다. 이 기술은 다른 절연 방법 중 하나로 간주 될 수 있습니다.
Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 들어 EVs를 다양 한 호흡기 조건19,20,,2122에서 다양 한 생물 학적 기능을가지고 있습니다. 공부 BALF 파생 EVs 임무 인 인간, 상계 절차로 제한 된 양의 게 유체 복구의 침입으로 인해 몇 가지 도전. 쥐 같은 작은 실험실 동물에 몇 밀리 리터 정상적인 폐 조건에서 복구할 수 있습니다, 그리고 염증 또는 거리 폐23에 덜도. 따라서, EV 격리에 대 한 충분 한 양의 BALF 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 차동 ultracentrifugation에 의해 수집 수 있습니다 실현. 그러나, 올바른 EV 인구 격리 EV 생물 학적 기능을 공부에 대 한 중요 한 요소 이다. 효율성과 효능 사이의 미묘한 균형 잘 설립 EV 격리 방법에 도전 하 고 있습니다.
현재이 연구는 100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) nanomembrane 필터 단위를 활용 하 여 원심 외 접근 BALF 같은 작은 볼륨 생물 표본 적합은 보여 줍니다. 이 기술은 간단 하 고 효율적으로, 그리고 높은 순도 BALF 파생 EVs의 연구를 지 원하는 확장성을 제공 합니다.
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Protocol
동물의 활용 및 모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (CSMC)에 의해 승인 되었다.
1. murine Bronchoalveolar 게 액체 (BALF) 수집 및 준비
- BALF 컬렉션
- 케 타 민 (300 mg/kg) 및 자 궁 경부 전위 뒤 복 루트를 통해 xylazine (30 mg/kg)의 칵테일 쥐 안락사
- 기도에 22 G angiocatheter를 삽입 합니다. 얼음 처럼 차가운 살 균 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 1 mL (mL)을 포함 하는 인슐린 주사기를 연결 하 고는 angiocatheter 통해 양쪽 폐로 DBPS의 1 mL를 주입.
- 천천히 BALF 검색 하 여 50 mL 원뿔 튜브로는 BALF 분배 주사기 플런저를 철회 한다. 얼음에 BALF 유지.
- 1.1.2, 1.1.3 단계를 반복 3 배 (4 배 총 각 마우스에).
참고: 약 0.8 mL 주입의 밀리 리터 당 일반적으로 검색 됩니다. 또한, 개별 마우스 (즉, 3 mL의 BALF), 다음 단계를 수행할 수 있습니다 하지만 여러 BALF 샘플 풀링 다운스트림 실험에 일관성에 대 한 EVs의 큰 배치의 절연을 허용할 것 이다.
- BALF 준비
- 25 마우스에서 BALF 수영장 하 고 동등한 두 (약 수 당 ~ 35 mL)으로 나눕니다.
- 세포와 다른 세포 파편을 제거 하는 상쾌한 수집에서 5 분, 4 ° C에 400 x g BALF 원심.
- 세포 파편을 제거 하려면 10 분, 4 ° C에서 1500 x g에서 상쾌한 원심. 상쾌한을 수집 하 고 EV 격리 단계를 진행 합니다.
2. 세포 외 소포 Murine Bronchoalveolar 게 액체에서의 격리
참고:이 연구에서 두 개의 EV 격리 기술, 즉 UFC와 부 력과 ultracentrifugation 사용 BALF에서 EVs를 분리. 각 방법의 상세한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다.
-
한 원심 (UFC) 농축 방법
참고:이 메서드는 앞에서 설명한 프로토콜10에서 수정 되었습니다.- 1.2.3 단계별로 0.2 μ m 무 균 주사기 필터에서 상쾌한 필터링 하 고 얼음에 필터링된 BALF 유지.
참고: 이것은 이다 크기 제외 단계 그것에 의하여만 200 보다 작은 소포 nm 수집 됩니다. - 폐기는 DPBS 10 분 4 ° C에서 10 분 원심 1500 x g에서 원심 단위에 대 한 살 균 DPBS와 100 kDa MWCO 원심 필터 단위를 equilibrate.
주의: 필터 장치에 막 DPBS와 equilibrated는, 일단 막 유지 해야 젖은 장치가 사용 될 때까지 모든 시간에. - 2.1.1 단계에서 BALF 샘플의 15 mL로 필터 단위를 작성 하 신 4 ° c.에 30 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 흐름을 통해 BALF는 삭제 또는 별도 정식 관으로 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.
- 나머지 0.2 µ m 필터링 BALF에 대해 2.1.3 단계를 반복 합니다.
참고: 그것은 충분히 35 mL의 원래 시작 볼륨에서 BALF EVs를 집중 하는 centrifugations의 3 개의 반복 했다. 이 retentate의 1-1.5 mL 귀착되는. - 살 균 DPBS의 14 mL와 retentate는 부드럽게 pipetting 반복적으로 세척. 원심에서 30 분, 4 ° C에서 3000 x g 필터 단위는 DPBS 제거 하 고 EV retentate 집중.
- 필터 장치 하단에는 pipettor를 삽입 하 고 철수 총 복구 되도록 사이드-투-사이드 연소 모션을 사용 하 여 샘플 필터 장치에서 집중된 BALF 파생 EVs를 수집 합니다.
- 약 BALF 파생 EVs 수-80 ° C 더 입자 정량화 및 특성화 (3 단계 참조)에서 그들을 저장 하 고.
- 1.2.3 단계별로 0.2 μ m 무 균 주사기 필터에서 상쾌한 필터링 하 고 얼음에 필터링된 BALF 유지.
-
부 력 밀도 그라데이션 원심 (DGC)와 Ultracentrifugation (UC)
참고: 다음 프로토콜은 앞에서 설명한 프로토콜24에서 수정 되었습니다.- 37 mL ultracentrifuge 튜브에는 상쾌한 2.1.1 단계에서 전송 하 고 ultracentrifuge를 사용 하 여 4 ° C에서 30 분 동안 10000 x g에서 샘플 원심. 상쾌한 고 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다. EV 펠 릿 centrifuged는 하는 동안 단계 2.2.3 부 력 밀도 그라데이션 버퍼 (표 1)의 다른 농도 준비 합니다.
- 삭제는 상쾌한 고 DPBS의 200 μ에 EV 펠 릿 resuspend.
- 50 %iodixanol 작업 솔루션 (표 1)의 300 μ와 EV 현 탁 액을 혼합 하 고 15 mL ultracentrifuge 관에 그것을 전송. 50% iodixanol EV 혼합물 정지 위에 순차적으로 가기 하단에서 순서로 다음 버퍼 솔루션 레이어: 30 %iodixanol (4.5 mL), iodixanol (3 mL), 15 %iodixanol (2.5 mL), 및 5 %iodixanol (6 mL)의 25%. 230 분 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기.
참고: 부 력 밀도 그라데이션 iodixanol 하단 상단에 최저 농도 (5%)에 가장 높은 농도 (50%)와 확장의 비율에 근거한 다. Iodixanol의 다양 한 농도 생성 하려면 균질 매체 (표 1) 다양 한 양의 작업 솔루션 (50 %iodixanol)와 혼합 했다. - 15%와 25% 분수를 수집 하 고 볼륨을 15 mL를 무 균 DPBS에 그들을 희석. 새로운 작은 ultracentrifuge 튜브와 60 분 동안 4 ° C에서 100000 x g에서 원심 분리기에 그들을 전송.
- 상쾌한 삭제 하 고 추가 특성에 대 한 살 균 DPBS의 50 μ에 EV 펠 릿 resuspend.
3. 세포 외 기 정량화
참고: BALF 파생 EVs 복구 수익률 두 통계 quantitated입니다.
- 나노 측정 분석 (NTA)를 추적
- 1: 200에서 EV 샘플 희석-DPBS 및 부하는 인슐린 주사기에 샘플의 1 mL에 1: 500. 주사기 펌프 샘플 주사기를 연결 하 고 ( 재료의 표참조) 입자 숫자와 크기를 측정 하기 시작.
- 모든 샘플 측정 1 카메라 수준 14와 검출 임계값에 설정 합니다. 1500 프레임 30에 5 반복 측정의 20의 지연 각 샘플에 대 한 기록 된 읽기 사이 s. 결합 하 고 최종 농도 및 크기 보고서에 대 한 데이터를 평균.
참고: 모든 입자의 정확한 캡처에 대 한 모든 입자를 시각화 하 고 비슷한 설정을 사용 하 여 각 실험에서 모든 샘플 측정에 적합 한 카메라 수준을 조정 합니다.
- 단백질 정량화
참고: bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 BALF 파생 EVs의 단백질 농도 측정 하기 위해 사용 되었다.- 1 x 세포의 용 해 버퍼에서 EV 샘플 solubilize
- BCA 표준 프로토콜 색도계 탐지 560에서 흡 광도 측정 하 여 당 BALF 파생 EVs에 있는 단백질의 양을 계량 접시 리더에 nm.
4. 세포 외 소포 BALF 파생의 탐지
참고: 일반적으로 알려진된 exosome 표면 마커 단백질 (TSG101, CD63, CD81, 및 CD9) EV 복구 확인 하 SDS 페이지 및 immunoblotting 흐름 cytometry 분석에 의해 사용 되었다.
- SDS 페이지 및 immunoblotting
- 버퍼 (리튬 라우릴 황산 염) 및 1.6 mL 튜브에서 50 m m dithiothreitol (DTT) 로드 blotting으로 각 샘플의 EV 단백질의 동일한 금액을 디졸브. 10 분 동안 70 ° C에서 샘플을 열.
- 4-12% 두번째-트리 스 플러스 아크릴 아 미드 젤으로 4.1.1 단계에서 샘플을 로드 하 고 실행할 전기 이동 법 (150 볼트, 35 mA) 35 분.
- 건조 전송 방법을 사용 하 여 니트로 막 단백질을 전송 합니다.
- 60 분, 실 온 (RT)에서 락 5% 무 지방 우유와 함께 막을 차단 합니다.
- 5 %BSA Tris 버퍼 염 분 트윈 20 (TBST) 하룻밤 락 4 ° c에서 1: 500 희석에는 EV 표면 단백질 마커, 종양 민감성 유전자 101 (TSG101)에 항 체를 막 품 어.
- 다음 날, 씻고 막 3 x, 10 분 각 TBST 버퍼에서 세척 하 고 안티-토끼 IgG, HRP 연결 된 항 체, 실시간에서 60 분에 대 한 1:5,000 희석에와 그것을 품 어
- 3 막 씻고 x, 각 세척, TBST 버퍼에서 10 분. Chemiluminescent HRP 항 체 탐지 시 약 및 이미지 (이미징 시스템에 대 한 재료의 표 참조)와 막 개발.
- Cytometry
- PEB 버퍼 (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %BSA, 0.1 μ m 주사기 필터 멤브레인 통해 필터링) 얼룩의 49 μ BALF 파생 EVs를 희석.
- 각 개별 샘플으로 다음 항 체의 각 추가: 1) 쥐 반대로 마우스 PE CD63 항 체 (100 반응 당 ng); 2) 쥐 반대로 마우스 PE CD81 (500 ng); 3) 쥐 반대로 마우스 FITC CD9 (200 ng). 어둠 속에서 60 분 락 4 ° C에서 품 어.
- 멤브레인 필터 PEB 버퍼 얼룩의 450 μ와 샘플을 희석 하 고 교류 cytometry 분석 하는 샘플 제목 ( 재료의 표참조)25.
- 다음과 같이 교류 cytometer 설정을 조정: 1) 하이퍼 로그 (hlog);에 모든 채널 설정 2) 4;에 SSC에 트리거 설정 3) 보조 트리거 해제 합니다. 낮은 속도 설정에서 샘플을 실행 하 고 각 샘플에 적어도 10000 이벤트를 확보.
- 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 샘플에 낮은 cytometry 데이터 분석 수행 ( 재료의 표참조).
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Representative Results
마우스 BALF에서에서 EV 격리를 수행 하는 우리 같은 날에 UFC와 UC DGC 격리 방법을 사용 하 여. 반면에 UC DGC 기술 필요한 처리 시간의 8 h UFC 메서드 약 2.5-3 h, 필요 합니다. 이 버퍼 및 시 약 준비 시간을 포함 하지 않았다. 그것은 긴 원심 기간 동안 다른 작업을 수행할 수는 주목 한다. 그럼에도 불구 하 고, 전체 절차는 거의 하루 종일 UC DGC 격리 기술에 대 한 지속.
정상적인 쥐 UFC 메서드에서 고립에서 EVs BALF 파생 표시 작은 크기와 UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM, 그림 1B)에 비해 더 균일 한 크기 분포 (148.8 ± 1.1 nM, 그림 1A). UFC 기술 심오한 했다 65-fold 더 큰 총 입자 계산 UC DGC 절연 (29.4 ± 18.4 대 0.5 ± 0.1 x 1010 입자;에 비해 p < 0.05; 표 2 와 그림 1C). UFC EVs의 (µ g)에서 총 단백질 복구는 또한 더 높은 (3,136 ± 1,860 대 73.7 38.3 ± µ g; p < 0.05; 표 2 와 그림 1D). 따라서, UFC는 시간 및 노력을 효율적 이며 높은 EV 수익률을 제공 합니다.
더 phenotypically BALF 파생 EV 인구 특성, 우리는 일반적으로 알려진된 exosome 표면 단백질 마커의 존재 검사: CD63 CD9, 및, cytometry에 의해 CD81 immunoblotting 여 TSG101. 우리 UFC EVs와 UC DGC EVs 모두 표현 CD63 시연 흐름 cytometry 분석을 사용 하 여 (그림 2A -2 C), CD9 (그림 2D -2F), 그리고 CD81 (그림 2G -2I). 식 (gMFI) CD63, CD9, 및 CD81 정량 되었고 두 조건 사이 통계적으로 다르지 않아 (그림 3A -3 층).
다음, 우리는 다른 EV 단백질 마커, TSG101, immunoblotting 여 검사. 우리 (UFC-FT) 샘플 흐름을 통해 UFC의 20 µ g TSG101 단백질을 포함 하지 않았다 제안 UFC 격리 기술을 효율적으로 선택 하 고 BALF 샘플 (그림 4)에서 EV 인구 유지는 보였다. 같은 양의 총 단백질 (20 µ g) BALF EV 샘플에서 로드 된, 우리는 UFC EVs UC DGC EVs (그림 4) 보다 더 높은 수준의 TSG101 표현 발견. 우리는 또한 UFC EV 단백질의 순도 허용, 단일 격리 된 단백질 밴드 여 보였다.
모든 결과, 학생의 t-테스트 2-그룹 비교를 위해 사용 되었다. 결과 ± SEM는 뜻의 (표준 오차), 의미 하는 대로 표시 됩니다 그리고 p < 0.05 중요 하 게 고려 되었다.
그림 1: murine bronchoalveolar 게 액체 (BALF)의 한 원심 분리-파생된 EVs murine BALF 파생 EVs의 밀도 그라데이션 원심 분리와 ultracentrifugation 보다는 더 균일 분포를 시연 하 고 있 었는 상당히 높은 총 입자 수와 단백질 콘텐츠. EV 입자 크기의 분포 분석 (NTA)를 추적 하는 나노 입자에 의해 측정 되었다 고 총 단백질 함량은 bicinchoninic 산 분석 결과 의해 측정 되었다. (A) UFC BALF EVs의 NTA 크기 분포 그래프입니다. (B) UC DGC BALF EVs의 크기 분포 그래프입니다. NTA에 의해 (C) 총 입자 수 (의미 ± SEM x 1010 입자; * p < 0.05). (D) 총 단백질 콘텐츠 (µ g에 * p < 0.05). 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 파생 되었다. UFC: 한 원심 분리; 조밀도 기온 변화도 원심 분리;와 UC-DGC: ultracentrifugation EVs: extracellular 소포; SD: 표준 편차; 광: 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Murine bronchoalveolar 게 액체 파생 한 원심 분리 하 여 고립 된 EVs와 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 ultracentrifugation tetraspanin 단백질 CD63, CD9, 및 CD81 표현. EVs의 백분율 묻은 게 있다 긍정적인 (A - C) 모조 색상 플롯에 의해 그림 UFC와 UC DCG 격리 기술에 의해 표시 된 PE-CD63, (D - F) FITC CD9 그리고 (G - 나) PE CD9. 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 파생 됩니다. UFC = 한 원심 분리; UC-DGC 조밀도 기온 변화도 원심 분리;와 ultracentrifugation = EVs = extracellular 소포; SSC A = 사이드 분산형 분석; PE phycoerythrin; = FITC fluorescein isothiocyanate를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 외 murine bronchoalveolar 원심 분리 게 액체 파생 EVs ultracentrifugation 절연 evs tetraspanin 단백질의 유사한 형광 밀도 표현. (A 와 D) PE-CD63+의 히스토그램과은 식 (gMFI)-EVs 스테인드. (B 와 E) 히스토그램과 FITC CD9+의 gMFI-EVs 스테인드. (C 와 F) 히스토그램과 PE CD81+의 gMFI-EVs 스테인드. 이러한 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 파생 됩니다. UFC: 한 원심 분리; UC-DGC 조밀도 기온 변화도 원심 분리;와 ultracentrifugation = EVs: extracellular 소포; SSC: 측 분산 분석; PE: phycoerythrin; FITC: fluorescein isothiocyanate입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Murine bronchoalveolar 게 액체 파생 한 원심 분리 하 여 고립 된 EVs와 조밀도 기온 변화도 원심 분리 방법으로 ultracentrifugation 표현 exosome 표면 단백질, TSG101. 이 패널 TSG101 항 체 (47 kDa)에 대 한 murine BALF 파생 EVs의 immunoblotting을 보여줍니다. UFC = 한 원심 분리; UC-DGC 조밀도 기온 변화도 원심 분리;와 ultracentrifugation = EVs = extracellular 소포; FT = 흐름-통해; TSG 종양 민감성 유전자 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 근무 솔루션 Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| 작업 솔루션 (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| 균질 매체 (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
표 1: 부 력 밀도 그라데이션 버퍼. 이 표는 murine bronchoalveolar 게 extracellular 소포 액체 파생 된 인구 ultracentrifugation 기술에 의해 절연을 정화 하는 데 사용 된 각 그라데이션 솔루션의 구성 및 버퍼 비율을 제공 합니다. * 작업 솔루션은 50 %iodixanol (25 mL 밀도 그라데이션 중간의 [참조 테이블의 자료] + 희석제 솔루션 [pH 7.4 0.25 M 자당 + 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl의]의 5 mL). * * 균질 매체 (0.25 M 자당 20 mM HEPES + 150 mM NaCl의 pH 7.4)
| 방법 | 시작 볼륨 (mL) | NTA* (x 108/μL) | 총 입자† (x1010) | 단백질 광‡ (µ g / µ L) | 총 단백질§ (µ g) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29.4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0.5 ± 0.05 | 0.5 ± 0.1 | 0.6 | 73.7 ± 38.3 |
표 2: 한 원심 분리 방법 높은 murine bronchoalveolar 게 액체 파생 된 세포 외 기 수익률 제공. 총 입자 수와 입자 농도 분석 (NTA)를 추적 하는 나노 입자에 의해 측정 되었다. 단백질의 총 양과 단백질 농도 bicinchoninic 산 성 단백질 분석 실험에 의해 측정 되었다. * BALF EVs의 입자 농도 (평균 ± SEM x 108/μL 3 개의 독립적인 실험에서). † BALF EVs의 총 입자 (평균 ± SEM 1010 입자 x 3 개의 독립적인 실험에서). ‡ BALF EVs의 단백질 농도 (평균 ± SEM µ g / µ L 3 개의 독립적인 실험에서). § BALF EVs의 총 단백질 (3 개의 독립적인 실험에서 평균 ± SEM mg).
UFC: 한 원심 분리; 조밀도 기온 변화도 원심 분리;와 UC-DGC: ultracentrifugation 광: 농도; NTA: 나노 추적 분석; Sem의: 의미의 표준 오류입니다.
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Discussion
지난 몇 년간, 과학자는 세포 항상성에서 EVs의 significances unraveled는. 더 중요 한 것은, EVs 역할 주요 많은 질병 과정에 그들의 생리 화물 분자1,21,22,,2627 를 통해 이웃과 먼 셀을 변조 하 여 , 28 , 29 , 30. 미래 개발 및 발전이 분야에서 깊이 의존 신뢰할 수 있는 그리고 효율적인 방법 뿐만 아니라 식별 하 고 별도 EV 인구의 하위 집합을 수정 하지만 또한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들의 생물 학적 기능을 유지 10 , 11 , 14 , 31. 현재 연구에서 설명 하는 마우스 BALF에서에서 EVs를 분리 하는 nanomembrane 한 원심 (UFC) 메서드. 다른 보고서와 일치에서 우리는 UFC 간단 하 고 높은 복구 수율 및 순도 이며, 따라서, 작은 생물 학적 샘플10,,1718,32에 적합 했다 .
UC-DGC 일반적으로 사용 되 고 매우 순화 된 EV 입자10,14을 제공 하기 때문에 EV 격리에 대 한 표준 기술 것 여겨진다. 그러나,이 방법은 기술적으로 복잡 하 고, 시간이 걸리는, 노동 집약, 이며 낮은 확장성을 있다. 새로 개발된 된 마이크로 기반 기술은 이러한 한계를 극복 하지만이 방법은 추가 유효성 검사 전에는 다른 방법33,34로 완벽 하 게 구현할 수 있다. 따라서, 순수성 및 확장성 샘플의 손상 없이 그 어려움을 수용 하는 적절 한 메서드는 심하게 필요, 특히 작은 볼륨 생물학 액체에 대 한 합니다.
우리 시연 nanomembrane 필터 장치를 사용 하 여 UFC BALF 표본에서 EV 격리에 대 한 효과적 이었습니다. 여기에 제시 된 연구 결과 골드 표준 단순 및 높은 확장성 UC DGC 방법에 비해 UFC 프로시저의 우월성을 강조 표시 합니다. 한 기반 접근 다양 한 생물 표본에서에서 EV을 널리 채택 되고있다 있다: 소변35, 세포 조절 미디어17및 소 태아 혈 청36. 다른 모듈 크기 기반 EV 절연 기술을 적용 한 플랫폼으로 사용 하는 exosome 총 격리 칩 (이국적인)31. 이 방법은 작은 샘플 크기 표본 적합도입니다. 필터 소재 등의 몇 가지 요소 및 기 공 크기는 nanomembranes의 그들은 복구 된 EVs의 속성을 영향을 미칠 수 있기 때문에 UFC 기술을 사용 하 여 고려 될 필요가 있다. 예를 들어 다른 유형의 필터 막 소변18에서 다른 EV 관련 RNA 복구 수율 결과. 이 연구에서 우리는 10 kDa MWCO와 재생된 셀 룰 로스 (RC) NOP10, OST4, SNRPG의 가장 높은 mRNA 표현 제공 하 고 TOMM7 비교 보였다 Hydrosart 10 kDa, 또는 10 kDa18polyethersulfone (PES). 우리 10 kDa와 RC 100 kDa 보다 높은 retentate EV 복구 했다 입증 되었습니다. 다른 절연 기술37의 종류에 의해 영향을 받은 소변 EVs 화물 내용을 특징 있다. 우리의 연구 100 kDa MWCO RC 막 retentate 큰 MWCO 때문에 훨씬 덜 원치 않는 단백질의 만족 스러운 BALF 파생 EV 수확량을 제공 했다.
이 연구는 크기와 크기 분포 UFC EVs의 작고 UC DGC EVs 보다 더 균질 분산 했다 설명 했다. 일반적인 UC 기술로, 소포 집계 UC DGC EVs38의 차원이 설명할 수 있습니다. 우리는 TSG101, CD63, CD9, 및는 retentates에서 exosomes의 존재를 확인 CD81 EV 막 단백질을 감지 하 여 BALF 파생 EV 순도 평가. 우리 등도 사용 가장 UFC EVs35,39,,4041의 형태를 보여 줍니다. 리 우 외. EVs를 격리 비슷한 외 기반 접근 방식을 사용 했으며, ultracentrifugation에 의해 고립 된 EVs에 비해 transcriptomic 및 proteomic 프로필 비슷한31. 따라서, 우리와 100 kDa의 MWCO bronchoalveolar 게 액체 같은 작은 생물 액체 샘플에 적합 한 대체 EV 격리 방법으로 재생된 셀 룰 로스 멤브레인을 사용 하 여 한 원심 분리 방법을 설명 합니다.
이 UFC 접근을 사용 하 여 생물학 액체에서 EVs를 분리 하는 중요 한 단계 포함 되도록 농축된 입자 exosomal 크기 범위 및 수 있는 추가 힘의 회피에 초기 성공 막 0.2 µ m 여과 손상 또는 변형 exosome 형태학과 구조10,42. EVs는 낮은 확장성에서 여과 막에 준수 수 있습니다. 따라서, 샘플의 볼륨 필터 단위의 각 유형에 권장된 금액을 넘지 말아야 한다. 우리는 소변에서 파생 된 EVs18에서 높은 mRNA 수익률 제공 재생된 셀 룰 로스를 사용 하기로 결정 했습니다. EVs의 유형과 복구 수율 필터 막 사용의 유형을 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 100 kDa의 MWCO 생물 학적 체액에서 단백질의 대부분을 제거 한다, 비록 일부 단백질 오염 물질을 100 kDa 또는 단백질 집계 보다 큰 했다43을관찰 되었다. 이 경우에, 세척 단계는 EV와 단백질 집계를 최소화 하기 위해 중요 한. 또한, 기능 연구 해야 제대로 제어할 수 완벽 하 게 결과 해석 하기 위해 EV 관련 된 단백질 UFC EVs에 있을 것입니다.
우리 결론 UFC 가능한 작은 또는 큰-볼륨 샘플에 대 한 EV 격리에 대 한 대체 방법은입니다. 현재 사용 가능한 microfilter 단위 샘플의 15 mL까지 수용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
작품은 NHLBI/NIH 교부 금 HL103868 (컴퓨터)에 및 HL137076 (시공)를, (PC)를 미국 심장 협회 선진적인 및 Samuel Oschin 포괄적인 암 연구소 (솟) 폐 암 연구 상 (컴퓨터)에 의해 지원 됩니다. 우리는 우리에 게 EV 나노 분석 추적에 대 한 Nanosight 기계를 제공 하는 삼목 시 나이 의료 센터에 Smidt 심장 연구소에 우리의 큰 감사를 표현 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
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