Summary
Здесь мы описываем две протоколы изоляции внеклеточного везикул, ультрафильтрация центрифугирования и ultracentrifugation с плотность градиентного центрифугирования, изолировать внеклеточного пузырьки из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости образцов. Внеклеточные везикулы, получаемые из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости обоих методов количественно и характерны.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVs) являются вновь открывшимися субцеллюлярные компоненты, которые играют важную роль в многих биологических, сигнальные функции во время физиологических и патологических состояний. Изоляции EVs продолжает оставаться серьезной проблемой в этой области, из-за ограничений, присущих каждой техники. Дифференциальный ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования метод — это часто используемый подход и считается Золотой стандарт процедура изоляции EV. Однако эта процедура является длительным, трудоемкий и обычно приводит к низкой масштабируемости, которые не могут быть пригодны для малообъемной образцов таких Бронхоальвеолярный лаваж жидкости. Мы продемонстрировать, что метод изоляции центрифугирования ультрафильтрации прост и времени и труда эффективным еще обеспечивает высокое извлечение доходности и чистоты. Мы предлагаем, что этот метод изоляции может быть альтернативный подход, который подходит для изоляции EV, особенно для малообъемной биологических образцов.
Introduction
Exosomes самый маленький поднабор EVs, 50 – 200 Нм в диаметре и имеют несколько биологических функций через разнообразные сигнализации процессов1,2,3,4,5. Они управляют клеточной и тканевой гомеостаза главным образом путем содействия межклеточные связи через грузовые молекул, например, липиды, белки и нуклеиновые кислоты6,,78,9 . Один важный шаг в EV исследований является процесс изоляции. Дифференциальный ultracentrifugation (UC), с или без плотность градиентного центрифугирования (ДГК), считается золотым стандартом подход, но этот метод несет основные ограничения, включая неэффективное EV ставок возмещения и низкой масштабируемость10 , 11 , 12, которые ограничивают его наилучшего использования большего объема пробы, например клетки культуры супернатанта или высокой exosome производства образцов. Преимущества и недостатки других методов, таких как размер исключения ультрафильтрации или хромотографии immunoaffinity изоляции бусы или столбцы и микрофлюидика, хорошо описано, и современные дополнительные процедуры были разработаны для преодоления и сведения к минимуму технических ограничений в каждом подход11,12,13,14,15. Другие показали, что ультрафильтрации центрифугирования (UFC) с мембраной нанопористого в группе фильтр является альтернативным методом, который обеспечивает сопоставимой чистоты для UC метод16,17,18. Эта техника может рассматриваться как один из методов, альтернативных изоляции.
Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) содержит EVs, которые обладают многочисленные биологические функции в различных респираторных заболеваний19,20,21,22. Изучение BALF-производные EVs влечет за собой некоторые проблемы из-за инвазивность процедуре Бронхоскопия в организме человека, а также ограниченное количество жидкости восстановления промывание. В небольших лабораторных животных, таких как мышь только несколько миллилитров могут быть восстановлены в обычных легких условиях, даже меньше в воспаленных или фиброзных легких23. Следовательно сбор достаточное количество BALF для изоляции EV с дифференциальной ultracentrifugation течению приложений не может быть осуществимо. Однако изолируя правильный EV населения является решающим фактором для изучения EV биологические функции. Хрупкое равновесие между эффективностью и эффективностью продолжает оставаться проблемой в устоявшихся методов изоляции EV.
В это исследование мы демонстрируем, что центробежные ультрафильтрации подход, используя 100 кДа молекулярный вес производства (MWCO) nanomembrane фильтр, подходит для малообъемной биологических образцов таких BALF. Этот метод является простым, эффективным и обеспечивает высокую чистоту и масштабируемость для поддержки исследования BALF-производные EVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных и животных все процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC) в Cedars-Sinai медицинского центра (ЦСМС).
1. мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) сбор и подготовка
- BALF коллекция
- Усыпить мышей с коктейль кетамин (300 мг/кг) и ксилазина (30 мг/кг) через внутрибрюшинного маршрута следуют шейки матки дислокации.
- Вставьте angiocatheter 22 G в трахею. Прикрепите шприц Инсулин, содержащий 1 мл (мл) ледяной стерильные Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) и привить 1 мл DBPS в обоих легких через angiocatheter.
- Медленно снять поршень шприца для получения BALF и отказаться от BALF в 50-мл Конические трубки. Сохраните BALF на льду.
- Повторите, 1.1.2 и 1.1.3 3 x (4 x в общей сложности в каждой мыши).
Примечание: Обычно около 0,8 мл извлекается на миллилитр инстилляции. Кроме того можно выполнить следующие действия для отдельных мышей (т.е., 3 мл BALF), но объединение нескольких образцов BALF позволит изоляции более крупного пакета EVs для обеспечения согласованности в нижнем течении экспериментов.
- BALF подготовка
- Бассейн BALF от 25 мышей и разделить его на две равные части (~ 35 мл / Алиготе).
- Центрифуга BALF на 400 x g, при температуре 4 ° C за 5 мин, чтобы удалить клетки и другие сотовой мусора и собирать супернатант.
- Центрифуга супернатант в 1500 x g, при 4 ° C на 10 минут, чтобы удалить ячейки мусор. Собирать супернатант и приступить к изоляции EV ступени.
2. изоляция внеклеточного Vesicles из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости
Примечание: В этом исследовании, два EV методов изоляции, а именно UFC и ultracentrifugation с высоким используется для изоляции EVs от BALF. Ниже приводится подробный протокол каждого метода.
-
Ультрафильтрация метод обогащения центрифугирования (UFC)
Примечание: Этот метод был изменен из ранее описанных протокол10.- Фильтр супернатант из шага 1.2.3 через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем и сохранять отфильтрованные BALF на льду.
Примечание: Это исключение шаг, размер которой только везикулы меньше 200 Нм собираются. - Сбалансировать 100 кДа MWCO центробежный фильтр с стерильных DPBS 10 мин центрифуги центробежные блок на 1500 x g 10 мин при температуре 4 ° C для отмены DPBS.
Предупреждение: После мембраны фильтра устройства является достижение равновесного уровня с DPBS, мембраны должны храниться влажной на все время, пока устройство используется. - Заполните фильтр с 15 мл BALF образца из шага 2.1.1 и центрифуги на 3000 x г за 30 мин при 4 ° C. BALF потока через может быть отброшен или собраны в отдельный канонические трубку и температуре-80 ° C для использования в будущем.
- Повторите шаг 2.1.3 для оставшихся 0.2 мкм фильтрации BALF.
Примечание: Он взял три повторения centrifugations достаточно сосредоточиться на BALF EVs от оригинального начальный объем 35 мл. Это привело к 1-1,5 мл концентрируются. - Стирать концентрируются с 14 мл стерильного DPBS нежно закупорить многократно. Центрифуга фильтр на 3000 x g, при 4 ° C на 30 минут, чтобы удалить DPBS и сконцентрировать концентрируются EV.
- Соберите концентрированной EVs BALF-производные от фильтра устройства, вставив дозаторов в нижней части фильтра устройства и снятия образца с помощью side-to-side радикальные движения для обеспечения полного восстановления.
- Алиготе EVs BALF-производные и хранить их в-80 ° C для дальнейшей количественной оценки частиц и характеристик (см. шаг 3).
- Фильтр супернатант из шага 1.2.3 через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем и сохранять отфильтрованные BALF на льду.
-
Ultracentrifugation (UC) с плавучей плотность градиентного центрифугирования (ДГК)
Примечание: Следующий протокол был изменен ранее описанных протокол24.- Передача супернатант из шага 2.1.1 в ультрацентрифуга 37-мл пробирку и центрифуги выборки в 10 000 x г за 30 мин при 4 ° C, с помощью ультрацентрифугирования. Собирайте супернатант и центрифуги на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 60 мин. В то время как гранулы EV центрифугируется, подготовиться шаг 2.2.3 различные концентрации плавучесть плотность градиента буферов (Таблица 1).
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте EV окатышей в 200 мкл DPBS.
- Смешать EV подвеска с 300 мкл рабочего раствора iodixanol 50% (Таблица 1) и передать его на 15 мл ультрацентрифуга трубки. На вершине 50% iodixanol-EV смесь подвеска, последовательно слоя ниже буферного раствора в порядке от дна к верхней части: 30% iodixanol (4,5 мл), 25% iodixanol (3 мл), 15% iodixanol (2,5 мл) и 5% iodixanol (6 мл). Центрифуга на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 230 мин.
Примечание: Градиент плотности в плавучесть основана на процент масштабирования с самой высокой концентрацией (50%), внизу, чтобы низкие концентрации (5%), в верхней iodixanol. Для создания различных концентраций iodixanol, различные суммы гомогенизации среды (Таблица 1) были смешаны с рабочим раствором (50% iodixanol). - Сбор 15% и 25% фракции и развести их в стерильные DPBS довести объем до 15 мл. Их передачи новой небольшой ультрацентрифуга трубки и центрифуги на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 60 мин.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте EV окатышей в 50 мкл стерильные DPBS для дальнейшей характеризации.
3. внеклеточного везикул количественная оценка
Примечание: Доходность восстановления BALF-производные EVs предел с двух метрик.
- Наночастицы, отслеживание измерений анализ (НТА)
- Разбавить EV образца при 1: 200 – 1: 500 в 1 мл DPBS и загрузки образца в шприц инсулина. Присоединить шприц образца к шприцевый насос и начать измерения частиц числа и размера (см. Таблицу материалы).
- Установите уровень камеры на 14 и порог обнаружения на 1 для всех измерений образцов. Пять повторяющихся измерений с 1500 кадров в 30 s были записаны для каждого образца, с задержкой в 20 s между читает. Объединить и средние данные для конечной концентрации и размер сообщений.
Примечание: Для точного захвата всех частиц, отрегулируйте уровень камеры при необходимости визуализировать все частицы и использовать одинаковые параметры для всех измерений образец в каждом эксперименте.
- Количественное определение белка
Примечание: Bicinchoninic кислота assay протеина (BCA) был использован для измерения концентрации белка BALF-производные EVs.- Солюбилизировать последнего образцы EV 1 x литического буфера.
- Подсчитать количество белка в BALF-производные EVs в BCA стандартный протокол с помощью колориметрических обнаружения, измерения оптической плотности на 560 Нм в тарелку читателя.
4. Определение BALF-производные внеклеточного пузырьки
Примечание: Широко известный exosome поверхности маркер белков (TSG101, CD63, CD81 и CD9) были использованы для проверки EV возмещений SDS-PAGE и immunoblotting и потока cytometry анализ.
- SDS-PAGE и immunoblotting
- Растворите равное количество белков EV каждого образца с промокательной загрузки буфера (литий Додециловый сульфат) и 50 мм Дитиотреитол (DTT) в 1,6 мл. Тепло образцов при 70 ° C на 10 мин.
- Загрузить образцы из шага 4.1.1 в гель акриламида бис-трис плюс 4 – 12% и запустить электрофореза (150 вольт, 35 мА) для 35 мин.
- Передача белков на нитроцеллюлозную мембрану, с помощью метода сухой передачи.
- Блокировать мембраны с 5% сухого обезжиренного молока для 60 мин, тряся при комнатной температуре (RT).
- Проинкубируйте мембрану с антитела EV поверхности белка маркера, опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), при разбавлении 1: 500 в 5% BSA в трис буфер солевой Tween-20 (TBST) в при температуре 4 ° C, покачиваясь на ночь.
- Следующий день, Промойте мембрану 3 x, 10 мин каждого мытья, TBST буфер и проинкубируйте его с анти кролик IgG, ПХ связаны антител, при разбавлении 1:5,000 60 мин на RT.
- Промойте мембрану 3 x, 10 мин, каждый мыть, в TBST буфер. Разработка мембраны с хемилюминесцентный HRP антитела обнаружения реагента и изображения (см. Таблицу материалы для визуализации системы).
- Проточная цитометрия
- Развести BALF-производные EVs в 49 мкл PEB пятнать буфера (PBS + ЭДТА 5 мм + 0.5% BSA, фильтруют через мембрану фильтра шприц 0,1 мкм).
- Добавьте каждый из следующих антител в каждый индивидуальный образец: 1) крыса анти мыши PE CD63 антитела (100 нг в реакции); 2) крыса анти мыши PE CD81 (500 нг); 3) крыса анти мыши FITC CD9 (200 нг). Инкубируйте на 4 ° C, качалки для 60 мин в темноте.
- Развести образцы с 450 мкл мембранная фильтрация PEB пятнать буфера и подвергать образцы cytometry анализ потока (см. Таблицу материалы)25.
- Настройки потока цитометр следующим образом: 1) установить все каналы на гипер журнала (hlog); 2) установите триггер на SSC в 4; 3) Выключите вторичных триггера. Выполнение примеров в условиях низкой скорости и приобрести по крайней мере 10 000 событий в каждом образце.
- Выполнять анализ данных низкого цитометрии в каждом образце с помощью программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы исполняли EV изоляции от мыши BALF с использованием методов изоляции UFC и UC-ДГК в тот же день. Метод UFC требуется примерно 2,5-3 ч, тогда как UC-ДГК техника требует 8 h времени обработки. Это не включать, буферов и время приготовления реагентов. Следует отметить, что некоторые другие задачи могут выполняться в периоды длительного центрифугирования. Тем не менее вся процедура длилась почти целый день для UC-ДГК изоляции техники.
BALF-производные EVs от обычных мышей, изолированные методом UFC отображаться меньший размер и более равномерное распределение размера (148.8 ± 1,1 Нм, рис. 1A) по сравнению с UC-ДГК EVs (176,7 ± 7,8 Нм, Рисунок 1B). UFC технику имели глубокие 65-fold больше всего частиц отсчеты по сравнению с UC-ДГК изоляции (частицы против 0,5 29,4 ± 18,4 ± 0,1 x 1010 ; p < 0,05; Таблица 2 и Рисунок 1 c). Общий белок восстановление (мкг) по UFC EVs также был выше (3,136 ± 1860 против 73,7 ± 38,3 мкг; p < 0,05; В таблице 2 и на рисунке 1 d). Таким образом UFC время и усилия эффективным и обеспечивает более высокую доходность EV.
Для дальнейшего фенотипически характеризуют население BALF-производные EV, мы рассмотрели наличие маркеров широко известный exosome поверхности белка: CD63, CD9 и CD81 подачей cytometry и TSG101 по immunoblotting. С помощью анализа цитометрия потоков, мы продемонстрировали, что UFC EVs и UC-ДГК EVs выразил CD63 (рисунок 2A -2 C), CD9 (Рисунок 2D -2F) и CD81 (Рисунок 2 g -2I). Геометрическое выражение (gMFI) CD63, CD9 и CD81 был количественных и статистически не отличается между двумя условиями (Рисунок 3А -3F).
Далее мы исследовали еще EV белка маркера, TSG101, по immunoblotting. Мы показали, что 20 мкг UFC проточный (UFC-FT) образца не содержат TSG101 белки, предполагая, что метод изоляции UFC эффективно выбран и сохранил EV населения из BALF образца (рис. 4). Когда равное количество общего белка (20 мкг) из BALF-EV образца была загружена, мы обнаружили, что UFC EVs выразили более высокий уровень TSG101 чем UC-ДГК EVs (рис. 4). Мы также показали, что чистоту белка UFC-EV приемлемым, продемонстрировал одной изолированной белка-группы.
Для всех результатов, студента t-тест используется для сравнения двух групп. Результаты представлены как означает ± SEM (Среднеквадратичная ошибка среднего значения), и p < 0,05 считался значительным.
Рисунок 1: ультрафильтрации центрифугирования мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF)-производных EVs продемонстрировали более равномерное распределение размера чем ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования мышиных BALF-производные EVs и имел значительно выше всего частиц count и белков содержание. Распределение размеров частиц EV был измерен наночастиц, отслеживания анализа (НТА), и содержание общего белка было измерено bicinchoninic кислоты assay. График распределения размера НТА EVs UFC-BALF (A). График распределения размера EVs UC-ДГК-BALF (B). (C) количество всего частиц, ЗТК (означает ± SEM x 10 частиц10 ; * p < 0,05). (D) содержание общего белка (в мкг, * p < 0,05). Данные были получены от трех независимых экспериментов. UFC: ультрафильтрации центрифугирования; UC-ДГК: ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования; EVs: внеклеточная везикулы; SD: стандартное отклонение; Conc: концентрация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости производные EVs, изолированные центрифугированием ультрафильтрации и ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования методы выразил tetraspanin белки CD63, CD9 и CD81. Показаны являются проценты EVs запятнана положительных методов изоляции UFC и UC-DCG, иллюстрируется псевдоцветном участков, (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 и (G - I) PE-CD9. Данные являются производными от трех независимых экспериментов. UFC = ультрафильтрации центрифугирования; UC-ДГК = ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования; EVs = внеклеточного везикулы; SSC-A = сторона разброс анализ; PE = фикоэритрин; FITC = флуоресцеин Изотиоцианаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ультрафильтрации центрифугирования изолированные мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости производные EVs выразили аналогичные флуоресцентные плотность tetraspanin белков изолированных ultracentrifugation EVs. (A и D) Гистограмма и геометрическое выражение (gMFI) PE-CD63+-витражи EVs. (B и E) гистограммы и gMFI FITC-CD9+-витражи EVs. (C и F) гистограммы и gMFI PE-CD81+-витражи EVs. Эти данные являются производными от трех независимых экспериментов. UFC: ультрафильтрации центрифугирования; UC-ДГК = ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования; EVs: внеклеточная везикулы; SSC-A: стороне разброс анализ; PE: фикоэритрин; FITC: флуоресцеин Изотиоцианаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости производные EVs, изолированные центрифугированием ультрафильтрации и ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования методами выразил поверхности белка exosome, TSG101. Эта панель показывает immunoblotting мышиных BALF-производные EVs для TSG101 антитела (47 кДа). UFC = ультрафильтрации центрифугирования; UC-ДГК = ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования; EVs = внеклеточного везикулы; FT = поток через; TSG = ген восприимчивости опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Рабочий раствор Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Рабочий раствор (мл)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Гомогенизация среднего (мл)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Таблица 1: плавучесть плотность градиента буферов. Эта таблица дает соотношение композиции и буфера каждого градиента решения, который был использован для того чтобы очистить мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости производные внеклеточного везикул населения изолированных методом ultracentrifugation. * Рабочий раствор был 50% iodixanol (25 мл средний градиент плотности [см. Таблицу материалы] + 5 мл разбавителя раствора [рН 7,4 0,25 М сахарозы + 120 мм HEPES + 0,9 М NaCl]). ** Гомогенизации среды (рН 7,4 0,25 М сахарозы + 20 мм HEPES + 150 мм NaCl)
| Методы | Начиная объем (мл) | НТА* (x 108/μL) | Всего частиц† (x1010) | Белка Conc‡ (мкг/мкл) | Гербера§ (мкг) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2,6 | 29,4 ± 18,4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-ДГК | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0.5 ± 0,1 | 0.6 | 73,7 ± 38,3 |
Таблица 2: метод изоляции центрифугирования ультрафильтрации предоставляется выход жидкости производные внеклеточного везикул промывание высокий мышиных Бронхоальвеолярный. Концентрация частиц и количество всего частиц были измеряется наночастиц, отслеживания анализа (НТА). Концентрация белка и общее количество белка были измеряется пробирного кислоты белка bicinchoninic. * BALF EVs концентрации частиц (среднее ± SEM x 108/μL от трех независимых экспериментов). † BALF EVs всего частиц (среднее ± SEM x 1010 частиц от трех независимых экспериментов). ‡ Концентрация белка BALF EVs (среднее ± SEM мкг/мкл от трех независимых экспериментов). § BALF EVs общего белка (среднее ± SEM мг от трех независимых экспериментов).
UFC: ультрафильтрации центрифугирования; UC-ДГК: ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования; Conc: концентрация; НТА: наночастиц отслеживания анализа; SEM: среднеквадратичная ошибка среднего значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние несколько десятилетий ученые разгадана significances EVs в клеточного гомеостаза. Что еще более важно EVs играют важную роль во многих процессах, болезни, модулируя соседних и дальних клетки через их биоактивные грузов молекул1,21,22,,2627 , 28 , 29 , 30. будущее развитие и прогресс в этой области глубоко полагаться на надежные и эффективные методы, которые не только выявить и отдельные исправить подмножеств населения EV, но также сохранять свои биологические функции для нисходящие приложения 10 , 11 , 14 , 31. в рамках нынешнего исследования, мы описали nanomembrane ультрафильтрации центрифугирования (UFC) способ изолировать EVs от мыши BALF. В согласовании с другими докладами мы показали, что UFC проста и приводит к высокой восстановления урожайности и чистоты и, таким образом, подходит для небольших биологических образцов10,,1718,32 .
UC-ДГК широко используется и считается метод золотой стандарт для изоляции EV потому, что она обеспечивает высокоочищенных EV частиц10,14. Однако этот метод является технически громоздкой, времени, трудоемкий и имеет низкий масштабируемость. Недавно разработанные методы, основанные на микрофлюидика преодолеть эти ограничения, однако этот подход требует дальнейшей проверки, прежде чем он может быть полностью реализован как альтернативный метод33,34. Таким образом соответствующие методы, которые разместить эти трудности без ущерба для чистоты и масштабируемость образцов остро необходимы, особенно для малообъемной биологические жидкости.
Мы показали, что UFC, с помощью фильтра устройства nanomembrane эффективным для EV изоляции от BALF образцов. Представленные здесь выводы подчеркивают превосходство UFC процедуры по сравнению с золотой стандарт UC-ДГК метод благодаря своей простоте и выше масштабируемость. Подход, основанный на ультрафильтрации стал широко принят изолировать EV из целого ряда биологических образцов: мочи35, клетки кондиционером СМИ17и плода бычьим сывороточным36. Другие модульные на основе размера EV изоляции техника, которая использует ультрафильтрации как платформа является exosome полной изоляции чип (экзотические)31. Этот метод также подходит для небольшой размер выборки образцов. Несколько факторов, таких как фильтрующий материал и размер пор nanomembranes, необходимо учитывать при использовании метода UFC, потому что они могут влиять на свойства рекуперированного EVs. Например различные типы мембран фильтра привели к различных EV-связанные РНК восстановления урожайности от мочи18. В этом исследовании, мы показали, что регенерированной целлюлозы (RC) с 10 кДа MWCO высшим выражением мРНК NOP10, OST4, SNRPG, и TOMM7 по сравнению с Hydrosart 10 кДа, или Полиэфирсульфон (PES) 10 кДа18. Мы также продемонстрировали, что RC с 10 кДа выше восстановления EV концентрируются чем 100 кДа. Другие характеризовали мочи EVs грузов содержимое, которые пострадали от типа изоляции методов37. Наши исследования показали, что 100-кДа MWCO RC мембраны обеспечивает удовлетворительного урожайность BALF-производные EV с преимуществом гораздо меньше нежелательных белков в концентрируются из-за больших MWCO.
Это исследование показало, что размеры и распределение по размерам UFC EVs были меньше и более равномерно распределенной, чем те из UC-ДГК EVs. Везикул агрегации, который является общим с UC техники, может объяснить измерения неоднородность UC-ДГК EVs38. Мы оценили BALF-производные EV чистоты, обнаруживая EV мембранных белков, TSG101, CD63, CD9 и CD81, который подтверждает наличие exosomes в retentates. Мы и другие использовали ТЕА для демонстрации морфология UFC EVs35,,3940,41. Лю et al. используется аналогичный подход, основанный на ультрафильтрации для изоляции EVs и, когда по сравнению с EVs, изолированные, ultracentrifugation, профили протеомных и транскриптомики были аналогичные31. Таким образом мы описываем метод центрифугирования ультрафильтрации, с помощью мембраны регенерированной целлюлозы с MWCO 100 кДа как альтернативный метод изоляции EV, который подходит для небольших биологические жидкости образцов, таких как Бронхоальвеолярный лаваж жидкости.
Важнейшие шаги, используя этот подход UFC изолировать EVs от биологической жидкости включают первоначальный нанопористого мембраны 0,2 мкм фильтрации для обеспечения что обогащенного частиц находятся в диапазоне размеров exosomal и недопущение применения дополнительной силой, которая может повреждение или деформировать exosome морфологии и структуры10,42. EVs могут придерживаться фильтрации мембраны, что приводит к нижней масштабируемость. Таким образом объем образца не должен превышать рекомендуемую сумму в каждом типе фильтр. Мы решили использовать регенерированной целлюлозы, которая предоставляет более высокую доходность mRNA от мочи производные EVs18. Тип мембраны фильтра используется могут изменить восстановления урожайность и тип EVs. Наконец даже несмотря на то, что MWCO 100 кДа следует устранить большинство белков в биологических жидкостях, некоторые белковых загрязнений, которые были больше, чем 100 кДа или белка агрегатов наблюдались43. В этом случае стиральная шаг имеет решающее значение для сведения к минимуму EV и белка агрегации. Кроме того функциональные исследования должна надлежащим образом контролироваться для того, чтобы полностью интерпретировать результаты, как белки, не связанные с-EV будет присутствовать в UFC EVs.
Мы заключаем, что UFC это альтернативный подход, который возможен для изоляции EV для малых или больших тома образцов. В настоящее время микрофильтр единиц могут разместиться до 15 мл образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа поддерживается NHLBI/низ грантов HL103868 (УК) и HL137076 (для ПК), Американской ассоциации субсидий сердца (для ПК) и Самуэля Ошина всеобъемлющей рака институт (SOCCI) легких Рак исследований премию (УК). Мы хотели бы выразить нашу большую признательность институт сердца Артурович в Cedars-Sinai медицинский центр, который предоставляет нам Nanosight машина для EV наночастиц отслеживания анализа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
