Summary
Här beskriver vi två extracellulära vesikler isolering protokoll, ultrafiltrering centrifugering och ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering, att isolera extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär lavage vätskeprover. De extracellulära blåsor som härstammar från murina bronkoalveolär lavage vätska genom båda metoderna är kvantifierade och karakteriseras.
Abstract
Extracellulära blåsor (EVs) är nyupptäckt subcellulära komponenter som spelar viktiga roller i många biologiska signalering funktioner under fysiologiska och patologiska stater. Isolering av EVs fortsätter att vara en stor utmaning i det här fältet, på grund av begränsningar för varje teknik. Den differentiella ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering metod är en vanligt förekommande strategi och anses vara guldmyntfot förfarandet för EV isolering. Proceduren är tidskrävande, arbetsintensiva, vilket resulterar i låg skalbarhet, vilket inte kanske är lämplig för små volymer prover såsom bronkoalveolär lavage vätska. Vi visar att en ultrafiltrering centrifugering isolering metod är enkel och tid - och labor-effektiv men ger en hög avkastning och renhet. Vi föreslår att denna metod för isolering kan vara en alternativ metod som är lämplig för EV isolering, särskilt för små volymer biologiska prover.
Introduction
Exosomes är den minsta delmängden av EVs, 50 – 200 nm i diameter, och har flera biologiska funktioner över en mångfald av signalering processer1,2,3,4,5. De reglerar cellulär och vävnad homeostas primärt genom att underlätta kommunikationen genom Last molekyler såsom lipider, proteiner och nukleinsyror6,7,8,9 . Ett kritiskt steg i EV forskning är isolering processen. Differentiell ultracentrifugering (UC), med eller utan täthet lutning centrifugering (DGC), anses vara den gyllene standard strategin, men denna metod bär stora begränsningar, ineffektiva EV återvinningsprocent och låg skalbarhet10 , 11 , 12, som begränsar dess bästa utnyttjande till större volym prover, såsom cell kultur supernatant eller hög exosome produktion exemplar. Fördelar och nackdelar med andra metoder, såsom storlek utslagning genom ultrafiltrering eller kromatografi, immunoaffinity isolering av pärlor eller kolumner och mikrofluidik, är väl beskrivna och moderna kompletterande procedurer har utvecklats till övervinna och minimera tekniska begränsningar i varje strategi11,12,13,14,15. Andra har visat att en ultrafiltrering centrifugering (UFC) med nanoporösa membran i Filterenheten är en alternativ teknik som ger jämförbara renhet till en UC metod16,17,18. Denna teknik kunde betraktas som en av de alternativa isoleringsmetoder.
Bronkoalveolär lavage vätska (BALF) innehåller EVs som besitter många biologiska funktioner i olika luftvägsbesvär19,20,21,22. Studera BALF-derived EVs innebär vissa utmaningar på grund av invasivitet av bronkoskopi förfarandet hos människor, liksom en begränsad mängd lavage vätska återhämtning. I små försöksdjur som möss, endast några milliliter kan återställas med normala lungsjukdomar, ännu mindre i inflammerad eller fibrotisk lungorna23. Därför kanske samla en tillräcklig mängd BALF för EV isolering av en differential ultracentrifugering för nedströms program inte genomförbart. Isolera rätt EV populationer är dock en avgörande faktor för att studera EV biologiska funktioner. Den känsliga balansen mellan effektivitet och effekt fortsätter att vara en utmaning i väletablerade EV isoleringsmetoder.
I den här aktuella studien visar vi att en centrifugal ultrafiltrering strategi, utnyttja en 100 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) nanomembrane filterenhet, är lämplig för små volymer biologiska preparatet såsom BALF. Denna teknik är enkel, effektiv och ger hög renhet och skalbarhet att stödja studier av BALF-derived EVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utnyttjande av djur och alla djur förfaranden godkändes av institutionella djur vård och användning kommittéer (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).
1. murina bronkoalveolär Lavage vätska (BALF) insamling och förberedelse
- BALF samling
- Euthanize möss med en cocktail av ketamin (300 mg/kg) och xylazin (30 mg/kg) via den intraperitoneala vägen följt av cervikal dislokation.
- Infoga en 22 G angiocatheter i luftstrupen. Bifoga en insulinspruta innehållande 1 mL (mL) iskall sterila Dulbeccos fosfat buffert saltlösning (DPBS) och ingjuta 1 mL DBPS i båda lungorna genom angiocatheter.
- Dra sakta upp sprutkolven för att hämta BALF och fördela BALF i en 50 mL konisk slang. Hålla BALF på is.
- Upprepa steg 1.1.2 och 1.1.3 3 x (4 x totalt i varje mus).
Obs: Cirka 0,8 mL hämtas generellt per milliliter av instillation. Även följande åtgärder kan utföras för enskilda möss (dvs3 mL BALF), men sammanslagning flera BALF prover kommer att tillåta isolering av ett större parti EVs för konsekvens i nedströms experiment.
- BALF förberedelse
- Pool BALF från 25 möss och dela den i två lika uppsättningar (~ 35 mL per alikvot).
- Centrifugera BALF vid 400 x g, vid 4 ° C i 5 minuter för att avlägsna celler och andra cellulära skräp och samla supernatanten.
- Centrifugera supernatanten vid 1500 x g, vid 4 ° C i 10 min, ta bort cellfragment. Samla in supernatanten och vidare till EV isolering stegen.
2. isolering av extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär Lavage vätska
Obs: I denna studie, två EV isolering tekniker, nämligen UFC och ultracentrifugering med flytande för att isolera EVs från BALF. Det detaljerade protokollet av varje metod beskrivs nedan.
-
Ultrafiltrering centrifugering (UFC) berikning metod
Obs: Denna metod ändrades från en tidigare beskrivna protokollet10.- Filtrera supernatanten från steg 1.2.3 genom ett 0,2 μm steril spruta filter och hålla den filtrerade BALF på is.
Obs: Detta är en storlek utslagning steg varigenom endast blåsor mindre än 200 nm samlas. - Temperera 100 kDa MWCO centrifugal filterenheten med sterila DPBS för 10 min. Centrifugera centrifugal enheten vid 1500 x g i 10 minuter vid 4 ° C om du vill ignorera DPBS.
Varning: När membranet i enhetens filter är utjämnad med DPBS, membranet måste hållas våt hela tiden tills enheten används. - Fyll på filterenhet med 15 mL av BALF provet från steg 2.1.1 och centrifugera vid 3 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Den genomströmmande BALF kan kasseras eller samlas i en separat kanoniska röret och lagras vid-80 ° C för framtida bruk.
- Upprepa steg 2.1.3 för den resterande 0,2 µm-filtrerad BALF.
Obs: Det tog tre upprepningar av centrifugations tillräckligt koncentrera BALF EVs från den ursprungliga starta volymen av 35 mL. Detta resulterade i 1-1,5 mL retentate. - Tvätta retentate med 14 mL steril DPBS genom ett försiktigt pipettering upprepande. Centrifugera filterenheten på 3 000 x g, vid 4 ° C i 30 min, att ta bort DPBS och koncentrera den EV retentate.
- Samla in koncentrerad BALF-derived EVs från filtret enheten genom att infoga en vi rekommenderar i botten av filtret enheten och dra provet med svepande rörelser sida till sida för att säkerställa total återhämtning.
- Alikvot BALF-derived EVs och lagra dem vid-80 ° C för ytterligare partikel kvantifiering och karakterisering (se steg 3).
- Filtrera supernatanten från steg 1.2.3 genom ett 0,2 μm steril spruta filter och hålla den filtrerade BALF på is.
-
Ultracentrifugering (UC) med stark täthet lutning centrifugering (DGC)
Obs: Följande protokoll ändrades från den tidigare beskrivna protokoll24.- Överför supernatanten från steg 2.1.1 i ett 37-mL ultracentrifugen rör och centrifugera provet vid 10 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C med ultracentrifugen. Samla in supernatanten och centrifugera vid 100 000 x g, vid 4 ° C i 60 min. Medan EV pellets centrifugeras, förbereda olika koncentrationer av buoyant täthet lutning buffertar (tabell 1) för steg 2.2.3.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera EV pellets i 200 μL av DPBS.
- Blanda EV suspensionen med 300 μL 50% iodixanol arbetslösning (tabell 1) och överför det till 15 mL ultracentrifugen röret. Ovanpå den 50% iodixanol-EV blandningen suspensionen, sekventiellt lager följande buffertlösningen i ordning från botten till toppen: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% av iodixanol (3 mL), 15% iodixanol (2,5 mL) och 5% iodixanol (6 mL). Centrifugera vid 100 000 x g, vid 4 ° C för 230 min.
Obs: Buoyant täthetlutningen baseras på procent av iodixanol skalning med den högsta koncentrationen (50%) längst ner till den lägsta koncentrationen (5%) på toppen. För att generera olika koncentrationer av iodixanol, blandades olika mängder homogenisering medium (tabell 1) med fungerande lösning (50% iodixanol). - Samla den 15 och 25% fraktionen och späda ut dem i sterila DPBS att få upp volymen till 15 mL. Överföra dem till en ny liten ultracentrifugen tub och centrifugera vid 100 000 x g, vid 4 ° C i 60 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera EV pellets i 50 μl sterilt DPBS för ytterligare karakterisering.
3. extracellulär vesikler kvantifiering
Obs: BALF-derived EVs återhämtning avkastningen är quantitated med två mätvärden.
- Nanopartiklar spårning analys (NTA) mätning
- Späd EV provet på 1: 200 – 1: 500 i 1 mL av DPBS och laddar provet i en insulinspruta. Bifoga en prov spruta till en sprutpumpen och börja mäta partikeln numrerar och storlek (se Tabell för material).
- Ställa in kameran på 14 och den påvisbara gränsen vid 1 för alla prov mätningar. Fem repetitiva mätningar med 1500 bildrutor i 30 s registrerades för varje prov, med en försening på 20 s mellan läsningar. Kombinera och genomsnitt data för slutlig koncentration och storlek rapporter.
Obs: För korrekt att fånga alla partiklar, justera kameran som lämpligt att visualisera alla partiklar och använda liknande inställningar för alla testmätningar i varje experiment.
- Protein kvantifiering
Obs: Bicinchoninic syra (BCA) protein analysen användes för att mäta protein koncentrationen av BALF-derived EVT.- Solubilize EV proverna i 1 x lyseringsbuffert.
- Kvantifiera mängden protein i BALF-derived EVs per BCA standard protokoll använder kolorimetriska upptäckt genom att mäta absorbansen vid 560 nm i en spektrofotometer.
4. identifiering av BALF-derived extracellulära blåsor
Obs: Känd exosome yta markör proteiner (TSG101, CD63, CD81 och CD9) användes för att kontrollera EV återvinningar av SDS-PAGE och immunoblotting och flöde flödescytometri analys.
- SDS-PAGE och immunoblotting
- Lös upp en lika stor mängd EV proteiner av varje prov med en blotting lastning buffert (litium dodecyl sulfate) och 50 mM Ditiotreitol (DTT) i en 1,6 mL tub. Värm proverna vid 70 ° C i 10 min.
- Läsa in proverna från steg 4.1.1 till en 4 – 12% Bis-Tris Plus akrylamid gel och köra elektrofores (150 volt, 35 mA) för 35 min.
- Överföra proteiner till en nitrocellulosa membran med en torr överföringsmetod.
- Blockera membranet med 5% skummjölk för 60 min, gunga i rumstemperatur (RT).
- Inkubera membranet med en antikropp till en EV ytan protein markör, tumör känslighet genen 101 (TSG101), på 1: 500 spädning med 5% BSA i Tris-buffrad koksaltlösning Tween-20 (TBST) vid 4 ° C, gunga över natten.
- Nästa dag, tvätta membranet 3 x, 10 min varje tvätta, i TBST buffert, och inkubera det med anti-kanin IgG, en HRP-länkade antikropp, 1:5,000 spädning för 60 min på RT.
- Tvätta membranet 3 x, 10 min varje tvätta, i TBST buffert. Utveckla membranet med Kemiluminiscens HRP antikroppreagens upptäckt och bild (se Tabell av material för imaging system).
- Flödescytometri
- Späd BALF-derived EVs i 49 μL PEB färgning buffert (PBS + 5 mM EDTA + 0,5% BSA, filtreras genom en 0,1 μm spruta filtermembranet).
- Lägg till följande antikroppar i varje enskilt prov: 1) råtta antimus PE CD63-antikropp (100 ng per reaktion); (2) råtta antimus PE CD81 (500 ng); (3) råtta antimus FITC CD9 (200 ng). Inkubera vid 4 ° C, gunga i 60 min i mörker.
- Späd ut proverna med 450 μl av membran-filtrerad PEB färgning buffert och underkasta proverna Flödesanalys flödescytometri (se Tabell för material)25.
- Justera flödet cytometer inställningarna enligt följande: 1) ange alla kanaler på hyper log (hlog); (2) ange utlösaren på SSC på 4. (3) Stäng av den sekundära avtryckaren. Kör exemplen i en låg hastighet inställning och förvärva minst 10.000 händelser i varje prov.
- Utföra låga flödescytometri dataanalyser i varje prov med analysprogramvara (se Tabell för material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde EV isolering från mus BALF med UFC och UC-DGC isoleringsmetoder på samma dag. Metoden UFC krävs cirka 2,5 – 3 h, medan UC-DGC tekniken krävs 8 h bearbetningstid. Detta inkluderade inte buffertar och reagens förberedelsetid. Det bör noteras att vissa andra uppgifter kan utföras under perioderna som lång centrifugering. Dock varade hela förfarandet nästan en hel dag för UC-DGC isolering teknik.
BALF-derived EVs från normala möss isolerade av metoden UFC visas en mindre storlek och en mer enhetlig storlek distribution (148,8 ± 1,1 nM, figur 1A) jämfört med UC-DGC EVs (176,7 ± 7,8 nM, figur 1B). UFC tekniken hade en djupgående 65-fold större total partikel räknas jämfört med UC-DGC isolering (29,4 ± 18,4 vs. 0,5 ± 0,1 x 1010 partiklar; p < 0,05; Tabell 2 och figur 1 c). Totalt protein återvinning (i µg) av UFC EVs var också högre (3,136 ± 1 860 vs. 73,7 ± 38,3 µg; p < 0,05; Tabell 2 och figur 1 d). Således, UFC är tid - och ansträngning-effektiv och ger en högre avkastning för EV.
För att ytterligare karakterisera fenotypiskt BALF-derived EV populationer, vi undersökte förekomsten av känd exosome yta protein markörer: CD63, CD9 och CD81 av flödescytometri och TSG101 av immunoblotting. Med hjälp av flödescytometri Flödesanalys, vi visat att både UFC EVs och UC-DGC EVs uttryckt CD63 (figur 2A -2 C), CD9 (figur 2D -2F), och CD81 (figur 2 g -2I). Det geometriska medelvärde uttrycket (gMFI) CD63, CD9 och CD81 var kvantifierade och inte statistiskt skilt mellan de två villkor (figur 3A -3F).
Nästa, vi undersökt en annan EV protein markör, TSG101, av immunoblotting. Vi visade att de 20 µg av UFC genomströmning (UFC-FT) provet inte innehåller TSG101 proteiner, vilket tyder på att UFC isolering tekniken effektivt valt och behålls EV befolkningen från BALF provet (figur 4). När lika mängder totalt protein (20 µg) från BALF-EV provet lästes in, hittade vi att UFC EVs uttryckte en högre TSG101 än UC-DGC EVs (figur 4). Vi visade också att renheten av UFC-EV protein var acceptabel, framgår av en enda isolerad protein band.
För alla resultat, Student's t-test användes för två-gruppen jämförelse. Resultaten presenteras som menar ± SEM (standardfelet för medelvärdet), och p < 0.05 ansågs betydande.
Figur 1: ultrafiltrering centrifugering av murina bronkoalveolär lavage vätska (BALF)-härledda EVs visat en mer homogen storlek distribution än ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering av murina BALF-derived EVs och hade en betydligt högre totala räkningen och protein partikelhalt. Fördelningen av EV partikelstorlek mättes av nanopartiklar spårning analys (NTA) och det totala proteininnehållet mättes genom bicinchoninic syra analysen. (A) UFC-BALF EVs' NTA storlek distribution diagram. (B) UC-DGC-BALF EVs' storlek distribution diagram. (C) Total partikelantal av NTA (menar ± SEM x 1010 partiklar; * p < 0,05). (D) totalt proteininnehåll (uttryckt i µg, * p < 0,05). Uppgifterna härrör från tre oberoende experiment. UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC: ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering; EVs: extracellulära blåsor; SD: standardavvikelse; Conc: koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: murina bronkoalveolär lavage vätska-derived EVs isolerade genom ultrafiltrering centrifugering och ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering metoder uttryckt tetraspanin proteiner CD63, CD9 och CD81. Visas är procentandelar av EVs färgade positivt av UFC och UC-DCG isolering tekniker, illustrerad av falsk tomter, för (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 och (G - I) PE-CD9. Uppgifterna hämtas från tre oberoende experiment. UFC = ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering; EVs = extracellulära blåsor; SSC-A = side scatter analys; PE = fykoerytrin; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ultrafiltrering centrifugering-isolerade murina bronkoalveolär lavage vätska-derived EVs uttryckt en liknande fluorescerande densitet av tetraspanin proteiner till ultracentrifugering isolerad EVs. (A och D) Histogram och geometriska uttryck (gMFI) för PE-CD63+-målat EVs. ( EochB ) Histogram och gMFI av FITC-CD9+-målat EVs. (C och F) Histogram och gMFI av PE-CD81+-målat EVs. Uppgifterna härrör från tre oberoende experiment. UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering; EVs: extracellulära blåsor; SSC-A: side scatter analys; PE: fykoerytrin; FITC: fluoresceinisothiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: murina bronkoalveolär lavage vätska-derived EVs isolerade genom ultrafiltrering centrifugering och ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering metoder uttryckt proteinet exosome yta, TSG101. I denna panel visas immunoblotting av murina BALF-derived EVs för TSG101 antikroppen (47 kDa). UFC = ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC = ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering; EVs = extracellulära blåsor; FT = genomflöde; TSG = tumör känslighet genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fungerande lösning Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Fungerande lösning (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Homogenisering medium (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tabell 1: Buoyant täthet lutning buffertar. Denna tabell ger sammansättning och buffert förhållandet mellan varje övertoning lösning som användes för att rena murina bronkoalveolär lavage vätska-derived extracellulära vesikler populationer isoleras genom ultracentrifugering tekniken. * Fungerande lösningen var 50% iodixanol (25 mL täthet lutning medium [se Tabell för material] + 5 mL spädningsvätska lösning [pH 7,4 av 0,25 M sackaros + 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl]). ** Homogenisering medium (pH 7,4 av 0,25 M sackaros + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)
| Metoder | Starta volym (mL) | NTA* (x 108µl) | Summa partiklar† (x1010) | Protein konc‡ (µg/µL) | Totala proteiner§ (µg) |
| UFC | 35 | 7.69 ± 2.6 | 29,4 ± 18,4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0,5 ± 0,05 | 0,5 ± 0,1 | 0,6 | 73,7 ± 38,3 |
Tabell 2: metoden ultrafiltrering centrifugering isolering tillhandahålls en hög murina bronkoalveolär lavage vätska-derived extracellulära vesikler avkastning. Partikel koncentration och totala partikelantal mättes av nanopartiklar spårning analys (NTA). En proteinkoncentration och totala mängden protein mättes med en bicinchoninic acid protein analysmetod. * BALF EVs' partikel koncentration (medelvärde ± SEM x 108µl från tre oberoende experiment). † BALF EVs' total partikel (medelvärde ± SEM x 1010 partiklar från tre oberoende experiment). ‡ BALF EVs' proteinkoncentration (medelvärde ± SEM µg/µL från tre oberoende experiment). § BALF EVs' totalt protein (medelvärde ± SEM mg från tre oberoende experiment).
UFC: ultrafiltrering centrifugering; UC-DGC: ultracentrifugering med täthet lutning centrifugering; Conc: koncentration. NTA: nanopartiklar spårning analys; SEM: standardavvikelsen för medelvärdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senaste decennierna, har forskare avslöjad signifikans av EVs i cellulära homeostas. Viktigare, spelar EVs stora roller i många sjukdomsprocesser genom att modulera närliggande och avlägsna celler via deras bioaktiva Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. framtida utveckling och avancemang i det här fältet djupt beroende av pålitliga och effektiva metoder som inte bara identifiera och avgränsa rätta delmängder av EV populationer men också bevara sin biologiska funktioner för nedströms tillämpningar 10 , 11 , 14 , 31. i den aktuella studien beskrev vi en nanomembrane ultrafiltrering centrifugering (UFC) metod för att isolera EVs från mus BALF. I överensstämmelse med andra rapporter visade vi att UFC är enkelt och resulterar i en hög avkastning och renhet och, därför, är lämplig för små biologiska prover10,17,18,32 .
UC-DGC används ofta och anses vara den gyllene standard tekniken för EV isolering eftersom det ger högrenade EV partiklar10,14. Men, denna metod är tekniskt tungrott, tidskrävande, arbetsintensiva och har låg skalbarhet. De nyutvecklade mikrofluidik-baserad teknikerna övervinna dessa begränsningar, men detta tillvägagångssätt kräver ytterligare validering innan det kan genomföras fullt ut som en alternativ metod33,34. Således, lämpliga metoder som rymma dessa svårigheter utan att kompromissa med renhet och skalbarhet av prover är behövligt, särskilt för små volymer biologiska vätska.
Vi visat att UFC använder en nanomembrane filterenhet var effektivt för EV isolering från BALF exemplar. Resultaten presenteras här Markera överlägsenhet av UFC förfarandet i jämförelse med guldmyntfot UC-DGC metod på grund av dess enkelhet och högre skalbarhet. Den ultrafiltrering synsätt har blivit allmänt antas för att isolera EV från en mängd biologiska prover: urin35, cell-villkorade media17och fetalt bovint serum36. Den andra modulära storlek-baserade EV isolering teknik som använder ultrafiltrering som plattform är exosome total isolering chip (exotiska)31. Denna metod passar även för liten provstorlek exemplar. Några faktorer, såsom filtermaterial och porstorlek av nanomembranes, måste beaktas när du använder UFC tekniken eftersom det kan påverka egenskaperna för återvunna EVs. Exempelvis resulterade olika typer av filter membranen i olika EV-associerade RNA återhämtning avkastning från urin18. I denna studie visade vi att regenererad cellulosa (RC) med en 10 kDa MWCO gav det högsta mRNA-uttrycket av NOP10, OST4, SNRPG, och TOMM7 förhållande till Hydrosart 10 kDa eller polyetersulfon (PES) 10 kDa18. Vi visade vidare att RC med 10 kDa hade en högre retentate EV återhämtning än de 100 kDa. Andra har präglat urin EVs Last innehållet som påverkades av vilken typ av isolering tekniker37. Vår studie visade att 100-kDa MWCO RC membranet som en tillfredsställande BALF-derived EV avkastning med fördelen av mycket mindre oönskade proteiner i retentate på grund av den större MWCO.
Denna studie visade att de storlekar och storleksfördelningen för UFC EVs var mindre och mer homogent fördelad än UC-DGC EVs. Vesikler aggregering, vilket är vanligt med UC tekniker, kan förklara dimension heterogenitet i UC-DGC EVs38. Vi bedömde BALF-derived EV renhet genom att upptäcka de EV membranproteiner TSG101, CD63, CD9 och CD81, som bekräftar förekomsten av exosomes i retentates. Vi och andra har också använt TEM för att demonstrera morfologi av de UFC EVs35,39,40,41. LiU et al. använde en liknande ultrafiltrering metod för att isolera EVs, och jämfört med EVs isolerat av ultracentrifugering, proteomiska och transcriptomic Profilerna var liknande31. Således beskriver vi en ultrafiltrering centrifugering metod använder en regenererad cellulosa membran med en MWCO av 100 kDa som en alternativ EV isolering metod som är lämplig för små biologiska vätskeprover såsom bronkoalveolär lavage vätska.
De kritiska steg använder denna UFC metod för att isolera EVs från biologiska vätska inkluderar den första nanoporösa 0,2 µm membranfiltrering för att säkerställa att de berikade partiklarna i intervallet exosomal storlek och undvikande av tillämpa ytterligare kraft som kan skada eller deformeras de exosome morfologi och strukturer10,42. EVs kan följa filtrering membran, vilket resulterar i lägre skalbarhet. Volymen av provet bör därför inte överstiga det rekommenderade beloppet i varje typ av filterenheten. Vi valde att använda regenererad cellulosa, som gav en högre mRNA avkastning från urin-derived EVs18. Typ av filter membranen som används kan förändra återhämtning avkastning och typ av EVs. Slutligen, även om en MWCO av 100 kDa bör eliminera flesta proteiner i de biologiska vätskorna, vissa protein föroreningar som var större än 100 kDa eller protein aggregat observerades43. I det här fallet är en tvätt steg avgörande för att minimera EV och protein aggregation. Dessutom måste funktionella studier korrekt kontrolleras för att fullständigt tolka resultaten, som icke-EV-associerade proteiner kommer att närvara i UFC EVT.
Vi dra slutsatsen att UFC är ett alternativt tillvägagångssätt som är genomförbar för EV isolering för små eller större-volymer prover. De för närvarande tillgängliga mikrofilter enheterna rymmer upp till 15 mL av prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöds av NHLBI/NIH bidragen HL103868 (till PC) och HL137076 (för PC), den amerikanska hjärtat föreningen bidrag (till PC) och Samuel Oschin omfattande Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (för PC). Vi vill uttrycka vår stora uppskattning till Smidt hjärtat institutet vid Cedars-Sinai Medical Center som ger oss en Nanosight maskin för EV nanopartiklar spårning analys.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
