Summary
Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EVs) birçok biyolojik işlevleri fizyolojik ve patolojik durumları sırasında sinyal önemli rol oynamaktadır yeni keşfedilen hücre altı bileşenleridir. EVs yalıtım her tekniği için iç kısıtlamaları nedeniyle bu alanda büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yoğunluk gradient Santrifüjü yöntemi ile fark ultrasantrifüj yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır ve EV yalıtım için altın standart prosedür olarak kabul edilir. Ancak, bu yordam zaman alan, emek yoğun ve genellikle küçük hacimli örnekleri bronchoalveolar lavaj sıvı gibi için uygun olmayabilir düşük ölçeklenebilirlik sonuçlanır. Biz bir Ultrafiltrasyon Santrifüjü yalıtım yöntemi basit ve zaman ve emek verimli henüz bir yüksek kurtarma verim ve saflık sağlar göstermek. Önerdiğimiz bu yalıtım yöntemini EV yalıtımı, küçük hacimli biyolojik örnekler için özellikle uygun olan alternatif bir yaklaşım olabilir.
Introduction
Exosomes EVs, 50-200 nm çapında, en küçük alt kümesini ve işlemleri1,2,3,4,5sinyal çeşitli bir dizi birden çok biyolojik işlevleri yoktur. Öncelikle kargo moleküller gibi yağlar, proteinler ve nükleik asitler6,7,8,9 aracılığıyla hücreler arası iletişim kolaylaştırarak cep ve doku homeostazı yöneten . Bir kritik adım EV araştırma yalıtım işlemidir. Fark ultrasantrifüj (UC), ile ya da ezelî yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC), altın standart yaklaşım olarak kabul edilmektedir, ancak bu yöntem verimsiz EV kurtarma oranları ve düşük ölçeklenebilirlik10 da dahil olmak üzere büyük sınırlamalar taşır , 11 , 12, bu hücre kültür süpernatant veya yüksek eksozom üretim örnekleri gibi daha büyük ses örnekleri kendi en iyi kullanımı kısıtlamak. Avantajları ve dezavantajları boyutu dışlama Ultrafiltrasyon veya kromatografi, immunoaffinity yalıtım boncuk veya sütun ve havacilik, tarafından gibi diğer yöntemlerini de açıklanmıştır ve modern ek prosedür için geliştirilmiştir üstesinden gelmek ve her yaklaşım11,12,13,14,15dakika sonra teknik sınırlamalar en aza indirmek. Diğerleri nanoporous membran filtre birimi ile Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) UC yöntemi16,17,18karşılaştırılabilir saflık sağlar alternatif bir teknik olduğunu göstermiştir. Bu teknik bir alternatif izolasyon yöntemleri olarak düşünülebilir.
Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) çok sayıda Biyolojik işlevleri çeşitli solunum koşulları19,20,21,22sahip EVs içerir. BALF türetilmiş EVs gerektirdiği bazı zorluklar nedeniyle insanlar bronkoskopi yordamda yanı sıra lavaj sıvı kurtarma sınırlı bir miktarda invasiveness okuyor. Hayvanlarda küçük laboratuvar fareler gibi sadece bir kaç mililitre normal akciğer koşullarında elde edilebilir, iltihaplı veya fibrotik akciğerler23yılında daha az bile. Sonuç olarak, karşıdan akış uygulamaları için bir fark ultrasantrifüj tarafından BALF yeterli miktarda EV yalıtım için toplama mümkün olmayabilir. Ancak, doğru EV nüfus yalıtma EV biyolojik fonksiyonlar çalışmak için çok önemli bir faktördür. Verimliliği ve etkinliği arasındaki hassas dengeyi köklü EV yalıtım yöntemleri bir sorun olmaya devam etmektedir.
Bu çalışmada bir 100 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) nanomembrane filtre ünitesi, kullanan bir santrifüj Ultrafiltrasyon yaklaşım BALF gibi küçük hacimli biyolojik örnek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu teknik basit, etkili ve yüksek saflıkta ve BALF elde edilen EVs çalışma desteklemek için ölçeklenebilirlik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar kullanımı ve tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Cedars-Sinai Tıp Merkezi (CSMC) tarafından kabul edildi.
1. fare Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) toplama ve hazırlık
- BALF koleksiyonu
- Ketamin (300 mg/kg) ve xylazine (30 mg/kg) servikal çıkığı tarafından takip mayi rota üzerinden bir kokteyl ile fareler ötenazi.
- 22 G angiocatheter nefes borusu yerleştirin. 1 mL (mL) buz gibi steril Dulbecco'nın fosfat tampon salin (DPBS) içeren bir insülin şırıngayı takın ve DBPS 1 mL angiocatheter aracılığıyla her iki ciğerlerine aşılamak.
- Yavaş yavaş BALF alıp BALF 50 mL konik tüp içine dağıtmak için şırınga pistonu geri alıyorum. BALF buz üzerinde tutun.
- 1.1.2 1.1.3 aygıtlarından 3 x (her fare toplamda 4 x).
Not: Yaklaşık 0.8 mL genellikle korumak mililitre alınır. Ayrıca, aşağıdaki adımları tek tek fareler için (yani, BALF 3 mL) gerçekleştirilir, ancak birden fazla BALF örnekleri havuzu EVs daha büyük bir toplu işlem tutarlılık için yalıtım aşağı akım deneylerde izin verir.
- BALF hazırlık
- BALF 25 fareler havuz ve iki eşit kümeye (aliquot başına ~ 35 mL) bölün.
- BALF, 400 x g, 5 min için 4 ° C'de hücreler ve diğer hücresel enkaz kaldırmak ve süpernatant toplamak için santrifüj kapasitesi.
- Hücre artıkları kaldırmak için süpernatant 1.500 x g, 10 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi. Süpernatant toplamak ve EV yalıtım adımlarla devam edin.
2. izolasyon üzerinden fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller
Not: Bu çalışmada, iki EV yalıtım teknikleri, yani UFC ve ultrasantrifüj batmaz ile EVs BALF dan izole etmek için kullanılır. Her yöntemin detaylı Protokolü aşağıda açıklanmıştır.
-
Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) zenginleştirme yöntemi
Not: Bu yöntem yukarıda açıklanan protokol10' dan güncellenmiştir.- Süpernatant adım 1.2.3 0,2 mikron steril enjektör filtre ile filtre ve filtre uygulanmış BALF buz üzerinde tutun.
Not: Bu sayede bir boyutu dışlama adım olduğunu sadece 200 daha küçük veziküller nm toplanır. - DPBS atmak için 100 kDa MWCO santrifüj filtre ünitesi steril DPBS 10 dakika santrifüj 1.500 x g santrifüj birimi 4 ° C'de 10 dakika süreyle ile equilibrate.
Dikkat: bir kez içinde belgili tanımlık süzgeç aygıt membran DPBS ile equilibrated, membran cihaz kullanılır kadar tüm zaman ıslak tutulması gerekir. - Filtre ünitesi BALF örnek adım 2.1.1 15 mL ile doldurup 4 ° C'de 30 dk 3000 x g, santrifüj Akış yoluyla BALF atılır veya ayrı bir kanonik tüpüne toplanan ve ileride kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.
- 2.1.3 kalan 0.2 µm filtre BALF için yineleyin.
Not: Bu centrifugations yeterince konsantre BALF EVs 35 mL orijinal başlangıç hacmi üzerinden üç tekrar aldı. Bu 1-1.5 mL retentate sonuçlandı. - 14 mL steril DPBS ile retentate bir hafifçe hkr pipetting tarafından yıkayın. Filtre ünitesi 4 ° c 30 dk, 3000 x g, santrifüj kapasitesi DPBS kaldırmak için ve EV retentate konsantre.
- Konsantre BALF kaynaklı EVs filtre aygıttan bir pipettor cihazın alt tarafına filtre ekleme ve toplam malın güvenliğini garantiye almak için bir yan yana süpürme hareket kullanan örnek çekilmesi toplamak.
- Aliquot BALF elde edilen EVs ve-80 ° c daha fazla parçacık miktar ve karakterizasyonu (bkz. Adım 3) için saklayabilirsiniz.
- Süpernatant adım 1.2.3 0,2 mikron steril enjektör filtre ile filtre ve filtre uygulanmış BALF buz üzerinde tutun.
-
Ultrasantrifüj (UC) batmaz yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC) ile
Not: Aşağıdaki Protokolü yukarıda açıklanan protokol24güncellenmiştir.- Süpernatant 2.1.1 adımından 37-mL ultracentrifuge tüp içine aktarmak ve 10.000 x g ultracentrifuge kullanarak 4 ° C'de 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi. Süpernatant ve santrifüj 60 dk 4 ° C'de 100.000 x g de toplamak. EV granül centrifuged iken, batmaz yoğunluk gradient arabellekleri (Tablo 1) farklı konsantrasyonlarda 2.2.3 adım için hazır olun.
- Süpernatant atın ve EV granül DPBS 200 μL içinde resuspend.
- EV süspansiyon % 50 iodixanol çalışma çözüm (Tablo 1) 300 μL ile karıştırın ve 15 mL ultracentrifuge tüp için transfer. % 50 iodixanol-EV karışımı süspansiyon üzerine sırayla aşağıdaki arabellek çözüm alt sırada üst katman: % 30 iodixanol (4.5 mL), iodixanol (3 mL), % 15 iodixanol (2.5 mL) ve % 5 iodixanol (6 mL) % 25. Santrifüj 230 min için 4 ° C'de 100.000 x g de.
Not: Batmaz yoğunluk gradient iodixanol alt üst en düşük konsantrasyon (% 5) için en yüksek konsantrasyon (% 50) ile ölçekleme yüzdesini temel alır. İodixanol farklı konsantrasyonlarda üretmek için homojenizasyon Orta (Tablo 1) çeşitli miktarlarda çalışma çözüm (% 50 iodixanol) ile karıştırıldı. - % 15 ve % 25 kesir toplamak ve onları steril DPBS 15 mL birime konuyu sulandırmak. Onları yeni küçük ultracentrifuge tüp ve santrifüj 60 dk 4 ° C'de 100.000 x g de aktarın.
- Süpernatant atın ve daha fazla karakterizasyonu için steril DPBS 50 μL EV granül resuspend.
3. hücre dışı vezikül miktar
Not: BALF kaynaklı EVs kurtarma verim ile iki ölçüm quantitated.
- Nanopartikül analiz (NTA) ölçüm izleme
- EV örnek 1: 200, seyreltik-1:500 DPBS ve yük örnek bir insülin şırınga içine 1 ml. Bir şırınga pompa için bir örnek şırınga ekleyin ve ( Tablo malzemelerigörmek) partikül sayıları ve boyutunu ölçmek başlar.
- Kamera düzey 1 tüm örnek ölçümler için 14 ve algılama eşik olarak ayarlamak. Beş tekrarlayan ölçümler 30 1.500 çerçevelerle s 20 bir gecikmeyle her örnek için doğru kaydedildi s okuma arasında. Birleştirmek ve veri son konsantrasyon ve boyutu raporları için Ortalama.
Not: doğru tüm parçacıkların yakalamak için kamera düzeyini tüm parçacıklar görselleştirmek ve her denemede tüm örnek ölçümler için benzer ayarları kullanmak uygun olarak ayarlayın.
- Protein miktar
Not: Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil BALF kaynaklı EVs protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanıldı.- 1 x lizis arabellek EV örnekleri solubilize.
- BALF türetilmiş EVs Renkölçer algılama 560 absorbans ölçerek BCA standart iletişim kuralı'nı başına protein miktarını ölçmek nm bir plaka okuyucu.
4. hücre dışı veziküller BALF kaynaklı tespiti
Not: SDS-sayfa ve immunoblotting ve Akış Sitometresi Analizi ile EV iyileşme doğrulamak için yaygın olarak bilinen eksozom yüzey marker proteinleri (TSG101, CD63, CD81 ve CD9) kullanılmıştır.
- SDS-sayfa ve immunoblotting
- EV proteinler her örneğinin eşit miktarda bir arabellek (Lityum Lauryl Sülfat) ve 50 mM dithiothreitol (DTT) bir 1.6 mL tüp takılması kurutma ile geçiyoruz. Örnekleri 10 dk 70 ° C'de ısı.
- 4 – %12 artı Bis-Tris akrilamid jel içine adım 4.1.1 örnekleri yüklemek ve Elektroforez çalıştırın (150 volt, 35 mA) 35 dk için.
- Proteinler bir kuru aktarım yöntemini kullanarak bir nitroselüloz membran aktarın.
- Membran 60 dk, oda sıcaklığında (RT) sallanan için %5 yağsız süt ile engelleyin.
- Membran bir EV yüzey proteini işaretleyici, tümör duyarlılık Gene 101 (TSG101), bir antikor ile %5 BSA içinde Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik ara-20 (TBST) bir gecede sallanan 4 ° C'de 1:500 seyreltme, kuluçkaya.
- Ertesi gün, membran 3 yıkama x, 10 her, TBST arabellekte yıkama ve anti-tavşan IgG, 1:5,000 seyreltme için 60 dk RT. az, HRP bağlantılı bir antikor ile kuluçkaya min
- Membran 3 yıkama x, 10 min her yıkama, TBST bir arabellek. Membran chemiluminescent HRP antikor algılama reaktif ve görüntü ( Malzemeler tablo görmek için görüntüleme sistemi) ile geliştirmek.
- Akış Sitometresi
- BALF türetilmiş EVs 49 μL arabellek (PBS + 5 mM EDTA + 0,1 mikron şırınga filtre membran filtre % 0.5 BSA) boyama PEB içinde sulandırmak.
- Her birine tek tek her örnek içine aşağıdaki antikorlar ekleyin: 1) fare Anti-fare PE CD63 antikor (100 ng tepki başına); 2) fare Anti-fare PE CD81 (500 ng); 3) fare Anti-fare FITC CD9 (200 ng). Karanlıkta 60 dk için sallanan 4 ° C'de kuluçkaya.
- Membran filtre PEB arabellek boyama 450 μL örnekleriyle sulandırmak ve örnekleri Akış Sitometresi Analizi için konu (bakınız Tablo reçetesi)25.
- Akış Sitometresi ayarları aşağıdaki gibi yapın: 1) hiper günlüğü (hlog); tüm kanalları ayarlayın 2) kümesi SSC tetiğe 4; 3) ikincil tetikten uzak açınız. Düşük hızlı ayarlarında örnekleri çalıştığını ve her örnek içinde en az 10,000 olayları elde etmek.
- Her örnek analiz yazılımı kullanarak düşük sitometresi veri çözümlemesi gerçekleştir ( Tablo malzemelerigörmek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare BALF EV yalıtım gerçekleştirilen aynı gün UFC ve UC-DGC izolasyon yöntemleri kullanarak. UC-DGC tekniği, uzun işlem süresi 8 h gerekli ise UFC yöntemi yaklaşık 2,5-3 h, gerekli. Bu arabellekleri ve reaktif hazırlama süresi içermiyordu. Bu bazı diğer görevler uzun aralıklarla dönemlerde yerine olabilir unutulmamalıdır. Yine de, Bütün prosedür UC-DGC yalıtım tekniği için neredeyse bir gün sürdü.
BALF türetilmiş EVs normal farelere UFC yöntemle izole dan daha küçük bir boyuta ve UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, Şekil 1B) göre bir daha düzgün boyutu dağılımı (148.8 ± 1.1 nM, Şekil 1A) görüntülenir. UFC tekniği bir derin vardı 65-fold daha fazla toplam parçacık sayar UC-DGC yalıtım (29,4 ± 18.4 vs 0,5 ± 0.1 x 1010 parçacıklar; karşılaştırıldığında p < 0,05; Tablo 2 ve rakam 1 c). UFC EVs (içinde µg) Toplam protein kurtarılması da daha yüksek (3,136 ± 1,860 vs 73,7 ± 38.3 µg; p < 0,05; Tablo 2 ve Şekil 1 d). Bu nedenle, UFC zaman ve çaba verimli ve daha yüksek bir EV verim sağlar.
Daha fazla phenotypically EV BALF elde edilen nüfus karakterize etmek için biz yaygın olarak bilinen eksozom yüzey proteini işaretleri varlığı incelendiğinde: CD63, CD9 ve CD81 akış sitometresi tarafından ve immunoblotting tarafından TSG101. Akış Sitometresi Analizi kullanarak, biz CD63 ifade UFC EVs ve UC-DGC EVs gösterilmiştir (Şekil 2A -2 C), CD9 (Şekil 2B -2F) ve CD81 (Şekil 2 g -2I). Quantified ve istatistiksel olarak iki koşul arasında farklı CD63, CD9 ve CD81 geometrik ortalama ifade (gMFI) (Şekil 3A -3F).
Daha sonra başka bir EV protein marker, TSG101, immunoblotting tarafından incelenmiştir. UFC akışı aracılığıyla (UFC-FT) örnek 20 µg TSG101 proteinler, içermiyordu telkin UFC yalıtım teknik verimli bir şekilde seçilmiş ve BALF örnek (Şekil 4) EV popülasyondan muhafaza gösterdi. Toplam protein (20 µg) BALF-EV örnek eşit miktarda yüklü olduğunu UFC EVs TSG101 UC-DGC EVs (Şekil 4) daha yüksek bir düzeyde ifade bulduk. Ayrıca bir tek izole protein grubu gösterdi UFC-EV protein saflığı kabul edilebilir olduğunu gösterdi.
Tüm sonuçlar için öğrenci t-test için iki-grup karşılaştırma kullanıldı. Sonuçları ± SEM (ortalama, standart hata) demek gibi sunulur ve p < 0,05 önemli olarak kabul edildi.
Şekil 1: Ultrafiltrasyon Santrifüjü fare bronchoalveolar lavaj sıvı (BALF)-türetilmiş EVs daha homojen bir boyut dağılımı ultrasantrifüj ile fare BALF kaynaklı EVs yoğunluk gradient Santrifüjü daha gösterdi ve vardı bir anlamlı olarak daha yüksek toplam parçacık sayısı ve protein içeriği. EV Parçacık boyut dağılımı izleme çözümlemesi (NTA) nanopartikül tarafından ölçüldü ve toplam protein içeriği bicinchoninic asit tahlil tarafından ölçüldü. (A)UFC-BALF EVs NTA boyutu dağılımı grafiği. (B) UC-DGC-BALF EVs boyut dağılımı grafiği. (C) toplam parçacık sayısı NTA tarafından (10 parçacıklar; ± SEM x 10 demek * p < 0,05). (D) Toplam protein içeriği (µg içinde * p < 0,05). Verileri üç bağımsız deneylerden elde edilmiştir. UFC: Ultrafiltrasyon Santrifüjü; UC-DGC: ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü; EVs: hücre dışı veziküller; SD: standart sapma; Konsantrasyon: konsantrasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: fare bronchoalveolar lavaj sıvı elde edilen Ultrafiltrasyon Santrifüjü tarafından izole EVs ve ultrasantrifüj yoğunluk gradient Santrifüjü yöntemleri ile ifade tetraspanin proteinler CD63, CD9 ve CD81. EVs oranlarda lekeli olumlu yalancı araziler tarafından (A - C) resimli UFC ve UC-DSG yalıtım teknikleri tarafından gösterilen PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 ve (G - ı) PE-CD9. Verileri üç bağımsız deneylerden elde edilmiştir. UFC Ultrafiltrasyon Santrifüjü; = UC-DGC ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü; = EVs ekstraselüler veziküller; = SSC-A yan dağılım analizi; = PE = phycoerythrin; FITC floresein isothiocyanate =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Ultrafiltrasyon Santrifüjü izole fare bronchoalveolar lavaj sıvı elde edilen EVs tetraspanin proteinler ultrasantrifüj izole EVs için benzer bir floresan yoğunluğuna ifade. (A ve D) Çubuk grafik ve geometrik ortalama ifade (gMFI) PE-CD63+-EVs lekeli. (B ve E) çubuk grafik ve FITC-CD9+gMFI-EVs lekeli. (C ve F) çubuk grafik ve PE-CD81+gMFI-EVs lekeli. Bu veriler üç bağımsız deneylerden elde edilmiştir. UFC: Ultrafiltrasyon Santrifüjü; UC-DGC ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü; = EVs: hücre dışı veziküller; SSC-A: yan dağılım analizi; PE: phycoerythrin; FITC: floresein isothiocyanate. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: fare bronchoalveolar lavaj sıvı elde edilen Ultrafiltrasyon Santrifüjü tarafından izole EVs ve ultrasantrifüj yoğunluk gradient Santrifüjü yöntemleri ile ifade edilen eksozom yüzey proteini, TSG101. Bu panel fare BALF kaynaklı EVs TSG101 antikor (47 kDa) için immunoblotting gösterir. UFC Ultrafiltrasyon Santrifüjü; = UC-DGC ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü; = EVs ekstraselüler veziküller; = FT aracılığıyla akış; = TSG tümör duyarlılık gen =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çalışma çözüm Iodixanol (%) | 5 | 15 | 25 | 30 |
| Çalışma çözüm (mL)* | 2 | 6 | 10 | 12 |
| Homojenizasyon Orta (mL)* | 18 | 14 | 10 | 8 |
Tablo 1: batmaz yoğunluk gradient arabellekleri. Bu tablo ultrasantrifüj tekniği ile izole fare bronchoalveolar lavaj ekstraselüler vezikül sıvı elde edilen nüfus arındırmak için kullanılan her degrade çözüm kompozisyon ve tampon oranını verir. * Çalışma çözüm % 50 iodixanol oldu (yoğunluk gradient orta 25 mL [ Tablo malzemelerigörmek] + Dilüent çözüm [pH 7.4 0.25 M Sükroz + 120 mM HEPES + 0.9 M NaCl] 5 mL). ** Homojenizasyon Orta (pH 7.4 0.25 M Sükroz + 20 mM HEPES + 150 mM NaCl)
| Yöntemleri | Başlangıç hacmi (mL) | NTA* (x 108/μL) | Toplam parçacıklar† (x1010) | Protein konsantrasyon‡ (µg/µL) | Toplam protein§ (µg) |
| UFC | 35 | 7,69 ± 2.6 | 29,4 ± 18.4 | 3.7 | 3,136 ± 1860 |
| UC-DGC | 35 | 0.5 ± 0,05 | 0.5 ± 0,1 | 0,6 | 73.7 ± 38.3 |
Tablo 2: bir yüksek fare bronchoalveolar lavaj ekstraselüler vezikül sıvı elde edilen verim Ultrafiltrasyon Santrifüjü yalıtım yöntemini sağlanan. Parçacık konsantrasyonu ve toplam parçacık sayısı izleme çözümlemesi (NTA) nanopartikül tarafından ölçüldü. Protein konsantrasyonu ve toplam protein miktarı bicinchoninic asit protein tahlil tarafından ölçüldü. * BALF EVs parçacık konsantrasyonu (ortalama ± SEM x 108/μL üç bağımsız deneyler üzerinden). † BALF EVs toplam parçacık (ortalama ± SEM x 1010 parçacıklar üç bağımsız deneyler üzerinden). ‡ BALF EVs'protein konsantrasyonu (ortalama ± SEM üç bağımsız deneyler üzerinden µg/µL). § BALF EVs toplam protein (üç bağımsız deneyler üzerinden ortalama ± SEM mg).
UFC: Ultrafiltrasyon Santrifüjü; UC-DGC: ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü; Konsantrasyon: konsantrasyon; NTA: nanopartikül izleme çözümlemesi; SEM: standart hata ortalamaya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son birkaç on yıl içinde bilim adamları EVs anlamlar içinde hücresel homeostazı sökülmüş. Daha da önemlisi, EVs önemli rolleri birçok hastalığı süreçlerinde onların biyoaktif kargo molekülleri1,21,22,26,27 ile komşu ve uzak hücreleri oransal olarak oynamak , 28 , 29 , 30. gelecek gelişme ve ilerleme bu alanda son derece güvenilir üzerine itimat ve verimli yöntemleri sadece tanımlamak ve ayrı ama doğru EV nüfus alt kümelerine de aşağı akım uygulamaları için biyolojik işlevleri korumak 10 , 11 , 14 , 31. Mevcut çalışmada, açıkladığımız EVs fare BALF yalıtmak için nanomembrane Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) yöntemi. Diğer raporları ile birlikte uyum içinde biz UFC basittir ve yüksek kurtarma verim ve saflık ile sonuçlanır ve bu nedenle, küçük biyolojik örnekleri10,17,18için,32 uygundur, gösterdi .
UC-DGC yaygın olarak kullanılır ve yüksek oranda saflaştırılmış EV parçacıklar10,14sağlar çünkü EV yalıtım için altın standart teknik olarak kabul edilir. Ancak, bu yöntem Teknik olarak hantal, zaman alıcı, emek yoğun ve düşük ölçeklenebilirlik vardır. Yeni geliştirilen Havacilik tabanlı teknikleri bu sınırlamalarının üstesinden gelir, ama tam bir alternatif yöntem33,34uygulanabilir önce bu yaklaşım daha fazla doğrulama gerektirir. Böylece, saflık ve ölçeklenebilirlik örneklerinin ödün vermeden bu zorlukları karşılamak uygun yöntemleri fena halde, özellikle küçük hacimli biyolojik sıvı için ihtiyaç vardır.
Biz bir nanomembrane filtre aygıtı kullanarak UFC BALF numuneler EV izolasyonu için etkili olduğunu gösterdi. Burada sunulan bulgular UFC yordamı ile karşılaştırıldığında altın standart UC-DGC yöntemi sadeliği ve yüksek ölçeklenebilirlik nedeniyle üstünlüğünü vurgulamak. Ultrafiltrasyon dayalı yaklaşım yaygın EV biyolojik örnekler çeşitli yalıtmak için kabul haline: idrar35, hücre şartına medya17ve fetal Sığır serum36. Ultrafiltrasyon bir platform olarak kullanan diğer modüler boyutu tabanlı EV yalıtım teknik eksozom toplam yalıtım çip (egzotik)31' dir. Bu yöntem aynı zamanda küçük örnek ölçekli örnekler için uygundur. Filtre malzemesi gibi bazı faktörler ve nanomembranes gözenek boyutunu kurtarılan EVs özelliklerini etkileyebilir çünkü UFC tekniği kullanırken dikkate alınması gerekir. Örneğin, Filtre membranlar farklı türleri farklı EV ilişkili RNA kurtarma verimleri idrar18sonuçlandı. Bu çalışmada, gösterdik rejenere selüloz (RC) 10 kDa MWCO ile sağlanan yüksek mRNA ifade NOP10, OST4, SNRPG ve TOMM7 karşılaştırıldığında Hydrosart 10 kDa veya polyethersulfone (PES) 10 kDa18. Biz daha fazla 10 kDa ile belgili tanımlık RC 100 kDa daha yüksek bir retentate EV kurtarma olduğunu gösterdi. Diğer yalıtım teknikleri37türü tarafından etkilenen idrar EVs kargo içeriği nitelendirmiştir. Bizim çalışma 100-kDa MWCO RC membran retentate daha büyük MWCO nedeniyle daha az istenmeyen proteinler avantajı ile tatmin edici bir EV BALF elde edilen verim sağlanan gösterdi.
Bu çalışmada UFC EVs boyutu dağılımı ve boyutunu daha küçük ve daha homojen dağıtılmış Bu UC-DGC EVs daha gösterdi. UC teknikleri ile yaygındır, vezikül toplama, UC-DGC EVs38boyut heterojen açıklayabilir. Biz BALF elde edilen EV saflık EV membran proteinlerinin TSG101, CD63, CD9 ve exosomes retentates içinde varlığını doğrulayan CD81 algılayarak değerlendirildi. Biz ve diğerleri de TEM UFC EVs35,39,40,41morfolojisi göstermek için kullandık. Liu ve ark. EVs yalıtmak için benzer bir Ultrafiltrasyon tabanlı yaklaşım kullanılan ve ultrasantrifüj tarafından izole EVs karşılaştırıldığında, proteomik ve transcriptomic profilleri benzer31idi. Böylece, rejenere selüloz membran 100 kDa bir MWCO ile bronchoalveolar lavaj sıvı gibi küçük biyolojik sıvı örnekleri için uygundur alternatif bir EV yalıtım Yöntem olarak kullanarak bir Ultrafiltrasyon Santrifüjü yöntemi açıklanmaktadır.
Zenginleştirilmiş parçacıklar exosomal boyutu aralığı ve kaçınma olabilir ek kuvvet uygulayarak emin olmak için ilk nanoporous membran 0.2 µm filtrasyon EVs biyolojik sıvı yalıtmak için bu UFC yaklaşımı kullanarak kritik adımlar içerir zarar veya deforme eksozom Morfoloji ve yapıları10,42. EVs daha düşük ölçeklenebilirlik sonuçları filtrasyon zarının uygun. Bu nedenle, örnek hacmi filtre ünitesi her tür önerilen tutarı aşmaması gerekir. Daha yüksek bir mRNA verim idrar kaynaklı EVs18sağlanan rejenere selüloz kullanmayı seçtiniz. Kullanılan filtre membranlar tür kurtarma verim ve EVs türünü değiştirebilirsiniz. Son olarak, 100 kDa bir MWCO biyolojik sıvı protein çoğunluğu ortadan kaldırmak gerekir rağmen 100 kDa veya protein toplamları büyük bazı protein kirletici madde43gözlenmiştir. Bu durumda, bir çamaşır EV ve protein toplama en aza indirmek için kritik bir adımdır. EV ilişkili proteinler UFC EVs mevcut olduğu gibi Ayrıca, fonksiyonel çalışmalar düzgün tam sonuçlar yorumlamak için denetlenmelidir.
UFC EV yalıtımı için küçük veya daha büyük-hacimli örnekleri için uygun bir alternatif yaklaşım olduğu sonucuna varıldı. Şu anda mevcut microfilter birimleri örnekleri ilâ 15 mL kapasiteli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
İş NHLBI/NIH hibe HL103868 (PC) ve HL137076 (PC için) Amerikan Kalp Derneği Grant-in-Aid (PC için) ve Samuel Oschin kapsamlı Kanser Enstitüsü (SOCCI) akciğer kanser araştırma Ödülü (için PC) tarafından desteklenmektedir. Smidt Kalp Enstitüsü Nanosight makine EV nanopartikül izleme çözümlemesi için bize sağlar Cedars-Sinai Tıp Merkezi için bizim büyük takdir ifade etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | - | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | - | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | - | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | - | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
