Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

كشف وعزل الهيئات أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

يتم وضع سير عمل باستخدام الطرد المركزي التدفق الخلوي أو التفاضلية لاكتشاف وتحديد وعزل الهيئات أبوبتوتيك من نموذج أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية.

Abstract

الهيئات أبوبتوتيك (أبوبدس)، ميكروفيسيكليس، واكسوسوميس من الأعضاء الرئيسيين في الأسرة حويصلة خارج الخلية، مع كونها واحدة من نوع أكبر أبوبدس. واقترح أن أبوبدس يمكن أن تساعد في إزالة الخلايا، فضلا عن الاتصالات بين الخلايا من خلال الاتجار بالجزيئات الحيوية. النهج التقليدية المستخدمة لتحديد وعزل أبوبدس هي غالباً ما تكون محدودة بسبب عدم دقة القياس الكمي ونقاء العينة منخفضا. هنا، يمكننا وصف سير عمل تأكيد تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، والتحقق من صحة تكوين عببد، وعزل أبوبدس بدرجة نقاء عالية. وسنعمل أيضا الخطوط العريضة ومقارنة الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) والطرد المركزي التفاضلي على أساس نهج لعزل أبوبدس. وعلاوة على ذلك، سيتم تأكيد نقاء أبوبدس معزولة باستخدام سبق إنشاء التدفق الخلوي على تلطيخ والأسلوب التحليلي. مجتمعة، باستخدام النهج المبين، الناجم عن تفكيك الخلية المبرمج و apoptotic الوحيدات THP-1 والتحقق من صحتها، وعببد المتولدة من وحيدات THP-1 كانت معزولة لدرجة نقاء من 97-99%.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المبرمج، نموذج مدروسة من موت الخلايا المبرمج، مطلوب للمحافظة على التوازن الفسيولوجي وإزالة الخلايا الضارة داخل جسم الإنسان1. بعد إدخال المبرمج، خلايا أبوبتوتيك (أبوسيلس) يمكن إجراء سلسلة من التغييرات الشكلية وتفكيكه إلى حويصلات غشاء زمنياً صغيرة تسمى أبوبدس. عموما، هذه العملية هي المعروفة بتفكيك خلية أبوبتوتيك ويمكن تقسيمها إلى 3 خطوات متميزة استناداً إلى مورفولوجيا2،3. الخطوة 1 (غشاء البلازما بلبينغ) يتسم بتشكيل هياكل تشبه البالون على سطح الخلية المعروفة باسم بليبس4،5. الخطوة 2 (apoptotic تشكيل نتوء) يتضمن تشكيل نتوءات غشاء طويلة مثل أبوبتوبوديا، أبوبتوبوديا بالخرز و microtubule المسامير6،،من78. وأخيراً، يتضمن الخطوة 3 (تشكيل عببد) تجزؤ نتوءات أبوبتوتيك و/أو أبوسيلس لتوليد أبوبدس6،9. وقد اقترح النتائج السابقة دور أبوبدس في مساعدة إزالة خلية أبوبتوتيك والتوسط للاتصالات بين الخلايا. على سبيل المثال، يقترح أن تجزئة أبوسيل إلى أبوبدس قد يولد القطع الصغيرة 'لدغة الحجم' التي يمكن إزالتها بسهولة عن طريق إحاطة البالعات2،10،11. وعلاوة على ذلك، قد تأوي أبوبدس سلسلة من الجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، والتي قد تكون بهن إلى الخلايا المجاورة لتيسير خلية خلية الاتصالات12،،من1314. وظيفيا التحقيق في هذه العمليات، من المهم للتأكد من المعلمات الرئيسية الثلاث بما في ذلك (ط) التحقق من صحة الاستقراء المبرمج وتشكيل عببد، (ثانيا) عزل أبوبدس، و (ثالثا) تأكيد نقاء عببد.

سابقا، قد استخدمت عدد من الأساليب بما في ذلك التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني لدراسة الخلايا وأبوبدس15،16،،من1718. ومع ذلك، عببد الكشف والتحديد الكمي غالباً ما تكون صعبة أو تجاهلها. على سبيل المثال، الاعتداء المبرمج على أساس قياس التدفق الأكثر استخداماً بشكل روتيني توظف annexin الخامس (A5، بروتين الذي يربط الخارجية 'أكل-لي' إشارة فوسفاتيديلسيريني (بتدسير)) والحمض النووي (PI) يوديد propidium19وصمة عار. ومع ذلك، باستخدام هذا المزيج العالمي وصمة عار، يفترض التحليل أن هناك ثلاثة أنواع فقط من مجموعات فرعية خلية (خلايا قابلة للحياة وأبوسيلس ونخريه الخلايا) في العينة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من اعتبار "معيار الذهبي" بالعديد من الباحثين للمبرمج، التدفق الخلوي فحوصات وتحليل البيانات اللاحقة غالباً ما يستبعد أبوبدس من خلال خطوة أولية النابضة تحديد أحداث منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة-عالية . ولذلك، قمنا مؤخرا بتطوير فحص الخلوي تدفق رواية استخدام A5 والي-برو-3، وصمة عار النووية الأخرى التي يمكن اتخاذها بصورة انتقائية طريق caspase 3/7-تنشيط بانيكسين 1 (PANX1) القنوات7،20. كما caspase الناجمين عن 3 PANX1 التنشيط يسبق التعرض بتدسير في مرحلة مبكرة من المبرمج، إلى-برو-3 خلطات بقع نخرية الخلايا وأبوبتوتيك. وبالإضافة إلى ذلك، يشمل هذا النهج جنبا إلى جنب مع الرواية لدينا النابضة استراتيجية المكتسبة جميع الأحداث أثناء تحليل البيانات، ونتيجة لذلك حددت ست مجموعات فرعية خلية/الجسيمات، بما في ذلك: (ط) خلايا قابلة للحياة (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5 منخفض ، 3--إلى--برومنخفضة)، (ثانيا) A5 أبوسيلس المبكر (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5منخفضة، إلى-برو-3المتوسطة)، (ثالثا) A5+ أبوسيلس (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5عالية ، إلى-برو-3المتوسطة)، (رابعا) نخرية الخلايا أو أبوسيلس الراحل (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5عالية، إلى-برو-3عالية)، (v) أبوبدس (منتدى التعاون الأمني/SSCمنخفضة، A5الوسيطة، إلى-برو-3منخفض /الوسيطة)، و (سادسا) الحطام (منتدى التعاون الأمني/SSCمنخفضة، A5منخفضة، إلى-برو-3منخفض)20. نهجنا تشدد على أهمية تحليل جميع خلايا/الجسيمات مجموعات فرعية، والأهم من ذلك، فصل أبوبدس عن الخلايا والحطام20. وهكذا، يوضح هذا النهج أسلوب فعال للتحقق من صحة الاستقراء المبرمج وتشكيل عببد في وقت واحد.

تقليديا، كانت معزولة عن طريق مجموعة متنوعة من النهج التفاضلي الطرد المركزي حيث يمكن فصل أبوبدس من الخلايا أو حويصلات خارج الخلية الأخرى على أساس كثافة أبوبدس. ومع ذلك، تقتصر أساليب الطرد المركزي هذه غالباً ما منخفض عببد النقاء، عدم وجود خطوة التحديد الكمي لتأكيد نقاوة العينة، و/أو عدم القدرة على فصل الخلية المحددة بنوع أبوبدس17،،من2122. ولذلك وضعنا مؤخرا نهجين والقائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية ونهج المستندة إلى استخدام الطرد المركزي تفاضلية جديدة التي يمكن أن تقترن باسلوبنا الخلوي التدفق المحددة سابقا للتحقق من صحة الاستقراء من المبرمج وعينه نقاء23. عببد العزلة عبر نهجنا القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن تثري أبوبدس ما يصل إلى 99 ٪ النقاء، ويمكن أن يقترن بمجموعة متنوعة من الأجسام المضادة لنوع معين خلية لعزل أبوبدس من الخلايا المختلطة السكان، وعينات الأنسجة وسوائل الجسم23. وعلاوة على ذلك، يوضح نهجنا الطرد المركزي التفاضلي المنقحة طريقة فعالة لعزل أبوبدس إلى > نقاء 90%23.

في هذه الورقة، ويصف لنا بالتفصيل لدينا إجراءات تجريبية للتحقق من صحة الاستقراء المبرمج، وكشف وتحديد تشكيل عببد. كما وضعت العزلة عببد مهام سير العمل باستخدام الأساليب القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية والتفاضلية المستندة إلى استخدام الطرد المركزي ومقارنة. وتظهر البيانات الممثلة أن المنهجية وصف يوفر أداة فعالة متطورة للدراسات المستقبلية عببد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-تنظيم دورات تعريفية للمبرمج

  1. الطرد المركزي عينة الخلية في ز 300 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية لإزالة أي حطام خلية موجودة مسبقاً.
    ملاحظة: عند استخدام خلايا ملتصقة، بذور الخلايا في وقت مبكر وتغسل مع 1 × الحل مخزنة الفوسفات (PBS) قبل التعريفي المبرمج.
  2. تحديد عدد الخلايا وجمع الخلايا.
    ملاحظة: اعتماداً على عزلة بعد الفحص، نوصي بعدد خلايا بداية على الأقل 1 × 107 الخلايا.
  3. ريسوسبيند في وسائط كاملة (متوسط كل منها تحتوي على مصل العجل الجنين 10% (المجلد/المجلد)، البنسلين 50 وحدة دولية/مل، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين الخليط) لتركيز 1 × 106 خلايا/مل نهائي.
  4. الكوة ~ 2 × 106 خلايا كل من صفيحة جيدا 6 جيدا.
  5. للحث على المبرمج، إزالة غطاء لوحة وتشعيع الخلايا في 150 مللي جول/سم2 باستخدام إيرادياتور من الأشعة فوق البنفسجية. يجب أن يستغرق ذلك حوالي 30-60 ثانية.
    ملاحظة: قبل التشعيع، ضمان أن يتم الاحتفاظ ~0.5 x 106 خلايا لمراقبة الخلية 'أونتريتيد'.
    ملاحظة: يمكن أن يتسبب المبرمج أيضا عن طريق أساليب أخرى مثل مكافحة منظمة تضامن النساء الأفريقيات أو مصل مجاعة6.
  6. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 2-8 ساعات، اعتماداً على خط الخلية.
  7. استخدام مجهر ضوء أعلى مقاعد البدلاء، تصور الخلايا للتأكد من وجود مورفولوجيس أبوبتوتيك، مثل بلبينغ وتشكيل أبوبتوبوديا، وتشكيل عببد.
    ملاحظة: يكفي 40 X التكبير
  8. استخدام ماصة P1000، "الماصة؛" وجمع عينات من أبوبتوتيك.
  9. أغسل اللوحة مع برنامج تلفزيوني 1 x والجمع بين العينة المتبقية لضمان أقصى غلة.
  10. ~1/10 جمع التحكمال 'العينة Apoptotic كله' (WAS).
  11. جمع العينة 'المعالجة'.
  12. الطرد المركزي عينات أونتريتيد وكان في 3,000 س ز لمدة 6 دقائق.
  13. ريسوسبيند في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني وجانبا على الجليد.
  14. لعزل عببد، تواصل أما الخطوة 2 أو 3 مع العينة apoptotic المتبقية.

2-عببد العزلة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية

  1. الطرد المركزي عينة كاملة في 3,000 س ز لمدة 6 دقائق.
  2. إزالة معظم المادة طافية دون تعطيل بيليه.
  3. ريسوسبيند في حل المصبوغة التي تحتوي على 1 مل من x A5 1 ملزمة العازلة، ميليلتر 75 من A5-فيتك، وميليلتر 2 إلى-برو-3 الواحدة 1 × 107 الخلايا.
  4. احتضان عينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. إضافة 1-2 مل من x A5 1 ربط المخزن المؤقت والطرد المركزي عينة في 3,000 س ز لمدة 6 دقيقة لإزالة وصمة عار الزائدة.
    ملاحظة: لعينات الأنسجة أو الخلايا المختلطة السكان، أداء جسم تلطيخ خطوة باستخدام تركيبة من علامات خاصة بنوع الخلية في المخزن المؤقت لربط x A5 1 واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة (أو وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة) قبل استخدام الطرد المركزي في 3,000 ز x 6 دقيقة.
  6. ريسوسبيند بيليه عينة في 3 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (س 1 برنامج تلفزيوني، المخزن المؤقت ملزم x A5 1، 10% منتدى التعاون الأمني، 2 مم يدتا) الواحدة 1 × 107 الخلايا.
  7. التصفية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في جولة السفلي، أنبوب بولي بروبلين (التدفق الخلوي) والاحتفاظ بعينات الجليد وفي الظلام.
  8. قم بتشغيل الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية والقيام بإعداد قياسية باستخدام فوهة 100 ميكرومتر وتنفيذ التأخير قطره وضمان تدفق مستقر.
  9. تحميل العينة وسرعة اكتساب ~ 1000 الأحداث/s.
  10. ضبط منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب، آسيا والمحيط الهادئ (إلى-برو-3) والفولتية فيتك (A5) ووضع الأحداث ضمن مؤامرات نظام مراقبة الأصول الميدانية لضمان السكان يمكن أن يفصل بوضوح.
  11. سجل الأحداث 20,000.
  12. قم بإعداد استراتيجية النابضة كما هو الحال في الجزء 4.
  13. في تخطيط الفرز، إضافة بوابة عببد النهائي كالسكان الفرز المطلوب.
  14. البدء في الحصول على العينة وإجراء فرز اختبار عن طريق جمع أبوبدس 5,000-10,000 في أنبوب جديد يحتوي على المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ~ 250 ميليلتر.
  15. أداء نظام تدفق العودة وتحميل أبوبدس تم فرزها.
  16. حيازة وتسجيل اختبار-فرز أبوبدس.
  17. تحقق من أن نقاء عببد ~ 99% بمقارنة منتدى التعاون الأمني المحور (ص) مقابل A5 (المحور السيني الأحداث).
    ملاحظة: تلطيخ A5 قد خفض قليلاً عند إعادة تحليل العينات بسبب تبيض الليزر.
  18. متى تحقق درجة نقاء عالية، تحميل العينة الأصلية ومواصلة الفرز حتى تم الحصول على العدد المطلوب من أبوبدس.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، فرز ثنائي يمكن إنجازها لعزل في نفس الوقت أبوسيلس وأبوبدس.
    ملاحظة: عند فرز على مدى فترة طويلة من الزمن، نوصي بحضانة أنبوب جمع عند 4 درجة مئوية.
  19. بمجرد اكتمال الفرز، جمع جزء صغير من أبوبدس نوعا ما بعد، وبعد فرز أبوسيلس، أونتريتيد، وكان التحقق من صحة المبرمج وتأكيد نقاء نوعا ما بعد.
    ملاحظة: على الرغم من أن اختبار الفرز والنقاء نوعا ما بعد أن لا تختلف اختلافاً كبيرا، وهذا يستند على إعدادات الدفق والاستقرار.

3-عببد العزلة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي

  1. الطرد المركزي عينة apoptotic المتبقية في 300 غرام x لمدة 10 دقائق.
  2. جمع المادة طافية، تاركاً ~ 500 ميليلتر لتجنب عرقلة بيليه الخلية، وإضافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة.
  3. إزالة ميليلتر 500 المتبقية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من برنامج تلفزيوني 1 x (وهذا يمثل 'الكسر أثري أبوسيل'.
  4. الطرد المركزي المادة طافية المجمعة لمدة 20 دقيقة في 3,000 ز.
  5. التحقق من بيليه وإزالة المادة طافية (المادة طافية قد تحتوي على حويصلات خارج الخلية الصغيرة بما في ذلك ميكروفيسيكليس واكسوسوميس) بعناية.
  6. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x (وهذا يمثل الكسر 'التخصيب عببد')
  7. جمع 100 ميليلتر من كل قابلة للحياة وكان، أبوسيل عالي التخصيب، وأثرى عببد عينات في جولة جديدة-قاع، أنبوب البوليستيرين (التدفق الخلوي).
  8. إضافة 100 ميليلتر من وصمة عار الذي يحتوي على 2 ملزمة المخزن المؤقت x A5، 1: 100 A5-فيتك و 1:1,000 إلى-برو-3
  9. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
  10. تحليل العينات بالتدفق الخلوي، استخدام استراتيجية النابضة كما هو موضح أعلاه للتحقق من صحة الاستقراء ناجحة للمبرمج ونقاء الكسر أثري عببد.

4-التدفق الخلوي النابضة الاستراتيجية

  1. الأرض إلى-برو-3 المحور (ص) ضد منتدى التعاون الأمني محور (س) لفصل الخلايا نخرية (إلى-برو-3عالية) من كل أخرى غير بيرميبيليزيد الأحداث (3--إلى--برومنخفضة/متوسطة).
  2. حدد كافة الأحداث غير بيرميبيليزيد والأرض SSC ضد A5. بوابة اثنين من السكان بما في ذلك السكان 1 (P1)،متوسطة/عاليةمن التعاون بين بلدان الجنوب، الخلايا A5منخفضة/متوسطة والسكان 2 (P2)، جميع الأحداث الأخرى.
  3. من P2، ارسم 3--إلى--برو ضد A5 ثم حدد الأحداثمتوسطة/عالية A5 استبعاد كل خلية الحطام.
  4. حدد كافة الأحداث الإيجابية A5 ومؤامرة ضد A5، منتدى التعاون الأمني. فصل أبوبدس (FSCمنخفضة) من أبوسيلس (FSCمتوسطة/عالية).
    ملاحظة: عند النابضة أبوبدس لعزل عببد عبر النهج القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية، نوصي خطوة نهائية بتحديد أبوبدس ومقارنة 3--إلى--برو إلى A5 وتحديد كافة الأحداث. وهذا ما يضمن أن بوابة الفرز النهائي يستخدم fluorescence بدلاً من المعلمات منتدى التعاون الأمني/التعاون بين بلدان الجنوب.
  5. لتحليل خلايا قابلة للحياة، وحدد P1 وقم بإجراء إحدى استراتيجيتين النابضة. لتحليل خلايا قابلة للحياة العامة، وارسم منتدى التعاون الأمني ضد A5 وحدد كافة الخلاياالمتوسطة/العالية منتدى التعاون الأمني، وبالتالي إزالة المتبقية خلية الحطام. بدلاً من ذلك، يمكن فصل خلايا قابلة للتطبيق لإجراء تحليل متعمق، من A5 أبوسيلس المبكر برسم 3--إلى--برو ضد منتدى التعاون الأمني. حدد إلى-برو-3منخفضةومنتدى التعاون الأمنيمتوسطة/عالية الخلايا قابلة للتطبيق وإلى-برو-3المتوسطة، منتدى التعاون الأمنيالمتوسطة/العالية A5 أبوسيلس المبكر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

باستخدام الإجراء المبين هنا، حملت THP-1 الوحيدات المبرمج وتم الكشف عن أبوبدس ومعزولة عن طريق القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو اتباع نهج تفاضلي الطرد المركزي (الشكل 1). أولاً، حملت المبرمج باشعاع الأشعة فوق البنفسجية، وتم جمع عينات بعد 2-3 ساعة حضانة عند تعرض الخلايا مورفولوجيس أبوبتوتيك، بما في ذلك بلبينغ وتشكيل نتوء غشاء أبوبتوتيك وجيل أبوبدس6. واستخدمت أسلوب قياس تدفق إلى-برو-3 وتستند إلى A5 لتأكيد التعريفي للمبرمج الوحيدات وتشكيل عببد بفصل خلايا قابلة للحياة نخرية الخلايا وأوائل أبوسيلس، أبوسيلس، أبوبدس والحطام (الشكل 2). أخذت معا، التدفق الخلوي التحليل أشار إلى أن نتائج العلاج الأشعة فوق البنفسجية في ~ 20% أبوسيلس (الشكل 3).

الوحيدات THP-1 أبوبدس كانت في ذلك الحين معزولة عن كان عبر نهجين اثنين. أولاً، تم إعداد العينات لدرجة نقاء عالية النهج القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية حيثما يكون مطلوباً سوى خطوة واحدة الطرد المركزي لبيليه العينة apoptotic كامل قبل تلطيخ ونظام مراقبة الأصول الميدانية. هذا الأسلوب المناسب لفحوصات الفنية فيه إلى حد كبير عينة عالية النقاء المطلوبة (على سبيل المثال، لتحليل qPCR)، عندما يكون عدد معين من أبوبدس المطلوبة، أو عند اكتساب الخلية أبوبدس نوع معين من عينة معقدة. باستخدام هذه المنهجية، أبوبدس كانت معزولة للنقاء ~ 99 ٪ (الشكل 4).

بعد ذلك، الوحيدات THP-1 أبوبدس كما كانت معزولة عن طريق خطوتين، نهج الطرد المركزي التفاضلي. وتشمل الخطوة الأولى عزل خلايا قابلة للحياة، أبوسيلس، والخلايا نخرية. الخطوة الثانية تشمل فصل أبوبدس أكبر من حويصلات خارج الخلية الصغيرة مثل ميكروفيسيكليس واكسوسوميس، التي لا تستطيع أن تكون القريبون في 3000 × زاي التدفق الخلوي ثم أجرى لتأكيد التعريفي المبرمج ونقاء عينة عببد و أثبت نموذج أثري عببد تتضمن ~ 97% أبوبدس (الشكل 4). هذا يعرض تقنية سريعة وفعالة لعزل عببد لدرجة نقاء عالية نسبيا وهو مناسب عند تنقية أبوبدس من العينات التي تحتوي على نوع خلية مفردة.

Figure 1
الشكل 1 . رسم تخطيطي لعزل عببد عبر نهج الطرد المركزي القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو التفاضلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . التدفق الخلوي النابضة استراتيجية- ست مجموعات فرعية خلية/الجسيمات (بما في ذلك خلايا قابلة للحياة، A5أبوسيلس المبكر، A5+ أبوسيلس، نخرية الخلايا وأبوبدس والحطام) وحددت والمستخدمة لتحديد عببد للعزلة المستندة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية. (أ) غشاء بيرميبيليسيد نخرية الخلايا تنفصل عن الأحداث غير بيرميبيليسيد. يتم فصل الخلايا (ب) A5المنخفضة-المتوسطة, SSCمنخفض-مرتفع من الأحداثمنخفض-مرتفع A5. (b.i) لعمق التحليل، إلى-بور-3انخفاض خلايا قابلة للحياة لا يمكن فصلها عن إلى-برو-3المتوسطة A5 أبوسيلس المبكر. (b.ii) بدلاً من ذلك، عند مجرد حساب نقاء عببد، خلايا قابلة للحياة لا يمكن فصلها عن أحداثانخفاض منتدى التعاون الأمني. (ج) A5 الحطاممنخفضة مستبعدة. (د (FSCالمتوسطة/العالية أبوسيلس يفصلون عن منتدى التعاون الأمنيمنخفضة أبوبدس. (ﻫ) جميع A5 للمحترفين 3متوسطة/عالية أبوبدس المحددة للفرز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 3
الشكل 3 . التحقق من صحة للمبرمج الوحيدات THP-1- أجرى تحليل التدفق الخلوي وحيدات THP-1 غير المعالجة أو المعالجة بالإشعاعات فوق البنفسجية لتحديد مستويات خلايا قابلة للحياة، A5 أبوسيلس المبكر، A5+ أبوسيلس، والخلايا نخرية.

Figure 4
الشكل 4 . تنقية THP-1 الوحيدات المستمدة من أبوبدس- تم تنفيذ تحليل التدفق الخلوي على معزولة THP-1 المشتقة من الوحيدات أبوبدس عن طريق أما نهج الطرد المركزي القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية أو التفضيلية القائمة، تظهر في إثراء أبوبدس من خلايا قابلة للحياة، أبوسيلس، والخلايا نخرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

منذ أوائل الوصف الخاص به في الخمسينات، تقدمت ميدان المبرمج ملحوظا، أصبحت منطقة بارزة لبحث. ورغم الاهتمام الواسع والجهود المكثفة، جوانب معينة من المبرمج، وبخاصة تشكيل أبوبدس، لم جيدا تدرس نظراً لعدم وجود منهجيات ملائمة. تشمل هذه لا سيما الحد في تتبع التقدم المبرمج وتشكيل عببد في وقت واحد باستخدام قياس التدفق التقليدي تحليل A5/PI والشوائب من العزلة عببد. وقد وضعنا مؤخرا نهج لمعالجة أوجه القصور هذه المنهجية.

لدينا التدفق الخلوي النهج الجديد القائم التحليلية يسمح أبوبدس، التي غالباً ما يتم تجاهلها في استخدام الأساليب التحليلية التقليدية، إلى أن يتم الكشف عن وكمياً20. وباﻹضافة إلى ذلك، عدل هذا التدفق الخلوي الأسلوب، مع استخدام وصمة عار إلى-برو-3، يكشف A5 إضافية أبوبتوتيك مرحلة مبكرة، التقديم ومن ثم تحديد أفضل للمبرمج التقدم20. تقليديا، كشف عببد قد تعتمد اعتماداً كبيرا على تقنيات يستند إلى صورة مثل الفحص المجهري [كنفوكل] وعلم الأنسجة، بينما لدينا طريقة التدفق الخلوي يوفر نهجاً الفائق لتشكيل عببد كوانتيتاتي. على الرغم من أن تبدو معقدة، الإجراء سهلة نسبيا وفقط يتطلب الكواشف المتوفرة تجارياً و cytometer تدفق أساسي. أن المزيد من الكشف عن المنطقية والقياس الكمي الدقيق من أبوبدس معرفة المكروية خلية أبوبتوتيك أن ما يمليه الخلية التخليص والاستجابات المناعية. في الواقع، باقتران الموصوفة هنا التدفق الخلوي الأسلوب مع بقع محددة عضية، أبلغنا مؤخرا توزيع محتويات الخلايا في أبوبدس24غير متجانسة. وتوحي هذه النتائج أن أبوبدس يمكن تصنيفها إلى مجموعات فرعية مختلفة، وقد يحمل كل مجموعة فرعية عببد وظائف مختلفة.

لدينا تقنيات العزل عببد مؤخرا نمواً سيسهم أيضا في التطورات في هذا مجال حويصلات خارج الخلية. تقليديا، قد تشمل الطرد المركزي التفاضلي الأساليب المستخدمة لعزل عببد كمية كبيرة من خلايا أصغر، مما قد يؤثر على الاختبارات الوظيفية المتلقين للمعلومات. ومع ذلك، يمكن استخدام نهجنا تعديل الطرد المركزي التفاضلي لعزل أبوبدس بنقاوة 97%. على الرغم من أن درجة نقاء عالية يمكن أن يتحقق بالطرد المركزي التفاضلي، قد لا تكون هذه الطريقة مناسبة لعزل أبوبدس من العينات المعقدة. وفي المقابل، لدينا الأسلوب القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن إثراء أبوبدس بنقاوة 99%، ويستند إلى الخصائص البيولوجية الفريدة من أبوبدس بما في ذلك حجم الجسيمات، وتقسيمات والتعرض بتدسير، بدلاً من الاعتماد فقط على كثافة الجسيمات. وهذا النهج أيضا لديه القدرة على تحديد وعزل أبوبدس أصول مختلفة الخلية باستخدام علامات خاصة بنوع الخلية24في الوقت نفسه. وعلى الرغم من إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية طويلة التي يمكن أن تأخذ ح 1-8 تبعاً لكمية أبوبدس المطلوبة، سيسمح دقيقة عببد العزلة وتحليل المتلقين للمعلومات اللاحقة الإسناد المباشر للخصائص الجزيئية والأدوار الوظيفية أبوبدس. لهذه المنهجيات، من الأهمية بمكان أن نهج العزلة عببد تقترن مع تقنيات مثل التدفق الخلوي (كما ورد هنا) للتحقق من صحة كل تنظيم دورات تعريفية للمبرمج ونقاء العينة أثري عببد. وعلاوة على ذلك، نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة إعداد ضروري لعزل عببد عبر النهج القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية، تيار غير مستقرة أو تأخير انخفاض أداء بشكل غير صحيح قد تؤدي نقاوة منخفضة.

جماعياً، وقد اوجزنا المنهجيات المتطورة للتحديد الكمي للمبرمج التعريفي وكشف عببد وعزل أبوبدس نقية جداً. النهج الذي نتبعه قد توفر أداة جديدة لدراسة عملية تفكيك خلية أبوبتوتيك وتوضيح دور هذه العملية في إعدادات المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وهذا عمل تدعمها المنح التي تقدمها الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (GNT1125033 و GNT1140187) والمجلس الأسترالي للبحوث (DP170103790) إلى I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
كشف وعزل الهيئات أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter