Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Detectie en isolatie van Apoptotic instanties hoge zuiverheid

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

Een workflow met behulp van stroom cytometry of differentieel centrifugeren is ontwikkeld om te detecteren, te kwantificeren en te isoleren van apoptotic instanties uit een monster apoptotic hoge zuiverheid.

Abstract

Apoptotic organen (ApoBDs), microvesicles en exosomes zijn de belangrijkste leden van de familie extracellulaire blaasje met ApoBDs wordt één van de grootste type. Er is voorgesteld dat de ApoBDs cel goedkeuring, alsmede de intercellulaire communicatie via mensenhandel biomoleculen kan steun. Conventionele benaderingen gebruikt voor de identificatie en de isolatie van de ApoBDs zijn vaak beperkt door het gebrek aan nauwkeurige kwantificering en lage monster zuiverheid. Hier beschrijven we een werkstroom om te bevestigen de inductie van apoptosis, ApoBD formatie te valideren en isoleren van ApoBDs naar hoge zuiverheid. We zullen ook schetsen en vergelijk fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en differentiële centrifugeren gebaseerde benaderingen te isoleren van de ApoBDs. Bovendien zal de zuiverheid van geïsoleerde ApoBDs worden bevestigd met behulp van een eerder stellen stroom cytometry gebaseerde kleuring en de analysemethode. Tezamen, met behulp van de beschreven benadering, THP-1 monocyt apoptosis en de apoptotic cellen te demonteren was geïnduceerd en gevalideerd, en ApoBD gegenereerd op basis van THP-1 monocyten werden geïsoleerd met een zuiverheid van 97-99%.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een goed bestudeerde vorm van geprogrammeerde celdood, apoptosis, is vereist voor de fysiologische homeostase te handhaven en potentieel schadelijke cellen binnen het menselijk lichaam1verwijderen. Na de inductie van apoptosis, kunnen apoptotic cellen (ApoCells) een aantal morfologische veranderingen ondergaan en demonteren in kleine membraan-gebonden blaasjes genoemd ApoBDs. Globaal, is dit proces staat bekend als de apoptotic cellen demontage en kan worden onderverdeeld in 3 duidelijke stappen op basis van morfologie2,3. Stap 1 (plasmamembraan blebbing) wordt gekenmerkt door de vorming van ballon-achtige structuren aan het celoppervlak bekend als blebs4,5. Stap 2 (apoptotic uitsteeksel vorming) omvat de vorming van de lange membraan uitsteeksels zoals kralen-apoptopodia, apoptopodia en microtubulus spikes6,7,8. Stap 3 (ApoBD vorming) bevat ten slotte de versnippering van de apoptotic uitsteeksels en/of ApoCells voor het genereren van ApoBDs6,9. Eerdere bevindingen hebben voorgesteld een rol van ApoBDs in de medeplichtigheid van apoptotic cellen goedkeuring en bemiddelen van de intercellulaire communicatie. Bijvoorbeeld, wordt voorgesteld dat de fragmentatie van een ApoCell in de ApoBDs kleine 'hapklare' stukjes die gemakkelijk kunnen worden verwijderd door het omringende fagocyten2,10,11kan genereren. Bovendien kunnen ApoBDs een reeks van biomoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten, die kunnen worden verhandeld naar omliggende cellen te vergemakkelijken van cel-cel communicatie12,13,14haven. Functioneel onderzoek doen naar deze processen, is het essentieel voor het bevestigen van drie essentiële parameters, met inbegrip van (i) validering van apoptose inductie en vorming van de ApoBD, (ii) isolatie van ApoBDs, en (iii) de bevestiging van ApoBD zuiverheid.

Eerder, een aantal methoden, met inbegrip van stroom cytometry en elektronenmicroscopie hebben gebruikt om apoptosis en ApoBDs15,16,17,18te studeren. ApoBD detectie en kwantificering zijn echter vaak moeilijk of over het hoofd gezien. Bijvoorbeeld, de meest routinematig gebruikte stroom cytometry gebaseerde apoptosis assay werken Annexine V (A5, een eiwit dat de externalized bindt ' eten-me' signaal fosfatidylserine (PtdSer)) en nucleïnezuur vlek propidium jodide (PI)19. Echter, met behulp van deze universele vlek combinatie, analyse is verondersteld dat er slechts drie soorten cel deelverzamelingen (levensvatbare cellen, ApoCells en necrotische cellen) in het monster zijn. Bovendien al beschouwd als "een goudstandaard" door vele onderzoekers voor apoptose, stroom cytometry testen en latere data-analyse vaak worden uitgesloten van ApoBDs door middel van een eerste gating stap FSC/SSCintermediair-hoge gebeurtenissen selecteren. Daarom hebben we onlangs een nieuwe stroom cytometry assay met A5 en aan-PRO-3 ontwikkeld, een ander stikstofbase vlek die kan selectief worden overgenomen door caspase-3/7-geactiveerde pannexin 1 (PANX1)7,,20kanalen. Zoals activering van caspase 3-geïnduceerde PANX1 voorafgaat PtdSer blootstelling aan het vroege stadium van apoptosis, vlekken aan-PRO-3 differentieel apoptotic en necrotische cellen. Bovendien, deze aanpak in combinatie met onze roman gating strategie omvat alle verworven evenementen tijdens gegevensanalyse en daardoor zes cel/deeltje deelverzamelingen zijn geïdentificeerd, met inbegrip van: (i) levensvatbare cellen (FSC/SSCintermediair/hoge, A5laag ,Lageaan-PRO-3), (ii) A5- vroege ApoCells (FSC/SSCintermediair/hoge,lageA5, aan-PRO-3intermediaire), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermediair/hoge, A5hoog ,Tussenliggendeaan-PRO-3), (iv) necrotische cellen of late ApoCells (FSC/SSCintermediair/hogeA5hoog, aan-PRO-3hoog), (v) ApoBDs (FSC/SSClage, A5tussenliggende, aan-PRO-3laag / intermediate), en (vi) puin (FSC/SSClage,lageA5, aan-PRO-3lage)20. Onze aanpak benadrukt het belang van het analyseren van alle deelverzamelingen van de cellen/deeltje en, nog belangrijker, de scheiding van ApoBDs van cellen en puin20. Aldus, toont deze aanpak een efficiënte techniek voor het valideren van de inductie van apoptosis en de vorming van de ApoBD gelijktijdig.

Traditioneel zijn ApoBDs geïsoleerd door een verscheidenheid van differentiële centrifugeren benaderingen waarbij ApoBDs kan worden losgekoppeld van de cellen of andere extracellulaire blaasjes op basis van dichtheid. Dergelijke centrifugeren methoden zijn echter vaak beperkt door lage ApoBD zuiverheid, gebrek aan een kwantificering stap te bevestigen monster zuiverheid en/of onvermogen om te scheiden van de cel type-specifieke ApoBDs17,21,22. Dus ontwikkelde we recent twee benaderingen, een FACS gebaseerde en een nieuwe differentiële centrifugeren gebaseerde benadering, die kan worden gekoppeld aan onze eerder vastgestelde stroom cytometry methode voor het valideren van de inductie van apoptosis en monster zuiverheid23. ApoBD isolatie via onze FACS gebaseerde benadering kan verrijken ApoBDs tot 99% zuiverheid en kan gepaard gaan met een scala aan cel type-specifieke antilichamen tegen ApoBDs isoleren van gemengde cel populaties, weefselsteekproeven en lichaamsvloeistoffen23. Bovendien, onze herziene differentiële centrifugeren aanpak toont een efficiënte methode om ApoBDs te isoleren > 90% zuiverheid23.

In deze paper beschrijven we in detail onze experimentele procedure apoptose inductie, valideren en te detecteren en kwantificeren van de vorming van de ApoBD. De ApoBD isolatie werkstromen met behulp van FACS gebaseerde en differentiële centrifugeren gebaseerde methoden zijn ook uitgewerkt en vergeleken. De representatieve gegevens tonen aan dat de beschreven methodologie een effectieve geavanceerde hulpprogramma voor toekomstige ApoBD studies bevat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. de inductie van Apoptosis

  1. Centrifugeer cel monster bij 300 x g gedurende 5 minuten en schakel eventuele reeds bestaande cel puin wordt weggeworpen.
    Opmerking: Wanneer u Adherente cellen, cellen vooraf zaad en wassen met 1 x fosfaatgebufferde oplossing (PBS) vóór apoptose inductie.
  2. Bepalen aantal cellen en cellen te verzamelen.
    Opmerking: Afhankelijk van de test na isolatie, raden we aan een cel beginnummer van minstens 1 x 107 cellen.
  3. Resuspendeer in volledige media (respectieve opslagmedium met foetaal kalfsserum 10% (vol/vol) 50 IU/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine mengsel) voor een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/mL.
  4. Aliquot ~ 2 x 106 cellen per putje van een 6 goed plaat.
  5. Om het induceren van apoptose, verwijder het deksel van de plaat en bestralen cellen op 150 mJ/cm2 met behulp van een UV-irradiator. Dit zou duren ongeveer 30-60 s.
    Opmerking: Voorafgaand aan de bestraling, zorgen dat het besturingselement van de cel 'Untreated' ~0.5 x 106 cellen worden bewaard.
    Opmerking: Apoptosis kan ook via andere methoden zoals anti-Fas of serum honger6worden opgewekt.
  6. Incubeer bij 37° C, 5% CO2 voor 2-8 uur, afhankelijk van de cellijn.
  7. Met behulp van een bank top lichte Microscoop, visualiseer cellen ter bevestiging van de aanwezigheid van apoptotic morphologies, zoals blebbing, vorming van apoptopodia en ApoBD-formatie.
    Opmerking: 40 X vergroting is voldoende
  8. Met behulp van een pipet P1000, Pipetteer en apoptotic monsters te verzamelen.
  9. Wassen van de plaat met 1 x PBS en combineren met resterende monster om ervoor te zorgen maximale opbrengst.
  10. Verzamelen ~1/10th voor de "hele Apoptotic monster" (WAS) bepalen.
  11. De 'Onbehandeld' monster verzameld.
  12. Centrifugeer WAS zowel de Untreated monsters bij 3000 x g gedurende 6 min.
  13. Resuspendeer in 1 mL 1 x PBS en zet opzij op het ijs.
  14. ApoBD isolatie, blijven beide stap 2 of 3 met de resterende apoptotic monster.

2. ApoBD isolatie via FACS

  1. Centrifugeer het gehele monster bij 3000 x g voor 6 min.
  2. De meerderheid van de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder de pellet te verstoren.
  3. Resuspendeer in een kleurstofoplossing met 1 mL van de 1 x A5 bindende buffer, 75 µL van A5-FITC en 2 µL van aan-PRO-3 per 1 x 107 cellen.
  4. Incubeer het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  5. Voeg 1-2 mL 1 x A5 bindende buffer en centrifugeer monster bij 3000 x g voor 6 min te verwijderen overtollige vlek.
    Opmerking: Voor gemengde cel populaties of weefselsteekproeven, uitvoeren van een antilichaam kleuring stap met behulp van een combinatie van cel type-specifieke markers in 1 x A5 bindende buffer en incubeer op ijs gedurende 20 minuten (of volgens protocol van de fabrikant) voor centrifugeren bij 3000 x g gedurende 6 min.
  6. Resuspendeer de pellet monster in 3 mL FACS buffer (1 x PBS, 1 x A5 bindende buffer, 10% FSC, 2 mM EDTA) per 1 x 107 cellen.
  7. Filtreer door een 70 µm cel zeef in een ronde-bodem, polypropyleen (stroom cytometry) buis en monsters op het ijs en in het donker te houden.
  8. Inschakelen van de machine FACS en voeren standaard instellen met behulp van een verstuiver 100 µm, uitvoeren van de daling van de vertraging en zorgen voor een stabiele stroom.
  9. Laden van het monster en overname snelheid ingesteld op ~ 1000 evenementen/s.
  10. Aanpassen van FSC, WS, APC (aan-PRO-3) en de FITC (A5) spanningen en plaats van de gebeurtenissen binnen de FACS percelen om de bevolking duidelijk kunnen worden gescheiden.
  11. 20.000 gebeurtenissen registreren.
  12. Instellen van een gating strategie zoals in deel 4.
  13. Toevoegen in de sortering indeling, de laatste ApoBD-poort als de gewenste sorteer bevolking.
  14. Beginnen met het verwerven van het monster en het uitvoeren van een soort test door het verzamelen van 5.000-10.000 ApoBDs in een nieuwe buis met ~ 250 µL FACS buffer.
  15. Het uitvoeren van een systeem terug spoelen en gesorteerde ApoBDs laden.
  16. Verwerven en test-soort ApoBDs opnemen.
  17. Controleer of de ApoBD zuiverheid ~ 99% is door het vergelijken van FSC (y-as) versus A5 (x-as gebeurtenissen).
    Opmerking: A5 kleuring enigszins kan verminderen bij het opnieuw analyseren van monsters als gevolg van laser bleken.
  18. Zodra hoge zuiverheid is bereikt, originele monster laden en blijven sorteren totdat het gewenste aantal ApoBDs heeft verkregen.
    Opmerking: Indien nodig, dual sorteren kan worden uitgevoerd om gelijktijdig isoleren ApoCells en ApoBDs.
    Opmerking: Bij het sorteren van een lange periode van tijd, raden we aan het broeden van de buis van de collectie bij 4 ° C.
  19. Zodra sorteren is voltooid, een klein gedeelte van post sorteren ApoBDs verzamelen, post sorteren ApoCells, Untreated en WAS te valideren apoptosis en post sorteren zuiverheid te bevestigen.
    Opmerking: Hoewel de test-soort en de post sorteren zuiverheid niet aanzienlijk verschillen moeten, is dit gebaseerd op de stream instellingen en stabiliteit.

3. ApoBD isolatie via differentiële centrifugeren

  1. Centrifugeer het resterende apoptotic monster bij 300 x g gedurende 10 minuten.
  2. De bovendrijvende substantie, verlaten ~ 500 µL om te voorkomen dat de cel pellet, verzamelen en in een nieuwe conische tube van 15 mL toevoegen.
  3. Verwijder de resterende 500 µL en resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver 1 x PBS (dit is de 'ApoCell-verrijkt breuk'.
  4. De verzamelde bovendrijvende vloeistof gedurende 20 minuten op 3000 gcentrifugeren.
  5. Controleer voor een pellet en verwijder voorzichtig het supernatant (het supernatant kan bevatten kleine extracellulaire blaasjes met inbegrip van microvesicles en exosomes).
  6. Resuspendeer de pellet in 1 mL 1 x PBS (dit is de 'ApoBD-verrijkt' breuk)
  7. Het verzamelen van 100 µL van elke levensvatbaar, WAS, ApoCell-verrijkt, en ApoBD verrijkte monsters in een nieuwe ronde-bodem, polystyreen (stroom cytometry) buis.
  8. Voeg 100 µL van de vlek met 2 x A5 bindende buffer 1:100 A5-FITC en 1:1,000 aan-PRO-3
  9. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker.
  10. Het analyseren van monsters met stroom cytometry, gebruikt de gating strategie zoals hierboven beschreven om te valideren van de succesvolle inductie van apoptosis en zuiverheid van de breuk ApoBD-verrijkt.

4. Stroom Cytometry Gating strategie

  1. Plot aan-PRO-3 (y-as) tegen FSC (x-as) te scheiden van necrotisch cellen (aan-PRO-3hoog) van alle andere niet-permeabel evenementen (aan-PRO-3lage/intermediate).
  2. Selecteer alle niet-permeabel gebeurtenissen en plot SSC tegen A5. Poort twee populaties met inbegrip van bevolking 1 (P1), SSCintermediair/hoge, A5laag/intermediate cellen en bevolking 2 (P2), alle andere evenementen.
  3. P2, plot aan-PRO-3 tegen A5 en selecteer A5intermediair/hoge gebeurtenissen uit te sluiten van alle vuil van de cel.
  4. Selecteer alle A5 positieve gebeurtenissen en plot FSC tegen A5. ApoBDs (FSClage) van ApoCells (FSCintermediair/hoge) scheiden.
    Opmerking: Wanneer gating ApoBDs voor ApoBD isolatie via de FACS gebaseerde benadering, raden we aan een laatste stap door te ApoBDs selecteren en vergelijken aan-PRO-3 tot en met A5 en alle gebeurtenissen. Dit zorgt ervoor dat de laatste sorteren poort fluorescentie in plaats van FSC/SSC parameters gebruikt.
  5. P.a. van levensvatbare cellen, selecteert u P1 en voer een van de twee gating strategieën. Voor de analyse van de algemene levensvatbare cellen, plot FSC tegen A5 en selecteer alle FSCintermediair/hoge cellen, dus het verwijderen van resterende cel puin. Als alternatief voor grondige analyse, levensvatbare cellen kunnen worden gescheiden van de A5- vroege ApoCells door aan-PRO-3 tegen FSC. Select TO-PRO-3lage, FSCintermediair/hoge levensvatbare cellen en aan-PRO-3intermediaire, FSCintermediair/hoge A5- vroege ApoCells.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met behulp van de procedure hier, THP-1 monocyt apoptosis was geïnduceerd en ApoBDs werden gedetecteerd en geïsoleerd via een gebaseerde FACS of een differentiële centrifugeren benadering (Figuur 1). Ten eerste, apoptosis werd veroorzaakt door UV-bestraling en monsters werden genomen na 2-3 uur incubatie wanneer cellen tentoongesteld apoptotic morphologies, met inbegrip van apoptotic membraan uitsteeksel vorming, blebbing en de generatie van ApoBDs6. Een aan-PRO-3 en A5 gebaseerde stroom cytometry methode werd gebruikt voor het bevestigen van de inductie van monocyt apoptosis en de vorming van de ApoBD door het scheiden van levensvatbare cellen, necrotisch cellen, vroege ApoCells, ApoCells, ApoBDs en puin (Figuur 2). Tezamen, stroom cytometry analyse aangegeven dat UV behandeling tot ~ 20 leidt % ApoCells (Figuur 3).

THP-1 monocyte ApoBDs waren toen geïsoleerd uit de WAS via twee benaderingen. Ten eerste, monsters waren voorbereid op een hoge zuiverheid FACS gebaseerde benadering waar slechts een enkele centrifugeren stap is moet het gehele apoptotic monster pellet voordat kleuring en FACS. Deze methode is geschikt voor functionele testen wanneer aanzienlijk veel monsters zuiverheid is vereist (bijvoorbeeld voor qPCR analyse), wanneer een bepaald aantal ApoBDs wordt vereist, of wanneer verwerven cell type-specifieke ApoBDs uit een complex monster. Met behulp van deze methode, werden ApoBDs geïsoleerd ~ 99% zuiverheid (Figuur 4).

Vervolgens THP-1 monocyte ApoBDs werden ook geïsoleerd via een in twee fasen, de aanpak van differentiële centrifugeren. De eerste stap omvat het isolement van levensvatbare cellen, ApoCells en necrotische cellen. De tweede stap bevat de scheiding van de grotere ApoBDs van kleine extracellulaire blaasjes zoals microvesicles en exosomes, die niet kunnen worden Ingehuld op 3.000 x g. stroom cytometry vervolgens werd uitgevoerd om apoptose inductie en ApoBD monster zuiverheid te bevestigen en aangetoond van een ApoBD verrijkte monster bevattende ~ 97 gewichtspercenten ApoBDs (Figuur 4). Dit biedt een snelle en doeltreffende techniek om te isoleren ApoBD relatief hoge zuiverheid en is geschikt bij het zuiveren van ApoBDs van monsters met een eencellige type.

Figure 1
Figuur 1 . Schematisch diagram van de ApoBD isolatie via een benadering van het FACS gebaseerde of differentiële centrifugeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Stroom cytometry strategie gating. Zes cel/deeltje deelverzamelingen (met inbegrip van levensvatbare cellen, A5- vroege ApoCells, A5+ ApoCells, necrotisch cellen, ApoBDs en puin) werden geïdentificeerd en gebruikt om te ApoBD selecteren voor FACS gebaseerde isolatie. (a) membraan permeabilised necrotische cellen worden gescheiden van niet-permeabilised gebeurtenissen. (b) A5laag-intermediair, SSClaag-hoog cellen zijn gescheiden van de A5laag-hoog gebeurtenissen. (b.i) voor diepgaande analyse, aan-POR-3lage levensvatbare cellen kunnen worden gescheiden van aan-PRO-3intermediaire A5- vroege ApoCells. (b.ii) anderzijds bij het eenvoudig berekenen ApoBD zuiverheid, levensvatbare cellen kunnen worden gescheiden van FSClage gebeurtenissen. (c) A5laag puin zijn uitgesloten. (d) FSCintermediair/hoge ApoCells zijn gescheiden van FSClage ApoBDs. (e) alle A5-naar-PRO-3intermediair/hoge ApoBDs zijn geselecteerd voor het sorteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 3
Figuur 3 . Validatie van THP-1 monocyt apoptosis. Stroom cytometry analyse van onbehandeld of UV-bestraalde THP-1 monocyten werd uitgevoerd om te bepalen van het aantal levensvatbare cellen, A5- vroege ApoCells, A5+ ApoCells, en necrotische cellen.

Figure 4
Figuur 4 . Zuivering van THP-1 monocyt-afgeleide ApoBDs. Stroom cytometry analyse werd uitgevoerd op geïsoleerde THP-1 monocyt-afgeleide ApoBDs via ofwel een FACS gebaseerde of differentiële centrifugeren gebaseerde aanpak, tonen de verrijking van ApoBDs van levensvatbare cellen, ApoCells en necrotische cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sinds de vroege beschrijving in de jaren 1950, het veld van apoptosis beschikt over geavanceerde aanzienlijk, steeds een prominente onderzoeksruimte. Ondanks de brede interesse en uitgebreide inspanningen, zijn bepaalde aspecten van apoptosis, in het bijzonder de vorming van ApoBDs, niet goed bestudeerd door het gebrek aan geschikte methoden. Deze omvatten met name de beperking in het bijhouden van apoptosis progressie en vorming van de ApoBD gelijktijdig met behulp van de traditionele stroom cytometry A5/PI analyse en de onzuiverheden van ApoBD isolatie. Onlangs hebben we benaderingen om deze methodologische tekortkomingen te verhelpen.

Onze nieuwe stroom cytometry gebaseerde analytische benadering kunt ApoBDs, die vaak worden genegeerd met behulp van traditionele analysemethoden, worden gedetecteerd en gekwantificeerd20. Bovendien, dit aangepast stroom cytometry methode, met het gebruik van de vlek naar-PRO-3, onthult een extra A5- vroeg apoptotic stadium, vandaar het renderen van betere afbakening van apoptosis progressie20. Conventioneel, ApoBD detectie hebben leunde zwaar op beeld-gebaseerde technieken zoals confocale microscopie en histologie, overwegende dat onze stroom cytometry methode maakt hoge gegevensdoorvoer mogelijk te kwantificeren ApoBD formatie. Hoewel schijnbaar complex, de procedure is relatief eenvoudig en vereist alleen verkrijgbare reagentia en een elementaire stroom cytometer. De logische detectie en precieze kwantificering van ApoBDs zou verder de kennis van apoptotic cel communicatie dat dictaat cel mijnen en immunologische reacties. In feite, door de koppeling hierin beschreven stroom cytometry methode met organel-specifieke vlekken, hebben we onlangs gemeld de heterogene verdeling van mobiele inhoud in ApoBDs24. Deze bevindingen stellen voor dat ApoBDs kunnen worden onderverdeeld in verschillende subgroepen en elke deelverzameling van ApoBD verschillende functies kan vertonen.

Onze onlangs ontwikkelde ApoBD isolatie technieken zou ook bijdragen tot vooruitgang op het gebied van extracellulaire blaasjes. Traditioneel, bevatten differentiële centrifugeren methoden voor ApoBD isolatie een aanzienlijke hoeveelheid kleinere cellen, die invloed kunnen zijn op de downstream functionele testen. Echter, onze gemodificeerde differentiële centrifugeren benadering kan worden gebruikt om te isoleren ApoBDs 97% zuiverheid. Hoewel hoge zuiverheid kan worden bereikt door differentiële centrifugeren, deze methode mogelijk niet geschikt voor het isoleren van ApoBDs van complexe monsters. In tegenstelling, onze FACS gebaseerde methode ApoBDs kunt verrijken tot 99% zuiverheid, en is gebaseerd op de unieke biologische eigenschappen van ApoBDs met inbegrip van deeltjesgrootte, granulatie en PtdSer blootstelling, in plaats van zich het baseren alleen op dichtheid van de deeltjes. Deze aanpak heeft ook de mogelijkheid om gelijktijdig identificeren en ApoBDs van oorsprong van de verschillende cel met behulp van cel type-specifieke markeringen24isoleren. Ondanks een lange FACS procedure die zouden kunnen 1-8 h afhankelijk van de hoeveelheid ApoBDs nodig nemen, zou nauwkeurige ApoBD isolatie en latere downstream analyse rechtstreekse toekenning van de moleculaire kenmerken en functionele rollen van ApoBDs. Voor dergelijke methodologieën is het essentieel dat ApoBD isolatie benaderingen zijn in combinatie met technieken zoals stroom cytometry (zoals hier) om te valideren van zowel de inductie van apoptosis en zuiverheid van het monster ApoBD-verrijkt. Bovendien is goede FACS instellen essentieel voor ApoBD isolatie via de FACS gebaseerde aanpak, zoals een unstable stream of onjuist uitgevoerd drop vertraging in lage zuiverheid resulteren kan.

We hebben gezamenlijk, geavanceerde methoden voor het kwantificeren van apoptose inductie, ApoBD detectie en isolatie van zeer zuivere ApoBDs geschetst. Onze aanpak kan bieden een nieuwe tool om te studeren de apoptotic cellen demontage proces en verheldering van de rol van dit proces in de instellingen van de ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Zulks gehanteerd werd gesteund door subsidies van nationale gezondheids- en medische Onderzoeksraad (GNT1125033 en GNT1140187) en Australian Research Council (DP170103790) naar I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
Detectie en isolatie van Apoptotic instanties hoge zuiverheid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter