Summary
זרימת עבודה באמצעות צנטריפוגה לזרום cytometry או דיפרנציאלית מפותחת לזהות, לבודד את הגופות אפופטוטיים להיפגע מן דוגמה אפופטוטיים להיפגע טוהר גבוהה לכמת.
Abstract
מוות גופים (ApoBDs), שלפוחיות זעירות exosomes הם אנשי מפתח של משפחת שלפוחית חוץ-תאית, עם ApoBDs של הסוג הגדול. זה הוצע כי ApoBDs יכול לסייע תא סיווג, כמו גם המערכת בתקשורת דרך מולקולות לסחר בבני אדם. גישות קונבנציונליות, המשמש את זיהוי ובידוד של ApoBDs מוגבלים לעיתים קרובות על ידי העדר כימות מדויק וטוהר מדגם נמוך. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס, לאמת ApoBD היווצרות לבודד ApoBDs על טוהר גבוהה. אנו גם חלוקה לרמות, להשוות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) וגישות צנטריפוגה דיפרנציאלי המבוסס על מנת לבודד ApoBDs. יתר על כן, טוהר ApoBDs מבודדים תאושר באמצעות בעבר להקים לזרום cytometry מבוססי מכתים ושיטת אנליטית. יחדיו, באמצעות הגישה המתוארת, THP-1 מונוציט אפופטוזיס ועל מוות תא פירוק היה המושרה ואומתו, והיו ApoBD המופקים THP-1 ומונוציטים מבודד טוהר של 97-99%.
Introduction
אפופטוזיס, צורה למד היטב של מוות תאים מתוכנת, נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגית וכדי להסיר תאים מזיקים בתוך גוף האדם1. לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס, מוות תאי (ApoCells) ניתן לעבור סדרה של שינויים מורפולוגיים, לפרק לתוך שלפוחית ממברנה מכורך קטן הנקרא ApoBDs. באופן כללי, תהליך זה מכונה פירוק התא אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות מחולק 3 שלבים נפרדים בהתבסס על מורפולוגיה2,3. שלב 1 (קרום פלזמה blebbing) מאופיין על ידי היווצרות של מבנים דמויי בלון על פני תאים המכונה מגדלים פורחים4,5. שלב 2 (אפופטוטיים להיפגע תיתכן היווצרות) כולל להיווצרות בליטות ממברנה ארוך כמו apoptopodia, apoptopodia עם חרוזים, microtubule קוצים6,7,8. לבסוף, בשלב 3 (היווצרות ApoBD) כוללת את הפיצול בליטות מוות ו/או ApoCells כדי ליצור6,ApoBDs9. ממצאים קודמים הציעו תפקיד של ApoBDs ב מוות תא סיווג וסיוע תיווכה תקשורת המערכת. כך למשל, מוצע כי חלוקת ApoCell לתוך ApoBDs עשוי לייצר קטן '' הסוף יכול להסירו בקלות על-ידי תחימת phagocytes2,10,11. יתר על כן, ייתכן ApoBDs הארבור סדרה של מולקולות כמו DNA, RNA וחלבונים, אשר עשוי להיות הנסחר את התאים המקיפים אותם כדי להקל על התא-תא תקשורת12,13,14. לחקור באופן פונקציונלי תהליכים אלה, זה חיוני כדי לאשר שלושה פרמטרים מרכזיים כולל (i) אימות של אפופטוזיס ויצירת ApoBD, (ii) בידוד של ApoBDs, וכן (iii) אישור של טוהר ApoBD.
בעבר, היו בשימוש מספר שיטות כולל cytometry זרימה ואלקטרון ללמוד ואפופטוזיס ו ApoBDs15,16,17,18. עם זאת, ApoBD זיהוי, כימות הם לעתים קרובות קשה או תסולא בפז. למשל, ביותר-בשימוש שגרתי לזרום cytometry מבוססי אפופטוזיס assay מעסיקה annexin V (A5, חלבון זה מאגד את המוחצנים ' לאכול-לי ' האות phosphatidylserine (PtdSer)) חומצת גרעין כתם propidium יודיד (PI)19. עם זאת, באמצעות שילוב הכתם אוניברסלי, ניתוח מבוסס על ההנחה כי יש רק שלושה סוגים של תאים קבוצות משנה (התאים קיימא, ApoCells ותאי נמק) במדגם. יתר על כן, למרות נחשב "תקן הזהב" על ידי חוקרים רבים עבור אפופטוזיס, מבחני cytometry זרימה, ניתוח הנתונים הבאים לעיתים קרובות אינו כולל ApoBDs דרך צעד המגביל ראשוני בחירת אירועיםבינוני-גבוהה FSC/האס. לכן, פיתחנו לאחרונה וזמינותו cytometry זרימה הרומן באמצעות A5 ואל-PRO-3, עוד כתם nucleic יכול להיות סלקטיבי נלקח על ידי קספאז 3/7-הופעלו pannexin 1 (PANX1) ערוצי7,20. כפי קספאז 3-induced PANX1 ההפעלה לפני חשיפה PtdSer בשלב מוקדם של אפופטוזיס, אל-PRO-3 כתמים באופן שונה אפופטוטיים להיפגע ותאים נמק. בנוסף, גישה זו בשילוב עם הרומן שלנו gating אסטרטגיה כוללת אירועים הכל רכשה במהלך ניתוח נתונים, כתוצאה מכך, שישה תאים/חלקיקים תת-ערכות מזוהים, לרבות: (i) התאים קיימא (FSC/האסבינוני/גבוה, A5נמוך , אל-PRO-3נמוך), (ii) A5– ApoCells מוקדם (FSC/האסבינוני/גבוה, A5נמוכה, אל-PRO-3ביניים), (iii) A5+ ApoCells (FSC/האסבינוני/גבוה, A5גבוהה , אל-PRO-3ביניים), תאים עם נמק (iv) או מאוחר ApoCells (FSC/האסבינוני/גבוה, A5גבוה, אל-PRO-3גבוהה) (v) ApoBDs (FSC/האסנמוך, A5ביניים, אל-PRO-3נמוך / ביניים), ו (vi) פסולת (FSC/האסנמוך, A5נמוכה, אל-PRO-3נמוכה)20. הגישה שלנו מדגישה את החשיבות של ניתוח כל התאים/חלקיקים קבוצות משנה ו, וחשוב, ההפרדה של ApoBDs מן התאים פסולת20. לפיכך, גישה זו מדגימה טכניקה יעילה כדי לאמת את אינדוקציה של אפופטוזיס ויצירת ApoBD בו זמנית.
באופן מסורתי, ApoBDs היו מבודדים באמצעות מגוון רחב של גישות צנטריפוגה דיפרנציאלי לפיו ניתן להפריד ApoBDs תאים או אחרים שלפוחית חוץ-תאית בהתבסס על צפיפות. עם זאת, שיטות כאלה צנטריפוגה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי נמוך ApoBD טוהר, חוסר צעד כימות לאשר מדגם טוהר, ו/או חוסר היכולת להפריד בין תאים ייחודיים לסוג ApoBDs17,21,22. לכן, לאחרונה פיתחנו שתי הגישות, מבוסס-FACS, דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גישה חדשה אשר יכול להיות בשילוב עם שיטת cytometry זרימה שנקבעו קודם שלנו כדי לאמת את אינדוקציה של טוהר אפופטוזיס ודגימת23. ApoBD בידוד באמצעות הגישה שלנו מבוססת-FACS יכול להעשיר ApoBDs של עד 99% טוהר, יכול להיות בשילוב עם מגוון רחב של נוגדנים ייחודיים לסוג התא כדי לבודד ApoBDs אוכלוסיות מעורבות לתאים, דגימות רקמה, נוזלי גוף23. יתר על כן, הגישה שלנו צנטריפוגה דיפרנציאלית המתוקן מדגימה שיטה יעילה כדי לבודד ApoBDs כדי > 90% טוהר23.
בנייר זה, נתאר בפירוט שלנו הליך ניסיוני לאימות אפופטוזיס, וכדי לזהות ולכמת היווצרות ApoBD. ApoBD בידוד של זרימות העבודה בשיטות FACS ומבוססי -דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גם פירט, בהשוואה. הנתונים נציג מדגימים כי המתודולוגיה המתוארת מספק כלי יעיל חדשנית ללימודי ApoBD בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אינדוקציה של אפופטוזיס
- תגובת שיקוע כדי להסיר את כל שאריות תאים קיימים צנטריפוגה דגימות התאים ב g 300 x במשך 5 דקות וזורקים.
הערה: בעת שימוש תאים חסיד, זרע תאים מראש ולא לשטוף עם 1 x באגירה פוספט פתרון (PBS) לפני אפופטוזיס. - לקבוע את מספר הטלפון הנייד ולאסוף תאים.
הערה: בהתאם הבידוד שלאחר assay, אנו ממליצים על מספר התא ההתחלתי לפחות 1 x 107 תאים. - Resuspend בתקשורת מלאה (בהתאמה בינוני המכיל 10% (vol/כרך) עגל עוברית סרום, פניצילין 50 IU/mL, 50 תערובת סטרפטומיצין µg/mL) עבור ריכוז סופי של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
- Aliquot ~ 2 x 106 תאים לכל טוב של צלחת טוב 6.
- כדי לגרום אפופטוזיס, להסיר את המכסה צלחת, לעורר תאים-150 mJ/cm2 תוך שימוש בעוצמה של UV. זה צריך לקחת כ- 30-60 s.
הערה: לפני הקרנה, ודא כי ~0.5 x 106 תאים נשמרים עבור הפקד תא 'Untreated'.
הערה: אפופטוזיס יכולה גם להיגרם באמצעות שיטות אחרות כגון אנטי-אופנה או סרום הרעבה6. - דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 2-8 שעות, בהתאם לקו תא.
- באמצעות מיקרוסקופ אור העליון ספסל, דמיינו תאים כדי לאשר הנוכחות של מוות מורפולוגיות, כגון blebbing, היווצרות apoptopodia ApoBD היווצרות.
הערה: 40 X הגדלה מספיקה - באמצעות פיפטה P1000, פיפטה ולאסוף דגימות אפופטוטיים להיפגע.
- לשטוף את הצלחת עם 1 x PBS ולשלב עם דגימת הנותרים כדי להבטיח מקסימום תשואה.
- ~1/10 לאסוףth למדגם "כל מוות" (WAS) לשלוט.
- איסוף הדגימה 'מטופל'.
- Centrifuge דגימות WAS והן Untreated ב 3000 g x במשך 6 דקות.
- Resuspend ב מ 1 ל 1 x PBS, להפריש על קרח.
- ApoBD בידוד, להמשיך גם שלב 2 או 3 עם הדגימה אפופטוטיים להיפגע הנותרים.
2. ApoBD בידוד באמצעות FACS
- Centrifuge המדגם כולו ב 3000 g x במשך 6 דקות.
- הסר את רוב תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר.
- Resuspend בפתרון מכתימים המכיל 1 מ"ל מאגר איגוד x A5 1, µL 75 של A5-FITC, 2 µL של-PRO-3 לכל עונה 1 פרק 107 תאים.
- דגירה מדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- מוסיפים 1-2 מ ל 1 מאגר איגוד x A5, צנטריפוגה מדגם ב 3000 g x עבור 6 דקות להסיר את הכתם עודף.
הערה: עבור אוכלוסיות מעורבות לתאים או דגימות רקמה, לבצע נוגדן מכתים שלב באמצעות שילוב של סמנים ייחודיים לסוג התא במאגר איגוד x A5 1, דגירה על קרח למשך 20 דקות (או לפי הפרוטוקול של היצרן) לפני צנטריפוגה ב 3000 g x 6 min. - Resuspend צנפה מדגם ב- 3 מ"ל של מאגר FACS (1 x PBS, מאגר איגוד x A5 1, 10% FSC, 2 מ מ EDTA) לכל עונה 1 פרק 107 תאים.
- לסנן דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך הסיבוב-תחתון, צינור פוליפרופילן (cytometry זרימה) ולשמור על דגימות על קרח, בחושך.
- להפעיל את המכונה FACS, לבצע הסטנדרטי הגדר שימוש זרבובית 100 מיקרומטר, לבצע את עיכוב שחרור ולהבטיח זרם יציב.
- לטעון את הדגימה והגדר רכישה מהירות ~ 1000 אירועים/s.
- להתאים FSC, האס, APC (אל-PRO-3) ואת המתחים FITC (A5) ומקם את האירועים בתוך העלילות FACS כדי להבטיח אוכלוסיות ניתן להפריד בבירור.
- שיא אירועים 20,000.
- הגדרת אסטרטגיה חסימה כמו חלק 4.
- בפריסה של מיון, הוסף את השער ApoBD הסופי האוכלוסייה המיון הרצויה.
- להתחיל רכישת המדגם ולבצע מעין מבחן על ידי איסוף 5,000-10,000 ApoBDs לתוך צינור חדש המכיל ~ 250 µL FACS מאגר.
- ביצוע מערכת סומק בחזרה וממוינות עומס ApoBDs.
- לרכוש ולתעד בדיקה-מיון ApoBDs.
- בדוק הטוהר ApoBD ~ 99% על-ידי השוואת FSC (ציר y) לעומת A5 (אירועי ציר x).
הערה: A5 מכתים עשויה להפחית מעט בעת מחדש ניתוח דגימות בשל הלבנת לייזר. - ברגע טוהר גבוהה מושגת, לטעון את הדוגמה הראשונה ולהמשיך מיון עד התקבל המספר הרצוי של ApoBDs.
הערה: אם יש צורך, מיון כפול יכול להתבצע לבודד בו זמנית ApoCells ו- ApoBDs.
הערה: בעת מיון על פני תקופה ארוכה של זמן, אנו ממליצים המקננת הצינור אוסף ב 4 º C. - לאחר מיון תושלם, לאסוף חלק קטן של פוסט-מיון ApoBDs, פוסט-למיין ApoCells, Untreated ו WAS לאמת אפופטוזיס, לאשר פוסט-מיון טוהר.
הערה: למרות הבדיקה-מיון וטוהר פוסט-מיון כדאי לא שונים באופן משמעותי, זה מבוסס על הגדרות זרם ועל יציבות.
3. ApoBD בידוד באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית
- Centrifuge המדגם אפופטוטיים להיפגע הנותרים ב g x 300 למשך 10 דקות.
- לאסוף את תגובת שיקוע, עוזב µL ~ 500 כדי להימנע מהפרעה בגדר תא, ומוסיפים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- להסיר את µL 500 הנותרים, resuspend בגדר תא ב- 2 מ של PBS 1 x (זה מייצג את 'השבר מועשר ApoCell'.
- Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו במשך 20 דקות ב 3000 g.
- בדוק אם גלולה, הסר בזהירות את תגובת שיקוע (תגובת שיקוע עשויים להכיל שלפוחית קטנה חוץ-תאית כולל שלפוחיות זעירות, exosomes).
- Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS 1 x (זה מייצג את השבר 'מועשר ApoBD')
- לאסוף 100 µL של כל Viable, WAS, מועשר ApoCell, ודוגמאות ApoBD מועשר ב חדש עגול-תחתון, שפופרת פוליסטירן (cytometry זרימה).
- להוסיף 100 µL של כתם המכיל 2 x A5 מאגר מחייב בטחונות A5-FITC, 1:1,000 אל-PRO-3
- דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בחושך.
- לנתח דגימות ידי cytometry זרימה, באמצעות אסטרטגיה המגביל כמתואר לעיל כדי לאמת את אינדוקציה מוצלחת של אפופטוזיס וטוהר של השבר מועשר ApoBD.
4. לזרום Cytometry Gating אסטרטגיה
- מגרש אל-PRO-3 (ציר y) נגד FSC (ציר x) להפריד (אל-PRO-3גבוהה) עם נמק תאי כל שאינו permeabilized אירועים אחרים (אל-PRO-3בינוני/נמוך).
- בחר כל האירועים שאינם permeabilized, עלילה האס נגד A5. שער שתי האוכלוסיות לרבות האוכלוסייה 1 (P1), האסבינוני/גבוה, התאיםנמוך/ביניים A5 והאוכלוסיה 2 (P2), כל האירועים האחרים.
- מ- P2, מגרש אל-PRO-3 נגד A5 ובחר A5 אירועיםבינוני/גבוה כדי לא לכלול את כל שאריות תאים.
- בחר כל האירועים חיובי A5, מגרש FSC נגד A5. להפריד בין ApoBDs (FSCנמוך) לבין ApoCells (FSCביניים/גבוהה).
הערה: כאשר gating ApoBDs ApoBD בידוד באמצעות הגישה מבוססת-FACS, אנו ממליצים על צעד סופי על-ידי בחירת ApoBDs, השוואה בין אל-PRO-3 ל A5 ובחירה כל האירועים. פעולה זו מבטיחה כי השער המיון הסופי משתמש זריחה במקום פרמטרים FSC/האס. - לניתוח תא קיימא, בחר P1 ולבצע לאחד שתי אסטרטגיות חסימה. לניתוח כללי תא קיימא, מגרש FSC נגד A5, לבחור את כל התאיםבינוני/גבוה FSC, ולכן הסרת שאריות תאים הנותרים. לחלופין, עבור ניתוח מעמיק, התאים קיימא ניתן להפריד בין A5– ApoCells מוקדם ידי אל-PRO-3 נגד FSC. בחר אל-PRO-3נמוך,בינוני/גבוה FSC התאים קיימא, אל-PRO-3ביניים, FSCבינוני/גבוה A5– ApoCells המוקדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך שתואר כאן, אפופטוזיס מונוציט THP-1 היה המושרה, ApoBDs היו זוהה, מבודדים באמצעות או מבוסס-FACS או גישה דיפרנציאלית צנטריפוגה (איור 1). ראשית, אפופטוזיס היה המושרה על ידי הקרנת UV, דגימות נאספו לאחר 2-3 h של דגירה כאשר תאים הציג אפופטוטיים להיפגע מורפולוגיות, כולל blebbing, מוות ממברנה תיתכן היווצרות הדור של ApoBDs6. שיטה cytometry זרימה אל-PRO-3, מבוסס על A5 נעשה שימוש כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס מונוציט ויצירת ApoBD על-ידי הפרדת התאים קיימא, תאים עם נמק, מוקדם ApoCells, ApoCells, ApoBDs, פסולת (איור 2). יחדיו, ניתוח cytometry זרימה ציין כי תוצאות טיפול UV ~ 20% ApoCells (איור 3).
מונוציט THP-1 ApoBDs היו אז מבודד את WAS באמצעות שתי גישות. ראשית, הדגימות היו מוכנים טוהר גבוהה גישה המבוססות על FACS, שבו רק צעד בודד צנטריפוגה מחויבת הצניפה המדגם כולו אפופטוטיים להיפגע לפני צביעת ו FACS. שיטה זו מתאימה עבור מבחני פונקציונלי כאשר באופן משמעותי טוהר גבוהה מדגם נדרש (לדוגמה, לניתוח qPCR), כאשר נדרש מספר מסוים של ApoBDs או בעת רכישת תא ApoBDs ייחודיים לסוג מתוך מדגם מורכבים. באמצעות מתודולוגיה זו, ApoBDs היו מבודדים לטוהר ~ 99% (איור 4).
בשלב הבא, מונוציט THP-1 ApoBDs היו גם מבודד דרך שני שלבים, גישה דיפרנציאלית צנטריפוגה. השלב הראשון כולל את ניתוקה של התאים קיימא, ApoCells ותאי נמק. השלב השני כולל ההפרדה של ApoBDs גדול יותר מן שלפוחית קטנה חוץ-תאית כגון שלפוחיות זעירות, exosomes, אשר אינם מסוגלים להיות מגורען, ב-3,000 x cytometry זרימה g. בוצע ואז לאשר אפופטוזיס וטוהר מדגם ApoBD, הפגינו דוגמה מועשר ApoBD המכיל ~ 97% ApoBDs (איור 4). זה מציג שיטה מהירה ויעילה כדי לבודד ApoBD לטוהר גבוה יחסית, מתאים כאשר לטיהור ApoBDs מדגימות להכיל סוג תא בודד.
איור 1 . תרשים סכמטי של בידוד ApoBD דרך גם גישה דיפרנציאלית או מבוססי FACS צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . Flow cytometry gating אסטרטגיה. שש קבוצות משנה תא/חלקיקים (לרבות התאים קיימא, A5– ApoCells מוקדם, A5+ ApoCells, תאים עם נמק, ApoBDs ופסולת) מזוהה ומשמש לבחירת ApoBD לבידוד מבוססי FACS. (א) ממברנות התאים נמק של permeabilised מופרדים מאירועים שאינם permeabilised. (ב) A5נמוך-בינוני, האסנמוך-גבוה תאים מופרדים A5נמוך-גבוה אירועים. (בי. אני צריך) בניתוח עומק, התאים קיימאנמוך אל-פור-3 ניתן להפריד בין אל-PRO-3ביניים A5– ApoCells המוקדמות. (b.ii) לחלופין, בעת חישוב פשוט ApoBD טוהר, התאים קיימא ניתן להפריד מאירועיםנמוך FSC. (ג) A5 פסולתנמוכה אינן נכללות. (ד) FSCבינוני/גבוה ApoCells מופרדים FSCנמוך ApoBDs. (ה) כל A5-ל-PRO-3בינוני/גבוה ApoBDs נבחרים למיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . אימות של אפופטוזיס מונוציט THP-1- ניתוח cytometry זרימה של monocytes THP-1 אינו מטופל או מוקרן UV בוצע כדי לקבוע את הרמות של התאים קיימא, A5– ApoCells מוקדם, A5+ ApoCells, תאים עם נמק.
איור 4 . טיהור של THP-1 מונוציט נגזר ApoBDs. מבודדים THP-1 נגזר מונוציט ApoBDs דרך גם בגישה צנטריפוגה דיפרנציאלית או מבוססי FACS מבוסס, מציג את העשרת של ApoBDs התאים קיימא, ApoCells, תאים עם נמק בוצעה אנליזה cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז התיאור שלו בתחילת שנות החמישים, השדה של אפופטוזיס התקדם במידה ניכרת, להפוך אזור מחקרים בולטים. למרות האינטרס הרחב המאמצים, היבטים מסוימים של אפופטוזיס, בפרט היווצרות של ApoBDs, לא טוב נחקרו בשל היעדר מתודולוגיות המתאים. אלה כוללים בעיקר המגבלה תוך מעקב אחר התקדמות אפופטוזיס, היווצרות ApoBD בו זמנית באמצעות cytometry זרימה המסורתי של ניתוח A5/PI הזיהומים ApoBD בידוד. לאחרונה פותחו גישות כדי לטפל אלה חסרונות מתודולוגיים.
הגישה החדשה שלנו זרימה מבוססי cytometry האנליטית מאפשר ApoBDs, אשר לעיתים קרובות מתעלמת בשיטות מסורתיות אנליטית, יזוהו לכמת20. בנוסף, זה ששינה לזרום cytometry שיטה, עם השימוש של הכתם אל-PRO-3, מגלה A5 נוספים– אפופטוטיים להיפגע שלב מוקדם, ומכאן עיבוד תיחום טוב יותר של אפופטוזיס התקדמות20. כמקובל, ApoBD זיהוי יש נתמכה מבוססת תמונה טכניקות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, היסטולוגיה, ואילו השיטה שלנו cytometry זרימה מספקת גישה תפוקה גבוהה כדי quantitate ApoBD גיבוש. למרות לכאורה מורכבים, ההליך קל יחסית ודורש רק ריאגנטים זמינים מסחרית, cytometer של זרימה בסיסי. כימות מדויק של ApoBDs וזיהוי לוגי לקדם הידע של מוות תא microenvironment כי מכתיבה התא סיווג תגובות אימונולוגי. למעשה, על-ידי התאמת שיטת cytometry זרימה המתוארים במסמך זה עם כתמי ספציפיים אברון, לאחרונה דיווחנו ההתפלגות הטרוגנית של תוכן סלולרי ApoBDs24. ממצאים אלה מראים כי ApoBDs יכולים להיות מסווגים לערכות משנה שונים, משנה ApoBD עשוי להפגין פונקציות שונות.
שלנו לאחרונה שפיתחו שיטות בידוד ApoBD יתרום גם להתקדמות בתחום של שלפוחית חוץ-תאית. באופן מסורתי, שיטות צנטריפוגה דיפרנציאלי ApoBD בידוד עשוי לכלול כמות משמעותית של תאים קטנים יותר, אשר עשויים להשפיע על מבחני פונקציונלי במורד הזרם. עם זאת, אותנו מתקרבים שהשתנו צנטריפוגה דיפרנציאלי יכול לשמש כדי לבודד ApoBDs 97% לטוהר. למרות טוהר גבוהה יכולה להיות מושגת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, שיטה כזו בהכרח מתאים לבידוד ApoBDs מדגימות מורכבים. לעומת זאת, השיטה שלנו מבוססת-FACS יכול להעשיר ApoBDs 99% לטוהר, והיא מבוססת על מאפייניו הביולוגיים הייחודיים של ApoBDs כולל גודל החלקיקים, צפיפות, חשיפה PtdSer, במקום להסתמך אך ורק על צפיפות החלקיקים. גישה זו יש גם הפוטנציאל לזיהוי ולבידוד ApoBDs ממוצא תאים שונים באמצעות סמנים ייחודיים לסוג התא24בו זמנית. למרות הליך FACS ארוך שיכול להימשך 1-8 h תלוי בכמות ApoBDs הנדרשים, בידוד ApoBD מדויק וניתוח במורד הזרם הבאים תאפשר ייחוס ישיר המאפיינים המולקולריים ותפקידי פונקציונלי של ApoBDs. בשביל כזה מתודולוגיות, זה קריטי כי גישות בידוד ApoBD נמצאים ביחד עם טכניקות כגון cytometry זרימה (כמתואר כאן) כדי לאמת את הן את אינדוקציה של אפופטוזיס והטוהר של המדגם מועשר ApoBD. יתר על כן, FACS ראוי להגדיר הוא חיוני ApoBD בידוד באמצעות הגישה מבוססת-FACS, כמו זרם לא יציב או עיכוב שחרור שבוצעו באופן שגוי עלול לגרום טוהר נמוך.
באופן קולקטיבי, לנו יש המתוארים מתודולוגיות מתקדמות עבור לכימות אפופטוזיס, ApoBD זיהוי ובידוד של ApoBDs מאוד טהור. הגישה שלנו עשוי לספק כלי חדש ללמוד את תהליך פירוק של תאים אפופטוטיים להיפגע ואף להבהיר את התפקיד של תהליך זה בהגדרות המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
נארגן את זה נתמך על ידי מענקים הלאומי לבריאות ואת המועצה למחקר רפואי (GNT1125033 ו- GNT1140187) מועצת המחקר האוסטרלי (DP170103790) I.K.H.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | - | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
