Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

उच्च शुद्धता के लिए अपोप्तोटिक निकायों का पता लगाना और अलगाव

Published: August 12, 2018 doi: 10.3791/58317
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

Summary

प्रवाह cytometry या विभेदक केंद्रापसारक का उपयोग कर एक कार्यप्रवाह उच्च शुद्धता के लिए एक अपोप्तोटिक नमूना से अपोप्तोटिक निकायों का पता लगाने, यों और अलग करने के लिए विकसित की है ।

Abstract

अपोप्तोटिक निकायों (ApoBDs), microvesicles और exosomes extracellular पुटिका परिवार के प्रमुख सदस्य हैं, ApoBDs सबसे बड़ा प्रकार में से एक होने के साथ । यह प्रस्ताव किया गया है कि ApoBDs सेल क्लीयरेंस के साथ-साथ सेलुलर संचार के माध्यम से भी तस्करी के अणुओं को सहायता कर सकते हैं । पारंपरिक पहचान और ApoBDs के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण अक्सर सही ठहराव और कम नमूना शुद्धता की कमी से सीमित हैं । यहाँ, हम apoptosis की प्रेरण की पुष्टि करने के लिए एक कार्यप्रवाह का वर्णन, ApoBD गठन मान्य है, और उच्च शुद्धता के लिए ApoBDs को अलग. हम भी रूपरेखा और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और विभेदक केंद्रापसारक आधारित दृष्टिकोण ApoBDs को अलग करने के लिए तुलना करेंगे । इसके अलावा, पृथक ApoBDs की पवित्रता की पुष्टि की जाएगी एक पहले से स्थापित प्रवाह cytometry आधारित धुंधला और विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग कर । एक साथ ले लिया, वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर, THP-1 monocyte apoptosis और अपोप्तोटिक कोशिका विधानसभा प्रेरित और मान्य किया गया था, और ApoBD से उत्पन्न-1 THP 97-99% की शुद्धता के लिए अलग-थलग थे.

Introduction

Apoptosis, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का एक अच्छी तरह से अध्ययन फार्म, शारीरिक homeostasis बनाए रखने और मानव शरीर के भीतर संभावित हानिकारक कोशिकाओं को हटाने के लिए आवश्यक है1. apoptosis की प्रेरण के बाद, अपोप्तोटिक कोशिकाओं (ApoCells) रूपात्मक परिवर्तन की एक श्रृंखला से गुजरना और छोटे झिल्ली में जुदा कर सकते हैं-बंधे बुलबुले ApoBDs । कुल मिलाकर, इस प्रक्रिया को अपोप्तोटिक सेल असेंबली के रूप में जाना जाता है और आकृति विज्ञान2,3के आधार पर 3 अलग चरणों में विभाजित किया जा सकता है । चरण 1 (प्लाज्मा झिल्ली blebbing) blebs4,5के रूप में जाना जाता सेल सतह पर गुब्बारे की तरह संरचनाओं के गठन की विशेषता है । चरण 2 (अपोप्तोटिक दखल गठन) apoptopodia, मनके-apoptopodia और microtubule spikes के रूप में लंबी झिल्ली की दखलंदाजी के गठन में शामिल6,7,8। अंत में, चरण 3 (ApoBD गठन) अपोप्तोटिक की दखलंदाजी और/या ApoCells6,9उत्पंन करने के लिए विखंडन भी शामिल है । पिछले निष्कर्षों अपोप्तोटिक सेल की मंजूरी और मध्यस्थता सेलुलर संचार सहायता में ApoBDs की भूमिका का सुझाव दिया है । उदाहरण के लिए, यह प्रस्तावित है कि ApoBDs में एक ApoCell के विखंडन ' छोटे काटने के आकार ' टुकड़े कि आसानी से फ़ैगोसाइट2,10,11आसपास के द्वारा हटाया जा सकता है उत्पंन कर सकते हैं । इसके अलावा, ApoBDs डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के रूप में इस तरह के अणुओं की एक श्रृंखला बंदरगाह हो सकता है, जो सेल सेल संचार की सुविधा के लिए आसपास के कोशिकाओं को तस्करी हो सकता है12,13,14. कार्यात्मक रूप से इन प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए, यह सहित तीन प्रमुख मापदंडों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है (i) apoptosis प्रेरण और ApoBD गठन के सत्यापन, (ii) ApoBDs के अलगाव, और (iii) ApoBD शुद्धता की पुष्टि.

पहले, प्रवाह cytometry और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित कई तरीकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है apoptosis और ApoBDs15,16,17,18. हालांकि, ApoBD डिटेक्शन और ठहराव अक्सर मुश्किल या अनदेखी कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सबसे नियमित रूप से इस्तेमाल किया प्रवाह cytometry-आधारित apoptosis परख annexin V (A5, एक प्रोटीन है कि ' बाहरी ' खाने के बांध मुझे संकेत phosphatidylserine (PtdSer)) और न्यूक्लिक एसिड दाग propidium आयोडाइड (PI) को रोजगार19। हालांकि, इस सार्वभौमिक दाग संयोजन का उपयोग करके, विश्लेषण मानता है कि वहां केवल तीन प्रकार के सेल सबसेट (व्यवहार्य कोशिकाओं, ApoCells और गल कोशिकाओं) नमूने में हैं । इसके अलावा, हालांकि apoptosis, प्रवाह cytometry परख और अनुवर्ती डेटा विश्लेषण के लिए कई शोधकर्ताओं ने एक स्वर्ण मानक "के रूप में माना जाता है अक्सर FSC/एसएससीमध्यवर्ती-उच्च घटनाओं का चयन एक प्रारंभिक गेटिंग कदम के माध्यम से ApoBDs शामिल नहीं है । इसलिए, हम हाल ही में एक उपंयास प्रवाह cytometry परख A5 का उपयोग कर विकसित की है और प्रो-3, एक और न्यूक्लिक दाग है कि चुनिंदा caspase द्वारा लिया जा सकता है 3/7 सक्रिय pannexin 1 (PANX1) चैनल7,20। caspase 3-प्रेरित PANX1 सक्रियण के रूप में apoptosis के प्रारंभिक चरण में PtdSer जोखिम से पहले, करने के लिए-प्रो 3 विभेदक दाग अपोप्तोटिक और गल कोशिकाओं । इसके अलावा, हमारे उपंयास गेटिंग रणनीति के साथ संयुक्त इस दृष्टिकोण डेटा विश्लेषण के दौरान सभी अधिग्रहीत घटनाओं और एक परिणाम के रूप में शामिल हैं, छह सेल/कण सबसेट सहित, की पहचान कर रहे हैं: (i) व्यवहार्य कोशिकाओं (FSC/SSCमध्यवर्ती/उच्च, A5कम , टू-प्रो-3कम), (ii) a5- अर्ली ApoCells (FSC/sscइंटरमीडिएट/हाई, a5कम, टू-प्रो-3मध्यवर्ती), (iii) a5+ ApoCells (FSC/sscमध्यवर्ती/उच्च, a5उच्च , को-प्रो-3मध्यवर्ती), (iv) गल कोशिकाओं या देर से ApoCells (FSC/एसएससीइंटरमीडिएट/हाई,A5 हाई, टू-प्रो-3उच्च), (v) ApoBDs (FSC/एसएससीकम, A5मध्यवर्ती, टू-प्रो-3कम /intermediate), और (vi) मलबे (FSC/एसएससीकम, A5कम, टू-प्रो-3कम)20. हमारे दृष्टिकोण सभी कोशिकाओं का विश्लेषण के महत्व पर बल देता है/कण सबसेट और, अधिक महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं और मलबे से ApoBDs के जुदाई20। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एक कुशल तकनीक को प्रदर्शित करता है apoptosis और ApoBD गठन एक साथ की प्रेरण मांय है ।

परंपरागत रूप से, ApoBDs अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण जिससे ApoBDs कोशिकाओं या अंय extracellular बुलबुले से अलग किया जा सकता है घनत्व के आधार पर विभिंन प्रकार के माध्यम से अलग किया गया है । हालांकि, इस तरह के केंद्रापसारक तरीकों अक्सर कम ApoBD शुद्धता, एक ठहराव कदम की कमी के लिए नमूना शुद्धता की पुष्टि के द्वारा सीमित हैं, और/या अलग सेल प्रकार-विशिष्ट ApoBDs17,21,22करने के लिए असमर्थता । इसलिए, हम हाल ही में दो दृष्टिकोण, एक FACS आधारित है और एक नया अवकलन केंद्रापसारक आधारित दृष्टिकोण है जो हमारे पहले की स्थापना की प्रवाह cytometry विधि के साथ युग्मित किया जा सकता है apoptosis और नमूना शुद्धता23की प्रेरण मांय के आधार पर विकसित की है । हमारे FACS आधारित दृष्टिकोण के माध्यम ApoBD अलगाव ९९% शुद्धता के लिए ApoBDs को समृद्ध कर सकते हैं, और सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी की एक किस्म के साथ युग्मित किया जा सकता है मिश्रित कोशिका आबादी से ApoBDs अलग, ऊतक के नमूने और शारीरिक तरल पदार्थ23। इसके अलावा, हमारे संशोधित अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण एक कुशल विधि को प्रदर्शित करता है ApoBDs को अलग > 90% शुद्धता23।

इस पत्र में, हम विस्तार से वर्णन हमारे प्रयोगात्मक प्रक्रिया apoptosis प्रेरण मांय करने के लिए, और पता लगाने और ApoBD गठन मात्रा । FACS-आधारित और विभेदक केंद्रापसारक-आधारित विधियों का उपयोग कर ApoBD आइसोलेशन कार्यप्रवाह भी सविस्तार और तुलना की जाती है । प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है कि वर्णित पद्धति एक प्रभावी भविष्य ApoBD अध्ययन के लिए अत्याधुनिक उपकरण प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Apoptosis की प्रेरण

  1. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल नमूना केंद्रापसारक और supernatant त्यागें किसी भी पूर्व मौजूदा सेल मलबे को हटाने के लिए ।
    नोट: अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग करते समय, अग्रिम में बीज कोशिकाओं और apoptosis प्रेरण से पहले 1x फॉस्फेट-बफर समाधान (पंजाब) के साथ धोने ।
  2. कक्ष संख्या निर्धारित करें और कक्षों को संग्रहीत ।
    नोट: परख के बाद अलगाव पर निर्भर करता है, हम एक प्रारंभिक सेल की संख्या की सिफारिश की एक शुरुआत कक्ष नंबर से कम 1 x 107 कोशिकाओं ।
  3. पूर्ण मीडिया में resuspend (संबंधित मध्यम 10% (vol/) भ्रूण बछड़ा सीरम, ५० IU/एमएल पेनिसिलिन, ५० µ g/एमएल streptomycin मिश्रण) 1 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए/
  4. Aliquot ~ 2 x 106 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 9 कोशिकाओं ।
  5. apoptosis प्रेरित करने के लिए, प्लेट ढक्कन और विकीर्ण कोशिकाओं पर १५० माइकल/सेमी2 एक यूवी irradiator का उपयोग कर निकालें । यह लगभग 30-60 एस ले जाना चाहिए ।
    नोट: विकिरण से पहले, यह सुनिश्चित करें कि ~ ०.५ x 106 कोशिकाओं ' अनुपचारित ' सेल नियंत्रण के लिए बनाए रखा जाता है ।
    नोट: Apoptosis भी विरोधी के रूप में अंय तरीकों से प्रेरित किया जा सकता है-फास या सीरम भुखमरी6।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन, 5% 2-8 घंटे के लिए सह2 , सेल लाइन पर निर्भर करता है ।
  7. एक बेंच शीर्ष प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, अपोप्तोटिक morphologies की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं कल्पना, जैसे blebbing, apoptopodia गठन, और ApoBD गठन.
    नोट: 40X आवर्धन पर्याप्त है
  8. एक P1000 पिपेट का प्रयोग, पिपेट और अपोप्तोटिक नमूने इकट्ठा ।
  9. 1x पंजाबियों के साथ थाली धो और शेष नमूना के साथ गठबंधन करने के लिए अधिकतम उपज सुनिश्चित करते हैं ।
  10. ' पूरे अपोप्तोटिक नमूना ' (was) नियंत्रण के लिए ~ 1/10वें लीजिए.
  11. ' अनुपचारित ' नमूना लीजिए ।
  12. दोनों था और अनुपचारित नमूने के लिए ३,००० x g पर 6 मिनट के लिए ।
  13. 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में resuspend और बर्फ पर अलग सेट ।
  14. ApoBD आइसोलेशन के लिए, या तो चरण 2 या 3 शेष अपोप्तोटिक नमूने के साथ करने के लिए जारी रखें ।

2. FACS के जरिए ApoBD अलगाव

  1. 6 मिनट के लिए ३,००० x g पर पूरे नमूना केंद्रापसारक ।
  2. गोली को बाधित किए बिना supernatant के बहुमत को हटा दें ।
  3. एक धुंधला समाधान में resuspend 1x a5 बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर, A5-FITC के ७५ µ एल, और 2 µ एल के लिए प्रो-3 प्रति 1x107 कोशिकाओं ।
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में मशीन नमूना ।
  5. 1x A5 बाध्यकारी बफर के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें और 6 मिनट के लिए ३,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक अतिरिक्त दाग को दूर करने के लिए ।
    नोट: मिश्रित कोशिका आबादी या ऊतक के नमूनों के लिए, एक एंटीबॉडी धुंधला कदम सेल प्रकार 1x A5 बाध्यकारी बफर में विशिष्ट मार्करों और 20 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी (या निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) ३,००० x g के लिए 6 के लिए के रूप में से पहले एक संयोजन का उपयोग करते हुए प्रदर्शन न्यूनतम.
  6. 1x107 कोशिकाओं प्रति FACS बफर के 3 मिलीलीटर (1x पंजाब, 1x A5 बाध्यकारी बफर, 10% FSC, 2 mM EDTA) में नमूना गोली resuspend ।
  7. एक दौर में एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर-नीचे, (फ्लो cytometry) ट्यूब और बर्फ पर और अंधेरे में नमूने रखने के लिए ।
  8. FACS मशीन पर बारी और एक १०० µm नोजल का उपयोग कर मानक सेट अप प्रदर्शन, ड्रॉप देरी प्रदर्शन, और एक स्थिर धारा सुनिश्चित करते हैं ।
  9. नमूना लोड और अधिग्रहण गति सेट करने के लिए ~ १००० घटनाओं/
  10. समायोजित FSC, एसएससी, APC (करने के लिए प्रो-3) और FITC (A5) वोल्टेज और FACS भूखंडों के भीतर की स्थिति की घटनाओं को सुनिश्चित करने के लिए आबादी स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है ।
  11. रिकॉर्ड २०,००० ईवेंट्स ।
  12. 4 भाग के रूप में एक गेटिंग रणनीति सेट करें ।
  13. सॉर्ट लेआउट में, वांछित छंटाई जनसंख्या के रूप में अंतिम ApoBD गेट जोड़ें ।
  14. नमूना प्राप्त करना शुरू करें और एक नई ट्यूब में 5000-10000 ApoBDs एकत्रित करके एक परीक्षण तरह प्रदर्शन ~ २५० µ l FACS बफर ।
  15. एक सिस्टम वापस फ्लश और लोड ApoBDs सॉर्ट करें ।
  16. मोल और रिकॉर्ड टेस्ट-क्रमबद्ध ApoBDs ।
  17. जांच करें कि ApoBD शुद्धता ~ ९९% की तुलना FSC (y-अक्ष) A5 बनाम (x-अक्ष घटनाओं) है ।
    नोट: A5 धुंधला थोड़ा कम हो सकता है जब फिर से लेजर ब्लीचिंग के कारण नमूनों का विश्लेषण ।
  18. एक बार उच्च शुद्धता हासिल की है, मूल नमूना लोड और ApoBDs की वांछित संख्या प्राप्त किया गया है जब तक छंटाई जारी ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, दोहरी छंटाई एक साथ ApoCells और ApoBDs को अलग करने के लिए किया जा सकता है ।
    नोट: समय की एक लंबी अवधि के दौरान छंटाई, हम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह ट्यूब की सलाह देते हैं ।
  19. एक बार छंटाई पूरा हो गया है, पोस्ट के एक छोटे से हिस्से को इकट्ठा तरह ApoBDs, पोस्ट तरह ApoCells, अनुपचारित, और apoptosis मांय और बाद की तरह पवित्रता की पुष्टि थी ।
    नोट: यद्यपि परीक्षण-सॉर्ट करें और पोस्ट-सॉर्ट शुद्धता महत्वपूर्ण रूप से अलग नहीं होना चाहिए, यह स्ट्रीम सेटिंग्स और स्थिरता पर आधारित है ।

विभेदक केंद्रापसारक के माध्यम से 3. ApoBD अलगाव

  1. 10 मिनट के लिए ३०० x g पर शेष अपोप्तोटिक नमूना केंद्रापसारक ।
  2. supernatant लीजिए, छोड़ने ~ ५०० µ एल सेल गोली बाधित से बचने के लिए, और एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जोड़ें ।
  3. शेष ५०० µ एल निकालें और 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (यह ' ApoCell-समृद्ध अंश ' का प्रतिनिधित्व करता है ।
  4. ३,००० gपर 20 मिनट के लिए एकत्र supernatant केंद्रापसारक
  5. एक गोली के लिए जांच करें और ध्यान से supernatant को दूर (supernatant microvesicles और exosomes सहित छोटे extracellular बुलबुले शामिल हो सकते हैं) ।
  6. 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend (यह ' ApoBD-समृद्ध अंश ' का प्रतिनिधित्व करता है)
  7. प्रत्येक व्यवहार्य के १०० µ एल लीजिए, था, ApoCell-समृद्ध, और एक नए दौर में ApoBD-समृद्ध नमूनों-नीचे, polystyrene (फ्लो cytometry) ट्यूब.
  8. 2x a5 बाध्यकारी बफर, 1:100 a5-FITC युक्त दाग के १०० µ एल जोड़ें, और 1:1000 से-PRO-3
  9. अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  10. apoptosis और ApoBD-समृद्ध अंश की शुद्धता की सफल प्रेरण को मान्य करने के लिए ऊपर वर्णित के रूप में गेटिंग रणनीति का उपयोग कर, प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण ।

4. फ्लो Cytometry गेटिंग स्ट्रैटेजी

  1. प्लॉट करने के लिए-प्रो 3 (y-अक्ष) FSC (x-अक्ष) के खिलाफ अलग (करने के लिए-प्रो-3उच्च) अंय सभी गैर permeabilized घटनाओं से (के लिए-प्रो-3कम मध्यवर्ती) ।
  2. A5 के विरुद्ध सभी नॉन-permeabilized ईवेंट्स और प्लाट एसएससी का चयन करें । गेट दो आबादी सहित जनसंख्या 1 (P1), एसएससीमध्यवर्ती/उच्च, A5कम/मध्यवर्ती कोशिकाओं और जनसंख्या 2 (P2), अंय सभी घटनाओं ।
  3. P2 से, प्लॉट करने के लिए-प्रो 3 a5 के खिलाफ और सभी सेल मलबे को बाहर करने के लिए a5मध्यवर्ती/
  4. सभी a5 सकारात्मक घटनाओं और a5 के खिलाफ साजिश FSC का चयन करें । पृथक ApoBDs (FSCकम) से ApoCells (FSCमध्यवर्ती/
    नोट: जब FACS आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से ApoBD अलगाव के लिए गेटिंग ApoBDs, हम ApoBDs का चयन और करने के लिए-प्रो 3 A5 और सभी घटनाओं का चयन करने की तुलना द्वारा एक अंतिम कदम की सिफारिश । यह सुनिश्चित करता है कि अंतिम छंटाई फाटक प्रतिदीप्ति बजाय FSC/
  5. व्यवहार्य सेल विश्लेषण के लिए, P1 का चयन करें और दो गेटिंग रणनीतियों में से एक प्रदर्शन । सामांय व्यवहार्य सेल विश्लेषण के लिए, A5 के खिलाफ साजिश FSC और सभी FSCमध्यवर्ती/उच्च कोशिकाओं का चयन करें, इसलिए शेष सेल मलबे को हटाने । वैकल्पिक रूप से, में गहराई से विश्लेषण के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं FSC के खिलाफ-प्रो-3 के लिए साजिश रचने के द्वारा A5- जल्दी ApoCells से अलग किया जा सकता है । का चयन करने के लिए-प्रो 3कम, FSCमध्यवर्ती/उच्च व्यवहार्य कोशिकाओं और करने के लिए प्रो-3मध्यवर्ती, FSCमध्यवर्ती/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहां उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करना, THP-1 monocyte apoptosis प्रेरित और ApoBDs का पता लगाया गया था और या तो एक FACS आधारित या एक अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण (चित्रा 1) के माध्यम से अलग । सबसे पहले, apoptosis यूवी विकिरण और नमूनों द्वारा प्रेरित किया गया था 2-3 मशीन के एच जब कोशिकाओं blebbing, अपोप्तोटिक झिल्ली दखल गठन और6ApoBDs की पीढ़ी सहित अपोप्तोटिक morphologies, प्रदर्शन के बाद एकत्र किए गए । एक से प्रो-3 और A5-आधारित प्रवाह cytometry विधि व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करके monocyte apoptosis और ApoBD गठन की प्रेरण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, गल कोशिकाओं, जल्दी ApoCells, ApoCells, ApoBDs और मलबे (चित्रा 2). एक साथ ले लिया, प्रवाह cytometry विश्लेषण संकेत दिया कि यूवी उपचार में परिणाम ~ 20% ApoCells (चित्रा 3) ।

THP-१ monocyte ApoBDs तो दो दृष्टिकोणों के जरिए छात्रसंघ से अलग-थलग पड़ गए. सबसे पहले, नमूने एक उच्च शुद्धता FACS के लिए तैयार किया गया दृष्टिकोण आधारित है जहां केवल एक ही केंद्रापसारक कदम धुंधला और FACS से पहले पूरे अपोप्तोटिक नमूना गोली करने के लिए आवश्यक है । इस विधि कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त है जब काफी उच्च नमूना शुद्धता (उदाहरण के लिए, qPCR विश्लेषण के लिए) की आवश्यकता है, जब ApoBDs की एक विशिष्ट संख्या की आवश्यकता है, या जब एक जटिल नमूना से सेल प्रकार-विशिष्ट ApoBDs प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इस पद्धति का प्रयोग, ApoBDs ~ ९९% शुद्धता (चित्रा 4) को अलग किया गया ।

अगले, THP-1 monocyte ApoBDs भी एक दो कदम, अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण के माध्यम से अलग थे । पहला कदम व्यवहार्य कोशिकाओं के अलगाव, ApoCells और गल कोशिकाओं शामिल हैं । दूसरे चरण में microvesicles और exosomes, जो ३,००० x g. प्रवाह cytometry में गोली नहीं कर रहे है तो apoptosis प्रेरण और ApoBD नमूना शुद्धता की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया गया था के रूप में छोटे extracellular बुलबुले से बड़ा ApoBDs की जुदाई भी शामिल है और एक ApoBD-समृद्ध नमूना युक्त ~ ९७% ApoBDs (चित्रा 4) का प्रदर्शन किया । यह अपेक्षाकृत उच्च शुद्धता के लिए ApoBD को अलग करने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तकनीक प्रस्तुत करता है और एक एकल कोशिका प्रकार वाले नमूनों से ApoBDs शुद्ध जब उपयुक्त है.

Figure 1
चित्रा 1 . या तो एक FACS आधारित या अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण के माध्यम से ApoBD अलगाव की योजनाबद्ध आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . प्रवाह cytometry गेटिंग रणनीति । छह सेल/कण सबसेट (व्यवहार्य कोशिकाओं सहित, a5- अर्ली ApoCells, a5+ ApoCells, गल कोशिकाओं, ApoBDs और मलबे) की पहचान की और FACS-आधारित अलगाव के लिए ApoBD का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । (क) झिल्ली permeabilised गल कोशिकाओं को गैर-permeabilised घटनाओं से पृथक किया जाता है. (ख) a5कम-मध्यवर्ती, एसएससीकम उच्च कोशिकाओं a5कम उच्च घटनाओं से अलग कर रहे हैं. (बी. आई.) गहराई में विश्लेषण के लिए, करने के लिए---3कम व्यवहार्य कोशिकाओं को-प्रो 3मध्यवर्ती A5- जल्दी ApoCells से अलग किया जा सकता है । (ख. ii) वैकल्पिक रूप से, जब बस ApoBD शुद्धता की गणना, व्यवहार्य कोशिकाओं FSCकम घटनाओं से अलग किया जा सकता है । (ग) A5कम मलबे को बाहर रखा गया है । (घ) FSCमध्यवर्ती/उच्च ApoCells को FSCकम ApoBDs से पृथक किया जाता है. (ङ) सभी A5-से-PRO-3मध्यवर्ती/उच्च ApoBDs सॉर्टिंग के लिए चयनित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 . THP-1 monocyte apoptosis की मान् यता । अनुपचारित या यूवी-विकिरणित THP-1 monocytes के प्रवाह cytometry विश्लेषण व्यवहार्य कोशिकाओं के स्तर का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया गया था, a5- जल्दी ApoCells, a5+ ApoCells, और गल कोशिकाओं.

Figure 4
चित्र 4 . THP-१ monocyte-प्राप्त ApoBDs का शुद्धिकरण. प्रवाह cytometry विश्लेषण अलग THP-1 monocyte पर प्रदर्शन किया था-या तो एक FACS आधारित या अंतर केंद्रापसारक आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से व्युत्पंन ApoBDs, व्यवहार्य कोशिकाओं, ApoBDs और गल कोशिकाओं से ApoCells के संवर्धन दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1950 के दशक में अपनी प्रारंभिक विवरण के बाद से, apoptosis के क्षेत्र के रूप में चिह्नित किया गया है, एक प्रमुख अनुसंधान क्षेत्र बनने । व्यापक ब्याज और व्यापक प्रयासों के बावजूद, विशेष रूप से ApoBDs के गठन में apoptosis के कुछ पहलुओं, अच्छी तरह से उचित तरीके की कमी की वजह से अध्ययन नहीं किया गया है । ये विशेष रूप से ट्रैकिंग apoptosis प्रगति और ApoBD गठन एक साथ पारंपरिक प्रवाह cytometry A5/PI विश्लेषण और ApoBD अलगाव की अशुद्धियों का उपयोग करने में सीमा शामिल हैं । हमने हाल ही में इन methodological कमियों को हल करने के लिए दृष्टिकोण विकसित किया है ।

हमारे नए प्रवाह cytometry आधारित विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण ApoBDs, जो अक्सर पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग कर नजरअंदाज कर दिया जाता है की अनुमति देता है, का पता लगाया और20quantified । इसके अलावा, इस संशोधित प्रवाह cytometry विधि, के लिए दाग के उपयोग के साथ-प्रो-3, एक अतिरिक्त A5- जल्दी अपोप्तोटिक चरण का पता चलता है, इसलिए apoptosis प्रगति20के बेहतर रेखांकित प्रतिपादन । पारंपरिक रूप से, ApoBD का पता लगाने की छवि पर भारी भरोसा किया है जैसे फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रोटोकॉल के रूप में आधारित तकनीक, जबकि हमारे प्रवाह cytometry विधि quantitate ApoBD गठन के लिए एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण प्रदान करता है । हालांकि प्रतीत होता है जटिल, प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है और केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट और एक बुनियादी प्रवाह cytometer की आवश्यकता है । ApoBDs का तार्किक पता लगाना और सटीक ठहराव अपोप्तोटिक सेल microenvironment के ज्ञान को आगे करेगा जो सेल क्लियरेंस और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को तय करता है । वास्तव में, यहां युग्मन द्वारा-organelle-विशिष्ट दाग के साथ प्रवाह cytometry विधि वर्णित है, हम हाल ही में ApoBDs24में सेलुलर सामग्री के विषम वितरण की सूचना दी है । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि ApoBDs विभिंन उपसमुच्चय में वर्गीकृत किया जा सकता है और प्रत्येक ApoBD सबसेट विभिंन कार्यों प्रदर्शन कर सकते हैं ।

हमारे हाल ही में विकसित ApoBD अलगाव तकनीक भी extracellular बुलबुले के क्षेत्र में प्रगति के लिए योगदान होगा । परंपरागत रूप से, अंतर केंद्रापसारक ApoBD अलगाव के लिए इस्तेमाल किया तरीकों छोटे कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण राशि है, जो बहाव कार्यात्मक परख को प्रभावित कर सकते है शामिल हो सकते हैं । हालांकि, हमारे संशोधित अंतर केंद्रापसारक दृष्टिकोण ९७% शुद्धता के लिए ApoBDs को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि उच्च शुद्धता विभेदक केंद्रापसारक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, ऐसी विधि जटिल नमूनों से ApoBDs अलग करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । इसके विपरीत, हमारे FACS आधारित विधि ९९% शुद्धता के लिए ApoBDs को समृद्ध कर सकते हैं, और कण का आकार, दानेदार और PtdSer जोखिम सहित ApoBDs के अद्वितीय जैविक विशेषताओं पर आधारित है, बजाय केवल पार्टिकल घनत्व पर निर्भर है । इस दृष्टिकोण भी एक साथ की पहचान करने के लिए और अलग सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों का उपयोग कर24ApoBDs को अलग करने की क्षमता है । के बावजूद एक लंबा FACS प्रक्रिया है जो 1-8 की मात्रा के आधार पर ले सकता है एच आवश्यक ApoBDs, सटीक ApoBD अलगाव और बाद के बहाव विश्लेषण आणविक विशेषताओं और ApoBDs के कार्यात्मक भूमिकाओं के प्रत्यक्ष रोपण की अनुमति होगी । इस तरह के तरीके के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि ApoBD अलगाव दृष्टिकोण ऐसी प्रवाह cytometry के रूप में तकनीक के साथ युग्मित कर रहे है (के रूप में यहां उल्लिखित) को apoptosis और ApoBD की पवित्रता के प्रेरण नमूना दोनों को मांय । इसके अलावा, उचित FACS सेट अप FACS-आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से ApoBD अलगाव के लिए आवश्यक है, एक अस्थिर स्ट्रीम या गलत ढंग से प्रदर्शन ड्रॉप देरी कम पवित्रता में परिणाम हो सकता है के रूप में ।

सामूहिक रूप से, हम apoptosis प्रेरण, ApoBD का पता लगाने और अत्यधिक शुद्ध ApoBDs के अलगाव को बढ़ाता है के लिए अत्याधुनिक तरीके से रेखांकित किया है । हमारा दृष्टिकोण अपोप्तोटिक कोशिका विविधानसभा प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान कर सकता है और रोग सेटिंग्स में इस प्रक्रिया की भूमिका स्पष्ट ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (GNT1125033 और GNT1140187) और ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (DP170103790) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).

Tags

जैव रसायन अंक १३८ अपोप्तोटिक निकाय apoptosis अपोप्तोटिक कोशिका संविधानसभा FACS प्रवाह cytometry विभेदक केंद्रापसारक
उच्च शुद्धता के लिए अपोप्तोटिक निकायों का पता लगाना और अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K.,… More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter