Summary
Un flusso di lavoro utilizzando una centrifuga di flusso cytometry o differenziale è stato sviluppato per individuare, quantificare e isolare i corpi apoptotici da un campione di apoptotic di elevata purezza.
Abstract
I membri principali della famiglia delle vescicole extracellulari, con ApoBDs essendo uno del più grande tipo di corpi apoptotici (ApoBDs), microvescicole ed esosomi. È stato proposto che ApoBDs può aiutare la liquidazione delle cellule, come pure la comunicazione intercellulare attraverso traffico biomolecole. Gli approcci convenzionali utilizzati per l'identificazione e l'isolamento di ApoBDs sono spesso limitati dalla mancanza di quantificazione accurata e purezza basso del campione. Qui, descriviamo un flusso di lavoro per confermare l'induzione di apoptosi, convalidare ApoBD formazione e isolare ApoBDs di elevata purezza. Inoltre, contorni e confrontare approcci di centrifugazione differenziale basato per isolare ApoBDs e fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Inoltre, la purezza del ApoBDs isolato verrà confermata utilizzando un stabilire in precedenza flusso cytometry-based colorazione e metodo analitico. Presi insieme, utilizzando l'approccio descritto, THP-1 del monocito apoptosi e apoptotica delle cellule lo smontaggio è stato indotto e validato, e ApoBD generati dai monociti THP-1 sono stati isolati per una purezza del 97-99%.
Introduction
Apoptosi, una forma ben studiata di morte cellulare programmata, sono necessaria per mantenere l'omeostasi fisiologica e rimuovere le cellule potenzialmente dannose all'interno del corpo umano1. Dopo l'induzione dell'apoptosi, cellule apoptotiche (ApoCells) possono subire una serie di cambiamenti morfologici e smontare in piccole vescicole di membrana-limita, chiamate ApoBDs. Nel complesso, questo processo è noto come smontaggio delle cellule apoptotiche e può essere diviso in 3 fasi distinte sulla base di morfologia2,3. Passaggio 1 (membrana plasmatica blebbing) è caratterizzata dalla formazione di aerostato-come le strutture sulla superficie delle cellule, noto come vescichette4,5. Passaggio 2 (formazione di protrusione apoptotici) comprende la formazione di protrusioni di membrana lungo come apoptopodia, apoptopodia in rilievo e microtubuli picchi6,7,8. Infine, passo 3 (formazione di ApoBD) include la frammentazione apoptotica protrusioni e/o ApoCells per generare ApoBDs6,9. I risultati precedenti hanno suggerito un ruolo di ApoBDs in favoreggiamento liquidazione delle cellule apoptotiche e mediare la comunicazione intercellulare. Ad esempio, si propone che la frammentazione di un ApoCell in ApoBDs può generare piccoli pezzi 'bite-sized' che potrebbero essere facilmente rimossi da circostante fagociti2,10,11. Inoltre, ApoBDs può harbor una serie di biomolecole quali DNA, RNA e proteine, che possono essere vittime di tratta a cellule circostanti per facilitare cella comunicazione12,13,14. Per funzionalmente studiare questi processi, è fondamentale per confermare tre parametri chiave, tra cui (i) validazione di induzione di apoptosi e ApoBD formazione, (ii) isolamento di ApoBDs e (iii) la conferma dell'ApoBD purezza.
In precedenza, una serie di metodi tra cui citofluorimetria e microscopia elettronica è stata usata per studiare l'apoptosi e ApoBDs15,16,17,18. Tuttavia, quantificazione e rilevamento di ApoBD sono spesso difficili o trascurato. Per esempio, l'apoptosi di base di citometria a flusso più ordinariamente utilizzati test impiega Annessina V (A5, una proteina che lega l'esternalizzati ' mangiare-me' segnale fosfatidilserina (PtdSer)) e dell'acido nucleico macchia propidio ioduro (PI)19. Tuttavia, con questa combinazione di macchia universale, analisi presuppone che ci sono solo tre tipi di sottoinsiemi di cellule (cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche) nel campione. Inoltre, anche se considerata come "gold standard" da molti ricercatori per apoptosi, analisi di citometria a flusso e l'analisi successiva dei dati spesso esclude ApoBDs attraverso un passaggio di gating iniziale selezionando eventiintermedio-alto FSC/SSC. Di conseguenza, abbiamo recentemente sviluppato un'analisi di citometria a flusso romanzo usando A5 e TO-PRO-3, un'altra macchia di acido nucleico che può essere preso in modo selettivo di caspase 3/7-attivato Pannexina 1 (PANX1) canali7,20. Come attivazione di caspase 3-induced PANX1 precede l'esposizione PtdSer nella fase iniziale dell'apoptosi, TO-PRO-3 macchie differenzialmente apoptotici e cellule necrotiche. Inoltre, questo approccio combinato con il nostro romanzo gating strategia include eventi tutti acquisiti durante l'analisi dei dati e di conseguenza, sei sottoinsiemi di cellule/particella sono identificati, tra cui: (i) cellule vitali (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso , A-PRO-3bassa), (ii) A5– primi ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5basso, TO-PRO-3intermedi), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta , A-PRO-3intermedi), cellule necrotiche (iv) o tardo ApoCells (FSC/SSCintermedio/alto, A5alta, TO-PRO-3alta), (v) ApoBDs (FSC/SSCbasso, A5intermedi, a-PRO-3basso / intermedio) e (vi) detriti (FSC/SSCbasso, A5basso, TO-PRO-3basso)20. Il nostro approccio sottolinea l'importanza di analizzare tutti i sottoinsiemi di cellule/particella e, cosa ancora più importante, la separazione di ApoBDs dalle cellule e detriti20. Quindi, questo approccio dimostra una tecnica efficace per convalidare l'induzione di apoptosi e ApoBD formazione simultaneamente.
Tradizionalmente, i ApoBDs sono stati isolati attraverso una varietà di approcci di centrifugazione differenziale per cui ApoBDs può essere separato dalle cellule o altre vescicole extracellulari in base alla densità. Tuttavia, tali metodi di centrifugazione sono spesso limitati dalla bassa ApoBD purezza, mancanza di una fase di quantificazione per confermare la purezza del campione e/o incapacità di separare cella tipo-specific ApoBDs17,21,22. Di conseguenza, abbiamo sviluppato recentemente due approcci, basati su FACS e un nuovo approccio differenziale basato su centrifugazione che può essere accoppiato con il nostro metodo di citometria a flusso precedentemente stabilito per convalidare l'induzione di apoptosi e campione purezza23. ApoBD isolamento tramite nostro approccio basato su FACS può arricchire ApoBDs fino a 99% di purezza e può essere accoppiato con una varietà di anticorpi specifici del tipo delle cellule per isolare ApoBDs da popolazioni di cellule miste, campioni di tessuti e fluidi corporei23. Inoltre, il nostro approccio riveduto centrifugazione differenziale viene illustrato un metodo efficiente per isolare ApoBDs a > 90% purezza23.
In questo articolo, descriviamo dettagliatamente la nostra procedura sperimentale per convalidare l'induzione di apoptosi e per rilevare e quantificare ApoBD formazione. I flussi di lavoro di isolamento ApoBD utilizzando metodi basati su centrifugazione differenziali e basati su FACS anche elaborati e confrontati. I dati rappresentativi dimostrano che la metodologia descritta fornisce un efficace strumento all'avanguardia per gli studi futuri di ApoBD.
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Protocol
1. induzione di apoptosi
- Centrifugare il campione di cellule a 300 x g per 5 min ed eliminare il surnatante per rimuovere eventuali detriti cellulari pre-esistenti.
Nota: Quando si utilizza cellule aderenti, cellule del seme in anticipo e lavare con soluzione tampone fosfato (PBS) prima di induzione di apoptosi: 1x. - Determinare il numero di cell e raccogliere le cellule.
Nota: A seconda post-dell'isolamento di test, si consiglia un numero di cellulare iniziale di almeno 1 x 107 cellule. - Risospendere in completa per i media (mezzo rispettivo contenente siero fetale di vitello di 10% (vol/vol), 50 UI/mL penicillina, 50 µ g/mL di miscela di streptomicina) per una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
- Aliquotare ~ 2 x 106 cellule per pozzetto di una piastra ben 6.
- Per indurre l'apoptosi, rimuovere il coperchio della piastra e irradiare le cellule a 150 mJ/cm2 utilizzando un irradiatore UV. Questo dovrebbe prendere circa 30-60 s.
Nota: Prima di irradiamento, assicurarsi che ~0.5 x 106 celle vengono mantenute per il controllo di cella 'Non trattato'.
Nota: L'apoptosi può essere indotta anche tramite altri metodi quali anti-Fas o siero fame6. - Incubare a 37° C, 5% CO2 per 2-8 ore, a seconda della linea cellulare.
- Utilizzando un microscopio chiaro superiore di panca, visualizzare le cellule per confermare la presenza di morfologie apoptotici, come blebbing, formazione di apoptopodia e ApoBD.
Nota: ingrandimento 40x è sufficiente - Utilizzando una pipetta P1000, pipettare e raccogliere campioni di apoptotic.
- Lavare la piastra con PBS 1X e si combinano con campione rimanente per garantire il massimo rendimento.
- Raccogliere ~1/10th per il 'intero Apoptotic campione' (WAS) di controllo.
- Raccogliere il campione 'Non trattato'.
- Centrifugare i campioni non trattato sia WAS a 3.000 x g per 6 min.
- Risospendere in 1 mL di PBS 1X e mettere da parte il ghiaccio.
- Per l'isolamento di ApoBD, continuare a passo 2 o 3 con il restante campione di apoptotic.
2. ApoBD isolamento tramite FACS
- Centrifugare il campione intero a 3.000 x g per 6 min.
- Rimuovere la maggior parte del surnatante senza interrompere il pellet.
- Risospendere in una soluzione colorante contenente 1 mL di buffer di associazione x A5 1, 75 µ l di A5-FITC e 2 µ l di TO-PRO-3 a 1 x 107 cellule.
- Incubare il campione al buio a temperatura ambiente per 10 min.
- Aggiungere 1-2 mL di buffer di associazione x A5 1 e centrifugare il campione a 3.000 x g per 6 min rimuovere macchie in eccesso.
Nota: Per le popolazioni delle cellule miste o campioni di tessuto, eseguire un anticorpo che macchia passo utilizzando una combinazione di indicatori specifici del tipo delle cellule in 1 tampone di associazione x A5 e incubare in ghiaccio per 20 minuti (o secondo il protocollo del produttore) prima centrifugazione a 3.000 x g per 6 min. - Risospendere il pellet di campione in 3 mL di tampone di FACS (1x PBS, 1 tampone di associazione x A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) per 1 x 107 cellule.
- Filtrare con un colino di cella 70 µm in un fondo di turno, tubo in polipropilene (citometria a flusso) e mantenere i campioni sul ghiaccio e al buio.
- Accendere la macchina di FACS ed eseguire set standard utilizzando un ugello di 100 µm, eseguire il ritardo di goccia e garantire un flusso stabile.
- Caricare l'esempio e impostare la velocità di acquisizione a ~ 1000 eventi/s.
- Regolare FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) e tensioni di FITC (A5) e posizionare gli eventi entro le trame di FACS affinché le popolazioni possono essere chiaramente separati.
- Registrare eventi di 20.000.
- Impostare una strategia di gating come in parte 4.
- Nel layout di sorta, è necessario aggiungere l'ultimo cancello di ApoBD come la popolazione di ordinamento desiderata.
- Iniziare l'acquisizione del campione ed eseguire una sorta di prova attraverso la raccolta di 5.000-10.000 ApoBDs in una nuova provetta contenente ~ 250 µ l di tampone FACS.
- Eseguire un sistema torna a filo e carico ordinato ApoBDs.
- Acquisire e registrare test-ordinamento ApoBDs.
- Verificare che la purezza di ApoBD ~ 99% confrontando vs FSC (asse y) A5 (eventi asse x).
Nota: A5 macchiatura può ridurre leggermente quando ri-analisi dei campioni a causa di sbiancamento laser. - Una volta ottenuta la elevata purezza, caricare il campione originale e continuare l'ordinamento fino a quando il numero desiderato di ApoBDs è stato ottenuto.
Nota: Se necessario, l'ordinamento dual può essere eseguita per isolare contemporaneamente ApoCells e ApoBDs.
Nota: Durante l'ordinamento per un lungo periodo di tempo, si raccomanda di incubare la provetta di raccolta a 4 ° C. - Una volta che l'ordinamento è completo, raccogliere una piccola porzione di ApoBDs post-ordinamento, post-ordinamento ApoCells, non trattato e WAS apoptosi di convalidare e confermare post-ordinamento purezza.
Nota: Anche se la prova-ordinamento e la purezza di post-ordinamento non dovrebbe differire significativamente, questo si basa sulle impostazioni di flusso e stabilità.
3. ApoBD isolamento tramite centrifugazione differenziale
- Centrifugare il campione di apoptotic rimanenti a 300 x g per 10 min.
- Raccogliere il surnatante, lasciando ~ 500 µ l per evitare di interrompere il pellet cellulare e aggiungere in una nuova provetta conica da 15 mL.
- Rimuovere i rimanenti 500 µ l e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di PBS 1X (questo rappresenta la frazione di ApoCell-arricchita.
- Centrifugare il surnatante raccolto per 20 min a 3.000 g.
- Controllare una pallina e rimuovere con cautela il surnatante (il supernatante può contenere piccole vescicole extracellulari tra cui microvescicole ed esosomi).
- Risospendere il pellet in 1 mL di PBS 1X (questo rappresenta la frazione 'arricchita di ApoBD')
- Raccogliere 100 µ l di ogni vitali, WAS, arricchita di ApoCell e ApoBD-arricchita di campioni in un nuovo fondo di turno, tubo di polistirolo (citometria a flusso).
- Aggiungere 100 µ l di macchia contenente 2 buffer obbligatorio x A5, 1: 100 A5-FITC e 1:1,000 TO-PRO-3
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min al buio.
- Analizzare i campioni mediante citometria a flusso, utilizzando la strategia di gating come descritto in precedenza per convalidare la riuscita induzione di apoptosi e la purezza della frazione arricchita di ApoBD.
4. flusso Cytometry Gating strategia
- Plot TO-PRO-3 (asse y) contro FSC (asse x) per separare le cellule necrotiche (TO-PRO-3alta) da tutti gli altri eventi non-permeabilized (TO-PRO-3basso/intermedio).
- Selezionare tutti gli eventi non-permeabilized e trama SSC contro A5. Due popolazioni tra cui popolazione 1 (P1), SSCintermedio/alto, A5basso/intermedio celle e popolazione 2 (P2), tutti gli altri eventi del cancello.
- Da P2, plot TO-PRO-3 contro A5 e selezionare A5intermedio/alto eventi per escludere tutti i detriti cellulari.
- Selezionare tutti gli eventi positivi A5 e plot FSC contro A5. Separare ApoBDs (FSCbasso) da ApoCells (FSCintermedio/alto).
Nota: Quando gating ApoBDs per l'isolamento di ApoBD tramite l'approccio basato su FACS, consigliamo un passaggio finale selezionando ApoBDs e confronto a-PRO-3-A5 e tutti gli eventi. Questo assicura che il cancello di ordinamento finale utilizza fluorescenza piuttosto che i parametri FSC/SSC. - Per l'analisi di cellule vitali, selezionare P1 ed effettuare una delle due strategie di Gate. Per l'analisi generale delle cellule vitali, plot FSC contro A5 e selezionare tutte le celle FSCintermedio/alto , quindi rimozione detriti cellulari rimanenti. In alternativa, per un'analisi approfondita, cellule vitali possono essere separate da A5– ApoCells primi tracciando TO-PRO-3 contro FSC. Selezionare a-PRO-3basso, cellule vitali di FSCintermedio/alto e TO-PRO-3intermedio, FSCintermedio/alto A5– ApoCells presto.
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Representative Results
Utilizzando la procedura descritta qui, è stato indotto apoptosi monociti THP-1 e ApoBDs sono stati rilevati e isolato tramite un FACS-based o un approccio di centrifugazione differenziale (Figura 1). In primo luogo, l'apoptosi è stata indotta da irradiazione UV e campioni sono stati raccolti dopo 2-3 h di incubazione, quando le cellule hanno esibito apoptotica morfologie, compreso blebbing, formazione di protrusione della membrana apoptotici e la generazione di ApoBDs6. Un metodo di citometria a flusso basati su A5 e TO-PRO-3 è stato utilizzato per confermare l'induzione di apoptosi del monocito e ApoBD formazione separando le cellule vitali, le cellule necrotiche, presto ApoCells, ApoCells, ApoBDs e detriti (Figura 2). Presi insieme, analisi di citometria a flusso indicato che il trattamento UV provoca ~ 20% ApoCells (Figura 3).
Monociti THP-1 ApoBDs erano allora isolato da WAS tramite due approcci. In primo luogo, i campioni sono stati preparati per un'approccio basato su FACS dove è necessaria solo una singola centrifugazione a pellet apoptotica intero campione prima della colorazione di elevata purezza e FACS. Questo metodo è appropriato per saggi funzionali quando significativamente campione ad alta purezza è necessario (ad esempio, per l'analisi qPCR), quando è richiesto un numero specifico di ApoBDs o quando l'acquisizione la cella specifica del tipo ApoBDs da un campione complesso. Utilizzando questa metodologia, ApoBDs sono stati isolati a ~ 99% di purezza (Figura 4).
Successivamente, monociti THP-1 ApoBDs inoltre sono stati isolati tramite un in due fasi, approccio di centrifugazione differenziale. Il primo passo include l'isolamento di cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche. La fase successiva prevede la separazione del più grande ApoBDs da piccole vescicole extracellulari quali microvescicole ed esosomi, che sono in grado di essere pellettato a 3.000 x g. citometria a flusso è stata poi eseguito per confermare l'induzione di apoptosi e la purezza del campione di ApoBD e dimostrato un campione ApoBD-arricchita contenente ~ 97% ApoBDs (Figura 4). Questo presenta una tecnica rapida ed efficace per isolare ApoBD a relativamente elevata purezza ed è appropriato quando ApoBDs di purificazione da campioni contenenti un tipo di cella singola.
Figura 1 . Diagramma schematico di isolamento ApoBD via sia un metodo di centrifugazione differenziale o basato su FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Flusso cytometry strategia di gating. Sei sottoinsiemi di cellule/particella (tra cui cellule vitali, A5– primi ApoCells, A5+ ApoCells, le cellule necrotiche, ApoBDs e detriti) sono stati individuati e utilizzati per selezionare ApoBD per isolamento basati su FACS. (a) cellule necrotiche di analisi membrana sono separate dai non-analisi eventi. (b) A5intermedio-basso, SSCbasso-alto cellule sono separate da eventi dibassa-alta A5. (Bambi) per un'analisi approfondita, TO-POR-3 cellule vitalibasso possono essere separate dalla TO-PRO-3intermedio A5– ApoCells presto. (b) in alternativa, semplicemente calcolando ApoBD purezza, cellule vitali possono essere separate dagli eventibasso FSC. (c) A5basso detriti sono esclusi. (d) FSCintermedio/alto ApoCells sono separati da FSCbasso ApoBDs. (e) tutte le A5-a-PRO-3intermedio/alto ApoBDs sono selezionati per l'ordinamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Convalida dell'apoptosi monociti THP-1. Analisi di citometria a flusso dei monociti THP-1 non trattati o UV-irradiati è stato effettuato per determinare i livelli di cellule vitali, A5– primi ApoCells, A5+ ApoCells e cellule necrotiche.
Figura 4 . Purificazione di THP-1 del monocito-derivato ApoBDs. Analisi di citometria a flusso è stata eseguita isolato THP-1 del monocito-derivato ApoBDs via sia un metodo di centrifugazione differenziale o basato su FACS basato, mostrando l'arricchimento di ApoBDs da cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dalla sua descrizione iniziale nel 1950, il campo dell'apoptosi ha avanzato notevolmente, diventando una zona prominenti di ricerca. Nonostante il vasto interesse e gli sforzi profusi, alcuni aspetti dell'apoptosi, in particolare la formazione di ApoBDs, non sono stati studiati bene a causa della mancanza di adeguate metodologie. Queste comprendono in particolare la limitazione in progressione di apoptosi e ApoBD formazione contemporaneamente usando la citometria a flusso tradizionale analisi A5/PI e le impurità di isolamento ApoBD di rilevamento. Recentemente abbiamo sviluppato approcci per affrontare questi problemi metodologici.
Il nostro nuovo flusso cytometry-based approccio analitico permette di ApoBDs, che sono spesso ignorati utilizzando metodi analitici tradizionali, per essere rilevati e quantificati20. Inoltre, questo modificato flusso cytometry metodo, con l'uso della macchia a-PRO-3, rivela un ulteriore A5– apoptotica precoce, quindi rendering migliore delineazione del apoptosis progressione20. Convenzionalmente, ApoBD rilevamento si affidano pesantemente basata su immagini tecniche quali la microscopia confocale e l'istologia, considerando che il nostro metodo di citometria a flusso fornisce un approccio di alto-rendimento per quantificare ApoBD formazione. Anche se apparentemente complesso, la procedura è relativamente facile e richiede solo reagenti commercialmente disponibili e un citometro a flusso di base. La logica rilevazione e quantificazione precisa di ApoBDs ulteriormente la conoscenza del microambiente delle cellule apoptotiche che dettami cella liquidazione e risposte immunologiche. Infatti, accoppiando metodo cytometry di flusso qui descritti con macchie specifiche dell'organello, recentemente abbiamo segnalato la distribuzione eterogenea del contenuto cellulare in ApoBDs24. Questi risultati suggeriscono che ApoBDs possono essere classificati in diversi sottoinsiemi e ogni sottoinsieme di ApoBD può presentare diverse funzioni.
Le nostre tecniche di isolamento ApoBD recentemente sviluppati contribuirebbe anche a progressi nel campo delle vescicole extracellulari. Tradizionalmente, centrifugazione differenziale metodi utilizzati per l'isolamento di ApoBD possono includere una quantità significativa di cellule più piccole, che possono incidere sulle analisi funzionali a valle. Tuttavia, il nostro approccio di centrifugazione differenziale modificato consente di isolare ApoBDs al 97% di purezza. Anche se ad alta purezza può essere ottenuta tramite centrifugazione differenziale, tale metodo potrebbe non essere adatto per l'isolamento ApoBDs da campioni complessi. Al contrario, il nostro metodo FACS-basato può arricchire ApoBDs al 99% di purezza ed è basata sulle caratteristiche biologiche uniche di ApoBDs tra cui la dimensione delle particelle, granularità e l'esposizione di PtdSer, invece di basarsi esclusivamente sulla densità della particella. Questo approccio ha anche il potenziale per simultaneamente identificare e isolare ApoBDs di origini differenti delle cellule usando marcatori specifici del tipo di cella24. Nonostante una lunga procedura di FACS che potrebbe richiedere 1-8 h a seconda della quantità di ApoBDs necessaria, accurata ApoBD isolamento e la successiva analisi a valle consentirebbe l'attribuzione diretta delle caratteristiche molecolari e ruoli funzionali di ApoBDs. Per tali metodologie, è fondamentale che gli approcci di isolamento ApoBD sono accoppiati con tecniche quali la citometria a flusso (come descritto qui) per convalidare sia l'induzione di apoptosi e la purezza del campione ApoBD-arricchita. Inoltre, FACS corretto impostare è essenziale per l'isolamento di ApoBD tramite l'approccio basato su FACS, come un flusso instabile o erroneamente eseguita goccia ritardo può provocare scarsa purezza.
Collettivamente, abbiamo delineato metodologie all'avanguardia per quantificare l'induzione di apoptosi, ApoBD rilevamento e isolamento di ApoBDs altamente puro. Il nostro approccio può fornire un nuovo strumento per studiare il processo di smontaggio delle cellule apoptotiche e delucidare il ruolo di questo processo in impostazioni di malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo ha funzionato è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health e il Medical Research Council (GNT1125033 e GNT1140187) e Australian Research Council (DP170103790) a I.K.H.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | - | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
References
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