Summary
Her præsenterer vi en praktisk vejledning i opbygning af en integreret mikroskopi system, som fletter konventionelle epi-fluorescerende imaging, enkelt-molekyle påvisning funderet super-resolution imaging og multi-farve enkelt-molekyle afsløring, herunder enkelt-molekyle fluorescens resonans energioverførsel imaging, i én set-up på en omkostningseffektiv måde.
Abstract
Fluorescens mikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at opdage biologiske molekyler i situ og overvåge deres dynamik og samspil i realtid. Ud over konventionelle epi-Fluorescens mikroskopi, er forskellige Billeddannende teknikker blevet udviklet for at opnå specifikke eksperimentelle mål. Nogle af de anvendte teknikker omfatter enkelt-molekyle fluorescens resonans energi transfer (smFRET), som kan berette konformationel ændringer og molekylære interaktioner med ångstrøm opløsning og enkelt-molekyle opdagelse-baseret super-opløsning (SR) imaging, der kan styrke den rumlige opløsning ca ti at twentyfold i forhold til diffraktion-begrænset mikroskopi. Her præsenterer vi en kunde-designet integrerede system, som fusionerer flere Billeddannende metoder i et mikroskop, herunder konventionelle epi-fluorescerende imaging, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR imaging og multi-farve enkelt-molekyle påvisning, herunder smFRET billeddannelse. Forskellige Billeddannende metoder kan nås nemt og reproducerbar ved at skifte optiske elementer. Dette set-up er nem at vedtage ved enhver research laboratory i biologiske videnskaber med behov for rutine og forskelligartede imaging eksperimenter på et reduceret omkostningerne og rum i forhold til bygge separate mikroskoper til individuelle formål.
Introduction
Fluorescens mikroskoper er vigtige værktøjer for den moderne biologiske forskning og fluorescerende imaging udføres rutinemæssigt i mange laboratorier, biologi. Ved tagging biomolekyler interesse med fluorophores, kan vi direkte visualisere dem under mikroskop og optage tidsafhængig ændringer i lokalisering, kropsbygning, interaktion, og forsamlingen stat in vivo eller in vitro. Konventionelle fluorescens mikroskoper har en diffraktion-begrænset rumlige opløsning, som er ~ 200-300 nm i lateral retning og ~ 500-700 nm i aksial retning1,2, og er derfor begrænset til billedbehandling på 100s af nanometer til micron skala. For at afsløre finere detaljer i den molekylære forsamling eller organisation, der er udviklet forskellige SR microscopies, der kan bryde diffraktion grænse. Strategier, der anvendes til at opnå SR omfatter ulineære optiske effekter, såsom stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi3,4 og struktureret belysning mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiske påvisning af enkelt molekyler, som stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)8 og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9, og en kombination af begge, som MINFLUX10. Blandt disse SR microscopies, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskoper relativt nemt kan redigeres fra en enkelt-molekyle mikroskop set-up. Med gentagne aktivisering og billeddannelse af photoactivatable fluorescerende proteiner (FPs) eller foto-omstillelig farvestoffer markeret på biomolekyler af interesse, kan rumlige opløsning nå 10-20 nm11. For at få oplysninger om molekylære interaktioner og konformationelle er dynamics i realtid, Ångstrøm til nanometer opløsning påkrævet. smFRET12,13 er en metode til at opnå denne beslutning. Normalt, afhængigt af de biologiske spørgsmål af interesse, Billeddannende metoder med forskellige rumlige beslutninger er nødvendigt.
Typisk, for hver type af imaging, specifikke excitation og/eller emission optiske konfiguration er nødvendig. For eksempel, er en af de mest almindeligt anvendte belysning metoder til registrering af enkelt-molekyle gennem samlede interne reflection (TIR), hvor en specifik excitation vinkel skal opnås enten gennem et prisme eller objektive linse. Til smFRET påvisning skal emissioner fra både donor og acceptor farvestoffer være rumligt adskilt og rettet til forskellige dele af elektron-multiplikation, charge - sammen enhed (EMCCD), som kan opnås med et sæt spejle og dichroic beam splittere placeret i stien emission. For tre-dimensionelle (3-D) SR imaging, en optisk komponent, såsom en cylindrisk linse14, er nødvendig for at forårsage en bygningsfejl effekt i stien emission. Derfor, hjemmebygget eller kommercielt tilgængelige integreret mikroskoper er, normalt, funktionelt specialiserede for hver type af imaging metode og er ikke fleksible til at skifte mellem forskellige Billeddannende metoder på det samme set-up. Her præsenterer vi en omkostningseffektiv, hybridsystem, der giver justerbar og reproducerbare skifter mellem tre forskellige Billeddannende metoder: konventionelle epi-fluorescerende imaging med diffraktion-begrænset opløsning, enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR billedbehandling, og multi-farve enkelt-molekyle detektion, herunder smFRET imaging (figur 1A). Specifikt, set-up præsenteres her indeholder fiber-koblede input lasere til multi-farve excitation og en kommerciel belysning arm i stien excitation, som tillader programmeret kontrol af excitation vinkel, at skifte mellem epi-mode og TIR-tilstanden. I stien emission en flytbar hjemmebygget cylindrisk linse kassette er placeret i mikroskop kroppen for 3D-SR imaging og en kommerciel stråledeler er placeret før en EMCCD kamera, der kan aktiveres selektivt at opdage flere emission kanaler samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroskop Design og montage
-
Excitation sti
Bemærk: Excitation stien indeholder lasere, differential interferens kontrast (DIC) komponenter, mikroskop kroppen og dens belysning arm.- Forberede en vibration-isolerede optisk tabel. F.eks. en strukturel dæmpning tabel over 48 x 96 x 12'' giver plads nok til alle komponenter.
Bemærk: Bygge set-up i et rum med temperaturkontrol (f.eks.21.4 ± 0,55 ° C). Temperatur stabilitet er afgørende for at opretholde den optiske justering. - Installere et mikroskop organ, der er udstyret med en belysningsstyrke arm for optisk fiberforbindelse, en 100 X oliebestan JOHANNAS mål linse og DIC komponenter.
- Anbring fire laser hoveder (647 nm, 561 nm, 488 nm og 405 nm, omkranset i figur 1B) og deres varme dræn på tabellen optisk, og sørg for at de udsendte laserstråler har den samme højde og er så kort som muligt for at sikre god stabilitet (f.eks. 3'').
Bemærk: Hvis en laserhoved sidder på en kortere højde end andre lasere, sætte en aluminiumplade med tilstrækkelig tykkelse nedenunder. Altid sikre maksimal kontakt mellem varme dræn og optisk tabellen for den bedste varmeafledning (figur 1B). Lasere skal være kraftig nok til SR billeddannelse. Se tabel over materialer. Det anbefales at have laser oprydning filtre foran diode lasere. - Installere et datakort på erhvervelse gennem en perifer komponent interconnect (PCI) grænseflade i en arbejdsstation og oprette forbindelse lasere med dette kort. Styre lasere ON/OFF opførsel af transistor-transistor logic (TTL) output, og deres magt justering af den analoge udgang af dette kort (figur 1 c). Installere en ordentlig mikroskopi imaging software (enten kommercielle eller hjemmebygget) til at styre erhvervelse datakort, samt selve mikroskop.
- Montere spejle og dichroic beam splittere (590, 525 og 470 lang pass filtre) til deres respektive mounts. Brug meget stabil spejl ophæng til spejle. Brug cirkulære splittere med ophøjet ringe til at undgå enhver bøjning af dichroic beam splittere (fig. 1 d).
- Placer spejle og dichroic beam splittere på tabellen optisk at kombinere laserstråler (figur 1B). For at opnå den mest stabile justering, gøre hele ordningen så kompakt som muligt, og bruge 1''-tykkelse optisk indlæg. Arranger lasere, så de kortere bølgelængde lasere er tættere på den optiske fiber kobling (figur 1B) da kort bølgelængde lys spreder mere i luften.
- Kombinere laserstråler ind i en single-mode optisk fiber. For at gøre dette, skal du bygge en fiber kobling i et bur system gennem følgende trin:
- Montere en fiber adapterplade i en z-akse oversættelse mount (figur 1E, længst til venstre panel).
- Montere en akromatisk doublet linse (brændvidde = 7,5 mm) i et bur plade (figur 1E, andet panel fra venstre).
- Tilslut to dele ovenfor af udvidelse stænger til at danne et bur. Montere buret på tabellen optisk med monteringsbeslag på 1''-tykke optisk indlæg (figur 1E, midterste panel).
- Juster 647-nm laser først med en single-mode optisk fiber (FC/APC ende på koblingen).
Bemærk: En ru justering ved hjælp af en multi mode optiske fiber, før ved hjælp af single-mode optisk fiber kan hjælpe justeringsprocessen. Justere vinklerne af spejle og dichroic beam splittere (figur 1 d, af justeringsknapperne), samt afstanden mellem akromatisk doublet linse og fiber adapterpladen (figur 1E, ved at justere z-aksen oversættelse mount) at få maksimale laser power output gennem fiber. - Når justeringen af den første laser er gjort, midlertidigt installere et par af iris og justere resten af lasere én efter én (figur 1F). Kontroller justeringen effektivitet med en energimåler.
- Forlade en iris foran adapterplade til at reducere refleksioner af lasere.
Bemærk: Stærk tilbage refleksioner kan reducere levetiden for laser kilder. Eventuelt kan en optisk isolator installeres foran hver laserhoved fjerne refleksioner fuldstændigt.
- Tilslut anden enden af den optiske fibre til belysning arm af mikroskop (figur 1 H).
- Design og installere "forstørrelse linsen (mag linse)" gennem følgende trin:
Bemærk: Lasere kan bruges til epi-fluorescens billeddannelse af prøven, men smal stråle størrelsen af hver laser begrænser det belyste område af prøven til et område flere gange mindre end den faktiske størrelse af de tilsvarende kamera sensor, især for de nyere kameraer (med 18,8 mm diagonal længde i forhold til de konventionelle 11,6-mm længde). Det er således ønskeligt at udvide stråle for at opnå en større og fladere belysning af prøven.- Design mag-linse, som kan passe ind i belysning arm (figur 1 H).
Bemærk: Design af mag linse afhænger hvor det vil blive installeret. Figur 1 H viser et eksempel på installationen i belysning arm, men det kan installeres i ethvert sted, efter laserstråler er kollimeres (Se diskussion). Design det med en computer-aided design og udarbejdelse software. - Placer to achromatic objektiver, en konkav (brændvidde = f1), og en konveks (brændvidde = f2) i hjemmelavet mag linse indehaveren (figur 2A og 2 C), med den afstand, der er lig med summen af deres brændvidder, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (figur 2B).
Bemærk: Med dette udvalg af brændvidder, mag objektivet udvider stråle af f2/ | f1| = 2 folder. Mag linse giver alsidighed. Det kan blive fjernet for at genoptage regelmæssige belysning uden at udvide bjælker (figur 2D) eller indsat i den modsatte retning at fokusere laserstråle for at opnå en stærkere excitation intensitet.
- Design mag-linse, som kan passe ind i belysning arm (figur 1 H).
- Forberede en vibration-isolerede optisk tabel. F.eks. en strukturel dæmpning tabel over 48 x 96 x 12'' giver plads nok til alle komponenter.
2. emission sti
Bemærk: Stien emission er sammensat af en flytbare cylindrisk linse, en barriere filter hjul, en emission splitter og en EMCCD kamera (figur 1 g). For at opnå den bedste punkt spredes funktion (PSF) enkelt molekyler, DIC prisme sættes væk fra mål linse.
- Custom-design den kassette, cylindrisk linse (3D-objektiv), som kan passe ind i den manuelle DIC analyzer indsætte slot i mikroskop kroppen (figur 3 c).
Bemærk: Dette design ikke kompromitterer DIC analyzer da en analyzer blok kan indsættes i filter tårn. - Placer 3D-linsen af 10 m af brændvidden i kassetten og indsætte det i emission strålegang at skabe bygningsfejl virkning for udvinding z-koordinaten for hver enkelt molekyle14.
Bemærk: Du kan eventuelt 3D-linsen kassette kan placeres i eller ud af stien emission (figur 3 c). - Installere en multi-band dichroic beam splitter i filter tårnet inde i selve mikroskop.
- Installere emission filtre.
Bemærk: Filtrene emission er valgt afhængigt af den foretrukne fluorophores. Afhængigt af modulet billeddannelse anvendes emission filtrene placeret forskellige steder som beskrevet nedenfor:- Brug emission filtre placeret i barriere filteret hjulet tilsluttet til sekventielle flerfarvet epi-fluorescens imaging eller SR imaging, ved siden af selve mikroskop til at minimere vibrationer i mikroskop kroppen under kanal switch (figur 1 g).
- For simultan multi-farve påvisning (fx, smFRET eksperimenter), sted et andet filter i en emission splitter (check trin 4 for detaljer).
Bemærk: Normalt er en kommerciel emission splitter har to switchable tilstande (dvs., "engageret" eller "omgå" modes). For at adskille emission lys kromatisk for simultan multi-farve imaging ("engageret" mode), et filter cube holder to dichroic beam splittere og tre emission filtre bruges ("triple terning," figur 4 c og 4 D). En tom slot i barriere filteret hjulet bruges i kombination med tredobbelt kuben. På den anden side for sekventielle flerfarvet imaging, er tredobbelt kuben erstattet af en kube, der bare har et spejl inde ("bypass terning," figur 4A og 4 D).
- Installere EMCCD kameraet som den sidste del af stien emission. Udnytte USB PCI-forbindelsen for at opnå en hurtig billedhastighed.
Bemærk: En EMCCD kamera anbefales til de mest følsomme enkelt-molekyle påvisning, men en avanceret sCMOS kamera kan være et alternativ.
3. diffraktion-begrænset Imaging med Epi-excitation
- Justere excitation lasere tilfældig vinkel til epi-tilstand i belysning arm.
- Frigøre 3D-objektivet hvis engageret (figur 3 c, højre panel).
- Indsæt bypass kuben i emission splitter (figur 4A og 4E, nederste panel).
- (Valgfrit) Indsæt mag linsen til et udvidet belysning område (figur 2D, venstre panel).
Bemærk: Ved brug af en mag linse og en 100 X oliebestan mål linse, omkring 91 x 91 µm2 kan være oplyst jævnt, eliminerer behovet for at bruge en hvid lyskilde og flere filter kuber. - Bruge en mikroskopi tænkelig programmel at tage multi-kanal, og/eller Z-stak, og/eller time-lapse billeder.
Bemærk: Der er flere programmer tilgængelige for mikroskopi imaging, ikke kun fra mikroskop producenter, men også fra tredjepartsfirmaer eller open source-udviklere.
4. multi-kanal enkelt-molekyle Imaging herunder smFRET
Bemærk: Flytte til en "Tom" position i den barriere filter hjul, således at alle emission med enhver bølgelængde kan nå til det andet sæt af filtre/dichroic beam splittere i emission splitter.
- For at oprette flerfarvede enkelt-molekyle påvisning af overflade-immobiliseret molekyler15 brug JOHANNAS excitation, herunder smFRET måling, justere excitation lasere tilfældig vinkel at JOHANNAS vinkel. Frigøre mag linse og 3D-linsen.
- Engagere tre-kanal-mode i emission splitter (figur 1 g) gennem følgende trin:
- Erstatter bypass cube med en "kalibrering terning", der giver lys til at gå gennem alle kanaler (figur 4B og 4E).
- Tænd kameraet under DIC (dvs., nogen emissions filter i barriere filteret hjulet) og justere blænde af emission splitter indtil tre helt separate kanaler vises på skærmen.
Bemærk: Udføre dette trin med værelse lys tændt, for at visualisere alle kanaler. - Vende lodret/vandret justering kontrol drejeknapper på emission splitter og groft justere de tre kanaler (figur 4E og 4F).
- Sluk kameraet og erstatte kalibrering terning med en tredobbelt cube (figur 4 c og 4E).
- Placer en prøve med 100-nm multikanals perler på 100 X mål linsen og fokus på prøve.
- Tænde kameraet og 488 nm laser, zoome ind på en af de lyse perler, og fint justere de tre kanaler ved at dreje kontrol justeringsknapperne igen (figur 4E og 4 G).
Bemærk: 100-nm multikanals perler udsender forskellige bølgelængder af lys, 488 nm excitation, aktivering af den tre-kanal justering.
- Tænde kameraet og lasere, fokus, og finde en god position med en rimelig spot tæthed. Justere laser power og eksponering tid at opnå acceptable signal-støj og photobleaching niveauer. Bruge mikroskopi imaging software til at tage time-lapse billeder.
5. SR Imaging
Bemærk: Dette er enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskopi.
- Hvis du vil konfigurere SR imaging, indsætte 3D-linsen og fjerne mag linse. Indstillet eksponeringstid for kameraet i passende laser tv-kanalerne (f.eks.5-60 ms). Bestemme og manuelt indstille de optimale excitations lasere tilfældig vinkel at være JOHANNAS vinkel.
- Prøven anbringes i SR imaging buffer16. Tillad buffer til blandingen henstår i mindst 10 min før billeddannelse.
Bemærk: SR imaging buffer udløber efter ca 1 time, så laver ny SR imaging buffer i overensstemmelse hermed. - Tage en DIC billede før SR billeddannelse. For at finde de korrekte mål højde for SR, som optimerer bygningsfejl virkning, bruge DIC imaging for at finde det midterste plan af celler. Identificere flyet ved højden hvormed cellerne overgang fra "lys" til "mørke" billeder og synes at blive gennemsigtige (figur 5A, 5Bog 5 C). Når det ønskede brændplanet bestemmes, engagere z-drift korrektion system (figur 1A).
- Adfærd SR billeddannelse. Ændre 405-nm laser beføjelse til at opretholde en rimelig tæthed af 'blinkende på' steder.
Bemærk: Selv om det er muligt at ændre 405-nm laser manuelt, er det mere praktisk at køre en programmeret data erhvervelse kode opretholde tætheden af "blinker på" steder. Her er et eksempel på hvordan det foregår automatisk. Kildekoden er tilgængelig på anmodning (figur 6).- Start imaging erhvervelse med 0 W/cm2 violet laser power.
- Tæl antallet af blinker på steder i en bestemt periode.
- Modulere violet laser power, således at antallet af blinker på steder holdes tærskel en bruger-defineret"optælling" i synsfeltet. Øge violet laser power, når antallet af blinker på steder falder tærsklen på optælling.
- Opsige erhvervelse, når antallet af blinker på steder falder tælle tærsklen på ved hjælp af den maksimale violet laser power.
Bemærk: Maksimalt kan være sæt forskelligt afhængigt af prøven lysstyrke, men ikke højere end 130 W/cm2. Afhængigt af det faktiske mål at SR imaging, kan denne automatiske erhvervelse kode afsluttes manuelt på enhver ønsket sted.
- Kontrollere blinkende adfærd og vævede af pletterne snart efter begynder erhvervelse.
Bemærk: Hvis den blinkende adfærd ikke er ideel, ændre excitation lasere tilfældig vinkel eller erstatte den billeddiagnostiske buffer. Forvent et udsnit af "lodret", "vandret" og "diamant" figurer af PSF, der repræsenterer fluorophores nedefra, ovenfor, og inden for brændplanet, henholdsvis (fig. 5 d). Hvis de fleste steder viser enten lodret eller vandret vævede, derefter brændplanet er ud fra midten af cellerne, så opsige eksperimentet og justere brændplanet igen. En tilstedeværelse af luftboble i nedsænkning olie eller andre lokale faktorer kan påvirke vævede kvalitet, så kan det være nødvendigt at erstatte olien eller skifte til et andet billeddiagnostiske område af prøven. - Til dataanalyse, bruges enten open source (i NIH ImageJ plugins) eller kommercielt tilgængelige koder at opdage centroids af hver plet i hver tænkelig ramme og udtrække z-værdier for hver plet fra x - og y-bredder14.
Bemærk: I denne betænkning, en kildekode oprindeligt udviklet i en af de tidligste enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR8 blev ændret for 3D-påvisning16 og blev brugt. - Ved to-farve imaging, image fluorophore med den længere excitation bølgelængde, efterfulgt af ene med den kortere excitation bølgelængde. Kør automatiseret erhvervelse kode ligeledes beskrevet taktfast 5.4, men med en anden tænkelig laser.
Bemærk: kromatisk aberration bør korrigeres mellem billeder med forskellige fluorophores (fx, røde farvestof og gul-grøn farve). Her er trinene.- Immobilisere flere 100-nm multikanals perler på glas coverslip, undgå danne klynger.
- Tage billeder af dem i forskellige excitation kanaler.
- Uddrag deres (X, Y, Z) koordinerer software (trin 5.6).
- Plot ΔXjeg = X1i - X2i og ΔYi = Y1i - Y2i (jeg er for forskellige perler, og 1 og 2 er forskellige farvekanaler) separat og passe dem med ordentlig funktioner. Gem funktioner.
Bemærk: Lineære funktioner er tilstrækkelig i de fleste tilfælde. Når disse funktioner bestemmes, skal denne måling ikke gentages hver gang Imaging. - I den faktiske tofarvede SR imaging af en stikprøve af interesse, skal du anvende funktioner til korrekt (X, Y) kromatisk aberration. For z-directional kromatisk aberration, gennemføre det ved at indhente ΔZ = Z1 - Z2 for multikanal perler eller kendte reference multikanals prøver seedede sammen med prøven af interesse.
Bemærk: i modsætning til (X, Y) kromatisk aberration, z-directional kromatisk aberration er ikke godt-reproducerbare i hvert forsøg, hovedsagelig på grund af ufuldstændige z-directional fokus vedligeholdelse ved at skifte kanal. Således, det anbefales at foretage korrektion hver gang. ΔZ = Z1 - Z2 er for det meste uafhængig af (X, Y), så bare et par perler eller referenceprøver ville være tilstrækkelig pr. hver prøve område af interesse. Afbilde de beregnede endelige tofarvede SR billeder i en 3D-visualisering software og kontrollere ΔZ manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette mikroskop giver mulighed for fleksibel og reproducerbare skifter mellem forskellige Billeddannende metoder. Her viser vi prøve billeder indsamlet med hver billeddiagnostiske modul.
Figur 5 d viser PSF blinker på molekyle under SR erhvervelse. Tusindvis af sådanne billeder er ombygget til at generere den endelige SR billede (figur 5E). Figur 5E viser de samme bakterielle regulerende RNA'er som vist i epi-fluorescens billedet i figur 7A. Figur 7 viser de repræsentative epi-fluorescens billeder af en lille regulerende RNA i Escherichia coli celler og et mRNA i U2OS pattedyrsceller. Begge RNA'er er mærket med fluorophore-mærkede DNA oligo gennem i situ hybridisering17. Figur 8 viser den repræsentative smFRET måling af foldede RNA molekyler mærket med donor farvestof (grøn farve) og acceptor farvestof (røde farvestof). Komplekser er immobiliseret på objektglas, og ophidset af JOHANNAS belysning. Fluorescens intensitet baner kan udvindes fra individuelle enkelt molekyler, generere FRET effektivitet som funktion af tiden.
Figur 1: design af mikroskop set-up. (A) dette panel viser et diagram over set-up. M = spejl, DBS = dichroic stråledeler, LCF = laser oprydning filter, jeg = iris, L = linse, AP = adapterplade, ZTM = z-aksen translationel mount, i = optisk fiber, OFC = optisk fiber kobling, CL = cylindrisk linse, TL = tube linse, EF = emission filtre, Obj = mål linse, og SM = skridt motor. Z-drift korrektion system bevæger sig trin motor på næsestykket af formålet objektivet til den modsatte retning af z-drift, som er beregnet af infrarød (IR) signal genereret af sin egen LED og opdaget af sin egen detektor. (B) dette panel viser laser excitation forsamling. Fire lasere er kombineret gennem spejle og dichroic beam splittere og sendes derefter til en optisk fiber gennem en fokusering linse og en adapterplade sidder på en translationel mount (nederst i billedet). (C) dette panel viser laser graduering. To bajonet Neill-Concelman (BNC) kabler er tilsluttet hver af laser (enten hovedet eller controller, afhængigt af producenten) for TTL og analog graduering (længst til venstre panel). BNC kabler samles i et enkelt kabel (midterste panel), som er forbundet med en data erhvervelse kort i en arbejdsstation (længst til højre panel) til computerstyring. (D) dette panel viser spejl og dichroic stråledeler mounts. (E) bygning en fiber kobling i et bur system. En fiber adapterpladen (AP) er monteret i en z-akse oversættelse mount (ZTM), således at dens afstand til den akromatisk dobbelt linse (L1, side Se vist) kan moduleres. AP og ZTM har matchende tråde, samme som L1 og bur plade. (F) A par af iris (omkranser) installeres under proceduren justering for flere lasere. De bruges til at sikre, at 647-nm laser (venstre panel) og 561-nm laser (højre panel) gå gennem den samme sti. (G) A delvis del af stien emission er vist. Uden for selve mikroskop er emission filteret hjulet, emission splitter og EMCCD kameraet installeret i rækkefølge. (H) dette panel viser belysning arm forsamling. Mag linsen er indsat i belysning arm. Excitation laserstråler sendes til belysning arm gennem optiske fibre og optiske fiber kobling (på højre side af billedet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mag linse. (A) dette panel viser ortografisk fremskrivninger af indehaveren boliger linser for Forstørrelsesglas laserstråler (enhed: mm). Dette design er beregnet til at passe ind i belysning armen. (B) dette panel viser en intern tegning af hullet i indehaveren hvor to linser få i. L1 er en konkav linse og L2 er en konveks linse, og afstanden mellem dem er summen af deres brændvidder. (C) Dette er et foto af mag linse. (D) mag linsen kan indsættes i belysning arm til at udvide eller fokusere laserstråler (venstre) eller kan fjernes for at holde laserstråler uændret (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: 3D-linsen. (A) dette panel viser ortografisk fremskrivninger af indehaveren har en tom cirkelformet hul for bypass-tilstand og et rektangulært hul for at holde den cylindrisk linse (enhed: mm). Dette design er bestemt til at være egnet til DIC analyzer skyder i et mikroskop krop. (B) Dette er et foto af 3D-linsen. (C) den cylindrisk linse kan være involveret i strålegangen emission kan forårsage vævede med bygningsfejl (venstre) eller kan frakobles for bypass-tilstand, at holde vævede intakt (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: multi-kanal justering af emission splitter. Ordninger af optik og lys sti er vist i emission splitter med (A) en bypass kube, (B) en kalibrering terning, og (C) en tredobbelt kube. M = spejl. Bypass kube har et spejl inde (M5) og skal anvendes med en emission filter (UDDRIVNINGSFRAKTION) i barriere filteret hjulet. Kalibrering cube har stråle splittere (BS), der giver lys til at gå gennem alle kanaler. Den tredobbelte cube har to dichroic beam splittere (DBS), samt tre emission filtre. (D) disse er billeder af de tre terninger. (E) det indre af emission splitter er vist uden en terning (øverste panel) og med en terning (nederste panel) skydedøre i. M3 er bag M4 og fanget ikke i fotoet. Kontrol drejeknapper for spejlene er på toppen af emission splitter (øverste panel). (F) dette panel viser kanal justering ved hjælp af kalibrering kuben under DIC. (G) dette panel viser en fint justering af de grønne (toppanelet) og rød (midterste panel) kanaler ved hjælp af 100-nm multikanals perler og en tredobbelt kube. En flettede billede af de to kanaler er også vist (nederste panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative SR billede erhvervelse. Disse paneler viser et repræsentativt DIC billede (A) nedenfor, (B) på, eller (C) over det centrale plan af celler. (D) dette panel viser et eksempel på polyesterfibre af blinker på fluorophores. Den orange cirkel omgiver en "lodret" polyesterfibre. Den grønne cirkel omgiver en "horisontal" polyesterfibre. Den blå cirkel omgiver en diamant-formede PSF, der repræsenterer fluorophores på en målrettet plan. (E) dette panel viser en repræsentant rekonstrueret SR billede. En lille regulerende RNA er mærket med fluorescens i situ hybridisering med røde farvestof. De hvide kanter markerer kanterne af cellerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: en programmeret data erhvervelse kode for SR imaging. I denne programmerbare erhvervelse modul, forskellige udførelse kommandoer og mikroskop kontrolfunktioner er anført i panelet til venstre og kan vælges til at oprette programmeret erhvervelse kode. Kommandoerne køres sekventielt fra top til bund. Dette skærmaftryk viser et eksempel, hvor en foruddefineret række gentog imaging erhvervelser er gennemført indtil erhvervelsen er stillet og antallet af Steder i tre sekventielle billedrammer beregnes. Hvis det gennemsnitlige antal af disse steder er tærskel (defineret som 50% af antallet celler i bakteriel imaging), fortsætter image erhvervelse i samme loop. Hvis tærsklen, derefter billede erhvervelse fortsætter i næste loop hvor stærkere violet laser power bruges (klip nederst i skærmbilledet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: repræsentant epi-fluorescens billeder. (A) dette panel viser en lille regulerende RNA i E. coli celler. (B) dette panel viser et mRNA i U2OS pattedyrsceller. RNA'er er mærket med røde farve og blå farvestof gennem fluorescens i situ hybridisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: eksempel på smFRET imaging. (A) prøver var begejstrede med 561-nm laser. (B) emissioner fra de grønne og røde farvestoffer opsamles samtidigt og vises som grønne (højre) og rød (venstre) steder, henholdsvis. (C) dette panel viser repræsentative fluorescens intensitet vs. tid baner af grøn farve (grøn) og rød farve (rød) fra ét molekyle. (D) dette panel viser den FRET effektivitet vs. tid bane (blå streg) beregnes som jegAcceptor/ (jegDonor + IAcceptor) fra ét molekyle af prøven. FRET spor er monteret med de skjulte Markov-Model (stiplet rød linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne hybrid mikroskop system eliminerer behovet for at købe flere mikroskoper. De samlede omkostninger for alle dele, herunder optiske bordet, tabel installation arbejdskraft, software og arbejdsstation, er omkring $230,000. Custom-fræsede dele, herunder mag linse og 3D-objektiv, koste omkring $700 (omkostningerne afhænger af de faktiske afgifter på forskellige institutter). Typiske kommercielt tilgængelige integrerede systemer for enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskopi koste mere end $300.000 ~ 400.000 og er ikke let tilgængelige for smFRET måling eller epi-tænkelig nemlig en rimelig synsfelt uden hvidt lys kilde. Således kan tilgang præsenteres her opnå billedbehandling kapaciteter svarende til flere mikroskoper til en betydeligt reduceret pris.
Denne moduleret mikroskop system kan være baseret på mikroskop organer fra forskellige producenter. 3D-linsen kan potentielt være installeret i enhver position i stien emission, herunder inde emission splitter, inden for selve mikroskop eller i ledig plads mellem filteret hjulet og objektive næsestykket. Men den fysiske placering af 3D-linsen vil bestemme dens brændvidde for at opnå den bedste bygningsfejl effekt for 3-D SR billeddannelse. Vi anbefaler at starte med en 10-m brændvidde. Mag linsen er hovedsagelig en stråle expander installeret i stien excitation. Hvis excitation lasere er luft-koblet (dvs., uden optisk fiber), det er trivielt at installere sådan en expander i enhver plet efter laserstråler er kollimeret. Hvis excitation lasere er fiber-kombineret, derefter kigge efter ekstra slots til at installere to objektiver (en konkav og den anden konveks). For eksempel har mange kommercielle belysning våben slots for neutral-tæthed filtre. Finde to objektiver med summen af deres brændvidder svarende til afstanden mellem de to slots. De kan derefter indsættes for at fungere som en mag linse. Alternativt kan en mount for feltet mellemgulvet skyderen være et andet sted, hvis den er tilgængelig. Bygning mag linsen i en flytbar kassette har den yderligere fordel af aktivering til at fokusere excitation lasere til at opnå højere magt, som kan være nødvendige for SR imaging, simpelthen ved at vende retningen af mag linse.
I denne rapport viste vi, fleksibel Skift mellem tre forskellige Billeddannende teknikker ved hjælp af en moduleret mikroskop. Denne opsætning kan anvendes til bredere og mere avancerede programmer. For eksempel, SR-konfiguration kan bruges til enkelt-partikel sporing i levende celler, på foto-switchable eller photoactivatable fluorescerende proteiner-tagged biomolekyler af interesse18,19. Konfigurationen af smFRET kan bruges til at studere molekylære interaktioner i i vivo systemer20. Emission splitter-baseret multi-kanal detektion kan kombineres med SR-konfiguration til at udføre to-farve SR imaging eller enkelt-partikel tracking samtidigt21.
Denne opsætning kan udvides yderligere for at aktivere mere moduleret komponenter. For eksempel kan et andet lag af filter tårn og belysning rum tilføjet, så der yderligere excitation/emission kurver kan oprettes for ekstra kanaler, såsom en med en infrarød (IR) laser for imaging prøver mærket med IR farvestoffer. Ud over at lade den ekstra billedbehandling kanal, kan IR lasere bruges til at korrigere fase drift i SR imaging enten under imaging erhvervelse eller under post analyse. For afdrift korrektion under imaging erhvervelse, hvis z-drift korrektion system ikke er tilgængelig fra fabrikanten mikroskop et alternativt system med IR laser kan være enten hjemmebygget14 eller erhvervet fra tredjepartsvirksomheder. For efter købet drift korrektion, kan en IR laser bruges til at spore fiducial markører. 22
Enkelt-molekyle opdagelse-baseret SR mikroskopi kræver to sæt af software, én til dataopsamling og én til dataanalyse. For dataopsamling, selv en simpel hjemmebygget software, der tager billeder gennem kameraet mens kontrollerende lasere ON/OFF adfærd kan arbejde for at generere SR billeder, mens det er muligt at manuelt modulere 405-nm laser power, fx ved at dreje en gradient neutral-tæthed filter installeret foran laseren. Denne måde at føre eksperimentet er imidlertid afhængige af den eksperimentatoren subjektive dom af tætheden i blinker på steder. Således, denne måde er ikke objektiv og kan ikke være egnet til at blive brugt til kvantificering af SR imaging data. Data erhvervelse koden bruges her omfatter plet påvisning / en optælling algoritme mens dataopsamling er igangværende, gør det muligt automatisk graduering magtens 405-nm laser baseret på tætheden i blinker på steder (figur 6). I dag, leverer nogle mikroskop producenter programmerbare billedbehandling moduler, så man kan udnytte disse, eller kigge efter plugins fra åbne kilder som Micro-Manager. Til dataanalyse er det muligt at bruge kommercielt tilgængelige analyse moduler fra mikroskop producenter eller kigge efter plugins fra åbne kilder som ImageJ.
I Resumé giver set-up præsenteres her høje alsidighed og nemt skifte mellem forskellige imaging konfigurationer til en reduceret pris og plads. Dette set-up er relativt let at vedtage ved enhver research laboratory i biologiske videnskaber med behov for rutine og forskelligartede imaging eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
J.F. anerkender støtte fra programmet Searle forskere og NIH Directors nye Innovator Award. Forfatterne anerkender nyttige forslag fra Paul Selvin lab (University of Illinois, Urbana-Champaign) for positionering 3D-linsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
