Summary
Her presenterer vi en praktisk guide for å bygge en integrert mikroskopi system, som sammen med konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert super-oppløsning bilder og multi-farge single-molekylet gjenkjenning, inkludert Single-molekylet fluorescens resonans energioverføring bildebehandling, i et oppsett på en kostnadseffektiv måte.
Abstract
Fluorescens mikroskopi er et kraftig verktøy for å oppdage biologiske molekyler i situ og overvåke deres dynamikk og samhandling i sanntid. I tillegg til konvensjonelle epi-fluorescens mikroskopi, er ulike imaging teknikker utviklet for å oppnå bestemte eksperimentelle mål. Noen av de brukte teknikkene inkluderer enkelt-molekylet fluorescens resonans energioverføring (smFRET), som kan rapportere conformational endringer og molekylære interaksjoner med angstrom oppløsning og enkelt-molekylet gjenkjenning-basert Super-oppløsning (SR) bildebehandling, som kan forbedre romlig oppløsning ca ti å twentyfold forhold til Diffraksjon-begrenset mikroskopi. Her presenterer vi en kunde-designet integrert system, som fletter flere tenkelig metoder i en mikroskop, inkludert konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR imaging og multi-farge single-molekylet oppdagelsen, inkludert smFRET bildebehandling. Tenkelig metoder kan oppnås raskt og reproduserbar ved å bytte optiske elementer. Dette oppsettet er enkelt å vedta ved noen forskningslaboratorium i biologi med behov for rutine og variert tenkelig eksperimenter reduserte kostnader og plass i forhold til bygge separate mikroskop for personlige formål.
Introduction
Fluorescerende imaging utføres rutinemessig i mange biologi laboratorier fluorescens mikroskop er viktige verktøy for den moderne biologisk forskningen. Ved å merke biomolecules rundt med fluorophores, kan vi direkte visualisere dem under mikroskopet og registrere tidsavhengige endringene i lokalisering, konformasjon, samhandling, og forsamlingen staten i vivo eller i vitro. Konvensjonelle fluorescens mikroskop har Diffraksjon-begrenset romlig oppløsning, som er ~ 200-300 nm i laterale retning og ~ 500-700 nm i aksial retning1,2, og er derfor begrenset til bildebehandling på 100s av nanometer til mikron skala. For å vise finere detaljer i molekylær montering eller organisasjonen, er ulike SR-microscopies som kan bryte Diffraksjon grensen utviklet. Strategier som brukes til å oppnå SR inkluderer ikke-lineære optiske effekter, som tilsvarende nedbryting (STED) mikroskopi3,4 og strukturert belysning mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiske gjenkjenning av enkelt molekyler, som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM)8 og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9og en kombinasjon av begge, for eksempel MINFLUX10. Blant disse SR microscopies, kan enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskop relativt lett endres fra en enkelt-molekylet mikroskop oppsett. Med repeterende aktivisering og bildebehandling photoactivatable fluorescerende proteiner (FPs) eller Foto-valgbar fargestoffer merket på biomolecules rundt, kan romlig oppløsning nå 10-20 nm11. Dynamikk i sanntid, angstrom-til-nanometer oppløsning kreves for å få informasjon om molekylære interaksjoner og conformational. smFRET12,13 er en tilnærming til å oppnå denne oppløsningen. Vanligvis avhengig av biologiske spørsmålene rundt kreves tenkelig metoder med forskjellig romlig oppløsning.
Vanligvis for hver avbildning, er bestemte eksitasjon og/eller utslipp optiske konfigurasjon nødvendig. For eksempel er en av de mest brukte belysning metodene for single-molekylet gjenkjenning gjennom totale interne refleksjon (TIR), der en bestemt eksitasjon vinkel må oppnås gjennom et prisme eller gjennom linsen. For smFRET deteksjon må utslipp fra både giver og acceptor fargestoffer romlig atskilt og sendt til ulike deler av den elektron-multiplisere, kostnad - sammen enhet (EMCCD), som kan oppnås med et sett med speil og dichroic strålen splitters plassert i utslipp banen. For tredimensjonale (3D) kreves SR imaging, en optisk komponent, for eksempel en sylindrisk linsen14, å forårsake en astigmatisme effekt i utslipp banen. Derfor homebuilt eller kommersielt tilgjengelig integrert mikroskop er vanligvis, funksjonelt spesialisert for hver imaging metode og er ikke fleksible bytte mellom tenkelig metoder på det samme oppsettet. Her presenterer vi en kostnadseffektiv, hybridsystem som gir justerbar og reproduserbar veksler mellom tre forskjellige metoder for bildebehandling: konvensjonelle epi-fluorescerende bildebehandling med Diffraksjon-begrenset oppløsning, enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR bildebehandling, og multi-farge single-molekylet oppdagelsen, inkludert smFRET imaging (figur 1A). Spesielt satt opp presenteres her inneholder fiber-kombinert inngang laser for multi-farge eksitasjon og en kommersiell belysning arm i eksitasjon banen som lar programmert kontroll over eksitasjon vinkelen, bytte mellom epi- og TIR modus. I utslipp banen, en flyttbar homebuilt sylindriske linsen kassett plasseres i mikroskopet kroppen for 3D SR bildebehandling, og en kommersiell strålen splitter er plassert foran en EMCCD kamera som kan aktiveres selektivt å oppdage flere utslipp kanaler samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroskop Design og montering
-
Eksitasjon banen
Merk: Eksitasjon banen inneholder lasere, differensial forstyrrelser kontrast (DIC) komponenter, mikroskop kroppen og sitt belysning arm.- Forberede en vibrasjon-isolert optisk tabell. For eksempel gir en strukturell demping tabell med 48 x 96 x 12'' plass for alle komponentene.
Merk: Bygge satt opp i et rom med temperaturkontroll (f.eks21.4 ± 0.55 ° C). Temperatur stabilitet er avgjørende for å opprettholde den optiske innretting. - Installere et mikroskop organ som er utstyrt med en belysning arm for optisk fiber tilkobling, en 100 X oljeneddyp TIRF linsen og DIC komponenter.
- Plasser fire laser heads (647 nm, 561 nm, 488 nm og 405 nm, omgitt av figur 1B) og sin varme synker i tabellen optisk, og kontroller at slippes ut laserstråler har samme høyde og er så kort som mulig for å sikre god stabilitet (f.eks 3'').
Merk: Hvis en laser hode sitter i en kortere høyde enn andre lasere, putte en aluminiumsplate med tilstrekkelig tykkelse under den. Alltid sikre maksimal kontakt mellom kjølefinner og optisk for den beste varmespredningen (figur 1B). Lasere må være kraftig nok for SR bildebehandling. Se tabellen i materialer. Det anbefales å ha laser rydde opp filtre foran diode laser. - Installere et datakort oppkjøpet gjennom en peripheral component interconnect (PCI) grensesnitt i en arbeidsstasjon og koble lasere med dette kortet. Kontrollere laserstrålenes ON/OFF atferd av transistor-transistor logikk (TTL) utgang, og deres makt justering av analoge utgangen av dette kortet (figur 1 c). Installere en skikkelig mikroskopi tenkelig programvare (kommersielle eller homebuilt) å kontrollere oppkjøpet datakortet, samt selve mikroskop.
- Montere speilene og dichroic strålen splittere (590 525 og 470 lenge passere filtre) til deres respektive mounts. Bruk svært stabil speil monterer for speilene. Bruke sirkulære splittere med beholde ringer for å unngå alle bøye av dichroic strålen delelinjene (figur 1 d).
- Plass speil og dichroic strålen splittere i tabellen optisk kombinere laserstråler (figur 1B). For å oppnå mest stabile justeringen, gjør hele arrangement så kompakt som mulig, og bruk 1''-tykkelse optisk stillinger. Ordne lasere slik at de kortere bølgelengde lasere er nærmere optisk fiber koblingen (figur 1B) siden kort-bølgelengde lys spre mer i luften.
- Kombinere laserstråler i en enkelt optisk fiber. For å gjøre så, bygge en fiber coupler i et bur system gjennom følgende trinn:
- Montere en fiber adapterplate i en z-aksen oversettelse mount (figur 1E, venstre panel).
- Montere en akromatisk doublet linse (brennvidde = 7,5 mm) i en bur plate (figur 1E, andre panelet fra venstre).
- Koble de to delene ovenfor ved utvidelse stenger å danne et bur. Montere buret på tabellen optisk med monteringsbrakettene på 1''-tykk optisk innlegg (figur 1E, midtre panelet).
- Juster 647-nm laser først med en enkelt optisk fiber (FC/APC slutt kabelendene).
Merk: En grov justering ved hjelp av en multi optisk fiber før du bruker den enkelt optisk fiberen kan hjelpe justeringen prosessen. Justere vinklene av speilene og dichroic strålen splittere (figur 1 d, ved justering knotter), og avstanden mellom akromatisk doublet linsen og fiber adapterplate (figur 1E, ved å justere z oversettelse mount) å få maksimal laser utgangseffekt gjennom fiber. - Justeringen av første laser, midlertidig installere et par iriser og justere resten av lasere enkeltvis (figur 1F). Kontakt justering effektivitet en strømmåleren.
- La en iris foran adapterplate å redusere refleksjoner av lasere.
Merk: Sterk refleksjoner kan redusere levetiden til laser kilder. En optisk isolator kan eventuelt installeres foran hver laser hodet Fjern refleksjoner fullstendig.
- Koble den andre enden av fiberoptiske til belysning armen av mikroskopet (figur 1 H).
- Designe og installere "forstørrelse objektivet (mag objektiv)" gjennom følgende trinn:
Merk: Lasere kan brukes for epi-fluorescens avbilding av prøven, men trangt innløp stråle størrelsen på hver laser begrenser opplyst området utvalget til et område flere ganger mindre enn den faktiske størrelsen på tilsvarende kameraets sensor, spesielt for nyere kameraer (med 18.8 mm diagonale lang sammenlignet med konvensjonelle 11,6 mm lengden). Dermed er det ønskelig å utvide strålen for å oppnå en større og flatere belysning av prøven.- Utforme mag objektivet, som kan passe inn i belysning armen (figur 1 H).
Merk: Design av mag linsen kommer an på hvor det skal installeres. Figur 1 H viser et eksempel på installasjon i belysning armen, men det kan installeres i et sted etter laserstråler er collimated (se diskusjon). Design med en dataassistert design og tegning programvare. - Plasser to achromatic linser, en konkav (brennvidde = f-1), og en konveks (brennvidde = f2) i hjemmelaget mag linsen holderen (figur 2A og 2 C), med avstanden lik summen av deres brennvidder, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (figur 2B).
Merk: Med dette valget av brennvidder, mag linsen utvider strålen av f2/ | f1| = 2 folder. Mag objektivet gir allsidighet. Det kan være fjernet for å gjenoppta vanlig lys uten å utvide bjelker (figur 2D) eller settes inn i motsatt retning å fokusere laserstrålen for å oppnå en sterkere eksitasjon intensitet.
- Utforme mag objektivet, som kan passe inn i belysning armen (figur 1 H).
- Forberede en vibrasjon-isolert optisk tabell. For eksempel gir en strukturell demping tabell med 48 x 96 x 12'' plass for alle komponentene.
2. utslipp banen
Merk: Utslipp banen består av en flyttbar sylindriske linse, en barriere filter hjul, en utslipp splitter og et EMCCD kamera (figur 1G). For å oppnå det beste punktet spredning funksjon (PSF) enkelt molekyler, DIC prisme er satt bort på linsen.
- Custom-designe sylindriske linse (3D objektiv) kassetten, som kan passe inn i den manuelle DIC analyzer inn spor i mikroskopet kroppen (Figur 3 c).
Merk: Dette design ikke kompromiss DIC analysatoren siden en analyzer blokk kan settes i filteret dreieskiven. - Plasser 3D linsen på 10 m av brennvidde i kassetten og sett den inn utslipp strålen banen å opprette astigmatisme effekten nødvendig for utdrager hver enkelt molekyl14z koordinatene.
Merk: Eventuelt 3D linsen kassetten kan plasseres i eller ut av utslipp banen (Figur 3 c). - Installere en flere bånd dichroic strålen splitter i filteret dreieskiven i mikroskopet kroppen.
- Installer utslipp filtre.
Merk: Utslipp filtrene er valgt avhengig av den foretrukne fluorophores. Avhengig av modulen imaging brukes utslipp filtre plassert på forskjellige steder som beskrevet nedenfor:- Sekvensiell multi-farge epi-fluorescens imaging eller SR bildebehandling, bruke utslipp filtre i barriere filter hjulet tilkoblet ved siden av mikroskopet kroppen å redusere vibrasjoner i mikroskopet kroppen under channel-bryter (figur 1G).
- For samtidige multi-farge-detection (f.eks, smFRET eksperimenter), plasserer du et annet filter i et utslipp splitter (Sjekk trinn 4 for detaljer).
Merk: Vanligvis en kommersiell utslipp splitter har to valgbar modi (dvs., "engasjert" eller "bruk"-modus). Separate utslipp lys kromatisk for samtidige multi-farge imaging («forlovet» modus), et filter kuben holder to dichroic strålen splittere og tre utslipp filtre brukes ("trippel kube," figur 4C og 4 D). Et tomt spor i barriere filter hjulet er brukt i kombinasjon med trippel kuben. På den annen side, for sekvensiell multi-farge bildebehandling, er trippel kuben erstattet av en kube som bare har en speilet inni ("omkjøringsvei kube," figur 4A og 4 D).
- Installere EMCCD kameraet som siste del av utslipp banen. Bruke USB-PCI-forbindelsen for å oppnå en rask bildefrekvens.
Merk: En EMCCD kamera anbefales for mest sensitive single-molekylet deteksjon, men en avansert sCMOS kamera kan være et alternativ.
3. Diffraksjon-begrenset tenkelig med Epi-eksitasjon
- Justere eksitasjon lasere tilfeldige vinkel til epi-modus i belysning armen.
- Frigjøre 3D linsen hvis engasjert (Figur 3 c, høyre panel).
- Sett inn omkjøringsvei kuben i utslipp splitter (figur 4A og 4E, nedre panelet).
- (Valgfritt) Sett inn mag linsen for et utvidet belysning område (figur 2D, venstre panel).
Merk: Med bruk av en mag linse og en 100 X oljeneddyp linsen, ca 91 x 91 µm2 kan være opplyst jevnt, eliminerer behovet for å bruke en hvit lyskilde og flere filter kuber. - Bruk en mikroskopi bildebehandlingsprogrammer ta flerkanals, og/eller Z-stack og/eller time-lapse bilder.
Merk: Det finnes flere programmer tilgjengelig for mikroskopi bildebehandling, ikke bare fra mikroskop produsenter, men også fra tredjeparts selskaper eller åpen kildekode-utviklere.
4. flerkanals Single-molekylet Imaging inkludert smFRET
Merk: Flytte til "tomme" posisjon i barriere filter hjulet, slik at alle utslipp med noen bølgelengde kan nå til det andre settet med filtre/dichroic strålen splittere i utslipp splitter.
- For å sette opp multi-farge justere single-molekylet påvisning av overflaten-immobilisert molekyler15 bruker TIRF eksitasjon, inkludert smFRET måling, eksitasjon lasere tilfeldige vinkelen til TIRF vinkel. Frigjøre mag linsen og 3D linsen.
- Engasjer tre-kanals modus i utslipp splitter (figur 1G) gjennom følgende trinn:
- Erstatte omkjøringsvei kuben med en "kalibrering kube" som tillater lyset å gå gjennom alle kanaler (figur 4B og 4E).
- Slå på kameraet under DIC (dvs., uten utslipp filter i barriere filter hjulet) og justere åpning splitterens utslipp til tre fullt atskilt kanaler vises på skjermen.
Merk: Utføre dette trinnet med lysforholdene tent, for å visualisere alle kanaler. - Slå av vertikal/Horisontal justering kontroll knotter på utslipp splitter og omtrent justerer de tre kanalene (figur 4E og 4F).
- Slå av kameraet og erstatte kalibrering kuben med en trippel kube (figur 4C og 4E).
- Plass en prøve med 100-nm flerkanals perler på 100 X linsen og fokus på prøven.
- Slå på kameraet og 488-nm laser zoomer inn på en av lyse perler og fint justere de tre kanalene ved å slå justeringen kontroll knotter igjen (figur 4E og 4 G).
Merk: 100-nm flerkanals perler avgir ulike bølgelengder av lys 488-nm eksitasjon, aktivere tre-kanals justeringen.
- Slå på kameraet og lasere, fokus, og finne en god posisjon med en rimelig spot tetthet. Justere laser makt og eksponering tid å oppnå akseptable for signal-til-støy og photobleaching. Bruke mikroskopi tenkelig programvare for å ta time-lapse bilder.
5. SR Imaging
Merk: Dette er enkelt-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskopi.
- Sette opp SR bildebehandling, sett inn 3D linsen og fjerne mag linsen. Angi eksponeringstiden for kameraet i den aktuelle laser kanaler (f.eks5-60 ms). Bestemme og manuelt sette den optimale eksitasjon lasere tilfeldige vinkel skal TIRF vinkelen.
- Plass prøven i SR imaging buffer16. Tillate buffer til equilibrate på minst 10 min før bildebehandling.
Merk: SR tenkelig buffer utløper etter ca 1t, så gjør nye SR imaging buffer tilsvarende. - Ta en DIC bildet før SR bildebehandling. For å finne riktig objektive høyden for SR, som optimaliserer astigmatisme effekten, kan du bruke DIC for å finne midten flyet av cellene. Identifisere flyet ved høyden som cellene overgang fra "lys" til "mørk" bilder og synes å bli gjennomsiktig (figur 5A, 5Bog 5 C). Når ønsket fokalplanet bestemmes, engasjere z-drift korreksjon systemet (figur 1A).
- Gjennomføring SR bildebehandling. Endre 405-nm laser makt til å opprettholde en rimelig tetthet av "blinker på" flekker.
Merk: Det er mulig å endre 405-nm laser manuelt, er det mer praktisk å kjøre et programmert data oppkjøpet kode for å opprettholde tettheten av "blinker-on" flekker. Her er et eksempel på hvordan den utføres automatisk. Kildekoden er tilgjengelig på forespørsel (figur 6).- Start tenkelig oppkjøpet med 0 W/cm2 fiolett laser makt.
- Telle antall blinker på flekker i en bestemt periode.
- Modulere fiolett laser makt slik at antallet blinker på flekker holdes over en brukerdefinert "telling terskelen" i synsfeltet. Øke den fiolette laser makten når antall blinker på steder drops under telling terskelen.
- Avslutte oppkjøpet når antall blinker på flekker faller under telling grensen med maksimal fiolett laser makt.
Merk: Maksimal kan angi forskjellig avhengig av prøven lysstyrken, men ikke høyere enn 130 W/cm2. Avhengig av faktiske mål SR avbilding, kan automatisk oppkjøpet koden manuelt sies opp når som helst ønsket.
- Kontroller blinkende atferd og PSFs av stedene snart etter oppkjøpet.
Merk: Hvis blinkende atferden ikke er ideelt, endre eksitasjon lasere tilfeldige eller erstatte tenkelig bufferen. Forvent et utvalg av "vertikal", "horisontal" og "diamond" figurer av PSF, som representerer fluorophores fra under ovenfor, og innen fokalplanet, henholdsvis (figur 5 d). Hvis de fleste flekker viser enten vannrett eller loddrett PSFs, fokalplanet er av fra midten av cellene, så avslutte eksperimentet og justere fokalplanet igjen. En tilstedeværelse av luftboble i neddyppingsolje eller andre lokale faktorer kan påvirke PSFs' kvalitet, så det kan være nødvendig å erstatte olje eller endre til et annet tenkelig område av utvalget. - For dataanalyse, kan du bruke åpen kildekode (i NIH ImageJ plugins) eller kommersielt tilgjengelige koder å oppdage centroids av hver spot i hver tenkelig ramme og ekstra z-verdier for hver spot fra x - og y-bredder14.
Merk: I denne rapporten en kildekode opprinnelig utviklet i en av de tidligste single-molekyl gjenkjenning-basert SR8 ble endret 3D oppdagelsen16 og ble brukt. - I to farger imaging, image fluorophore med lengre eksitasjon bølgelengde, etterfulgt av en med kortere eksitasjon bølgelengde. Kjøre automatisert oppkjøpet kode tilsvarende beskrevet i trinn 5.4, men med en annen tenkelig laser.
Merk: kromatisk aberrasjon bør korrigeres mellom bilder med forskjellige fluorophores (f.eks, rød farge og gul-grønne farge). Her er fremgangsmåten.- Nakkens flere 100-nm flerkanals perler på glass dekkglassvæske, unngå danner klynger.
- Ta bilder av dem i ulike eksitasjon kanaler.
- Pakk deres (X, Y, Z) koordinerer programvare (trinn 5.6).
- Plot ΔXjeg = X1i - X2i og ΔYi = Y1i - Y2i (jeg er for forskjellige perler og 1 og 2 er forskjellige fargekanaler) separat og passer dem med riktig funksjoner. Lagre funksjonene.
Merk: Lineære funksjoner er tilstrekkelig i de fleste tilfeller. Når disse funksjonene er fastsatt, har ikke dette målet gjentas hver gang for imaging. - I faktiske tofarget SR avbilding av interesse, kan du bruke funksjonene til riktig (X, Y) kromatisk aberrasjon. For z-retningsbestemt kromatisk aberrasjon, gjennomføre det ved å skaffe ΔZ = Z1 - Z2 for flerkanals perler eller kjente referansen flerkanals prøver seeded sammen med prøven av interesse.
Merk: i motsetning til (X, Y) kromatisk aberrasjon, z-retningsbestemt kromatisk aberrasjon forekommer ikke godt-i hvert eksperiment, hovedsakelig på grunn av ufullstendige z-retningsbestemt fokus vedlikehold på kanal veksling. Derfor er det anbefalt å gjennomføre korreksjon hver gang. ΔZ = Z1 - Z2 er stort sett uavhengig av (X, Y), så bare noen perler eller referanse prøver ville være tilstrekkelig per hvert område av interesse. Plot konstruert siste to farger SR bildene i en 3-D visualisering programvare og kontrollerer ΔZ manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne mikroskop tillater fleksible og reproduserbar bytte mellom tenkelig metoder. Her viser vi Bildeeksempler samlet med hver tenkelig modul.
Figur 5 d viser PSF av blinker på molekylet under SR oppkjøp. Tusenvis av slike bilder er rekonstruert for å generere det endelige SR bildet (figur 5E). Figur 5E viser de samme bakteriell regulatoriske RNAs som vist i epi-fluorescens bildet i finne 7A. Figur 7 viser representant epi-fluorescens bilder av en liten regulatoriske RNA i Escherichia coli celler og en mRNA i U2OS pattedyrceller. Begge RNAs er merket med fluorophore-merket DNA oligo gjennom i situ hybridisering17. Figur 8 viser representant smFRET måling av brettet RNA molekyler merket med donor fargestoff (grønt fargebad) og acceptor fargestoff (rød farge). Komplekser er immobilized i mikroskopet lysbildet, og begeistret av TIRF belysning. Fluorescens intensitet baner kan hentes fra enkelt molekyler, genererer bånd effektivitet som en funksjon av tid.
Figur 1: utformingen av mikroskopet opplegget. (A) dette panelet viser et diagram over oppsettet. M = speil, DBS = dichroic strålen splitter, LCF = laser oppryddingen filter, jeg = iris, L = linsen, AP = adapterplate, ZTM = z translasjonsforskning montere, av = optisk fiber, OFC = optisk fiber kopling, CL = sylindriske linsen, TL = t linsen, EF = utslipp filtre, Obj = mål linsen, og SM = trinn motor. Z-drift korreksjon systemet flyttes trinn motoren på revolveren av målet linsen i motsatt retning av den z-drift, som er beregnet av infrarød (IR) signalet generert av sin egen LED og oppdaget av sin egen detektor. (B) dette panelet viser laser eksitasjon forsamlingen. Fire lasere kombineres gjennom speil og dichroic strålen splittere og deretter sendes til en optisk fiber gjennom en fokus linse og en adapterplate sitter på en translational mount (nederst på bildet). (C) dette panelet viser laser modulering. To bajonett Neill-Concelman (BNC)-kabler er koblet til hver av laser (hodet eller kontrolleren, avhengig av produsenten) for TTL og analoge modulering (venstre panel). BNC kabler er kombinert i en enkelt kabel (midten panel) som er koblet til et datakort for oppkjøp i en arbeidsstasjon (høyre panel), for datastyring. (D) dette panelet viser speilet og dichroic strålen splitter mounts. (E) bygge en fiber coupler i et bur system. En fiber adapterplate (AP) er montert i en z-aksen oversettelse mount (ZTM) slik at avstanden akromatisk dobbel linsen (L1, side-visning vises) kan være modulert. AP og ZTM har matchende tråder, samme som L1 og bur platen. (F) A par iriser (omkranser) installeres under justering fremgangsmåten for flere lasere. De brukes til å sikre at 647-nm laser (venstre panel) og 561-nm laser (høyre panel) gå gjennom den samme banen. (G) A delvis delen av utslipp banen er vist. Utenfor mikroskop kroppen installeres utslipp filter hjulet og utslipp splitter EMCCD kameraet i rekkefølgen. (H) dette panelet viser belysning arm forsamlingen. Mag linsen settes inn i belysning armen. Laserstråler eksitasjon sendes til belysning armen gjennom optisk fiber og optisk fiber for kopling (på høyre side av bildet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: mag linsen. (A) dette panelet viser ortografisk anslag av holderen bolig linser for forstørrende laserstråler (enhet: mm). Denne utformingen skal passe til belysning armen. (B) dette panelet viser en intern tegning av hullet i holderen hvor to linser få i. L1 er en konkav linse og L2 er en konveks linse, og avstanden mellom dem er summen av deres brennvidder. (C) Dette er et bilde av mag linsen. (D) mag linsen kan settes i belysning armen utvides eller fokusere laserstråler (venstre) eller kan fjernes for å holde laserstråler uendret (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: 3D linsen. (A) dette panelet viser ortografisk anslag av innehaveren har et tomt runde hull for bypass-modus og et rektangulært hull for å holde sylindriske objektivet (enhet: mm). Denne utformingen skal passe til glidebryteren DIC analyzer i mikroskopet brødtekst. (B) Dette er et bilde av 3D linsen. (C) den sylindriske linsen kan være engasjert i utslipp strålen banen til PSFs med Astigmatisme (venstre) eller kan være fri for bypass-modus, holde PSFs intakt (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: flerkanals justering av utslipp splitteren. Ordninger av optikk og lett bane vises i utslipp splitter med (A) en bypass kube, (B) en kalibrering kuben, og (C) en trippel-kube. M = speil. Omkjøringsvei kuben har et speil i (M5) og er ment for å brukes med et utslipp filter (EF) i barriere filter hjulet. Kalibrering kuben har strålen splittere (BS) at lysene til å gå gjennom alle kanaler. Trippel kuben har to dichroic strålen splittere (DBS), og tre utslipp filtre. (D) Dette er bilder av tre kuber. (E) den interne splitterens utslipp vises uten en kube (øvre panel) og med en kube (nedre panel) skyve. M3 er bak M4 og fanget ikke i bildet. Kontroll knotter for speilene er over utslipp splitter (øvre panel). (F) dette panelet viser kanalen justering med kalibrering kuben under DIC. (G) dette panelet viser en fin justering i grønt (topp panel) og rødt (midten panel) kanalene benytter 100-nm multikanal perler og en trippel kube. En sammenslåtte bildet av de to kanalene vises også (nedre panelet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant SR bildeopptak. Disse skjermbildene viser en DIC bilde (A) nedenfor, (B) på, eller (C) over sentrale flyet av cellene. (D) dette panelet viser et eksempel på PSF av blinkende-på-fluorophores. Oransje sirkelen omgir en "vertikal" PSF. En grønn sirkel omgir en "horisontal" PSF. Den blå kretsen omgir en diamant-formet PSF, som representerer fluorophores på et fokusert fly. (E) dette panelet viser en representant rekonstruert SR bilde. En liten regulatoriske RNA er merket med fluorescens i situ hybridisering med rød farge. De hvite kantlinjene markere kantene av cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: en programmert data oppkjøpet kode for SR bildebehandling. I denne programmerbar oppkjøpet modulen ulike kjøring av kommandoer og mikroskopet kontrollfunksjoner vises i informasjonsvinduet og kan velge å opprette programmert oppkjøpet kode. Kommandoer utføres sekvensielt fra topp til bunn. Dette skjermbildet viser et eksempel der en bestemt antall iterated tenkelig oppkjøp er utført før oppkjøpet er stilt og antallet av steder i tre sekvensiell rammer beregnes. Hvis gjennomsnittlig antall disse stedene er over sperregrensen (definert som 50% av antall celler i bakteriell bildebehandling), fortsetter bildeopptak i samme loop. Hvis du er under grensen, deretter fortsetter bilde oppkjøpet i neste loop der sterkere fiolett laser makt brukes (kuttet nederst på skjermbildet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: representant epi-fluorescens bilder. (A) dette panelet viser en liten regulatoriske RNA i E. coli celler. (B) dette panelet viser en mRNA i U2OS pattedyrceller. RNAs er merket med rød farge og blått fargestoff gjennom fluorescens i situ hybridisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: eksempel på smFRET bildebehandling. (A) prøver var begeistret med 561-nm laser. (B) utslipp fra de grønne og røde fargestoffer er samlet samtidig og vises som grønne (høyre) og rødt (venstre) flekker, henholdsvis. (C) dette panelet viser representant fluorescens intensitet vs tid baner av grønn farge (grønn) og rød farge (rød) fra ett molekyl. (D) dette panelet viser den bånd effektivitet vs tid banen (heltrukne blå linjen) beregnet som jegAcceptor/ (jegDonor + IAcceptor) fra ett molekyl av prøven. BÅND spor er utstyrt med Hidden Markov Model (stiplet rød linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette hybrid mikroskop systemet eliminerer behovet for å kjøpe flere mikroskop. Totalen kostnaden for alle deler, inkludert optisk tabellen, tabellen installasjon arbeid, software og workstation, er ca $230.000. Egendefinert-maskinert deler, inkludert mag linsen og 3D linsen, koste rundt $700 (kostnaden, avhengig av den faktiske belastninger på ulike institutter). Typisk kommersielt tilgjengelig integrert systemer for single-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskopi koster mer enn $300.000 ~ 400.000 og er ikke lett tilgjengelig for smFRET måling eller epi-imaging for en rimelig synsfelt, uten hvitt lys kilde. Tilnærmingen presenteres her kan dermed oppnå tenkelig evnene tilsvarende flere mikroskop til en betydelig redusert pris.
Modulert mikroskop systemet kan være basert på mikroskopet organer fra forskjellige produsenter. 3D linsen kan potensielt installeres i enhver posisjon i utslipp banen, inkludert inne utslipp splitter, i mikroskopet kroppen eller plass mellom filteret hjulet og objektive revolveren. Men bestemmer den fysiske plasseringen av 3D objektivet dens brennvidde for å oppnå den beste astigmatisme effekten for 3D SR bildebehandling. Vi anbefaler at du starter med en 10-m brennvidde. Mag objektivet er i hovedsak en bjelke expander installert i eksitasjon banen. Hvis eksitasjon lasere er luft-kombinert (dvs., uten optisk fiber), det er trivielt å installere slike en expander i et sted etter laserstråler er collimated. Hvis eksitasjon lasere fiber-kombinert, så se etter ekstra spor å installere to linser (en konkav og et konveks). For eksempel har mange kommersielle belysning spor for nøytral tetthet filter. Finne to linser med summen av deres brennvidder lik avstanden mellom de to sporene. Deretter kan de settes for å fungere som en mag linse. Eventuelt kan beløpet for feltet membran glidebryteren være et annet sted, hvis tilgjengelig. Bygge mag linsen i en flyttbar kassett har fordelen av muliggjør en fokusere eksitasjon lasere for å oppnå høyere makt, som kan være nødvendige for SR bildebehandling, ved å snu retningen på mag linsen.
I denne rapporten viste vi fleksibel bytte mellom tre ulike Bildeteknikker bruker modulert mikroskop. Dette oppsettet kan brukes for bredere og mer avanserte programmer. For eksempel SR konfigurasjonen kan brukes til enkelt-partikkel sporing i levende celler, i bilde-valgbar eller photoactivatable fluorescerende protein-merket biomolecules av interesse18,19. SmFRET konfigurasjon kan brukes å studere molekylære interaksjoner i i vivo systemer20. Utslipp splitter-baserte flerkanals deteksjon kan kombineres med SR konfigurasjonen tofarget SR imaging eller single-partikkel sporing samtidig21.
Dette oppsettet kan utvides ytterligere for å aktivere mer modulert komponenter. For eksempel kan et lag av filteret tårn og belysning kupé legges, slik at flere eksitasjon/utslipp baner kan opprettes for ekstra kanaler, slik som med en infrarød (IR) laser for imaging prøver merket med IR fargestoffer. I tillegg til at den ekstra tenkelig kanalen, kan IR laser brukes til å korrigere den scene drift i SR bildebehandling under imaging oppkjøp eller under innlegget analysen. Hvis drift under tenkelig oppkjøpet, hvis z-drift korreksjon systemet ikke er tilgjengelige fra produsenten av mikroskopet, en alternativ systemet med IR laser kan være enten homebuilt14 eller kjøpt fra tredjeparter. Etter oppkjøp drift korreksjon, kan en IR laser brukes til å spore fiducial markører. 22
Single-molekylet gjenkjenning-basert SR mikroskopi krever to sett av programvare, en for datainnsamling og en for dataanalyse. For datainnsamling, selv en enkel homebuilt programvare som tar bilder gjennom kameraet kontroll laserstrålenes ON/OFF atferd kan arbeide for å generere SR bilder, det er mulig å manuelt modulerer 405-nm laser makt, f.eks ved å rotere en gradert nøytral tetthet filter installert foran laser. Denne måten å gjennomføre eksperimentet er imidlertid avhengig av eksperimentator skjønn av tetthet blinker på steder. Derfor denne måten er ikke objektive og kan ikke være passende å bli anvendt for kvantifisering av SR bildebehandling data. Data oppkjøpet koden her inkluderer spot oppdagelsen / en telling algoritme mens datainnsamling pågår, slik at automatiske modulering av 405-nm laser makt basert på tettheten av blinker på flekker (figur 6). I dag, tilbyr noen mikroskop produsenter programmerbare bildebehandling moduler, så kan utnytte disse, eller se etter plugins fra åpne kilder som mikro-Manager. For dataanalyse er det mulig å bruke kommersielt tilgjengelige analyse moduler fra mikroskop produsenter eller se etter plugins fra åpne kilder som ImageJ.
Oppsummert gir opplegget presenteres her høy allsidighet og enkelt bytte mellom forskjellige tenkelig konfigurasjoner til en redusert pris og plass. Dette oppsettet er relativt lett å vedta ved noen forskningslaboratorium i biologi med behov for rutine og variert tenkelig eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
J.F. anerkjenner støtte fra programmet Searle forskere og NIH nye innovatør regiprisen. Forfatterne bekrefter nyttige forslag fra Paul Selvin lab (University of Illinois, ungdomstiden) for posisjonering 3D linsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
