Summary
在这里, 我们提出了一个实用的指南, 建立一个综合显微镜系统, 合并传统的 epi 荧光成像, 单分子检测的超分辨率成像和多色单分子检测, 包括单分子荧光共振能量转移成像, 成一种以经济高效的方式进行设置。
Abstract
荧光显微术是检测生物分子原位和实时监测其动力学和相互作用的有力工具。除了常规的免疫荧光显微镜外, 还开发了各种成像技术来实现特定的实验目标。一些广泛使用的技术包括单分子荧光共振能量转移 (smFRET), 它可以报告构象变化和分子相互作用与埃分辨率, 和单分子检测基于超分辨率 (SR) 成像, 与衍射有限显微镜相比, 它可以提高约十到多倍的空间分辨率。在这里, 我们提出了一个客户设计的集成系统, 它在一个显微镜中合并多种成像方法, 包括常规的 epi 荧光成像、基于单分子检测的 SR 成像和多色单分子检测,包括 smFRET 成像。通过切换光学元件, 可以轻松、可重复地实现不同的成像方法。这种设置很容易通过任何生物科学的研究实验室, 需要进行例行和多样化的成像实验, 以降低成本和空间相对于建立单独的显微镜为个人目的。
Introduction
荧光显微镜是现代生物科学研究的重要工具, 在许多生物实验室中都经常进行荧光成像。通过用荧光基团标记感兴趣的生物分子, 我们可以在显微镜下直接可视化它们, 并记录在体内或体外的定位、构象、相互作用和装配状态的时间依赖性变化。传统的荧光显微镜具有衍射有限的空间分辨率, 在横向方向上约为 200-300 nm, 在轴向1、2中为 500-700 nm, 因此仅限于100s 的成像。纳米到微米级。为了揭示分子组装或组织中更精细的细节, 开发了各种能打破衍射极限的 SR microscopies。用于实现 SR 的策略包括非线性光学效应, 如受激发射损耗 (STED) 显微镜3、4和结构化照明显微镜 (SIM)5、6、 7、随机检测单个分子, 如随机光学重建显微术 (风暴)8和光活化定位显微镜 (PALM)9, 以及两者的组合, 如 MINFLUX10。在这些 sr microscopies 中, 基于单分子检测的 sr 显微镜可以相对容易地从单分子显微镜设置中进行修改。通过重复激活和成像光敏荧光蛋白 (FPs) 或在感兴趣的生物分子标记的光交换染料, 空间分辨率可以达到 10-20 nm11。要获得实时的分子相互作用和构象动力学信息, 需要埃到纳米分辨率。smFRET12,13是实现这一决议的一种方法。通常, 根据感兴趣的生物学问题, 需要不同空间分辨率的成像方法。
通常, 对于每种类型的成像, 都需要特定的激励和/或发射光学配置。例如, 单分子检测最常用的照明方法之一是通过全内部反射 (TIR), 在这种情况下, 需要通过棱镜或通过物镜实现特定的激励角度。对于 smFRET 检测, 供体和受体染料的排放需要在空间上分离, 并定向到电子乘法、电荷耦合器件 (EMCCD) 的不同部分, 这可以通过一组反射镜和双色光束分配器实现。放置在排放路径中。对于三维 (3-D) SR 成像, 需要在发射路径中产生散光效应的光学元件, 如圆柱透镜14。因此, 自制或商业上可用的集成显微镜通常在功能上专门用于每种类型的成像方法, 并且在相同的设置下不灵活地在不同的成像方法之间切换。在这里, 我们提出了一个经济高效的混合系统, 提供三种不同成像方法之间的可调节和重复的开关: 传统的 epi-荧光成像, 衍射有限分辨率, 单分子检测 SR。成像和多色单分子检测, 包括 smFRET 成像 (图 1A)。具体而言, 此处提供的设置包含多色激励的光纤耦合输入激光器和激励路径中的商业照明臂, 允许对激励角度进行编程控制, 以便在 epi 模式和 TIR 模式之间切换。在发射路径中, 可拆卸的自制圆柱透镜盒放置在显微镜机身内, 用于3维 SR 成像, 在 EMCCD 摄像机前放置一个商用光束分配器, 可选择性地启用检测多个发射通道同时。
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Protocol
1. 显微镜设计和组装
-
激励路径
注: 激励路径包括激光器、差分干涉对比度 (DIC) 分量、显微镜本体及其照明臂。- 准备一个隔振的光学表。例如, 结构阻尼表为 48 x 96 x 12 "为所有组件提供足够的空间。
注: 在具有温度控制的房间内建立设置 (例如, 21.4 ±0.55 摄氏度)。温度稳定性对于保持光学对准至关重要。 - 安装一个显微镜机身, 配有用于光纤连接的照明臂、100X 油浸 TIRF 物镜和 DIC 组件。
- 放置四激光头 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 和 405 nm, 包围在图 1B) 及其在光学表上的散热器, 并确保发射的激光光束具有相同的高度和尽可能短, 以确保良好的稳定性 (例如:, 3 ")。
注意: 如果激光头的高度比其他激光器高, 请在其下方放置足够厚的铝板。始终确保散热器与光学工作台之间的最大接触, 以获得最佳散热 (图 1B)。激光器需要足够强大的 SR 成像。参见材料表。建议在二极管激光器前面有激光清理过滤器。 - 通过工作站上的外设组件互连 (PCI) 接口安装数据采集卡, 并将激光器与此卡连接。通过晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 输出控制激光器的开/关行为, 并通过此卡的模拟输出进行功率调节 (图 1C)。安装适当的显微成像软件 (商业或自制) 来控制数据采集卡以及显微镜本体。
- 将镜像和分色光束分配器 (590、525和470长通滤波器) 安装到各自的底座上。为后视镜使用非常稳定的镜像支架。使用带挡圈的环形分配器, 以避免二色光束分配器的弯曲 (图 1D)。
- 将镜面和分色分光器放在光学表上, 以组合激光光束 (图 1B)。为了实现最稳定的对准, 使整个布置尽可能紧凑, 并使用 1 "厚度光学柱。安排激光器, 使较短的波长激光器更接近光纤耦合 (图 1B), 因为短波长的光在空气中消散得更多。
- 将激光光束结合成单模光纤。为此, 请通过以下步骤在笼式系统中构建光纤耦合器:
- 在 z 轴平移安装中安装光纤适配器板 (图 1E, 最左侧的面板)。
- 在笼板上安装消色差双峰透镜 (焦距 = 7.5 mm) (图 1E, 左侧的第二面板)。
- 将上述两部分连接到延长杆上, 形成一个保持架。将固定架安装在 1 "-厚光学柱上的安装支架上 (图 1E, 中间板)。
- 将 647 nm 激光器首先与单模光纤 (FC/APC 端到耦合器) 对齐。
注: 在使用单模光纤之前, 使用多模光纤进行粗对齐可能有助于对齐过程。调整后视镜和分色光束分配器的角度 (图 1D, 按调整旋钮), 以及消色差双折射透镜与光纤适配器板之间的距离 (图 1E, 通过调整 z 轴平移安装) 以获得通过光纤实现最大激光功率输出。 - 一旦第一个激光的对准完成, 暂时安装一对虹膜, 并把其余的激光器一个一个一个 (图 1F)。使用功率计检查校准效率。
- 将一个虹膜放在适配器板的前面, 以减少激光器的反射。
注: 强背反射可减少激光源的使用寿命。另外, 可以在每个激光头前安装一个光学隔离器, 以完全消除反射。
- 将光纤的另一端连接到显微镜的照明臂 (图 1H)。
- 通过以下步骤设计并安装 "放大透镜 (mag 透镜)":
注: 激光器可用于样品的外延荧光成像, 但每台激光器的窄光束尺寸将样品的照明面积限制在比相应摄像机传感器实际尺寸小几倍的区域, 特别是对于较新的相机 (与传统的 11.6 mm 长度相比, 对角线长度为 18.8 mm)。因此, 扩大光束以实现样品的更大和更平坦的照明是可取的。- 设计可装入照明臂的 mag 透镜 (图 1H)。
注意: mag 透镜的设计取决于它将安装在哪里。图 1H显示了照明臂中安装的一个示例, 但在激光光束准直后, 它可以安装在任何位置 (参见讨论)。用计算机辅助设计和绘图软件设计它。 - 将两个消色差透镜、一个凹 (焦距 = f1) 和一个凸 (焦距 = f2) 放在国产的 mag 透镜支架中 (图 2A和2C), 其距离等于焦距的总和, f1+ f2 = (-25) + 50 = 25 mm (图 2B)。
注意: 在选择焦距时, mag 透镜将光束扩展到 f2/| f1|= 2 折叠。mag 透镜提供多功能性。它可以被移除以恢复常规照明, 而无需扩展光束 (图 2D) 或插入反向以聚焦激光光束以达到更强的激发强度。
- 设计可装入照明臂的 mag 透镜 (图 1H)。
- 准备一个隔振的光学表。例如, 结构阻尼表为 48 x 96 x 12 "为所有组件提供足够的空间。
2. 排放路径
注: 发射路径由可移动的圆柱透镜、阻隔滤波器轮、发射分配器和 EMCCD 摄像机 (图 1G) 组成。为了达到单分子的最佳点传播功能 (PSF), DIC 棱镜被放离物镜。
- 定制设计的圆柱透镜 (3 维透镜) 盒, 可放入手动 DIC 分析仪插入槽在显微镜体 (图 3C)。
注意: 此设计不会危及 DIC 分析仪, 因为分析仪块可以插入过滤塔。 - 将焦距为 10 m 的3维透镜放置在磁带盒中, 并将其插入发射光束路径中, 以创建提取每一个分子14的 z 坐标所需的散光效果。
注意: (可选) 3 维镜头盒可以放置在发射路径中或外 (图 3C)。 - 在显微镜机身内部的滤塔中安装多波段二向分色分束器。
- 安装排放过滤器。
注: 根据首选荧光基团选择排放过滤器。根据成像模块, 放置在不同位置的排放过滤器使用如下所述:- 对于顺序多色 epi-荧光成像或 SR 成像, 使用在显微镜本体旁边连接的阻隔滤光片中的发射过滤器, 以最小化通道开关中显微镜主体的振动 (图 1G)。
- 对于同时多色检测 (例如smFRET 实验), 请将另一个滤波器集放在发射分配器中 (检查步骤4以了解详细信息)。
注意: 通常, 商业发射分配器有两种可切换模式 (即"啮合" 或 "旁路" 模式)。为同时进行多色成像 ("啮合" 模式) 分离发光灯色, 使用两个分色分光器和三排放滤波器的过滤立方体 ("三重立方体"图 4C和4D)。阻隔过滤轮中的一个空槽与三重立方体结合使用。另一方面, 对于顺序多色成像, 三重立方体被一个立方体 ("旁路立方体"图 4A和4D) 所取代。
- 将 EMCCD 相机安装为发射路径的最后一部分。利用 USB PCI 连接实现快速帧速率。
注意: EMCCD 相机推荐用于最敏感的单分子检测, 但高级 sCMOS 相机可以作为替代方法。
3. 具有外延激励的衍射有限成像
- 在照明臂中调整激发激光器的附带角度到 epi 模式。
- 如果啮合, 请松开3维透镜 (图 3C, 右面板)。
- 在发射分配器中插入旁路立方体 (图 4A和4E, 底部面板)。
- 可选为加宽的照明区域插入 mag 透镜 (图 2D, 左面板)。
注意: 使用 mag 透镜和100X 油浸物镜, 大约 91 x 91 µm2可以均匀照明, 无需使用白色光源和多个滤镜立方体。 - 使用显微成像软件进行多通道和/或 Z 堆栈和/或延时图像。
注意: 有多个程序可用于显微成像, 不仅从显微镜制造商, 也从第三方公司或开源开发人员。
4. 多通道单分子成像, 包括 smFRET
注: 移动到屏障过滤器轮中的 "空" 位置, 以便所有波长的发射都能到达发射分配器中的第二组滤波器/分色光束分配器。
- 建立表面固定化分子的多色单分子检测15使用 TIRF 激励, 包括 smFRET 测量, 将激发激光器的偶发角调整为 TIRF 角。松开 mag 透镜和3维透镜。
- 通过以下步骤在发射分配器 (图 1G) 中接合三通道模式:
- 将旁路立方体替换为 "校准立方体", 允许光线穿过所有通道 (图 4B和4E)。
- 在 DIC 下打开摄像机 (即阻隔滤波器轮中没有排放滤波器), 并调整发射分配器的光圈, 直到屏幕上出现三个完全分离的通道。
注意: 在房间灯光照射下执行此步骤, 可视化所有通道。 - 转动发射分配器上的垂直/水平调节控制旋钮, 大致对准三通道 (图 4E和4F)。
- 关闭相机, 并用三重立方体替换校准立方体 (图 4C和4E)。
- 将 100 nm 多通道珠子的样品放置在100X 物镜的顶部, 并将焦点放在样品上。
- 打开相机和 488 nm 激光, 放大其中一个明亮的珠子, 并通过再次转动调整控制旋钮 (图 4E和4G) 精细对准三通道。
注: 100 nm 多通道珠子在 488 nm 激发时发出不同波长的光, 从而实现三声道对齐。
- 打开相机和激光, 对焦, 并找到一个良好的位置与合理的光斑密度。调整激光功率和曝光时间, 实现可接受的信噪比和光漂白电平。使用显微成像软件拍摄延时图像。
5. SR 成像
注意: 这是基于单分子检测的 SR 显微术。
- 要设置 SR 成像, 请插入3维透镜并取下 mag 透镜。将相机的曝光时间设置在适当的激光通道中 (例如, 5-60 ms)。确定并手动设置最佳激发激光器的偶发角为 TIRF 角。
- 将示例放置在 SR 映像缓冲区16中。在成像前允许缓冲区平衡至少10分钟。
注意: sr 成像缓冲器在大约1小时后过期, 因此请相应地制作新的 sr 成像缓冲器。 - 在 SR 成像之前拍摄 DIC 图像。为了找到合适的 SR 的目标高度, 优化了散光效应, 利用 DIC 成像找到了细胞的中间平面。根据单元格从 "光" 过渡到 "深色" 图像并显示为透明 (图 5A、 5B和5C) 的高度来识别基准面。一旦确定了所需的焦平面, 请参与 z 漂移校正系统 (图 1A)。
- 进行 SR 成像。更改 405 nm 激光功率, 以保持合理的 "闪烁" 点密度。
注意: 虽然可以手动更改 405 nm 激光, 但运行编程数据采集代码以保持 "闪烁" 点的密度更方便。下面是如何自动进行的示例。源代码可根据要求提供 (图 6)。- 以0瓦/cm2紫激光功率启动成像采集。
- 计算某个时间段内闪烁点的数量。
- 调制紫激光功率, 使闪烁点的数量保持在用户定义的 "计数阈值" 在视野中。当闪烁点数降至计数阈值以下时, 增加紫色激光功率。
- 使用最大紫激光功率将闪烁点数降至低于计数阈值时终止采集。
注意: 根据样品亮度, 最大可设置为不同, 但不高于130瓦特/厘米2。根据 SR 成像的实际目标, 此自动采集代码可以在任何所需的点手动终止。
- 在开始采集后不久, 检查 PSFs 的闪烁行为和斑点。
注意: 如果闪烁行为不理想, 请更改激发激光器的附带角度或更换成像缓冲器。预计将对 PSF 的 "垂直"、"水平" 和 "菱形" 形状进行抽样, 分别代表来自下方、上方和焦点平面内的荧光基团 (图 5D)。如果大多数斑点显示垂直或水平 PSFs, 则焦点平面从单元格的中心关闭, 因此终止实验并再次调整焦点平面。浸泡油或其他局部因素中存在气泡会影响 PSFs 的质量, 因此可能需要更换机油或更改样品的不同成像区域。 - 对于数据分析, 使用开源 (在 NIH ImageJ 插件中) 或商业上可用的代码来检测每个成像帧中每个点的质心, 并从 x 和 y 宽度14提取每个点的 z 值。
注: 在本报告中, 最初在基于单分子检测的 SR8中的一个源代码被修改为3维检测16 , 并被使用。 - 在双色成像的情况下, 用较长的激发波长对荧光团进行图像, 其次是具有较短的激发波长。运行自动购置代码类似于步骤5.4 中所述的, 但使用不同的成像激光器。
注意: 在不同荧光基团 (例如, 红色染料和黄绿色染料) 的图像之间应校正色差。下面是步骤。- 在玻璃盖玻片上固定多个 100 nm 多通道珠子, 避免形成簇。
- 在不同的激励通道中拍摄它们的图像。
- 按软件提取其 (X、Y、Z) 坐标 (步骤 5.6)。
- 绘图ΔXi = x1i -x2i和ΔYi = y1i -y2i (我是为不同的珠子, 和1和2是不同的颜色通道) 分开, 并适合他们适当的功能。保存函数。
注意: 在大多数情况下, 线性函数是足够的。确定这些函数后, 每次成像时不必重复此测量。 - 在实际的双色 SR 成像中, 对感兴趣的样本应用函数来校正 (X、Y) 色差。对于 z 方向色差, 通过获取ΔZ = z1 -z2获得多通道珠子或已知的参考多通道样本与感兴趣的样本一起进行。
注: 与 (X, Y) 色差不同, z 方向色差在每个实验中都无法重现, 主要是由于通道切换时的 z 方向对焦维护不完整。因此, 建议每次进行校正。ΔZ = z1 -z2主要是独立于 (X, Y), 所以只有几个珠子或参考样品将是足够的每个样本区域的兴趣。在3维可视化软件中绘制构建的最终双色 SR 图像, 并手动检查ΔZ。
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Representative Results
这种显微镜允许在不同的成像方法之间进行灵活和可重复的切换。这里我们展示了每个成像模块收集的样本图像。
图 5D显示了 SR 采集过程中闪烁的分子的 PSF。数以千计的这样的图像被重建, 以生成最终的 SR 图像 (图 5E)。图 5E显示了与图 7A中的 epi 荧光图像中显示的相同的细菌调控 rna。图 7显示了在大肠埃希菌细胞和 U2OS 哺乳动物细胞中的 mRNA 的一个小的调控 RNA 的代表性的免疫荧光图像。两个 rna 都标记有荧光标记的 DNA 寡核苷酸通过原位杂交17。图 8显示了用捐赠染料 (绿色染料) 和受体染料 (红色染料) 标记的折叠 RNA 分子的代表性 smFRET 测量。配合物固定在显微镜滑块上, 并通过 TIRF 照明激发。荧光强度轨迹可以从单个分子中提取出来, 从而产生烦恼的效率作为时间的函数。
图 1: 显微镜设置的设计.(A) 此面板显示了设置的示意图。M = 镜像, DBS = 分色分束器, ZTM = 激光清理滤波器, I = 光圈, L = 透镜, AP = 适配器板, = 光轴平移安装, = 光纤, OFC = 光纤耦合, CL = 圆柱透镜, TL = 管透镜, EF = 发射滤波器, Obj = 物镜透镜和 SM = 步进电机。z 漂移校正系统将物镜物镜上的步进电机移动到 z 漂移的相反方向, 这是由其自己的 LED 产生的红外线 (IR) 信号计算的, 并由其自己的探测器检测到。(B) 此面板显示激光励磁组件。四激光器通过反射镜和二色光束分离器组合, 然后通过聚焦透镜和位于平移支架上的适配器板 (图片底部) 定向到光纤。(C) 此面板显示激光调制。两个刺刀 Concelman (BNC) 电缆连接到每个激光器 (无论是头部或控制器, 取决于制造商) TTL 和模拟调制 (最左侧的面板)。BNC 电缆组合成一根电缆 (中间板), 连接到工作站 (最右侧的面板) 中的数据采集卡, 用于计算机控制。(D) 此面板显示镜向和二向分束器安装。(E) 在笼式系统中建立光纤耦合器。光纤适配器板 (AP) 安装在 z 轴平移安装 (ZTM) 中, 使其与消色差双透镜 (L1、侧视图显示) 的距离可以调制。AP 和 ZTM 有匹配的线程, 与 L1 和笼板相同。(F) 在多个激光器的对准过程中安装一对虹膜 (环绕)。它们用于确保 647 nm 激光 (左面板) 和 561 nm 激光 (右面板) 经过相同的路径。(G) 显示排放路径的部分部分。在显微镜体外, 发射过滤器轮、发射分配器和 EMCCD 摄像机按顺序安装。(H) 此面板显示照明臂组件。mag 透镜插入照明臂。激发激光光束通过光纤和光纤耦合 (在图片右侧) 发送到照明臂。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: mag 透镜.(A) 该面板显示了用于放大激光光束 (单位: mm) 的支架外壳透镜的正交投影。此设计旨在适合照明臂。(B) 此面板显示两个镜头进入的支架内的孔的内部图。L1 是凹透镜, L2 是凸透镜, 它们之间的距离是其焦距的总和。(C) 这是一张 mag 镜头的照片。(D) 可将 mag 透镜插入照明臂, 以扩大或聚焦激光光束 (左), 或将其移除以保持激光光束不变 (右)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 3 维镜头.(A) 该面板显示具有旁路模式的空白圆孔的刀柄的正交投影和用于固定圆柱透镜的矩形孔 (单位: mm)。此设计旨在适合显微镜体中的 DIC 分析仪滑块。(B) 这是3维透镜的照片。(C) 圆柱形透镜可参与发射光束路径, 使 PSFs 具有散光 (左) 或可脱离旁路模式, 保持 PSFs 完好 (右)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 发射分配器的多通道对准.光学和光路的方案显示在发射分配器与 (a) 旁路立方体, (B) 校准立方体, 和 (C) 三重立方体。M = 镜像。旁路立方体内部有一个镜像 (M5), 应该与阻隔滤波器轮中的发射滤波器 (EF) 一起使用。校准立方体有光束分配器 (BS), 允许灯光穿过所有通道。三重立方体有两个双色光束分配器 (DBS), 以及三排放滤波器。(D) 这些是三立方的照片。(E) 发射分配器的内部显示没有立方体 (上部板), 并有一个立方体 (下部板) 滑动。M3 在 M4 后面, 没有在照片中捕捉到。后视镜的控制旋钮位于发射分配器 (上部板) 的顶部。(F) 此面板使用 DIC 下的校准立方体显示通道对齐方式。(G) 此面板显示了使用 100 nm 多通道珠子和三重立方体的绿色 (顶板) 和红色 (中间板) 通道的精细对准。同时显示两个通道的合并图像 (底部面板)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 代表 SR 图像采集.这些面板在单元格的中央平面上方显示一个具有代表性的 DIC 图像 (a) (B) 或 (C)。(D) 此面板显示闪烁的荧光基团的 PSF 示例。橙色圆圈围绕着一个 "垂直" 的 PSF。绿色圆圈围绕着 "水平" PSF。蓝色圆圈围绕一个菱形的 PSF, 代表荧光基团在一个聚焦的平面上。(E) 该小组展示了一个有代表性的重建 SR 图像。一个小的调控 RNA 标记与荧光原位杂交与红色染料。白色边框标记单元格的边缘。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6: 用于 SR 成像的编程数据采集代码.在这个可编程采集模块中, 在左侧面板中列出了各种执行命令和显微镜控制功能, 可以选择创建编程的采集代码。命令按顺序从上到下执行。此屏幕截图显示了一个示例, 其中将进行预定义的一定数量的迭代成像采集, 直到进行采集并计算三个连续图像帧中的斑点数。如果这些斑点的平均数量高于阈值 (定义为细菌成像中的细胞数的 50%), 图像采集将继续在同一循环中。如果低于阈值, 则图像采集将继续在下一个循环中使用更强的紫色激光功率 (在屏幕截图的底部剪切)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 7: 具有代表性的 epi 荧光图像.(A) 此面板显示大肠杆菌细胞中的少量调节 RNA。(B) 此面板显示 U2OS 哺乳动物细胞中的 mRNA。rna 通过荧光原位杂交标记为红色染料和蓝色染料。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 8: smFRET 成像的示例.(A) 样品被561纳米激光激发。(B) 绿色和红色染料的排放量同时收集, 并分别显示为绿色 (右) 和红色 (左) 斑点。(C) 此面板显示了绿色染料 (绿色) 和红色染料 (红色) 从一个分子的代表性荧光强度与时间轨迹。(D) 此面板显示了在样品的一个分子中计算出的与 i 接受者/(i供体 + I受体) 相同的时间轨迹 (实心蓝线) 的烦恼效率。烦恼的痕迹配有隐马尔可夫模型 (虚线红线)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
这种混合显微镜系统无需购买多台显微镜。所有零件的总成本, 包括光学表、表安装人工、软件和工作站, 约为23万美元。定制加工部件, 包括 mag 透镜和3维透镜, 成本约为700美元 (成本取决于不同机构的实际费用)。用于基于单分子检测的 SR 显微显微镜的典型商业可用集成系统的成本超过30万美元 ~ 40万, 且不容易 smFRET 测量, 或在不使用白光的情况下为合理的视野提供 epi 成像。源。因此, 此处介绍的方法可以实现相当于多个显微镜的成像能力, 从而显著降低成本。
这种调制显微镜系统可以基于不同制造商的显微镜实体。3维透镜可以安装在发射路径中的任何位置, 包括发射分配器内部、显微镜本体内或过滤轮与物镜物镜转换器之间的可用空间。然而, 3 维透镜的物理位置将决定其焦距, 以达到3维 SR 成像的最佳散光效果。我们建议从 10 m 焦距开始。mag 透镜实质上是在激励路径中安装的光束扩展器。如果励磁激光器是空气耦合 (i. e., 没有光纤), 在激光光束准直后, 在任何位置安装这样的膨胀器是微不足道的。如果激发激光器是光纤耦合的, 然后寻找额外的插槽来安装两个镜头 (一个凹和另一个凸)。例如, 许多商用照明臂都有用于中性密度滤波器的槽。找到两个透镜, 其焦距的总和等于两个插槽之间的距离。然后, 它们可以插入到功能作为 mag 透镜。或者, 现场隔膜滑块的安装可以是另一个地方, 如果可用。在可拆卸的磁带盒中构建 mag 透镜具有额外的优势, 使一个人能够聚焦激发激光器以实现更高的功率, 这可能是 SR 成像所必需的, 只需翻转 mag 透镜的方向即可。
在本报告中, 我们演示了使用调制显微镜在三种不同成像技术之间进行灵活切换。此设置可用于更广泛和更高级的应用程序。例如, SR 配置可用于活细胞中的单粒子跟踪, 在光开关或光敏荧光蛋白标记生物分子的兴趣18,19。smFRET 配置可用于研究体内系统中的分子相互作用20。基于发射分光器的多通道检测可与 sr 配置结合使用, 同时执行双色 sr 成像或单粒子跟踪21。
此设置可进一步扩展以启用更多调制组件。例如, 可以添加另一层滤塔和照明隔间, 以便为附加通道创建额外的激励/发射路径, 例如使用红外线 (ir) 激光器进行标有 IR 染料的成像样品。除了允许添加成像通道外, IR 激光器还可用于在成像采集期间或在后期分析期间纠正 SR 成像中的舞台漂移。对于成像采集过程中的漂移校正, 如果显微镜制造商无法提供 z 漂移校正系统, 则可使用 IR 激光器的替代系统自制14或从第三方公司获得。对于采集后漂移校正, 红外激光可用于跟踪基准标记。22
基于单分子检测的 SR 显微镜需要两组软件, 一个用于数据采集, 一个用于数据分析。对于数据采集, 即使是一个简单的自制软件, 通过相机拍摄图像, 同时控制激光器的开/关行为, 可以产生 SR 图像, 而它是可能的手动调节405纳米激光功率,例如,通过旋转一个在激光前安装梯度中性密度滤波器。然而, 这种进行实验的方式取决于实验者对闪烁点密度的主观判断。因此, 这种方法不是客观的, 可能不适合用于对 SR 成像数据进行量化。此处使用的数据采集代码包括现场检测/计数算法, 同时进行数据采集, 从而根据闪烁点的密度自动调制 405 nm 激光功率 (图 6)。如今, 一些显微镜制造商提供可编程成像模块, 因此可以利用这些组件, 或者从开源 (如微管理器) 中查找插件。对于数据分析, 可以使用显微镜制造商提供的商用分析模块, 或者从开源 (如 ImageJ) 查找插件。
总之, 这里提供的设置具有高通用性和在不同的成像配置之间轻松切换, 从而降低了成本和空间。这种设置是相对容易采用任何生物科学的研究实验室, 需要例行和多样化的成像实验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
樱承认塞尔学者计划和 NIH 主任的新创新奖的支持。作者承认保罗 Selvin 的实验室 (伊利诺伊大学香槟分校) 为定位3维透镜提供了有用的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
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