Summary
Nous présentons ici un guide pratique de construction d’un système de microscopie intégrée, qui fusionne l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, l’imagerie Super-résolution axée sur la détection de molécules simples et détection de molécules simples multicolore, y compris transfert d’énergie Single-molecule fluorescence resonance imaging, dans une mise en place d’une manière rentable.
Abstract
La microscopie de fluorescence est un outil puissant pour détecter des molécules biologiques in situ et surveiller leur dynamique et les interactions en temps réel. En plus de la microscopie épifluorescente classiques, diverses techniques d’imagerie ont été développés pour atteindre des objectifs précis expérimentales. Les techniques répandues parmi single-molecule fluorescence transfert d’énergie (smFRET), qui peut signaler des changements conformationnels et interactions moléculaires avec une résolution de l’angström et molécule unique axée sur la détection Super résolution (SR) d’imagerie, qui peut améliorer la résolution spatiale environ dix à vingt par rapport à la microscopie limitée par la diffraction. Nous présentons un système intégré de conçue par le client, qui fusionne plusieurs méthodes d’imagerie dans un microscope, y compris l’imagerie conventionnelle épi-fluorescence, molécule unique axée sur la détection SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris l’imagerie smFRET. Différentes méthodes d’imagerie est possible facilement et de façon reproductible par des éléments optiques de commutation. Cette configuration est facile à adopter par tout laboratoire de recherche en sciences biologiques avec un besoin de routine et diverses expériences d’imagerie à un coût réduit et espace par rapport aux microscopes distincts à des fins individuelles de construction.
Introduction
Microscopes de fluorescence sont des outils importants pour la recherche en sciences biologiques modernes et imagerie de fluorescence est effectuée régulièrement dans de nombreux laboratoires de biologie. Par le marquage de molécules d’intérêt avec des fluorophores, nous pouvons directement les visualiser au microscope et enregistrer les changements temporels dans la localisation, conformation, interaction et l’Assemblée d’état in vivo ou in vitro. Microscopes de fluorescence conventionnels ont une résolution spatiale limitée par la diffraction, c'est-à-dire ~ 200-300 nm dans le sens latéral et ~ 500-700 nm dans le sens axial1,2et sont, par conséquent, limité à l’imagerie à la 100 s de échelle de nanomètres-à-micron. Afin de révéler les détails dans l’Assemblée moléculaire ou l’organisation, les différentes microscopies SR qui peuvent briser la limite de diffraction ont été développés. Stratégies utilisées pour atteindre SR comprennent des effets optiques non linéaires, tels qu’émission stimulée épuisement (STED) microscopie3,4 et illumination structurée microscopie (SIM)5,6, 7, stochastique détection de molécules simples, tels que le stochastique optique reconstruction microscopie (tempête)8 et photoactivation localisation microscopie (PALM)9et une combinaison des deux, par exemple MINFLUX10. Parmi ces microscopies SR, microscopes de SR axée sur la détection seule molécule peuvent être modifiés relativement facilement d’une configuration de microscope de molécules simples. Avec activation répétitive et l’imagerie des protéines fluorescentes photoactivatable (FPs) ou photo-commutable colorants contenant le tag sur les biomolécules d’intérêt, une résolution spatiale peut atteindre 10 à 20 nm11. Pour obtenir des informations sur les interactions moléculaires et conformationnelle dynamique dans la résolution en temps réel, angstrom-à-nanomètre est nécessaire. smFRET12,13 est une façon d’atteindre cette résolution. En général, selon les questions biologiques d’intérêt, les méthodes d’imagerie avec différentes résolutions spatiales sont nécessaires.
En général, pour chaque type d’imagerie, configuration optique excitation et/ou d’émission spécifique est nécessaire. Par exemple, une des méthodes illumination plus couramment utilisés pour la détection de molécules simples est par le biais de la réflexion totale interne (TIR), dans lequel un angle excitation spécifique doit être réalisé à travers un prisme ou au travers de l’objectif. Pour la détection de smFRET, les émissions des colorants donneur et accepteur doivent être spatialement séparés et dirigés vers les différentes parties de l’électron-multipliant, coupled dispositif de charge (EMCCD), qui peut être réalisé avec un jeu de miroirs et de séparateurs de faisceau dichroïque placé dans le chemin d’émission. Pour en trois dimensions (3d) SR d’imagerie, un composant optique, comme une lentille cylindrique14, est nécessaire pour provoquer un effet de l’astigmatisme dans le chemin d’accès d’émission. Par conséquent, fabrication artisanale ou microscopes intégrés disponibles dans le commerce sont, généralement, fonctionnellement spécialisés pour chaque type de méthode d’imagerie et ne sont pas flexibles pour basculer entre les différentes méthodes d’imagerie sur la mise en place même. Nous présentons un système hybride rentable, qui fournit des commutateurs réglables et reproductibles entre trois différentes méthodes d’imagerie : conventionnelle épi-fluorescence imagerie avec une résolution limitée par la diffraction, axée sur la détection de molécules simples SR imagerie et détection de molécules simples multicolore, y compris smFRET imaging (Figure 1 a). Plus précisément, le montage présenté ici contient des lasers d’entrée fibre couplés pour excitation multicolore et un bras d’éclairage commercial dans le chemin de l’excitation, qui permet de programmer contrôle de l’angle de l’excitation, pour basculer entre les modes TIR et epi. Dans le chemin d’accès d’émission, une cassette de lentille cylindrique amovible fabrication artisanale est placée dans le corps de microscope pour l’imagerie 3D SR, et un séparateur de faisceau commercial est placé devant une caméra EMCCD qui peut être sélectivement activée pour détecter plusieurs canaux d’émission en même temps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. montage et conception du microscope
-
Chemin de l’excitation
Remarque : Le chemin d’accès d’excitation comprend des lasers, composants (DIC) de contraste interférentiel différentiel, le corps de microscope et ses bras d’éclairage.- Préparer une table optique vibration isolé. Par exemple, un tableau amortissement structural de 48 x 96 x 12'' donne assez d’espace pour tous les composants.
NOTE : Construire la mise en place dans une chambre avec contrôle de la température (par exemple, 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilité de température est essentielle pour maintenir l’alignement optique. - Installer un corps de microscope qui est équipé d’un bras d’illumination pour le raccordement de la fibre optique, 100 X-immersion dans l’huile FRBR objectif et composants DIC.
- Placez les quatre têtes de laser (647 nm, 561 nm, 488 nm et 405 nm, encerclé dans la Figure 1 b) et leur chaleur coule sur la table optique, et assurez-vous que les faisceaux laser émis ont la même hauteur et sont aussi court que possible pour assurer une bonne stabilité (p. ex. 3'').
Remarque : Si une tête laser se trouve à une hauteur plus courte que les autres lasers, mettre une plaque en aluminium avec une épaisseur suffisante sous elle. Vérifiez toujours le maximum de contact entre les dissipateurs de chaleur et de la table optique pour la meilleure dissipation de la chaleur (Figure 1 b). Les lasers doivent être assez puissants pour l’imagerie de la SR. Voir Table des matières. Il est recommandé d’avoir des filtres de nettoyage laser devant les lasers à diode. - Installer une carte d’acquisition de données via une interface de peripheral component interconnect (PCI) dans un poste de travail et connecter les lasers avec cette carte. Contrôler les comportements ON/OFF des lasers par logique de transistor-transistor (TTL) de sortie et leur réglage de la puissance de la sortie analogique de cette carte (Figure 1). Installer un bon microscope imaging software (commerciale ou artisanale) pour contrôler la carte d’acquisition de données, ainsi que le corps de microscope.
- Montez les miroirs et les séparateurs de faisceau dichroïque (590, 525 et 470 longtemps passer les filtres) sur leurs montures respectives. Utiliser les supports de miroir très stable pour les miroirs. Utilisez diviseurs circulaires avec circlips pour éviter de tout plier les séparateurs de faisceau dichroïque (Figure 1).
- Placez les miroirs et les séparateurs de faisceau dichroïque sur la table optique pour combiner les faisceaux laser (Figure 1 b). Pour réaliser l’alignement plus stable, faire la solution proposée aussi compact que possible et utiliser 1''-épaisseur optique postes. Réorganisez les lasers afin que les lasers de longueur d’onde plus courtes sont plus proches de l’accouplement de la fibre optique (Figure 1 b) étant donné que les lumières de courte longueur d’onde se dissipent plus dans l’air.
- Combiner les faisceaux laser dans une fibre optique monomode. Pour ce faire, construire un coupleur de fibres dans un système de cage par les étapes suivantes :
- Monter un adaptateur fibre dans une monture de translation d’axe z (Figure 1E, groupe d’extrême gauche).
- Monter un objectif doublet achromatique (distance focale = 7,5 mm) dans une plaque de cage (Figure 1E, deuxième groupe de la gauche).
- Rassembler les deux parties ci-dessus de rallonges pour former une cage. Monter la cage sur la table optique avec supports de fixation sur les postes optiques 1'' d’épaisseur (Figure 1E, panneau central).
- Aligner le 647 nm laser tout d’abord avec une fibre optique (fin FC/APC au coupleur).
Remarque : Un alignement approximatif en utilisant une fibre optique multimodale avant d’utiliser la fibre optique monomode peut aider le processus d’alignement. Ajuster les angles des miroirs et séparateurs de faisceau dichroïque (Figure 1, par les boutons de réglage), ainsi que la distance entre la lentille doublet achromatique et la plaque adaptatrice de fibre (Figure 1E, en ajustant le Mont traduction axe z) à gagner puissance maximale laser par l’intermédiaire de la fibre. - Une fois l’alignement du premier laser fait, temporairement installer une paire d’IRIS et aligner le reste des lasers un après l’autre (Figure 1F). Vérifier l’efficacité de l’alignement avec un wattmètre.
- Laisser un iris sur le devant de la plaque d’adaptation pour réduire les reflets des lasers.
NOTE : Strong retour réflexions peuvent réduire la durée de vie des sources laser. Éventuellement, un isolateur optique peut être installé en face de chaque tête de laser pour enlever les reflets complètement.
- Branchez l’autre extrémité de la fibre optique sur le bras de l’éclairage du microscope (Figure 1 H).
- Concevoir et installer le « grossissement objectif (mag) » par les étapes suivantes :
Remarque : Les lasers peuvent être utilisés pour l’imagerie de l’épi-fluorescence de l’échantillon, mais la taille de faisceau étroit de chaque laser limite la zone éclairée de l’échantillon à une superficie plusieurs fois inférieure à la taille réelle du capteur caméra correspondante, en particulier pour les plus récents caméras (avec 18,8 mm en longueur de diagonale par rapport à la durée conventionnelle de 11,6 mm). Ainsi, il est souhaitable d’élargir le faisceau pour obtenir un éclairage plus large et plus plat de l’échantillon.- Concevoir l’objectif mag, ce qui peut s’insérer dans le bras de l’éclairage (Figure 1 H).
Remarque : La conception de l’objectif de mag dépend où il sera installé. 1 H de la figure montre un exemple de l’installation dans le bras de l’éclairage, mais il peut être installé dans n’importe quel endroit après que les faisceaux laser sont collimaté (voir Discussion). Concevoir avec un logiciel de rédaction et de conception assistée par ordinateur. - Placer deux lentilles achromatiques, un concave (distance focale = f1) et l’autre convexe (longueur focale = f2) dans le porte-objectif mag artisanale (Figure 2 a et 2C), avec la distance égale à la somme de leurs focales, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (Figure 2 b).
Remarque : Avec ce choix de longueurs focales, l’objectif de mag étend le faisceau en f2/ | f1| = 2 plis. L’objectif de mag offre une polyvalence. Il peut être enlevé pour reprendre l’éclairage régulier sans développer les poutres (Figure 2D) ou insérée dans le sens inverse de concentrer le faisceau laser pour parvenir à une plus forte intensité d’excitation.
- Concevoir l’objectif mag, ce qui peut s’insérer dans le bras de l’éclairage (Figure 1 H).
- Préparer une table optique vibration isolé. Par exemple, un tableau amortissement structural de 48 x 96 x 12'' donne assez d’espace pour tous les composants.
2. chemin d’accès d’émission
Remarque : Le chemin d’accès d’émission est composé d’une lentille cylindrique amovible, une roue de filtre de barrière, un séparateur d’émission et une caméra EMCCD (Figure 1). Pour atteindre le meilleur point spread function (PSF) de molécules simples, le prisme de la DIC est placé loin de l’objectif.
- Concevoir la cassette cylindrique (objectif 3-d), qui peut s’insérer dans l’analyseur DIC manuel insérer la fente dans le corps du microscope (Figure 3).
Remarque : Cette conception ne compromet pas l’analyseur DIC depuis un bloc analyseur peut être inséré dans la tourelle de filtre. - Placer la lentille 3D de 10 m de longueur focale dans la cassette et l’insérer dans le chemin d’accès du faisceau d’émission pour créer l’effet de l’astigmatisme nécessaire pour extraire la coordonnée z de chaque molécule unique14.
Remarque : Vous pouvez également la cassette de la lentille 3D peut être placée dans ou hors de la trajectoire des émissions (Figure 3). - Installer un séparateur de faisceau dichroïque multi-band dans la tourelle de filtre à l’intérieur du corps de microscope.
- Installer les filtres d’émission.
Remarque : Les filtres d’émission sont choisis selon les fluorophores préférés. Selon le module d’imagerie, filtres d’émission placés à différents endroits sont utilisés tel que décrit ci-dessous :- Pour l’imagerie séquentielle épifluorescente multicolore ou imagerie SR, utilisez des filtres d’émission placés dans la roue de filtre barrière relié près du corps de microscope pour minimiser les vibrations dans le corps du microscope au cours de la commutation de canal (Figure 1).
- Pour la détection simultanée multicolore (p. ex., des expériences de smFRET), placer un autre filtre dans un séparateur d’émission (cocher l’étape 4 pour plus de détails).
Remarque : Généralement, un séparateur d’émission commerciale possède deux modes commutables (c.-à-d.« engagés » ou « bypass » modes). Pour séparer les lumières d’émission chromatiquement pour l’imagerie simultanée de multicolore (mode « engagé »), un cube de filtre tenant deux séparateurs de faisceau dichroïque et trois filtres d’émission est utilisé (« triple cube, » Figure 4 et 4D). Un emplacement vide dans la roue de filtre de barrière est utilisé en combinaison avec le cube triple. En revanche, pour l’imagerie séquentielle multicolore, le cube triple est remplacé par un cube qui a juste un miroir à l’intérieur (« contournement cube, » Figure 4 a et 4D).
- Installez la caméra EMCCD comme la dernière partie du chemin d’émission. Utiliser la connexion USB-PCI pour atteindre une cadence rapide.
Remarque : Une caméra EMCCD est recommandée pour la détection de molécules simples plus sensible, mais une caméra sCMOS avancée peut être une alternative.
3. diffraction-limited d’imagerie avec Epi-excitation
- Orienter des lasers à excitation accessoires epi-mode dans le bras de l’illumination.
- Débrayer la lentille 3D si engagé (Figure 3, panneau de droite).
- Insérer le cube de dérivation dans le séparateur d’émission (Figure 4 a et 4F, panneau inférieur).
- (Facultatif) Insérez la lentille mag pour une zone d’illumination élargie (Figure 2D, panneau de gauche).
Remarque : Avec l’utilisation d’une lentille de mag et un 100 X objectif immersion dans l’huile, environ 91 x 91 µm2 peuvent être illuminés uniformément, éliminant le besoin d’utiliser une source de lumière blanche et plusieurs cubes de filtre. - Utilisez une microscopie imagerie du logiciel pour pouvoir multi-canal, Z-pile ou Time-lapse images.
Remarque : Il existe plusieurs programmes pour l’imagerie microscopie, non seulement de fabricants de microscopes, mais aussi de sociétés tierces ou de développeurs open source.
4. multi-canal Single-molecule Imaging y compris smFRET
Remarque : Déplacer vers une position « vide » dans la roue de filtre barrière, afin que toutes les émissions avec une longueur d’onde peuvent atteindre à la deuxième série de filtres/dichroïque séparateurs de faisceau dans le séparateur d’émission.
- Pour configurer la détection de molécules simples multicolore de molécules de surface immobilisée15 utilisant l’excitation de la FRBR, y compris la mesure smFRET, orienter des lasers à excitation accessoires à l’angle de la FRBR. Débrayez l’objectif mag et la lentille 3D.
- Engager le mode trois canaux dans le séparateur d’émission (Figure 1) par les étapes suivantes :
- Remplacer le cube de dérivation avec un cube « étalonnage » qui permet à la lumière de passer par tous les canaux (Figure 4 b et 4E).
- Mettez l’appareil photo sous DIC (c.-à-d., aucun filtre d’émission dans la roue de filtre barrière) et régler l’ouverture du séparateur d’émission jusqu'à ce que trois canaux entièrement séparés apparaître sur l’écran.
Remarque : Effectuer cette étape avec la lumière allumée, pour visualiser tous les canaux. - Tournez les boutons de commande de réglage vertical/horizontal sur la barre de fractionnement d’émission et aligner à peu près les trois canaux (Figure 4E et 4F).
- Éteignez votre appareil et remplacer le cube de calibration avec un triple cube (Figure 4 et 4E).
- Placez un échantillon avec 100 nm multicanal perles sur le dessus 100 X lentille d’objectif et de se concentrer sur l’échantillon.
- Allumez la caméra et le laser 488 nm, effectuer un zoom avant sur l’une des perles brillantes et finement aligner trois canaux en tournant les commande boutons de réglage à nouveau (Figure 4F et 4 G).
Remarque : 100 nm perles multicanal émettent différentes longueurs d’onde de la lumière sur l’excitation de 488 nm, ce qui permet l’alignement de trois canaux.
- Allumez la caméra et les lasers, les focus et trouver une bonne position avec une densité de spot raisonnable. Ajuster le temps de puissance et de l’exposition de laser pour atteindre des niveaux acceptables de signal-bruit et photoblanchiment. Utilisez la logiciel d’imagerie de la microscopie pour prendre des images de Time-lapse.
5. l’imagerie SR
NOTE : Ceci est la microscopie seule molécule de SR axée sur la détection.
- Pour configurer l’imagerie SR, insérez la lentille 3D et retirez la lentille mag. Définir la durée d’exposition de la caméra dans les canaux de laser approprié (par exemple, 5 à 60 ms). Déterminer et définir manuellement l’angle accessoire des lasers à l’excitation optimal à l’angle de la FRBR.
- Placer l’échantillon dans SR imagerie tampon16. Laisser le tampon s’équilibrer pendant au moins 10 min avant l’imagerie.
NOTE : Tampon d’imagerie SR expire après environ 1 h, donc faire SR nouvelle imagerie tampon en conséquence. - Prendre une image DIC avant l’imagerie SR. Afin de trouver la bonne hauteur objective pour SR, qui optimise l’effet de l’astigmatisme, utiliser DIC imaging pour trouver le plan médian des cellules. Identifier le plan de la hauteur à laquelle les cellules de transition de la « lumière » images « sombre » et semblent devenir transparent (Figure 5 a, 5 bet 5C). Une fois le plan focal désiré est déterminé, engager le système de correction de dérive des z (Figure 1 a).
- Imagerie de conduite de SR. Changer la puissance du laser de 405 nm pour maintenir une densité raisonnable de « clignotant-on » taches.
Remarque : S’il est possible de changer le 405 nm laser manuellement, il est plus pratique d’exécuter un code d’acquisition de données programmées pour maintenir la densité de « clignotant-sur » taches. Voici un exemple de comment il se déroule automatiquement. Le code source est disponible sur demande (Figure 6).- Démarrer l’acquisition d’imagerie avec puissance de laser violet 0 W/cm2 .
- Compter le nombre de clignotement sur taches dans une certaine période.
- Moduler la puissance du laser violet afin de préserver le nombre de clignotement-sur les taches un seuil défini par l’utilisateur « comptage » dans le champ de vision. Augmenter la puissance de laser violet quand le nombre de clignotement sur taches descend sous le seuil de comptage.
- Résilier l’acquisition lorsque le nombre de clignotement sur taches descend sous le seuil de comptage à l’aide de la puissance maximale laser violet.
Remarque : La valeur maximale peut être réglée différemment selon la luminosité de l’échantillon, mais ne dépassant pas 130 W/cm2. Selon l’objectif réel de l’imagerie de SR, ce code d’acquisition automatique peut être résilié manuellement à tout moment.
- Vérifier le comportement clignotant et SP des taches peu après le début de l’acquisition.
Remarque : Si le comportement de clignotant n’est pas idéal, changer les accessoires angle des lasers à l’excitation ou remplacer le tampon d’imagerie. S’attendre à un échantillon de « verticale », « horizontale » et « losanges » fibres discontinues de polyesters, représentant fluorophores par en dessous, au-dessus et dans le plan focal, respectivement (Figure 5). Si la plupart des taches afficher SP vertical ou horizontal, puis le plan focal est éteint depuis le Centre des cellules, donc mettre fin à l’expérience et ajustez de nouveau le plan focal. Une présence de bulle d’air dans l’huile d’immersion ou d’autres facteurs les peut affecter la qualité de la filature, alors il peut être nécessaire de remplacer l’huile ou changer vers une autre zone d’imagerie de l’échantillon. - Pour l’analyse des données, utiliser open source (dans plugins ImageJ NIH) ou codes disponibles dans le commerce pour détecter le centre de gravité de chaque endroit dans chaque cadre d’imagerie et extrait les valeurs z de chaque spot de largeurs x - et y14.
Remarque : Dans le présent rapport, un code source développé à l’origine dans l’une des plus ancienne molécule unique axée sur la détection SR8 a été modifié pour détection 3D16 et a été utilisé. - Dans le cas de l’imagerie de deux couleurs, image le fluorophore avec la longueur d’onde excitation plus longtemps, suivi par celui qui a la plus courte longueur d’onde d’excitation. Exécutez le code d’acquisition automatique de même que celle décrite à l’étape 5.4, mais avec un laser différent d’imagerie.
NOTE : il convient de corriger l’aberration chromatique entre les images avec des fluorophores différents (p. ex., colorant rouge et jaune-vert colorant). Voici les étapes.- Immobiliser plusieurs perles multicanaux de 100 nm sur la lamelle de verre, en évitant de former des grappes.
- Prendre des photos d’eux dans les canaux différents d’excitation.
- Extrait de leur (X, Y, Z) coordonne par logiciel (point 5.6).
- ΔXj’ai tracer = X1i - X2i et ΔYi = Y1i - Y2i (j’ai est pour différentes perles et 1 et 2 sont des canaux de couleur différente) séparément et fixez-les avec des fonctions appropriées. Enregistrer les fonctions.
Remarque : Les fonctions linéaires sont suffisantes dans la plupart des cas. Une fois ces fonctions déterminées, cette mesure n’a pas à être répété chaque fois que de l’imagerie. - Dans l’imagerie réelle de SR de deux couleurs d’un échantillon d’intérêt, appliquer les fonctions de l’aberration chromatique correcte (X, Y). Pour z-directional l’aberration chromatique, le conduisent en obtenant ΔZ = Z1 - Z2 perles multicanaux ou échantillons multicanaux de référence connue ensemencées avec l’échantillon.
Remarque : contrairement à (X, Y) l’aberration chromatique, aberration chromatique z directionnel n’est pas bien reproductibles dans chaque expérience, principalement en raison de l’entretien incomplètes z-directional focus lors du passage du canal. Ainsi, il est recommandé d’effectuer la correction chaque fois. ΔZ = Z1 - Z2 est le plus souvent indépendante de (X, Y), donc juste quelques perles ou échantillons de référence serait suffisants par chaque zone d’intérêt. Tracer les images construites du SR bicolore finales dans un logiciel de visualisation 3D et vérifier manuellement les ΔZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ce microscope permet flexible et reproductible de commutation entre les différentes méthodes d’imagerie. Nous montrons ici des exemples d’images collectées avec chaque module d’imagerie.
Figure 5 illustre la PSF de la molécule de clignotant sur lors de l’acquisition de SR. Des milliers de telles images sont reconstruits pour générer l’image finale de SR (Figure 5E). Figure 5E montre même bactérien RNAs réglementaire comme le montre l’image épifluorescente dans la Figure 7 a. La figure 7 illustre les images épifluorescente représentatifs d’un petit ARN réglementaire dans les cellules d’Escherichia coli et un ARNm dans les cellules de mammifères U2OS. Les deux RNAs sont étiquetés avec un fluorophore-tag ADN oligo par in situ hybridation17. La figure 8 montre la mesure représentant smFRET pliées des molécules d’ARN marqué avec colorant (colorant vert) de la donneur et accepteur colorant (colorant rouge). Les complexes sont immobilisés sur la lame de microscope et excités par l’illumination de la FRBR. Trajectoires d’intensité de fluorescence peuvent être extraite des molécules individuelles unique, générant frette efficacité en fonction du temps.
Figure 1 : la conception de la mise en place de microscope. (A), ce panneau affiche un schéma de l’installation. M = miroir, DBS = séparateur de faisceau dichroïque, LCF = laser nettoyage filtre, j’ai = iris, L = lentille, AP = plaque adaptatrice, ZTM = axe z translationnelle monter, de = fibre optique, OFC = fibre optique raccord, CL = lentille cylindrique, TL = lentille de tube, EF = d’émission ou les filtres, Obj = objectif lentille et SM = moteur pas à pas. Le système de correction de z-dérive déplace le moteur pas à pas sur l’embout du porte-objectif dans la direction opposée de la dérive des z, qui est calculée par le signal infrarouge (IR) générés par son propre témoin et détecté par son propre détecteur. (B), ce panneau indique l’Assemblée d’excitation de laser. Quatre lasers sont combinés par le biais de miroirs et de séparateurs de faisceau dichroïque et sont ensuite dirigés vers une fibre optique à travers une lentille de focalisation et une plaque adaptatrice assis sur une monture translationnelle (en bas de l’image). (C), ce panneau indique la modulation du laser. Deux câbles de baïonnette Neill-Concelman (BNC) sont reliées à chacun du laser (la tête ou le contrôleur, selon le fabricant) pour TTL et modulation analogique (panneau de gauche). Câbles BNC sont combinés dans un seul câble (panneau central) qui est relié à une carte d’achat de données dans un poste de travail (panneau à droite) pour le contrôle de l’ordinateur. (D), ce tableau montre le miroir et le séparateur de faisceau dichroïque Monte. (E) construction d’un coupleur de fibres dans un système de cage. Une plaque d’adaptation fibre (AP) est montée sur une monture de translation de l’axe z (ZTM) afin que sa distance à la lentille achromatique double (L1, vue de côté montré) peut être modulée. AP et ZTM ont correspondant threads, même que L1 et le disque de guidage. (F), une paire d’IRIS (cerne) sont installés au cours de la procédure d’alignement pour plusieurs lasers. Ils sont utilisés pour veiller à ce que le laser 647 nm (panneau de gauche) et le laser 561 nm (panneau de droite) passent par le même chemin. (G), un partie partielle du chemin d’émission est indiquée. En dehors du corps de microscope, la roue de filtre d’émission, le séparateur d’émission et la caméra EMCCD sont installés dans l’ordre. (H), ce panneau affiche l’ensemble de bras d’éclairage. L’objectif de mag est inséré dans le bras de l’illumination. Les faisceaux de laser d’excitation sont envoyés sur le bras d’éclairage grâce à la fibre optique et la fibre optique de couplage (à droite de la photo). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : la lentille mag. (A), ce panneau montre les projections orthographique du titulaire lentilles de logement pour magnifier les faisceaux laser (unité : mm). Ce modèle est conçue pour être en forme dans le bras de l’illumination. (B) ce panneau montre un dessin interne du trou dans la porte où deux lentilles obtenir en. L1 est une lentille concave et L2 est une lentille convexe, et la distance entre eux est la somme de leurs longueurs focales. (C) il s’agit d’une photo de la lentille de mag. (D) l’objectif de mag peut être inséré dans le bras de l’illumination d’étendre ou de concentrer les rayons laser (à gauche) ou peut être enlevé pour garder les faisceaux laser inchangés (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : la lentille 3D. (A), ce panneau montre les projections orthographique du titulaire ayant un trou circulaire vide pour le mode de dérivation et un trou rectangulaire pour la tenue de la lentille cylindrique (unité : mm). Ce modèle est conçue pour être en forme pour le curseur d’analyseur DIC dans un corps de microscope. (B) il s’agit d’une photo de la lentille 3D. (C) la cylindrique lentille peut être engagé dans le chemin du faisceau d’émission provoque des SP avec astigmatisme (à gauche) ou peut être débrayé pour le mode de dérivation, gardant intact PSF (droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : alignement multi-canal du séparateur d’émission. Schémas de l’optique et le trajet de la lumière apparaissent dans le séparateur d’émission avec (A) un cube de dérivation, (B) un cube de calibrage et (C), une triple cube. M = miroir. Le cube de dérivation possède un miroir à l’intérieur (M5) et est censé être utilisé avec un filtre d’émission (EF) dans la roue de filtre de barrière. Le cube de calibrage a des séparateurs de faisceau (BS) qui permettent aux lumières de passer par tous les canaux. Le cube triple possède deux séparateurs de faisceau dichroïque (DBS), ainsi que trois filtres d’émission. (D) Voici les photos des trois cubes. (E) interne du séparateur d’émission est indiquée sans un cube (du haut) et avec un cube (panneau inférieur), coulissant dans. M3 est derrière M4 et n’entrant pas dans la photo. Boutons de commande pour les miroirs sont sur le dessus le séparateur d’émission (du haut). (F), ce panneau affiche alignement de canaux en utilisant le cube d’étalonnage en vertu de la DIC. (G), ce panneau indique un alignement fin de vert (panneau supérieur) et rouge (panneau central) des canaux à l’aide de perles multicanal 100 nm et un cube triple. Une image fusionnée des deux canaux est également indiquée (panneau inférieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : acquisition d’images représentatives SR. Ces panneaux montrent une image DIC représentative (A) ci-dessous, (B) à, ou (C) au-dessus du plan central des cellules. (D), ce tableau montre un exemple de la PSF des fluorophores clignotant-sur. Le cercle orange entoure un polyesters « verticale ». Le cercle vert entoure un polyesters « horizontale ». Le cercle bleu entoure un PSF en forme de losange, représentant des fluorophores à un plan ciblé. (E), ce panneau indique un représentant reconstruit image SR. Un petit ARN réglementaire est étiqueté avec hybridation in situ fluorescence avec le colorant rouge. Les bordures blanches marquent les bords des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : un code d’acquisition de données programmées pour l’imagerie SR. Dans ce module acquisition programmable, diverses commandes d’exécution et les fonctions de contrôle de microscope sont répertoriées dans le panneau de gauche et peuvent être sélectionnées pour créer le code d’acquisition programmée. Les commandes sont exécutées séquentiellement de haut en bas. Cette capture d’écran montre un exemple où un prédéfini que certain nombre d’acquisitions d’imagerie itérées est menée jusqu'à ce que l’acquisition se pose et on calcule le nombre de taches en trois trames d’images séquentielles. Si le nombre moyen de ces taches est au-dessus du seuil (fixé à 50 % du nombre de cellules en imagerie bactérienne), l’acquisition de l’image se poursuit dans la même boucle. Si le seuil, puis l’acquisition de l’image se poursuit dans la boucle suivante où la plus forte puissance laser violet est utilisée (coupée en bas de la capture d’écran). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : images représentant épifluorescente. (A), ce panneau indique un petit ARN réglementaire en cellules d’Escherichia coli . (B), ce panneau indique un ARNm dans les cellules de mammifères U2OS. RNAs sont étiquetés avec le colorant rouge et un colorant bleu par fluorescence in situ hybridation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : exemple de l’imagerie smFRET. (A) les échantillons ont été excités avec le laser de 561 nm. (B) les émissions des colorants verts et rouges sont recueillies en même temps et illustrées en vert (à droite) et les taches de rouge (à gauche), respectivement. (C), ce panneau indique l’intensité de fluorescence Représentant le vs trajectoires temps de colorant vert (vert) et de colorant rouge (rouge) d’une molécule. (D) ce panneau montre la frette efficacité par rapport à la trajectoire de temps (ligne bleue) calculée comme je l’aiaccepteur/ (Idonneur + j’aiaccepteur) d’une molécule de l’échantillon. La trace de la frette est équipée avec le modèle de Markov caché (ligne rouge pointillée). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce système de microscope hybride élimine le besoin d’acheter plusieurs microscopes. Le coût total de toutes les parties, y compris la table optique, table installation travail, logiciel et poste de travail, est environ $ 230 000. Les pièces usinées avec personnalisé, y compris l’objectif mag et l’objectif 3D, coûtent environ 700 $ (le coût dépend des montants réels exigés dans les différents instituts). Typique disponible dans le commerce des systèmes intégrés pour la microscopie seule molécule de SR axée sur la détection coûte plus de $ 300 000 ~ 400 000 et sont pas facilement disponible pour la mesure de smFRET ou epi-imagerie pour un champ de vue raisonnable, sans lumière blanche source. Ainsi, l’approche présentée ici peut atteindre des capacités d’imagerie équivalentes à plusieurs microscopes à un coût considérablement réduit.
Ce système de microscope modulé peut reposer sur le corps de microscope de différents fabricants. La lentille 3D peut potentiellement être installée dans n’importe quelle position dans la voie des émissions, y compris à l’intérieur le séparateur d’émission, dans le corps de microscope, ou dans la quantité d’espace disponible entre la roue de filtre et de la tourelle. Toutefois, l’emplacement physique de la lentille 3D déterminera sa longueur focale pour atteindre le meilleur effet d’astigmatisme pour imagerie 3-d de SR. Nous vous recommandons de commencer avec une focale de 10 m. L’objectif de mag est essentiellement une extension de faisceau installée dans le chemin de l’excitation. Si les lasers à excitation sont couplés air (i.e., sans fibre optique), il est trivial d’installer tel un contrôle expander dans n’importe quel endroit après les faisceaux laser sont collimatés. Si les lasers à excitation sont couplés aux fibres, puis recherchez les emplacements supplémentaires installer deux lentilles (un concave et l’autre convexe). Par exemple, les nombreux bras de l’éclairage commercial ont fentes pour les filtres de densité neutre. Trouver deux lentilles avec la somme de leurs focales égale à la distance entre les deux fentes. Ensuite, ils peuvent être insérés pour fonctionner comme une lentille de mag. Une monture pour le curseur de diaphragme de champ peut également être un autre endroit, s’il est disponible. Construction de la lentille de mag dans une cassette amovible a l’avantage supplémentaire de permettre la mise au point des lasers d’excitation pour atteindre une puissance plus élevée, qui peut être nécessaire pour l’imagerie SR, simplement en renversant l’orientation de la lentille de mag.
Dans ce rapport, nous avons démontré de commutation souple entre trois différentes techniques d’imagerie à l’aide d’un microscope modulé. Cette configuration peut être utilisée pour des applications plus larges et plus avancées. Par exemple, la configuration de SR peut être utilisée pour la particule suivi dans des cellules vivantes, sur photo-commutable ou photoactivatable fluorescent protein-tag biomolécules d’intéressent18,19. La configuration de smFRET peut être utilisée pour étudier les interactions moléculaires dans in vivo systèmes20. La détection multi canaux d’émission splitter est cumulable avec la configuration de SR pour effectuer deux couleurs d’imagerie SR ou particule suivre simultanément21.
Cette configuration peut être étoffée pour activer des composants plus modulés. Par exemple, une autre couche de séparateurs de tourelle et d’illumination peut être ajoutée, afin que les chemins d’excitation/émission supplémentaires peuvent être créés pour des canaux supplémentaires, par exemple avec un laser d’infrarouge (IR) pour l’imagerie des échantillons étiquetés avec les colorants IR. En plus de permettre le canal supplémentaire d’imagerie, les lasers IR peuvent servir à corriger la dérive de la scène en imagerie SR pendant imaging acquisition ou lors de l’analyse de poste. Pour la correction de dérive lors de l’acquisition d’imagerie, si le système de correction de dérive des z n’est pas disponible auprès du fabricant de microscope, un système alternatif avec laser IR peut être soit de fabrication artisanale14 ou acquis auprès de sociétés tierces. Pour la correction de dérive après l’acquisition, un laser IR peut être utilisé pour le suivi de marqueurs fiducial. 22
La microscopie seule molécule de SR axée sur la détection nécessite deux séries de logiciel, un pour l’acquisition de données et l’autre pour l’analyse des données. D’acquisition de données, même un logiciel de fabrication artisanale simple qui prend des images à travers la caméra tout en contrôlant ON des lasers/OFF comportements peuvent travailler pour générer des images de SR, bien qu’il soit possible de moduler manuellement la puissance du laser de 405 nm, par exemple, en faisant tourner un filtre de densité neutre dégradé installée devant le laser. Cependant, cette façon de faire l’expérience est tributaire de la subjectivité de l’expérimentateur de la densité de clignotant-sur les taches. Ainsi, de cette façon n’est pas objective et n’est peut-être pas apte à être utilisé pour la quantification des données d’imagerie de SR. Le code d’acquisition de données utilisé ici permet la détection tache / un algorithme comptage tandis que l’acquisition de données est en cours, ce qui permet une modulation automatique de la puissance de 405 nm laser basé sur la densité de clignotant-sur les taches (Figure 6). De nos jours, certains fabricants de microscopes fournissent des modules programmables d’imagerie, donc on peut utiliser ces, ou chercher des plugins de sources ouvertes comme Micro-Manager. Pour l’analyse des données, il est possible d’utiliser des modules d’analyse disponible dans le commerce de fabricants de microscopes ou de chercher des plugins de sources ouvertes comme ImageJ.
En résumé, le montage présenté ici comprend grande versatilité et commutation facile entre espace et différentes configurations d’imagerie à un coût réduit. Cette installation est relativement facile à adopter par tout laboratoire de recherche en sciences biologiques avec un besoin de routine et diverses expériences d’imagerie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
J.F. reconnaît le soutien du programme des boursiers Searle et le directeur du NIH New Innovator Award. Les auteurs remercient les suggestions utiles du laboratoire de Paul Selvin (University of Illinois, Urbana-Champaign) permettant de positionner la lentille 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
