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Bioengineering

एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कई इमेजिंग मोड का आयोजन

Published: October 28, 2018 doi: 10.3791/58320
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 4, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

Summary

यहां हम एक एकीकृत माइक्रोस्कोपी प्रणाली है, जो पारंपरिक महामारी फ्लोरोसेंट इमेजिंग, एकल अणु का पता लगाने आधारित सुपर संकल्प इमेजिंग, और बहु रंग एकल अणु का पता लगाने, विलय के निर्माण के एक व्यावहारिक गाइड वर्तमान सहित एकल अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण इमेजिंग, एक सेट में एक लागत कुशल तरीके से ।

Abstract

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सीटू में जैविक अणुओं का पता लगाने और वास्तविक समय में उनकी गतिशीलता और बातचीत की निगरानी करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । पारंपरिक महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अलावा, विभिन्न इमेजिंग तकनीक विशिष्ट प्रायोगिक लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया है । व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक के कुछ एकल अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) है, जो angstrom संकल्प के साथ गठन के परिवर्तन और आणविक बातचीत की रिपोर्ट कर सकते हैं, और एकल-अणु का पता लगाने आधारित सुपर संकल्प (SR) इमेजिंग, जो स्थानिक संकल्प को बढ़ाने के लिए लगभग दस विवर्तन-सीमित माइक्रोस्कोपी की तुलना में twentyfold कर सकते हैं । यहां हम एक ग्राहक-डिजाइन एकीकृत प्रणाली है, जो एक खुर्दबीन में कई इमेजिंग तरीकों, पारंपरिक महामारी फ्लोरोसेंट इमेजिंग, एकल अणु पता लगाने आधारित एसआर इमेजिंग, और बहु रंग एकल अणु का पता लगाने सहित विलय, जिसमें smFRET इमेजिंग शामिल है । विभिन्न इमेजिंग विधियों आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और ऑप्टिकल तत्वों स्विचन द्वारा reproducibly. इस सेट अप एक कम लागत और व्यक्तिगत प्रयोजनों के लिए अलग सूक्ष्मदर्शी इमारत के सापेक्ष अंतरिक्ष में नियमित और विविध इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक की जरूरत के साथ जैविक विज्ञान में किसी भी शोध प्रयोगशाला द्वारा अपनाने के लिए आसान है ।

Introduction

प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी आधुनिक जैव विज्ञान अनुसंधान और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण उपकरण है नियमित रूप से कई जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया । fluorophores के साथ ब्याज के अणुओं टैगिंग द्वारा, हम सीधे उन्हें माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना कर सकते हैं और स्थानीयकरण, अनुरूपता, बातचीत, और vivo में या इन विट्रोमें विधानसभा राज्य में समय पर निर्भर परिवर्तन रिकॉर्ड. पारंपरिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी एक विवर्तन-सीमित स्थानिक संकल्प है, जो है ~ २००-३०० के पार्श्व दिशा में एनएम और ~ ५००-७०० के अक्षीय दिशा1,2में एनएम, और कर रहे हैं, इसलिए, इमेजिंग के 100s पर सीमित nanometers-टू-माइक्रोन स्केल । आणविक सभा या संगठन में महीन विवरण प्रकट करने के लिए, विभिन्न एसआर माइक्रोस्कोप्स जो विवर्तन सीमा को तोड़ सकते हैं, विकसित किए गए हैं । सीनियर हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया रणनीतियों ऐसे उत्तेजित उत्सर्जन घट (STED) माइक्रोस्कोपी3,4 और संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम)5,6, के रूप में गैर रेखीय ऑप्टिकल प्रभाव, शामिल 7, ऐसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान)8 और photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)9के रूप में एकल अणुओं, के stochastic का पता लगाने, और दोनों का एक संयोजन, जैसे MINFLUX10के रूप में । इन एसआर सूक्ष्मदर्शी के अलावा, एकल अणु का पता लगाने आधारित एसआर सूक्ष्मदर्शी एक एकल अणु माइक्रोस्कोप सेट अप से अपेक्षाकृत आसानी से संशोधित किया जा सकता है । दोहराए सक्रियकरण और photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग के साथ (एफपीएस) या फोटो स्विच्ड रंजक ब्याज के अणुओं पर टैग, स्थानिक संकल्प 10-20 एनएम11तक पहुंच सकते हैं । को आणविक बातचीत और वास्तविक समय में गठन गतिशीलता के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए, angstrom-to-नैनोमीटर संकल्प की आवश्यकता है । 12smFRET,13 इस संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक दृष्टिकोण है । आम तौर पर, ब्याज की जैविक प्रश्नों के आधार पर, विभिंन स्थानिक संकल्प के साथ इमेजिंग तरीकों की जरूरत है ।

आमतौर पर, इमेजिंग, विशिष्ट उत्तेजना और/या उत्सर्जन ऑप्टिकल विंयास के प्रत्येक प्रकार के लिए की जरूरत है । उदाहरण के लिए, एकल अणु का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दीप्ति तरीकों में से एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब (तिर), जिसमें एक विशिष्ट उत्तेजना कोण की जरूरत है या तो एक चश्मे के माध्यम से या उद्देश्य लेंस के माध्यम से प्राप्त किया जा करने के माध्यम से है । smFRET का पता लगाने के लिए, दोनों दाता और स्वीकार्यता रंजक से उत्सर्जन को स्थानिकी अलग और इलेक्ट्रॉन के विभिंन भागों के लिए निर्देशित-गुणा, प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) है, जो दर्पण और dichroic बीम के एक सेट के साथ प्राप्त किया जा सकता है विभाजन की जरूरत उत्सर्जन पथ में रखा । तीन आयामी (3-डी) एसआर इमेजिंग के लिए, एक बेलनाकार लेंस14के रूप में एक ऑप्टिकल घटक, उत्सर्जन पथ में एक दृष्टिवैषंय प्रभाव पैदा करने की जरूरत है । इसलिए, homebuilt या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकीकृत सूक्ष्मदर्शी हैं, आमतौर पर, इमेजिंग विधि के प्रत्येक प्रकार के लिए कार्यात्मक विशेषज्ञता और एक ही सेट अप पर विभिंन इमेजिंग तरीकों के बीच स्विच करने के लिए लचीला नहीं कर रहे हैं । यहां हम एक लागत प्रभावी, संकर प्रणाली है कि तीन अलग इमेजिंग तरीकों के बीच समायोज्य और reproducible स्विच प्रदान करता है वर्तमान: विवर्तन के साथ पारंपरिक महामारी फ्लोरोसेंट इमेजिंग-सीमित संकल्प, एकल अणु का पता लगाने आधारित SR इमेजिंग, और बहु रंग एकल अणु का पता लगाने, smFRET इमेजिंग सहित (आंकड़ा 1a) । विशेष रूप से, सेट अप यहां प्रस्तुत फाइबर-बहु रंग उत्तेजना और उत्तेजना पथ है, जो उत्तेजना कोण के क्रमादेशित नियंत्रण की अनुमति देता है में एक वाणिज्यिक रोशनी हाथ के लिए इनपुट पराबैंगनीकिरण शामिल है, महामारी मोड और तिर मोड के बीच स्विच करने के लिए । उत्सर्जन पथ में, एक हटाने योग्य homebuilt बेलनाकार लेंस कैसेट 3 डी एसआर इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप शरीर के भीतर रखा जाता है, और एक वाणिज्यिक बीम अलगानेवाला एक EMCCD कैमरा है कि चुनिंदा कई उत्सर्जन चैनलों का पता लगाने के लिए सक्षम किया जा सकता है से पहले रखा गया है साथ.

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Protocol

1. माइक्रोस्कोप डिजाइन और विधानसभा

  1. उत्तेजना पथ
    नोट: उत्तेजना पथ पराबैंगनीकिरण, विभेदक हस्तक्षेप इसके विपरीत (उद्योग) घटक, माइक्रोस्कोप शरीर, और इसकी रोशनी हाथ शामिल हैं ।
    1. एक कंपन-पृथक ऑप्टिकल तालिका तैयार करें । उदाहरण के लिए, ४८ x ९६ x 12 ' ' के एक संरचनात्मक भिगोने तालिका सभी घटकों के लिए पर्याप्त स्थान देता है ।
      नोट: तापमान नियंत्रण (जैसे, २१.४ ± ०.५५ डिग्री सेल्सियस) के साथ एक कमरे में सेट-अप का निर्माण । तापमान स्थिरता ऑप्टिकल संरेखण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. एक माइक्रोस्कोप शरीर है कि ऑप्टिकल फाइबर कनेक्शन, एक 100X तेल विसर्जन TIRF उद्देश्य लेंस, और उद्योग के घटकों के लिए एक रोशनी हाथ से सुसज्जित है स्थापित करें ।
    3. प्लेस चार लेजर सिर (६४७ एनएम, ५६१ एनएम, ४८८ एनएम, और ४०५ एनएम, आंकड़ा 1bमें घेर लिया) और ऑप्टिकल टेबल पर उनकी गर्मी डूब, और सुनिश्चित करें कि उत्सर्जित लेजर मुस्कराते हुए एक ही ऊंचाई है और के रूप में संभव के रूप में अच्छा स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए कम कर रहे है (जैसे , 3 ' ') ।
      नोट: यदि एक लेज़र सिर अन्य पराबैंगनीकिरण की तुलना में एक छोटी ऊंचाई पर बैठता है, यह नीचे पर्याप्त मोटाई के साथ एक एल्यूमीनियम प्लेट डाल दिया । हमेशा गर्मी सिंक और सबसे अच्छा गर्मी अपव्यय के लिए ऑप्टिकल टेबल के बीच अधिकतम संपर्क सुनिश्चित करने (आंकड़ा 1b) । पराबैंगनीकिरण एसआर इमेजिंग के लिए पर्याप्त शक्तिशाली होने की जरूरत है । सामग्री की तालिकादेखें । यह लेजर डायोड पराबैंगनीकिरण के सामने साफ-अप फिल्टर करने के लिए सिफारिश की है ।
    4. एक कार्य केंद्र में एक परिधीय घटक परस्पर (PCI) इंटरफेस के माध्यम से एक डेटा प्राप्ति कार्ड स्थापित करें और इस कार्ड के साथ पराबैंगनीकिरण कनेक्ट. ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क (TTL) आउटपुट, और इस कार्ड (चित्रा 1C) के अनुरूप आउटपुट द्वारा उनके पावर समायोजन द्वारा पराबैंगनीकिरण पर नियंत्रण. एक उचित माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्थापित करें (या तो वाणिज्यिक या homebuilt) डेटा अधिग्रहण कार्ड को नियंत्रित करने के लिए, साथ ही माइक्रोस्कोप शरीर.
    5. माउंट दर्पण और dichroic बीम विभाजन (५९०, ५२५, और ४७० लंबे पास फिल्टर) उनके संबंधित mounts करने के लिए । दर्पण के लिए बहुत स्थिर दर्पण माउंट का उपयोग करें । dichroic बीम बंटवारे (चित्रा 1 डी) के किसी भी झुकने से बचने के छल्ले बनाए रखने के साथ परिपत्र बंटवारे का उपयोग करें ।
    6. लेजर बीम (आंकड़ा 1b) गठबंधन करने के लिए ऑप्टिकल टेबल पर दर्पण और dichroic बीम बंटवारे प्लेस । सबसे स्थिर संरेखण प्राप्त करने के लिए, संभव के रूप में कॉंपैक्ट के रूप में पूरी व्यवस्था बनाने के लिए, और 1 ' '-मोटाई ऑप्टिकल पदों का उपयोग करें । पराबैंगनीकिरण की व्यवस्था इतनी है कि छोटे तरंग दैर्ध्य पराबैंगनीकिरण ऑप्टिकल फाइबर युग्मन (आंकड़ा 1b) के बाद से कम-तरंग दैर्ध्य रोशनी हवा में और अधिक फैलने के लिए करीब हैं ।
    7. एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर में लेजर बीम का मिश्रण । ऐसा करने के लिए, निम्न चरणों के माध्यम से एक पिंजरे प्रणाली में एक फाइबर युग्मक का निर्माण:
      1. एक z-अक्ष अनुवाद माउंट (चित्रा 1E, सबसे बाएं पैनल) में एक फाइबर अनुकूलक प्लेट माउंट ।
      2. एक पिंजरे की थाली में एक achromatic नक़ल लेंस (फोकल लंबाई = ७.५ mm) माउंट (चित्रा 1E, बाएं से दूसरे पैनल) ।
      3. एक पिंजरे के रूप में विस्तार छड़ से ऊपर दो भागों कनेक्ट । माउंट ' 1 पर बढ़ते कोष्ठक के साथ ऑप्टिकल टेबल पर पिंजरे-मोटी ऑप्टिकल पोस्ट (चित्रा 1E, मध्य पैनल) ।
      4. ६४७-एनएम लेजर पहले एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर के साथ संरेखित करें (एफसी/युग्मक के लिए APC अंत) ।
        नोट: एकल-मोड ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग करने से पहले एक बहु-मोड ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर किसी न किसी संरेखण संरेखण प्रक्रिया में मदद कर सकते हैं । दर्पण और dichroic बीम बंटवारे के कोण समायोजित (चित्रा 1 डी, समायोजन knobs के द्वारा), साथ ही achromatic नक़ल लेंस और फाइबर अनुकूलक प्लेट (चित्रा 1E, z-अक्ष अनुवाद माउंट समायोजन द्वारा) के बीच की दूरी हासिल करने के लिए फाइबर के माध्यम से अधिकतम लेजर बिजली उत्पादन ।
      5. एक बार पहले लेजर के संरेखण किया जाता है, अस्थायी रूप से आईरिस की एक जोड़ी स्थापित करने और एक (चित्रा 1F) के द्वारा एक पराबैंगनीकिरण के बाकी संरेखित करें. एक बिजली मीटर के साथ संरेखण दक्षता की जांच करें ।
      6. पराबैंगनीकिरण के प्रतिबिंब को कम करने के लिए अनुकूलक प्लेट के सामने एक आईरिस छोड़ दें ।
        नोट: मजबूत वापस प्रतिबिंब लेजर स्रोतों के जीवनकाल को कम कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक ऑप्टिकल अलग प्रतिबिंब पूरी तरह से हटाने के लिए प्रत्येक लेजर सिर के सामने स्थापित किया जा सकता है ।
    8. माइक्रोस्कोप की दीप्ति बांह के लिए ऑप्टिकल फाइबर के दूसरे छोर से कनेक्ट (आंकड़ा ज) ।
    9. डिजाइन और निंनलिखित चरणों के माध्यम से "आवर्धन लेंस (पत्रिका लेंस)" स्थापित करें:
      नोट: पराबैंगनीकिरण नमूने के महामारी प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक लेजर के संकीर्ण बीम आकार एक क्षेत्र के लिए नमूना के प्रबुद्ध क्षेत्र सीमा कई बार इसी कैमरे संवेदक के वास्तविक आकार की तुलना में छोटे, विशेष रूप से नए के लिए कैमरा (पारंपरिक ११.६ मिमी लंबाई की तुलना में विकर्ण लंबाई में १८.८ मिमी के साथ). इस प्रकार, यह वांछनीय है के लिए बीम का विस्तार करने के लिए नमूना की एक बड़ी और चापलूसी रोशनी को प्राप्त करने ।
      1. डिजाइन पत्रिका लेंस, जो रोशनी में फिट कर सकते है हाथ (आंकड़ा ज) ।
        नोट: पत्रिका लेंस के डिजाइन जहां यह स्थापित किया जाएगा पर निर्भर करता है । चित्रा ज प्रदीप्ति बांह में स्थापना का एक उदाहरण से पता चलता है, लेकिन यह लेजर मुस्कराते हुए collimated रहे है के बाद किसी भी स्थान में स्थापित किया जा सकता है ( चर्चादेखें) । यह एक कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन और मसौदा सॉफ्टवेयर के साथ डिजाइन ।
      2. दो achromatic लेंस प्लेस, एक गुफा (फोकल लंबाई = एफ1), और एक उत्तल (फोकल लंबाई = एफ2) घर में निर्मित पत्रिका लेंस धारक (चित्रा 2a और 2c), दूरी के साथ उनके फोकल लंबाई की राशि के बराबर, एफ1 + एफ2 = (-25) + ५० = 25 मिमी (आंकड़ा 2 बी) ।
        नोट: फोकल लंबाई के इस विकल्प के साथ, पत्रिका लेंस का विस्तार2एफ द्वारा बीम/ = 2 परतों । पत्रिका लेंस बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है । यह बीम (चित्रा 2d) का विस्तार या रिवर्स दिशा में डाला के लिए एक मजबूत उत्तेजना तीव्रता प्राप्त करने के लिए लेजर बीम ध्यान केंद्रित के बिना नियमित रोशनी को फिर से शुरू करने के लिए हटाया जा सकता है ।

2. उत्सर्जन पथ

नोट: उत्सर्जन पथ एक हटाने योग्य बेलनाकार लेंस, एक बाधा फिल्टर पहिया, एक उत्सर्जन अलगानेवाला, और एक EMCCD कैमरा (चित्रा 1G) से बना है । एक अणु का सबसे अच्छा बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) प्राप्त करने के लिए, उद्योग चश्मे उद्देश्य लेंस से दूर रखा जाता है ।

  1. कस्टम-डिजाइन बेलनाकार लेंस (3-डी लेंस) कैसेट, जो माइक्रोस्कोप शरीर (चित्रा 3सी) में मैनुअल उद्योग विश्लेषक डालने के स्लॉट में फिट कर सकते हैं ।
    नोट: यह डिजाइन एक विश्लेषक ब्लॉक फिल्टर बुर्ज में डाला जा सकता है के बाद से, उद्योग विश्लेषक समझौता नहीं करता है ।
  2. कैसेट में फोकल लंबाई के 10 मीटर के 3-डी लेंस प्लेस और यह उत्सर्जन बीम पथ में डालने के लिए z हर एक अणु14के समंवय निकालने के लिए आवश्यक दृष्टिवैषंय प्रभाव पैदा करते हैं ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 3-डी लेंस कैसेट को उत्सर्जन पथ (आंकड़ा 3सी) के अंदर या बाहर रखा जा सकता है ।
  3. माइक्रोस्कोप शरीर के अंदर फिल्टर बुर्ज में एक बहु बैंड dichroic बीम अलगानेवाला स्थापित करें ।
  4. उत्सर्जन फिल्टर स्थापित करें ।
    नोट: उत्सर्जन फिल्टर पसंदीदा fluorophores के आधार पर चुना जाता है । इमेजिंग मॉड्यूल के आधार पर, विभिंन स्थानों में रखा उत्सर्जन फिल्टर नीचे वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया जाता है:
    1. अनुक्रमिक बहु रंग महामारी-प्रतिदीप्ति इमेजिंग या एसआर इमेजिंग के लिए, चैनल स्विच (चित्रा 1G) के दौरान माइक्रोस्कोप शरीर में कंपन को कम करने के लिए माइक्रोस्कोप शरीर के बगल में बाधा फिल्टर पहिया में रखा उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें ।
    2. एक साथ बहु रंग का पता लगाने के लिए (जैसे, smFRET प्रयोगों), एक उत्सर्जन अलगानेवाला में सेट एक और फिल्टर जगह (विवरण के लिए चरण 4 की जाँच करें).
      नोट: आमतौर पर, एक वाणिज्यिक उत्सर्जन अलगानेवाला दो स्विच करने वाला मोड है (यानी, "लगे हुए" या "बाईपास" मोड) । एक साथ बहु रंग इमेजिंग के लिए रंगीन उत्सर्जन रोशनी अलग करने के लिए ("लगे हुए" मोड), एक फिल्टर घन दो dichroic बीम बंटवारे और तीन उत्सर्जन फिल्टर पकड़े ("ट्रिपल घन," चित्रा 4c और 4d) का उपयोग किया जाता है । बैरियर फिल्टर व्हील में एक खाली स्लॉट ट्रिपल घन के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, अनुक्रमिक बहु रंग इमेजिंग के लिए, ट्रिपल घन एक घन है कि सिर्फ अंदर एक दर्पण ("बाईपास घन," चित्रा 4a और 4d) है की जगह है ।
  5. उत्सर्जन पथ के पिछले भाग के रूप में EMCCD कैमरा स्थापित करें । एक तेज़ फ़्रेम दर प्राप्त करने के लिए USB-PCI कनेक्शन का उपयोग करें ।
    नोट: एक EMCCD कैमरा सबसे संवेदनशील एकल अणु का पता लगाने के लिए सिफारिश की है, लेकिन एक उन्नत sCMOS कैमरा एक विकल्प हो सकता है.

3. विवर्तन-महामारी के साथ सीमित इमेजिंग-उत्तेजना

  1. रोशन बांह में महामारी मोड के लिए उत्तेजना पराबैंगनीकिरण ' आकस्मिक कोण समायोजित करें ।
  2. 3-डी लेंस छुड़ाना अगर (चित्रा 3सी, सही पैनल) लगे ।
  3. उत्सर्जन अलगानेवाला में बाईपास घन डालें (चित्रा 4a और 4E, नीचे पैनल) ।
  4. वैकल्पिक एक विस्तृत रोशनी क्षेत्र (चित्रा 2d, बाएं पैनल) के लिए पत्रिका लेंस डालें ।
    नोट: एक पत्रिका लेंस और एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के उपयोग के साथ, के बारे में ९१ x ९१ µm2 समान रूप से प्रकाशित किया जा सकता है, एक सफेद प्रकाश स्रोत और एकाधिक फ़िल्टर क्यूब्स का उपयोग करने की आवश्यकता को नष्ट करने ।
  5. मल्टी चैनल लेने के लिए एक माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, और/या जेड-स्टैक, और/या समय चूक छवियों ।
    नोट: कई सूक्ष्म इमेजिंग के लिए उपलब्ध प्रोग्राम, न केवल सूक्ष्मदर्शी निर्माताओं से लेकिन यह भी तीसरे पक्ष कंपनियों या खुला स्रोत डेवलपर्स से कर रहे हैं ।

4. मल्टी चैनल एकल अणु इमेजिंग सहित smFRET

नोट: बैरियर फिल्टर व्हील में एक "खाली" स्थिति में ले जाएँ, ताकि सभी किसी भी तरंग दैर्ध्य के साथ उत्सर्जन उत्सर्जन अलगानेवाला में फिल्टर/dichroic बीम बंटवारे के दूसरे सेट तक पहुंच सकते हैं ।

  1. सतह के एक अणु का पता लगाने के लिए सेट अप-मैटीरियल अणुओं15 का उपयोग कर TIRF उत्तेजना, smFRET माप सहित, उत्तेजना पराबैंगनीकिरण ' घटनात्मक कोण TIRF कोण को समायोजित करें । पत्रिका लेंस और 3 डी लेंस छुड़ाना ।
  2. निंनलिखित चरणों के माध्यम से उत्सर्जन अलगानेवाला (चित्रा 1G) में तीन चैनल मोड संलग्न:
    1. बायपास क्यूब को एक "अंशांकन क्यूब" से प्रतिस्थापित करें जो सभी चैनलों (फिगर 4B और 4E) के माध्यम से लाइट जाने की अनुमति देता है ।
    2. (यानी, बैरियर फिल्टर व्हील में कोई उत्सर्जन फिल्टर) और तीन पूरी तरह से अलग चैनल स्क्रीन पर दिखाई देते हैं जब तक उत्सर्जन अलगानेवाला के एपर्चर समायोजित के तहत कैमरा पर बारी ।
      नोट: कमरे प्रकाश जलाया के साथ इस कदम आचरण, सभी चैनलों कल्पना करने के लिए ।
    3. उत्सर्जन अलगानेवाला पर ऊर्ध्वाधर/क्षैतिज समायोजन नियंत्रण knobs बारी और मोटे तौर पर तीन चैनलों (चित्रा 4E और 4F) संरेखित करें ।
    4. कैमरा बंद करें और अंशांकन क्यूब को ट्रिपल क्यूब (फिगर 4c और 4E) से बदलें ।
    5. 100X उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर १०० एनएम मल्टीचैनल मोतियों के साथ एक नमूना प्लेस और नमूना पर ध्यान केंद्रित ।
    6. कैमरा और ४८८-एनएम लेजर पर बारी, उज्ज्वल मोतियों में से एक पर ज़ूम, और पतले समायोजन नियंत्रण knobs फिर से बदल कर तीन चैनलों संरेखित करें (चित्रा 4E और 4g).
      नोट: १००-एनएम मल्टीचैनल मोती ४८८-एनएम उत्तेजना पर प्रकाश की विभिंन तरंग दैर्ध्य फेंकना, तीन चैनल संरेखण को सक्षम करने से ।
  3. कैमरा और पराबैंगनीकिरण पर बारी, ध्यान दें, और एक उचित स्थान घनत्व के साथ एक अच्छी स्थिति का पता लगाएं । लेजर शक्ति और जोखिम समय स्वीकार्य संकेत करने वाली शोर और photobleaching स्तर को प्राप्त करने के लिए समायोजित करें । समय-चूक छवियों को लेने के लिए माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।

5. एसआर इमेजिंग

नोट: यह एकल अणु का पता लगाने आधारित एसआर माइक्रोस्कोपी है.

  1. SR इमेजिंग सेट करने के लिए, 3-डी लेंस डालें और पत्रिका लेंस निकालें । उपयुक्त लेजर चैनलों (जैसे, 5-60 ms) में कैमरे के जोखिम समय निर्धारित करें । निर्धारित करें और मैन्युअल TIRF कोण होने के लिए इष्टतम उत्तेजना पराबैंगनीकिरण ' आकस्मिक कोण सेट.
  2. नमूना SR इमेजिंग बफ़र16में रखें । बफ़र को इमेजिंग से पहले कम से equilibrate 10 मिनट के लिए अनुमति दें ।
    नोट: sr इमेजिंग बफ़र लगभग 1 h के बाद समाप्त हो रही है, इसलिए नए sr इमेजिंग बफ़र तदनुसार करें ।
  3. एसआर इमेजिंग से पहले एक डिक छवि ले लो । आदेश में SR, जो दृष्टिवैषंय प्रभाव का अनुकूलन के लिए उचित उद्देश्य ऊंचाई को खोजने के लिए, का उपयोग करें, डिक इमेजिंग कोशिकाओं के मध्य विमान खोजने के लिए । जिस ऊँचाई पर "प्रकाश" से "डार्क" छवियों के संक्रमण और पारदर्शी (चित्र 5, 5B, और 5C) बनने के लिए दिखाई देते हैं, उस ऊंचाई से विमान की पहचान करें । एक बार वांछित फोकल विमान निर्धारित किया जाता है, जेड बहाव सुधार प्रणाली (आंकड़ा 1a) संलग्न ।
  4. आचरण एसआर इमेजिंग । ४०५-एनएम लेजर शक्ति बदलें के एक उचित घनत्व को बनाए रखने के लिए ' निमिष-ऑन ' स्पॉट ।
    नोट: हालांकि यह ४०५-एनएम लेजर मैंयुअल रूप से बदलने के लिए संभव है, यह और अधिक सुविधाजनक है एक क्रमादेशित डेटा अधिग्रहण कोड को चलाने के लिए "निमिष के घनत्व" स्थानों पर बनाए रखने के । यहां कैसे यह स्वचालित रूप से आयोजित किया जाता है का एक उदाहरण है । स्रोत कोड (चित्रा 6) अनुरोध पर उपलब्ध है ।
    1. 0 W/cm2 वायलेट लेजर पावर के साथ इमेजिंग अधिग्रहण शुरू करो ।
    2. एक निश्चित अवधि में ब्लिंकिंग-ऑन स्पॉट की संख्या गिनना ।
    3. वायलेट लेजर शक्ति का नियमन इतना है कि पलक-पर धब्बे की संख्या को देखने के क्षेत्र में एक उपयोगकर्ता परिभाषित "गिनती सीमा" के ऊपर रखा जाता है । वायलेट लेजर शक्ति बढ़ाएं जब पलक के धब्बे की संख्या गिनती सीमा से नीचे चला जाता है ।
    4. अधिग्रहण समाप्त जब ब्लिंकिंग की संख्या-स्थानों पर अधिकतम वायलेट लेजर शक्ति का उपयोग कर गिनती सीमा से नीचे गिरता है ।
      नोट: अधिकतम अलग नमूना चमक के आधार पर सेट किया जा सकता है, लेकिन कोई अधिक से अधिक १३० W/ SR इमेजिंग के वास्तविक लक्ष्य पर निर्भर करता है, इस स्वत: अधिग्रहण कोड मैंयुअल रूप से किसी भी वांछित बिंदु पर समाप्त किया जा सकता है ।
  5. अधिग्रहण शुरू करने के बाद जल्द ही स्पॉट के चमचमाते व्यवहार और PSFs की जांच करें ।
    नोट: यदि ब्लिंक करने वाला व्यवहार आदर्श नहीं है, तो उत्तेजना लेज़र्स के आकस्मिक कोण को बदलें या इमेजिंग बफ़र को प्रतिस्थापित करें । "ऊर्ध्वाधर", "क्षैतिज", और पीएसएफ के "हीरे" आकार के एक नमूने की उंमीद, नीचे से ऊपर, fluorophores का प्रतिनिधित्व करने के लिए, और फोकल विमान के भीतर, क्रमशः (चित्रा 5d) । यदि अधिकांश स्थानों या तो ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज PSFs दिखाने के लिए, तो फोकल विमान की कोशिकाओं के केंद्र से बंद है, तो प्रयोग को समाप्त करने और फोकल विमान फिर से समायोजित करें । विसर्जन तेल या अंय स्थानीय कारकों में हवा बुलबुला की उपस्थिति PSFs ' गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह तेल की जगह या नमूना के एक अलग इमेजिंग क्षेत्र में परिवर्तन करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  6. डेटा विश्लेषण के लिए, या तो खुला स्रोत का उपयोग करें (NIH ImageJ plugins में) या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोड प्रत्येक इमेजिंग फ्रेम में प्रत्येक स्थान के centroids का पता लगाने के लिए और x-और y-चौड़ाई14से प्रत्येक स्थान के z-मानों को निकालने के लिए ।
    नोट: इस रिपोर्ट में, मूल रूप से एक से जल्द एकल-अणु पता लगाना-आधारित SR8 में विकसित एक स्रोत कोड 3-डी डिटेक्शन16 के लिए संशोधित किया गया था और उपयोग ।
  7. दो रंग इमेजिंग के मामले में, अब उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ fluorophore छवि, छोटे उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक के बाद । स्वचालित प्राप्ति कोड चरण ५.४ में वर्णित एक करने के लिए इसी प्रकार चलाएँ, लेकिन एक भिन्न इमेजिंग लेज़र के साथ ।
    नोट: रंगीन वाकया अलग fluorophores (जैसे, लाल डाई और पीले-हरे रंग) के साथ छवियों के बीच सही किया जाना चाहिए । यहां कदम उठाए हैं ।
    1. कांच coverslip पर एकाधिक १०० एनएम मल्टीचैनल मोती स्थिर, समूहों के गठन से परहेज ।
    2. अलग उत्तेजना चैनलों में उनमें से छवियों को ले लो ।
    3. उनके (एक्स, वाई, जेड) सॉफ्टवेयर से निर्देशांक (चरण ५.६) निकालें ।
    4. भूखंड ΔXi = x1i -x2i और ΔYi = y1i -y2i (मैं अलग मोतियों के लिए है, और 1 और 2 अलग रंग चैनल हैं) अलग से और उचित कार्यों के साथ उन्हें फिट. कार्य सहेजें ।
      नोट: अधिकांश मामलों में रेखीय कार्य पर्याप्त होते हैं. एक बार इन फ़ंक्शंस निर्धारित कर रहे हैं, इस माप इमेजिंग के प्रत्येक समय दोहराया जा करने के लिए नहीं है ।
    5. ब्याज का एक नमूना के वास्तविक दो रंग एसआर इमेजिंग में, सही करने के लिए कार्य लागू (एक्स, वाई) रंगीन वाकया. z-दिशात्मक रंगीन विचलन के लिए, यह ΔZ प्राप्त करने के द्वारा आचरण = z1 -मल्टीचैनल मोतियों के लिए जेड2 या ज्ञात संदर्भ मल्टीचैनल नमूने ब्याज के नमूने के साथ एक साथ बीज ।
      नोट: विपरीत (एक्स, वाई) रंगीन वाकया, जेड-दिशात्मक रंगीन वाकया एक प्रयोग में अच्छी तरह से reproducible नहीं है, मुख्य रूप से अधूरा जेड के कारण चैनल स्विचन पर दिशात्मक ध्यान रखरखाव । इस प्रकार, यह हर बार सुधार का संचालन करने के लिए सिफारिश की है । ΔZ = z1 -z2 ज्यादातर (एक्स, वाई) के स्वतंत्र है, तो बस कुछ मोती या संदर्भ नमूने ब्याज की प्रत्येक नमूना क्षेत्र के प्रति पर्याप्त होगा । 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर में निर्मित अंतिम दो-रंग SR छवियां प्लॉट करें और मैंयुअल रूप से ΔZ जांचें ।

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Representative Results

इस माइक्रोस्कोप लचीला और reproducible विभिन्न इमेजिंग तरीकों के बीच स्विचन की अनुमति देता है. यहाँ हम प्रत्येक इमेजिंग मॉड्यूल के साथ एकत्र नमूना छवियों को दिखाते हैं.

चित्रा 5d एसआर अर्जन के दौरान पीएसएफ के चमचमाते-अणु पर प्रदर्शित होता है । इस तरह के हजारों छवियों को अंतिम SR छवि (चित्रा 5E) उत्पंन करने के लिए खंगाला जाता है । चित्रा 5E एक ही जीवाणु विनियामक RNAs के रूप में चित्र 7Aमें महामारी-प्रतिदीप्ति छवि में दिखाया दिखाता है । चित्रा 7 ई कोलाई कोशिकाओं में एक छोटे से विनियामक आरएनए के प्रतिनिधि महामारी प्रतिदीप्ति छवियों और U2OS स्तनधारी कोशिकाओं में एक mRNA से पता चलता है. दोनों RNAs fluorophore-टैग डीएनए oligo के माध्यम से सीटू संकरण17 में के माध्यम से लेबल रहे हैं । चित्रा 8 दाता डाई (ग्रीन डाई) और स्वीकारकर्ता डाई (लाल डाई) के साथ लेबल मुड़ा हुआ आरएनए अणुओं के प्रतिनिधि smFRET माप से पता चलता है. परिसरों माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मैटीरियल हैं, और TIRF रोशनी से उत्साहित । प्रतिदीप्ति तीव्रता पथ व्यक्तिगत एकल अणुओं से निकाला जा सकता है, समय के एक समारोह के रूप में झल्लाहट क्षमता पैदा ।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोस्कोप सेट अप की डिजाइन । (क) यह पैनल सेट-अप का एक आरेख दिखाता है. एम = दर्पण, डीबीएस = dichroic बीम अलगानेवाला, LCF = लेजर साफ अप फ़िल्टर, I = आईरिस, एल = लेंस, एपी = एडाप्टर प्लेट, ZTM = z-अक्ष शोधों के माउंट, = ऑप्टिकल फाइबर, ओएफसी = ऑप्टिकल फाइबर युग्मन, सीएल = बेलनाकार लेंस, TL = ट्यूब लेंस, EF = उत्सर्जन फ़िल्टर (ओं), Obj = उद्देश्य लेंस, और SM = कदम मोटर । z-बहाव सुधार प्रणाली z-बहाव के विपरीत दिशा करने के लिए उद्देश्य लेंस के nosepiece पर कदम मोटर चलता है, जो अपने स्वयं के नेतृत्व द्वारा उत्पन्न अवरक्त (आईआर) संकेत द्वारा गणना की है और अपने स्वयं के डिटेक्टर द्वारा पता चला. (ख) इस पैनल लेजर उत्तेजना विधानसभा से पता चलता है । चार पराबैंगनीकिरण दर्पण और dichroic किरण बंटवारे के माध्यम से संयुक्त कर रहे हैं और फिर एक फोकस लेंस के माध्यम से एक ऑप्टिकल फाइबर के लिए निर्देशित कर रहे हैं और एक अनुकूलक प्लेट एक शोधों पर बैठे (चित्र के नीचे) माउंट. (ग) यह पैनल लेजर मॉडुलन दिखाता है । दो संगीन Neill-Concelman (BNC) केबलों के प्रत्येक लेजर से जुड़े होते हैं (या तो सिर या नियंत्रक, निर्माता के आधार पर) TTL और एनालॉग मॉडुलन के लिए (सबसे बाएं पैनल). BNC केबल एक एकल केबल (मध्य पैनल) जो कंप्यूटर नियंत्रण के लिए एक कार्य केंद्र (rightmost पैनल) में एक डेटा प्राप्ति कार्ड से जुड़ा है में संयुक्त रहे हैं । (घ) इस पैनल के दर्पण और dichroic बीम अलगानेवाला mounts दिखाता है । (ङ) एक पिंजरे प्रणाली में एक फाइबर युग्मक निर्माण । एक फाइबर अनुकूलक प्लेट (एपी) एक z-अक्ष अनुवाद माउंट (ZTM) में घुड़सवार है ताकि achromatic डबल लेंस (L1, दिखाया ओर देखें) के लिए अपनी दूरी संग्राहक किया जा सकता है । एपी और ZTM धागे मिलान किया है, L1 और पिंजरे की थाली के रूप में ही । (च) आईरिस की एक जोड़ी (घेरना) एकाधिक पराबैंगनीकिरण के लिए संरेखण प्रक्रिया के दौरान स्थापित कर रहे हैं । वे ६४७-एनएम लेजर (बाएं पैनल) और ५६१-एनएम लेजर (सही पैनल) एक ही रास्ते के माध्यम से जाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है । (छ) उत्सर्जन पथ का आंशिक भाग दिखाया गया है । माइक्रोस्कोप शरीर के बाहर, उत्सर्जन फिल्टर पहिया, उत्सर्जन अलगानेवाला, और EMCCD कैमरा क्रम में स्थापित कर रहे हैं । (ज) यह पैनल दीप्ति आर्म असेंबली को दिखाता है । पत्रिका लेंस दीप्ति बांह में डाला जाता है । उत्तेजना लेजर मुस्कराते हुए ऑप्टिकल फाइबर और ऑप्टिकल फाइबर युग्मन (चित्र के दाहिने हाथ की ओर) के माध्यम से प्रदीप्ति बांह के लिए भेजा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पत्रिका लेंस । (क) इस पैनल लेजर बीम (इकाई: मिमी) शीशा के लिए धारक आवास लेंस के लिखने का अनुमानों से पता चलता है । इस डिजाइन को रोशन बांह में फिट होने का इरादा है । (ख) इस पैनल जहां दो लेंस में मिल धारक में छेद के एक आंतरिक ड्राइंग से पता चलता है । L1 एक गुफा लेंस है और L2 एक उत्तल लेंस है, और उन दोनों के बीच की दूरी उनके फोकल लंबाई का योग है । (ग) इस पत्रिका के लेंस की एक तस्वीर है । (घ) पत्रिका लेंस का विस्तार करने के लिए या लेजर बीम (बाएं) ध्यान केंद्रित करने के लिए या लेजर (सही) को अपरिवर्तित रखने के लिए हटाया जा सकता है मुस्कराते हुए प्रकाश हाथ में डाला जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:3-डी लेंस । (क) इस पैनल बाईपास मोड और बेलनाकार लेंस (इकाई: मिमी) रखने के लिए एक आयताकार छेद के लिए एक खाली परिपत्र छेद होने धारक के लिखने का अनुमानों से पता चलता है । इस डिजाइन के लिए एक खुर्दबीन शरीर में उद्योग विश्लेषक स्लाइडर फिट होना करना है । (ख) यह 3 डी लेंस की एक तस्वीर है । (ग) बेलनाकार लेंस दृष्टिवैषंय (बाएँ) के साथ PSFs पैदा करने के लिए उत्सर्जन बीम पथ में लगे हो सकते हैं या PSFs को अक्षुण्ण रखते हुए (दाएँ) बायपास मोड के लिए विलिप्त हो सकते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: उत्सर्जन अलगानेवाला के मल्टी चैनल संरेखण । प्रकाशिकी और प्रकाश पथ की योजनाओं के साथ उत्सर्जन अलगानेवाला में दिखाया गया है (क) एक बाईपास घन, (ख) एक अंशांकन घन, और (ग) एक ट्रिपल घन । मी दर्पण = । बाईपास घन (M5) के अंदर एक दर्पण है और बाधा फिल्टर पहिया में एक उत्सर्जन फिल्टर (EF) के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए माना जाता है । अंशांकन घन बीम बंटवारे (बी एस) है कि रोशनी सभी चैनलों के माध्यम से जाने के लिए अनुमति देते हैं । ट्रिपल क्यूब में दो dichroic बीम रिभक्त (डीबीएस) हैं, साथ ही तीन उत्सर्जन फिल्टर भी हैं । (घ) ये तीनों क्यूब्स की तस्वीरें हैं. (ङ) उत्सर्जन अलगानेवाला के आंतरिक एक घन (ऊपरी पैनल) और एक घन (निचले पैनल) में फिसलने के साथ बिना दिखाया गया है । एम 3 एम 4 के पीछे है और तस्वीर में कब्जा नहीं है । दर्पण के लिए नियंत्रण knobs के उत्सर्जन अलगानेवाला (ऊपरी पैनल) के शीर्ष पर हैं । (च) इस पैनल ने चैनल संरेखण से पता चलता है कि उद्योग के अंतर्गत अंशांकन घन का उपयोग । (छ) इस पैनल के एक ठीक संरेखण से पता चलता है हरी (शीर्ष पैनल) और लाल (मध्य पैनल) का उपयोग कर चैनल १००-एनएम मल्टीचैनल मोती और एक ट्रिपल घन । दो चैनलों की एक मर्ज की गई छवि भी (नीचे पैनल) दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि एसआर छवि अधिग्रहण । इन पैनलों एक प्रतिनिधि (एक) के नीचे, (ख) में, या (सी) कोशिकाओं के केंद्रीय विमान के ऊपर के ऊपर (सी) छवि को दिखाने के लिए । (घ) यह पैनल पलक-पीएसएफ fluorophores का एक उदाहरण दिखाता है. ऑरेंज सर्कल के चारों ओर एक "ऊर्ध्वाधर" पीएसएफ । ग्रीन सर्कल के चारों ओर एक "क्षैतिज" पीएसएफ । नीले घेरे के चारों ओर एक हीरे के आकार का पीएसएफ, एक केंद्रित विमान में fluorophores का प्रतिनिधित्व । (ङ) इस पैनल से पता चलता है एक प्रतिनिधि SR छवि को खंगाला । एक छोटे से विनियामक आरएनए लाल डाई के साथ सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के साथ लेबल है । सफ़ेद बॉर्डर्स कक्षों के किनारों को चिह्नित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: SR इमेजिंग के लिए एक क्रमादेशित डेटा अधिग्रहण कोड. इस प्रोग्राम अधिग्रहण मॉड्यूल में, विभिन्न निष्पादन आदेशों और माइक्रोस्कोप नियंत्रण कार्यों बाएँ पैनल में सूचीबद्ध हैं और क्रमादेशित अधिग्रहण कोड बनाने के लिए चुना जा सकता है. आदेश क्रमिक रूप से ऊपर से नीचे निष्पादित होते हैं । यह स्क्रीनशॉट एक उदाहरण से पता चलता है जहां दोहराया गया इमेजिंग अधिग्रहण की एक पूर्वनिर्धारित निश्चित संख्या जब तक अधिग्रहण उत्पंन होता है और तीन अनुक्रमिक छवि फ्रेम में धब्बों की संख्या की गणना की जाती है । यदि इन स्थानों की औसत संख्या थ्रेशोल्ड (बैक्टीरियल इमेजिंग में कक्षों की संख्या के ५०% के रूप में परिभाषित) से ऊपर हैं, तो छवि प्राप्ति एक ही लूप में जारी रहती है । दहलीज के नीचे है, तो छवि अधिग्रहण अगले पाश में जारी है, जहां मजबूत वायलेट लेजर शक्ति का उपयोग किया जाता है (स्क्रीनशॉट के तल में कटौती). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिनिधि महामारी-प्रतिदीप्ति छवियां । (क) यह पैनल ई. कोलाई कोशिकाओं में एक छोटी सी नियामक आरएनए दिखाता है । (ख) यह पैनल U2OS स्तनधारी कोशिकाओं में एक mRNA दिखाता है । RNAs को सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के जरिए रेड डाई और ब्लू डाई के साथ लेबल कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: smFRET इमेजिंग का उदाहरण । (A) नमूने ५६१-एनएम लेजर के साथ उत्साहित थे । (ख) हरे और लाल रंगों से उत्सर्जन एक साथ एकत्र कर रहे है और हरे (दाएं) और लाल (बाएं) धब्बे, क्रमशः के रूप में दिखाया गया है । (ग) यह पैनल एक अणु से प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम ग्रीन डाई (हरा) और लाल डाई (लाल) के समय पथ दिखाता है । (घ) इस पैनल से पता चलता है झल्लाहट दक्षता बनाम समय पथ (ठोस नीली रेखा) के रूप में मैंस्वीकारकी गणना/(मैंदाता + मैंस्वीकारकर्ता) नमूने के एक अणु से । झल्लाहट ट्रेस हिडन मार्कोव मॉडल (डैश्ड रेड लाइन) से सज्जित है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस संकर माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए कई सूक्ष्मदर्शी खरीद की जरूरत समाप्त । ऑप्टिकल टेबल, टेबल स्थापना श्रम, सॉफ्टवेयर, और कार्य केंद्र सहित सभी भागों, के लिए कुल लागत के बारे में $२३०,००० है । कस्टम मशीन भागों, पत्रिका लेंस और 3 डी लेंस सहित, $७०० के आसपास लागत (लागत विभिंन संस्थानों में वास्तविक शुल्क पर निर्भर करता है) । ठेठ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकल अणु का पता लगाने के लिए एकीकृत प्रणालियों-आधारित एसआर माइक्रोस्कोपी लागत से अधिक $३००,००० ~ ४००,००० और smFRET माप के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, या महामारी-दृश्य के एक उचित क्षेत्र के लिए, सफेद प्रकाश के बिना स्रोत. इस प्रकार, यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण एक काफी कम कीमत पर कई सूक्ष्मदर्शी के बराबर इमेजिंग क्षमताओं को प्राप्त कर सकते हैं ।

यह संग्राहक माइक्रोस्कोप प्रणाली विभिन्न निर्माताओं से माइक्रोस्कोप शरीर पर आधारित किया जा सकता है । 3-डी लेंस संभावित उत्सर्जन के रास्ते में किसी भी स्थिति में स्थापित किया जा सकता है, उत्सर्जन अलगानेवाला अंदर सहित, माइक्रोस्कोप शरीर के भीतर, या फिल्टर पहिया और उद्देश्य nosepiece के बीच उपलब्ध स्थान में । हालांकि, 3-डी लेंस के भौतिक स्थान 3 डी एसआर इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा दृष्टिवैषंय प्रभाव को प्राप्त करने के लिए अपने फोकल लंबाई निर्धारित करेगा । हम एक 10 मीटर फोकल लंबाई के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं । पत्रिका लेंस मूलतः एक बीम विस्तारक उत्तेजना पथ में स्थापित है । यदि उत्तेजना पराबैंगनीकिरण हवा-युग्मित कर रहे हैं (यानी, ऑप्टिकल फाइबर के बिना), यह इस तरह के एक विस्तारक के बाद किसी भी स्थान में स्थापित करने के लिए तुच्छ है लेजर बीम collimated हैं. यदि उत्तेजना पराबैंगनीकिरण फाइबर युग्मित कर रहे हैं, तो अतिरिक्त स्लॉट के लिए देखो दो लेंस स्थापित करने के लिए (एक गुफा और अंय एक उत्तल) । उदाहरण के लिए, कई वाणिज्यिक रोशनी हथियार तटस्थ घनत्व फिल्टर के लिए स्लॉट है । दो स्लॉट के बीच की दूरी के बराबर उनके फोकल लंबाई के योग के साथ दो लेंस का पता लगाएं । तो, वे एक पत्रिका लेंस के रूप में कार्य डाला जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक माउंट के लिए क्षेत्र डायाफ्राम स्लाइडर यदि उपलब्ध हो, एक और जगह हो सकती है । एक हटाने योग्य कैसेट में पत्रिका लेंस बिल्डिंग उत्तेजना पराबैंगनीकिरण ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च शक्ति है, जो एसआर इमेजिंग के लिए आवश्यक हो सकता है, बस पत्रिका लेंस के उंमुखीकरण flipping द्वारा प्राप्त करने के लिए एक को सक्षम करने का अतिरिक्त लाभ है ।

इस रिपोर्ट में, हम तीन अलग इमेजिंग तकनीक एक संग्राहक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के बीच लचीला स्विचन का प्रदर्शन किया । इस सेट अप व्यापक और अधिक उंनत अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, SR विंयास एकल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लाइव कोशिकाओं में ट्रैकिंग कण, फोटो पर स्विच या photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैग ब्याज18,19के अणुओं । smFRET विंयास में vivo सिस्टम20में आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उत्सर्जन अलगानेवाला-आधारित मल्टी चैनल पता लगाना दो-रंग sr इमेजिंग या एकल-कण ट्रैकिंग एक साथ21करने के लिए sr कॉन्फ़िगरेशन के साथ संयोजित किया जा सकता है ।

इस सेट अप और अधिक संग्राहक घटकों को सक्षम करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, फिल्टर बुर्ज और दीप्ति डिब्बे की एक और परत को जोड़ा जा सकता है, ताकि अतिरिक्त उत्तेजना/उत्सर्जन पथ को अतिरिक्त चैनलों के लिए बनाया जा सके, जैसे कि आईआर रंगों के साथ लेबल किए गए इमेजिंग नमूनों के लिए एक अवरक्त (ir) लेजर के साथ । जोड़ा गया इमेजिंग चैनल की अनुमति देने के अलावा, IR पराबैंगनीकिरण या तो इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान या पोस्ट विश्लेषण के दौरान एसआर इमेजिंग में मंच बहाव को सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान बहाव सुधार के लिए, z-बहाव सुधार प्रणाली माइक्रोस्कोप निर्माता से उपलब्ध नहीं है, तो आईआर लेजर के साथ एक वैकल्पिक प्रणाली14 homebuilt या तीसरे पक्ष की कंपनियों से अधिग्रहीत किया जा सकता है । बाद अधिग्रहण बहाव सुधार के लिए, एक IR लेजर फिड्यूशियल मार्करों पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 22

एकल अणु का पता लगाने आधारित एसआर माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर के दो सेट, डेटा अधिग्रहण के लिए एक और डेटा विश्लेषण के लिए एक की आवश्यकता है । डेटा अधिग्रहण के लिए, यहां तक कि एक सरल homebuilt सॉफ्टवेयर है कि कैमरे के माध्यम से छवियों लेता है, जबकि लेजर ' पर/बंद व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए SR छवियों को उत्पंन काम कर सकते हैं, जबकि यह संभव है मैंयुअल रूप से ४०५-एनएम लेजर शक्ति, जैसे, एक घूर्णन द्वारा ढाल तटस्थ घनत्व फिल्टर लेजर के सामने स्थापित किया । हालांकि, प्रयोग के संचालन के इस तरह के धब्बे पर निमिष के घनत्व के प्रयोगकर्ता के व्यक्तिपरक निर्णय पर निर्भर है । इस प्रकार, इस तरह से उद्देश्य नहीं है और SR इमेजिंग डेटा के ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा उपयुक्त नहीं हो सकता है । डेटा अधिग्रहण चल रहा है, जबकि यहाँ इस्तेमाल किया डेटा अधिग्रहण कोड स्थान का पता लगाने/एक गिनती एल्गोरिथ्म शामिल है, निमिष-ऑन स्पॉट (चित्रा 6) के घनत्व के आधार पर ४०५-एनएम लेजर शक्ति का स्वत: मॉडुलन सक्षम करने से । आजकल, कुछ सूक्ष्मदर्शी निर्माताओं प्रोग्राम इमेजिंग मॉड्यूल प्रदान करते हैं, तो एक इन का उपयोग कर सकते हैं, या माइक्रो प्रबंधक की तरह खुला स्रोतों से plugins के लिए देखो । डेटा विश्लेषण के लिए, यह सूक्ष्मदर्शी निर्माताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण मॉड्यूल का उपयोग करें या ImageJ जैसे खुले स्रोतों से plugins के लिए देखने के लिए संभव है ।

संक्षेप में, सेट अप यहां प्रस्तुत उच्च बहुमुखी प्रतिभा और एक कम लागत और अंतरिक्ष में विभिंन इमेजिंग विंयास के बीच आसान स्विचन प्रदान करता है । इस सेट अप को नियमित और विविध इमेजिंग प्रयोगों के लिए एक जरूरत के साथ जैविक विज्ञान में किसी भी शोध प्रयोगशाला द्वारा अपनाने के लिए अपेक्षाकृत आसान है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

J.F. Searle विद्वानों के कार्यक्रम और NIH निदेशक के नए आविष्कारक पुरस्कार से समर्थन स्वीकार करता है । लेखक पॉल सेलविन लैब से उपयोगी सुझाव स्वीकार (इलिनोइस विश्वविद्यालय, Urbana-Champaign) स्थिति 3 डी लेंस के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon Ti-E microscope stand Nikon Ti-E
Objective lens Nikon 100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Microscopy imaging software Nikon NIS-Elements Advanced Research/HC HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging.
The illumination arm Nikon Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M This arm has a slot for a magnification lens
Analyze block Nikon Ti-A This is installed in the filter turret.
Z-drift correction system Nikon PFS This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector.
Optical table top TMC 783-655-02R
Optical table bases TMC 14-426-35
647 nm laser Cobolt 90346 (0647-06-01-0120-100) Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
561 nm laser Coherent 1280721 OBIS 561nm LS 150mW Laser System
488 nm laser Cobolt 90308 (0488-06-01-0060-100) Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit)
405 nm laser Crystalaser DL405-025-O 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust
Heat sink Cobolt 11658 (HS-03) Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers
Heat sink Coherent 1193289 Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser
CAB-USB-miniUSB Cobolt 10908 Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers
aluminum for height adjustment McMaster-Carr 9146T35 Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser
aluminum for height adjustment McMaster-Carr 8975K248 Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser
BNC cable L-com CC58C-6 RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft
BNC adapter L-com BA1087 Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded
SMA to BNC Adapter HOD SMA-870 Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection.
SMB to BNC Adapter Fairview Microwave FMC1638316-12 SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers
Data Acquisition Card National Instruments PCI-6723 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc
Barrier Filter Wheel controller Sutter Instrument Lambda 10-B Optical Filter Changer
Emission Splitter Cairn OptoSplit III
Dichroic beamsplitter Chroma T640LPXR-UF2 Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III
Dichroic beamsplitter Chroma T565LPXR-UF2 Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III
Emission filter Chroma ET700/75M Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter Chroma ET595/50M Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter Chroma ET525/50M Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel
Emission filter Semrock FF02-447/60-25 Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel
Dichroic beamsplitter Chroma zt405/488/561/647/752rpc-UF3 Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body
DAPI Filter set Chroma 49000 installed in the microscope body
Nikon laser/TIRF filtercube Chroma 91032
590 long pass filter Chroma T590LPXR-UF1 for combining 647 nm laser and 561 nm laser
525 long pass filter Chroma T525LPXR-UF1 for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser
470 long pass filter Chroma T470LPXR-UF1 for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser
Laser clean-up filter (647) Chroma zet640/20x for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser
Laser clean up filter (488) Semrock LL01-488-25 for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser
LED light source Excelitas X-Cite120LED used only for DAPI imaging
Mirror mount Newport SU100-F3K
Optical posts Newport PS-2
Clamping fork Newport PS-F
Power Meter Newport PMKIT For measuring laser power
Dichroic beamcombiner mount Edmund Optics 58-872 C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly
Retaining ring Thorlabs CMRR used for dichroic beamcombiner mounts
Fiber Adapter Plate Thorlabs SM1FC FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread
Z-axis translational mount Thorlabs SM1Z Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible
Achromatic Doublet lens Thorlabs AC050-008-A-ML Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm
Cage Plate Thorlabs CP1TM09 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap
Cage Assembly Rod Thorlabs ER4 Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm
Cage Mounting Bracket Thorlabs CP02B 30 mm Cage Mounting Bracket
Single mode optical fiber Thorlabs P5-405BPM-FC-2 Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m
Multi mode optical fiber Thorlabs M42L01 Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m
Achromatic Doublet lens (mag lens) Thorlabs ACN127-025-A ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens"
Achromatic Doublet lens (mag lens) Thorlabs AC127-050-A f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens"
Retaining ring Thorlabs SM05PRR SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens"
Nylon-tipped screw Thorlabs SS3MN6 M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens"
3D lens CVI Laser Optics RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 f=10 m, rectangular cylindrical lens
EMCCD camera Andor iXon Ultra 888
100 nm multichannel beads Thermo T7279, TetraSpeck microspheres
red dye Thermo Alexa Fluor 647
yellow-green dye GE Healthcare Cy3
green dye GE Healthcare Cy3B
blue dye Thermo Alexa Fluor 488

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References

  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

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इंजीनियरिंग अंक १४० प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सुपर संकल्प इमेजिंग smFRET तूफान पाम TIRF
एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कई इमेजिंग मोड का आयोजन
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Park, S., Zhang, J., Reyer, M. A.,… More

Park, S., Zhang, J., Reyer, M. A., Zareba, J., Troy, A. A., Fei, J. Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope. J. Vis. Exp. (140), e58320, doi:10.3791/58320 (2018).

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