Summary
여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.
Abstract
형광 현미경 검사 법 생물학 분자에 제자리에서 감지 하 고 그들의 역학과 실시간으로 상호 작용을 모니터링 하는 강력한 도구입니다. 기존의 피-형광 현미경 검사 법, 뿐만 아니라 다양 한 이미징 기술은 특정 실험 목표를 달성 하기 위해 개발 되었습니다. 널리 사용 되는 기술의 일부 구조적 변화와 angstrom 해상도와 단일 분자 검출 기반 분자 상호 작용을 보고할 수 있는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (smFRET) 포함 슈퍼 해상도 (SR) 이미징, twentyfold 회절 제한 된 현미경 검사 법에 비해 공간 해상도를 약 10를 강화 수 있습니다. 여기에 우리가 고객 설계 통합된 시스템을 병합 한 현미경, 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 SR 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출을 포함 한 여러 이미징 방법 제시 smFRET 이미지를 포함 하 여. 다른 이미징 방법은 쉽고 reproducibly 광학 요소를 전환 하 여 얻을 수 있습니다. 이 설정 루틴 및 감소 된 비용 및 개별 목적에 대 한 별도 현미경 건물 상대적인 공간에 다양 한 이미징 실험에 대 한 필요와 함께 생물 과학에 어떤 연구소에 의해 채택 하는 것이 더 쉽습니다.
Introduction
형광 현미경 현대 생물 과학 연구를 위한 중요 한 도구 이며 형광 이미징 정기적으로 많은 생물학 실험실에서 수행 됩니다. Fluorophores에 대 한 관심의 생체에 태그를 지정, 우리가 직접 현미경 그들을 시각화 하 고 지역화, 구조, 상호 작용, 및 조립 상태 vivo 또는 생체 외에서시간에 따른 변화를 기록 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 있다 회절 한정 된 공간 해상도 측면 방향으로 200 ~ 300 nm와 ~ 500-700 nm 축 방향1,2에 이다, 따라서, 이미징의 100s에 제한 나노미터-미크론 규모입니다. 회절 한계를 깰 수 있는 다양 한 SR microscopies 분자 어셈블리 또는 조직에 미세한 세부 정보를 공개 하기 위해 개발 되었습니다. SR를 달성 하는 데 사용 하는 전략 등이 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경3,4 구조화 조명 현미경 (SIM)5,6, 등의 비선형 광학 효과 7, 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)8 , photoactivated 지역화 현미경 (팜)9, MINFLUX10등 둘의 조합 등 단일 분자의 확률론 탐지. 이러한 SR microscopies 중 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 단일 분자 현미경 설정에서 상대적으로 쉽게 수정할 수 있습니다. 반복적인 활성화 및 photoactivatable 형광 성 단백질 (FPs) 또는 관심의 생체에 태그 사진 전환 염료의 이미징, 공간 해상도 10-20 nm11를 도달할 수 있다. 분자 상호 작용 및 구조적 정보를 실시간, angstrom 나노미터 분해능의 역학이 필요 합니다. smFRET12,13 는이 해상도 달성 하기 위해 하나의 방법입니다. 일반적으로, 관심사의 생물학 질문에 따라 다른 공간 해상도 이미징 방법 필요 합니다.
일반적으로, 이미지의 각 유형에 대 한 특정 여기 / 방출 광 구성 필요 합니다. 예를 들어, 단일 분자 검출에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 조명 방법 중 하나는 특정 자극 각도 프리즘을 통해 또는 대물 렌즈를 통해 달성 될 필요가 총 내부 반사 (사격)을 통해서이다. SmFRET 검출에 대 한 기증자와 수락자 염료에서 방출 필요가 공간적으로 분리 하 고는 전자-멀티, 전 하 결합 소자 (EMCCD), 거울 및 dichroic 빔 스플리터 집합으로 달성 될 수 있는의 다른 부분에 지시 배출 경로에 배치. 3 차원 (3 차원) SR 이미징, 원통형 렌즈14등 광학 부품 방출 경로에 난시 효과 일으킬 필요 합니다. 따라서, homebuilt 또는 상업적으로 사용할 수 있는 통합된 현미경 이미징 방법의 각 유형에 대 한 일반적으로, 기능적으로 전문화, 고 유연에 같은 설정 다른 이미징 방법 사이 전환 하는. 여기에 우리가 현재 세 가지 다른 이미징 방법 사이 조정 하 고 재현할 수 스위치를 제공 하는 비용 효율적인, 하이브리드 시스템: 회절 제한 된 해상도, 단일 분자 검출 기반 SR 기존의 피 형광 이미징 이미징, 그리고 smFRET (그림 1A) 이미지를 포함 하 여 다 색 단일 분자 검출. 특히, 여기에 제시 된 설정 멀티 컬러 여기 입력된 레이저 섬유 커플링을 포함 하 고 있습니다 여기 경로에 상업 조명 팔 피 모드 및 사격 모드 사이 전환 하려면 여기 각도의 제어 프로그램. 배출 경로에 이동식 homebuilt 원통형 렌즈 카세트 3 차원 SR 이미징 위한 현미경 신체 내 되 고 상업 빔 스플리터는 여러 배출 채널 검색을 선택적으로 사용할 수 있는 EMCCD 카메라 앞 동시에.
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Protocol
1. 현미경 설계 및 조립
-
여기 경로
참고: 여기 경로 레이저, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 구성 요소, 현미경 신체와 그것의 조명 팔을 포함 됩니다.- 진동 절연 광학 테이블을 준비 합니다. 예를 들어 48 x 96 x 12'의 구조적 댐핑 테이블 모든 구성 요소에 대 한 충분 한 공간을 제공합니다.
참고: (예를 들어, 21.4 ± 0.55 ° C) 온도 제어와 방에 설정을 빌드하십시오. 온도 안정성은 광학 줄 맞춤을 유지 하기 위해 중요 합니다. - 광학 섬유 연결에 대 한 조명 팔으로는 현미경 몸 설치 100 기름 침수 TIRF 목표 렌즈, 그리고 DIC 구성 요소 X는.
- 4 레이저 헤드 배치 (647 nm, 561 nm, 488 nm, 그리고 405 nm, 그림 1B에서 둘러싸고) 광학 테이블에 그들의 열 싱크 그리고 있는지 확인 내보낸된 레이저 광선 같은 높이 위치 (예: 좋은 안정성을 보장 하기 위해 가능한 한 짧게 3').
참고: 경우 레이저 머리 다른 레이저 보다 짧은 높이에, 아래 적절 한 두께와 알루미늄 플레이트를 넣어. 항상 열 싱크 및 최고의 방열 (그림 1B)에 대 한 광학 테이블 사이의 최대 접촉이 되도록 합니다. 레이저는 SR 이미징 충분히 강력 할 필요가 있다. 자료의 표를 참조 하십시오. 레이저 다이오드 레이저 앞 필터를 청소 하는 것이 좋습니다. - 데이터 수집 카드 주변 기기 구성 요소 상호 연결 (PCI) 인터페이스를 통해 워크스테이션에 설치 하 고이 카드와 함께 레이저를 연결 합니다. 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 출력으로 레이저의 ON/OFF 동작 및이 카드 (그림 1C)의 아날로그 출력 그들의 전원 조정 제어 합니다. 현미경 몸 뿐만 아니라 적절 한 현미경 이미징 (상업 또는 homebuilt) 데이터 수집 카드를 제어 하는 소프트웨어를 설치 합니다.
- 그들의 각각 마운트를 거울과 dichroic 빔 스플리터 (590, 525, 및 긴 필터를 통과 하는 470)를 탑재 합니다. 매우 안정적인 미러 마운트를 사용 하 여 거울에 대 한. 않도록 모든 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D)의 반지를 유지와 함께 원형 스플리터를 사용 합니다.
- 레이저 광선 (그림 1B)를 결합 하 여 광학 테이블에 거울과 dichroic 빔 스플리터를 놓습니다. 가장 안정 된 맞춤을 달성 하기 위해 전체 배치를, 소형 만들고 1'-두께 광 게시물을 사용 하 여. 이후 파장이 짧은 빛 발산 공중에 더 짧은 파장 레이저는 광섬유 커플링 (그림 1B)에 가까이 있도록 레이저를 정렬 합니다.
- 단일 모드 광섬유에 레이저 광선을 결합 합니다. 이렇게 하려면 다음 단계를 통해 케이지 시스템에서 섬유 커플러를 구축:
- (그림 1E, 왼쪽 패널) z 축 번역 마운트에서 섬유 어댑터 플레이트를 탑재 합니다.
- 무색 남자 용 상의 렌즈 마운트 (초점 거리 = 7.5 m m)는 감 금 소 접시 (그림 1E, 왼쪽에서 두 번째 패널).
- 확장 막대 감 금 소를 형성 하 여 위의 두 부분을 연결 합니다. 부류 1'-두꺼운 광 게시물 (그림 1E, 중간 패널)에 장착 된 광학 테이블에 케이지를 탑재 합니다.
- 먼저 단일 모드 광섬유 (커플러 FC/APC 끝) 647-nm 레이저를 맞춥니다.
참고: 단일 모드 광섬유를 사용 하기 전에 멀티 모드 광섬유를 사용 하 여 거친 정렬 정렬 과정을 도울 수 있다. 무색 남자 용 상의 렌즈 (그림 1E, z 축 번역 마운트를 조정 하 여) 섬유 어댑터 플레이트 사이의 거리 뿐만 아니라 dichroic 빔 스플리터 (그림 1D, 조정 손잡이 의해), 그리고 거울의 각도 조정 얻을 섬유를 통해 최대 레이저 전원 출력입니다. - 첫 번째 레이저의 맞춤 완료 되 면, 일시적으로의 쌍을 설치 하 고 하나 하나 레이저의 나머지 부분 (그림 1 층)을 정렬. 파워 미터와 맞춤 효율성을 확인 하십시오.
- 레이저의 반사를 줄이기 위해 어댑터 플레이트 앞 한 아이리스를 남겨 주세요.
참고: 강력한 다시 반사 레이저 소스의 수명 줄일 수 있습니다. 선택적으로, 반사를 완전히 제거 하려면 각 레이저 머리 앞 광 아이 솔 레이 터를 설치할 수 있습니다.
- (그림 1 H) 현미경의 조명 팔을 광섬유의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
- 디자인 하 고 "확대 렌즈 (마그네틱 렌즈)" 다음 단계를 통해 설치:
참고: 레이저는 샘플의 피 형광 이미징에 사용할 수 있지만 각 레이저의 좁은 빔 크기 제한 지역 여러 번 해당 카메라 센서의 실제 크기 보다 작은 샘플의 조명된 영역 특히 최신 (함께 대각선 길이 기존의 11.6 m m 길이에 비해 18.8 m m) 카메라. 따라서, 그것은 샘플의 크고 아첨 조명 달성 하 빔 확장 하는 것이 좋습니다.- 조명 팔 (그림 1 H)에 들어갈 수 있는 탄 창 렌즈 디자인.
참고: 매기 렌즈의 디자인 설치 됩니다 어디에 따라 달라 집니다. 레이저 광선은 조명을된 ( 토론참조) 후 어떤 자리에 설치 될 수 있습니다 하지만 그림 1 H 조명 팔에서 설치의 예를 보여줍니다. 컴퓨터 지원 설계 및 제도 소프트웨어와 함께 그것을 디자인. - 장소 두 achromatic 렌즈, 한 오목 (초점 거리 f1=), 볼록 하나 (초점 거리 f2=) f1 그들의 촛점의 합계에 동등한 거리와 집에서 만든 매기 렌즈 홀더 (그림 2A 및 2 C) + f2 = (-25) + 50 = 25 m m (그림 2B).
참고: 초점 길이의이 선택, 매기 렌즈 확장 빔을 f2/ | f1| = 2 폴드입니다. 매기 렌즈 다양성을 제공합니다. 그것은 일반 조명 광선 (그림 2D)를 확대 하지 않고 다시 시작을 제거 하거나 강한 자극 강도 달성 하기 위해 레이저 광선을 초점을 반대 방향으로 삽입 될 수 있습니다.
- 조명 팔 (그림 1 H)에 들어갈 수 있는 탄 창 렌즈 디자인.
- 진동 절연 광학 테이블을 준비 합니다. 예를 들어 48 x 96 x 12'의 구조적 댐핑 테이블 모든 구성 요소에 대 한 충분 한 공간을 제공합니다.
2. 배출 경로
참고: 배출 경로 이동식 원통형 렌즈, 배리어 필터 휠, 방출 스플리터, 그리고 EMCCD 카메라 (그림 1G)의 구성 됩니다. 최고의 포인트를 달성 하기 위해 단일 분자의 기능 (PSF) 확산, DIC 프리즘은 대물 렌즈에서.
- 사용자 정의 디자인 수동 DIC 분석기에 들어갈 수 있는 원통형 렌즈 (3 차원 렌즈) 카세트 현미경 몸 (그림 3C)에 슬롯을 삽입 합니다.
참고:이 디자인 분석기 블록 필터 포 탑에 삽입할 수 있습니다 이후 DIC 분석기를 타협은 하지. - 카세트에 초점 거리의 10 m의 3 차원 렌즈를 놓고 모든 단일 분자14의 z 좌표를 추출 하는 데 필요한 난시 효과 만드는 방출 빔 경로에 삽입 합니다.
참고: 필요에 따라 3 차원 렌즈 카세트 놓일 수 있다 또는 방출 경로 (그림 3C). - 현미경 신체 내부 필터 포 탑에서 멀티 밴드 dichroic 빔 스플리터를 설치 합니다.
- 배기 필터를 설치 합니다.
참고: 방출 필터 기본 fluorophores에 따라 선택 됩니다. 이미징 모듈에 따라 다른 위치에 배치 하는 방출 필터는 아래 설명 된 대로 사용 됩니다.- 순차적 멀티 컬러 피-형광 이미징 또는 SR 이미징, 채널 스위치 (그림 1G) 동안 현미경 신체에 진동을 최소화 하기 위해 현미경 시체 옆 연결 배리어 필터 휠에 방출 필터를 사용 합니다.
- 동시 멀티 검색 (예를 들어, smFRET 실험), 방출 스플리터 (확인 단계 4 자세한)에 설정 하는 다른 필터를 배치 합니다.
참고: 일반적으로, 상업적인 방출 스플리터는 두 전환 모드 (즉, "약혼" 또는 "무시" 모드). 2 색 성 빔 스플리터 및 3 개의 방출 필터 필터 큐브 chromatically 동시 멀티 컬러 이미징 ("약혼된" 모드)에 대 한 방출 빛을 분리 하는 ("트리플 큐브," 그림 4C 와 4d). 배리어 필터 휠에 빈 슬롯 트리플 큐브와 함께에서 사용 됩니다. 다른 한편으로, 순차적 멀티 컬러 이미징, 트리플 큐브 ("우회 큐브," 그림 4A 와 4 D) 내부 거울은 큐브도 바뀝니다.
- 배출 경로의 마지막 부분으로 EMCCD 카메라를 설치 합니다. 빠른 프레임 속도 달성 하기 위해 USB PCI 연결을 활용 합니다.
참고: EMCCD 카메라는 가장 중요 한 단일 분자 검출을 위한 좋지만 고급 sCMOS 카메라 대안이 될 수 있습니다.
3. 회절 제한 피 여기 이미징
- 피-모드 조명 팔에서을 여기 레이저 부수적 각도 조정 합니다.
- (그림 3C, 오른쪽 패널) 종사 하는 경우 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
- 우회 큐브 방출 스플리터 (그림 4A 및 4E, 하단 패널)에 삽입 합니다.
- (선택 사항) 확대 조명 영역 (그림 2D, 왼쪽된 패널)에 대 한 매기 렌즈를 삽입 합니다.
참고: 매기 렌즈와 기름 침수 렌즈 X 100의 사용, 약 91 x 91 µ m2 수 수 조명 균등 하 게, 백색 광원을 사용 하 여 여러 필터 큐브 필요가 없습니다. - 시간 경과 이미지 및/또는 Z-스택, 현미경 이미징 소프트웨어 멀티 채널을 사용 합니다.
참고: 여러 프로그램이 있다 현미경 이미징, 현미경 제조 업체에서 뿐만 아니라 제 3 자 회사 또는 오픈 소스 개발자에서 사용할 수 있습니다.
4. 멀티 채널 단일 분자 이미징 등 smFRET
참고: 어떤 파장을 가진 모든 방출 방출 스플리터에 필터/dichroic 빔 스플리터의 두 번째 집합에 도달할 수 있도록 배리어 필터 바퀴에서 "빈" 위치로 이동 합니다.
- 다 색을 설정 하려면 표면 움직일 분자15 TIRF 여기, smFRET 측정을 포함 하 여를 사용 하 여 단일 분자 검출 여기 레이저 부수적 각도 TIRF 각도를 조정 합니다. 매기 렌즈와 3 차원 렌즈를 분리 합니다.
- 다음 단계를 통해 방출 스플리터 (그림 1G)에 참여 3 채널 모드:
- "교정 큐브"와 바이패스 큐브 교체 빛 (그림 4B 와 4E) 모든 채널을 통해 갈 수 있는.
- DIC (즉, 배리어 필터 휠에 방출 필터)에서 카메라를 켭니다 하 고 3 개의 완전히 분리 된 채널 화면에 나타날 때까지 방출 스플리터의 조리개를 조정 합니다.
참고: 모든 채널을 시각화 하는 점등 방 빛와이 단계를 수행 합니다. - 수직/수평 조정 제어 손잡이 방출 분배기 설정와 약 3 채널 (그림 4E 및 4F)를 맞춥니다.
- 카메라를 끄고 트리플 큐브 (그림 4C , 4E) 교정 큐브를 바꿉니다.
- 샘플에 X 렌즈와 초점 100 위에 100 nm 멀티 채널 구슬과 샘플을 놓습니다.
- 카메라 및 488 nm 레이저, 밝은 구슬 중에 확대 하 고 정밀 하 게 조정 제어 손잡이 다시 (그림 4E 및 4 G)를 설정 하 여 3 개의 채널을 정렬.
참고: 100 nm 멀티 채널 구슬 3 채널 정렬 있도록 488 nm 여기에 빛의 다른 파장을 방출 한다.
- 카메라와 레이저, 포커스를 설정 하 고 합리적인 현장 밀도와 좋은 위치를 찾을. 허용 신호-잡음 및 photobleaching 수준을 달성 하기 위해 레이저 전원 및 노출 시간을 조정 합니다. 현미경 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 시간 경과 이미지를 데리고.
5. SR 이미징
참고:이 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 검사 법입니다.
- 명함 이미지를 설정 하려면, 3 차원 렌즈를 삽입 하 고 매기 렌즈를 제거 합니다. 적절 한 레이저 채널 (예를 들어, 5-60 ms)에서 카메라의 노출 시간을 설정 합니다. 확인 하 고 수동으로 TIRF 각도 되도록 최적의 여기 레이저 부수적 각도 설정 합니다.
- SR 버퍼16이미징에 샘플을 놓습니다. 버퍼 이미징 하기 전에 적어도 10 분 동안 equilibrate를 허용 한다.
참고: SR 이미징 버퍼 약 1 시간 후에 만료 됩니다, 그리고 그래서 새로운 SR 따라 버퍼 이미징. - SR 영상 전에 DIC 이미지를 가져가 라. SR, 난시 효과 최적화를 위한 적절 한 객관적인 높이 찾기 위해 DIC 이미징 셀의 중간 비행기를 찾을 수를 사용 합니다. 높이는 셀 "어두운" 이미지를 "빛"에서 전환 하 고 투명 하 게 표시 하 여 비행기를 식별 (그림 5A, 5B, 5c). 원하는 초점 비행기 결정 되 면 z 드리프트 보정 시스템 (그림 1A)를 갖습니다.
- 명함 이미지를 수행 합니다. ' 깜박이-에 ' 관광 명소의 적당 한 밀도 유지 하기 위해 405 nm 레이저 전원을 변경 합니다.
참고: 405 nm 레이저를 수동으로 변경할 수 있지만, 그것은 더 편리 "점멸-에" 관광 명소의 밀도 유지 하기 위해 프로그램된 데이터 수집 코드 실행. 여기에 어떻게 그것 자동으로 실시의 예가입니다. 소스 코드는 요청 (그림 6).- 0 W/c m2 바이올렛 레이저 파워와 이미지 수집을 시작 합니다.
- 특정 기간에 깜박임에 관광 명소의 수를 계산.
- 깜박임에 반점의 수는 사용자 정의 "카운트 임계값" 보기의 필드 위에 유지 되도록 바이올렛 레이저 파워를 조절. 깜박임에 반점의 수 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 바이올렛 레이저 파워를 증가.
- 깜박임에 반점의 수 최대 바이올렛 레이저 파워를 사용 하 여 카운트 임계값 미만으로 떨어지면 인수를 종료 합니다.
참고: 샘플 밝기에 따라 다르게 설정 하지만 130 W/c m2보다 작은 최대가 될 수 있습니다. SR 이미징의 실제 목표에 따라이 자동 수집 코드 수동으로 원하는 언제 든 지 종료 될 수 있습니다.
- 인수를 시작 후 곧 점멸 동작과 PSFs의 관광 명소를 확인 합니다.
참고: 깜박이 동작 하지 않으면 이상적인, 여기 레이저 부수적 각도 변경 하거나 대체 이미징 버퍼. "수직", "수평"와 "다이아몬드" 모양의 PSF, 대표 fluorophores 아래에서 위에, 초점 비행기 내에서 각각 (그림 5D)의 샘플링을 기대 합니다. 대부분 관광 명소는 수직 또는 수평 PSFs를 보여주면 다음 초점면 꺼져 세포의 센터에서 그래서 실험을 종료 하 고 초점 비행기를 다시 조정. 석유를 대체 하거나 샘플의 다른 이미지 영역을 변경 하는 일을 해야 할 수도 있습니다 그래서 침수 기름 또는 다른 로컬 요소에서 공기 방울이 존재 PSFs의 품질, 달라질 수 있습니다. - 데이터 분석에 대 한 각 영상 프레임에 각 명소의 중심을 감지 하 여 x 및 y 너비14에서 각 명소의 z 값을 추출 (NIH ImageJ 플러그인)에서 오픈 소스 또는 상업적으로 사용할 수 있는 코드를 사용 합니다.
참고:이 보고서에서 원래 초기 단일 분자 검출 기반 SR8 중에서 개발한 소스 코드 3 차원 탐지16 에 대 한 수정 그리고 사용 되었다. - 2 색 이미지의 경우 더 이상 여기 파장, 단파장 여기 한 다음 fluorophore 이미지. 마찬가지로 단계 5.4, 하지만 다른 이미징 레이저를 설명 하는 것 자동된 수집 코드를 실행 합니다.
참고: 다른 fluorophores (예를 들어, 붉은 염료와 노란색-녹색 염료)와 이미지 사이 색수차 수정 한다. 여기 스텝이 있다.- 클러스터 형성을 피하고 유리 coverslip에 여러 100 nm 멀티 채널 구슬 무력화
- 다른 여기 채널에 그들의 이미지를 가져가 라.
- 소프트웨어 (5.6 단계)에 의해 그들의 (X, Y, Z) 좌표 추출 물.
- Δ X나 플롯 X =1i -2i 와 δ Yi X = Y1i -Y2i (내가 다른 구슬, 이며 1와 2는 다른 색상 채널) 별도로 적절 한 기능을 가진 그들을 맞는. 함수를 저장 합니다.
참고: 선형 함수는 대부분의 경우에서 충분 합니다. 이 함수를 확인 하는이 측정은 화상의 각 시간 반복 될 필요가 없습니다. - 관심의 샘플의 실제 2-컬러 명함 이미징, (X, Y) 올바른 색수차 기능 적용 됩니다. Z-방향 색수차에 대 한 ΔZ를 취득 하 여 실시 = Z1 -Z2 에 멀티 채널 구슬 또는 알려진된 기준 멀티 채널 샘플의 샘플 함께 시드.
참고: (X, Y)와 달리 색수차, z-방향 색수차 채널 전환 시 불완전 한 z-방향 초점 유지 보수로 인해 주로 각 실험에서 잘 재현 되지 않습니다. 따라서, 각 시간 보정을 수행 하는 것이 좋습니다. ΔZ = Z1 -Z2 는 주로 독립의 (X, Y), 그래서 그냥 몇 가지 구슬 또는 참조 샘플 각 샘플 지역 당 충분 한 것. 3 차원 시각화 소프트웨어에 생성 된 최종 2 컬러 명함 이미지를 플롯 하 고 ΔZ를 수동으로 확인 합니다.
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Representative Results
이 현미경에는 유연 하 고 다른 이미징 방법 전환 재현할 수 있습니다. 여기 우리가 각 영상 모듈와 수집 된 샘플 이미지를 보여줍니다.
그림 5D 는 SR 중 깜박이에 분자의 PSF를 보여 줍니다. 같은 이미지의 수천은 최종 명함 이미지 (그림 5E)를 생성 하 재건. 그림 5E 그림 7A에피 형광 이미지와 같이 같은 세균성 규제 RNAs를 보여줍니다. 그림 7 U2OS 포유류 세포에서 대장균 세포에 작은 규제 RNA는 mRNA의 대표적인 피 형광 이미지를 보여준다. 두 RNAs 제자리 교 잡17통해 DNA 올리고 fluorophore 태그와 함께 표시 됩니다. 그림 8 기증자 염료 (녹색 염료)와 수락자 염료 (붉은 염료) 분류는 접힌된 RNA 분자의 대표적인 smFRET 측정을 보여줍니다. 단지 현미경 슬라이드에서 움직일 수 있으며 TIRF 조명에 의해 흥분. 형광 강도 궤적 생성 시간의 기능으로 무서 워 효율 개별 단일 분자에서 추출할 수 있습니다.
그림 1: 현미경 설정의 디자인. (A)이이 패널 설정의 다이어그램을 표시 합니다. M = 거울, DBS dichroic 빔 스플리터, LCF = = 레이저 청소 필터, 나 아이리스, L = 렌즈, AP = 어댑터 플레이트, ZTM = = z 축 변환 탑재의 광학 섬유, OFC = 광섬유 커플링, CL = 원통형 렌즈, TL = 튜브 렌즈, EF = 방출 필터, Obj = 목표 = 렌즈, 그리고 SM = 단계 모터. Z-드리프트 보정 시스템 대물 렌즈의 nosepiece에 자체 LED에 의해 생성 하 고 자체 검출기에 의해 감지 적외선 (IR) 신호에 의해 계산 된 z 드리프트의 반대 방향으로 스텝 모터를 이동 합니다. (B)이이 패널 레이저 여기 어셈블리를 보여 줍니다. 4 레이저 거울 및 dichroic 빔 스플리터를 통해 결합 하 고 초점 렌즈와 변환 마운트 (그림의 아래쪽)에 어댑터 플레이트를 통해 광섬유 연결 됩니다. (C)이이 패널 레이저 변조를 보여준다. 2 개의 고정 닐-Concelman (BNC) 케이블 TTL 및 아날로그 변조 (왼쪽 패널) 각 레이저 (머리 또는 제조업체에 따라 컨트롤러)에 연결 됩니다. BNC 케이블은 컴퓨터 제어에 대 한 워크스테이션 (오른쪽 패널)에 데이터 수집 카드에 연결 되어 단일 케이블 (중간 패널)으로 결합 됩니다. (D)이이 패널 표시 미러와 dichroic 빔 스플리터를 탑재. (E) 케이지 시스템에서 섬유 커플러를 건물. 광섬유 어댑터 플레이트 (AP) 색 더블 렌즈 (L1, 사이드 뷰 표시)에 그 거리를 변조 수 있도록 z 축 번역 마운트 (ZTM)에 거치 된다. AP와 ZTM는 스레드, L1 동일 및 감 금 소 격판덮개. (F) 한 쌍의 (encircles) 여러 레이저 정렬 절차 동안 설치 됩니다. 그들은 647-nm 레이저 (왼쪽된 패널)와 561-nm 레이저 (오른쪽 패널)가 같은 경로 통해 확인 하는 데 사용 됩니다. (G) A 부분 부분의 방출 경로 표시 됩니다. 현미경 몸 밖 배출 필터 휠, 방출 스플리터 그리고 EMCCD 카메라 순서로 설치 됩니다. (H)이이 패널 조명 팔 어셈블리를 보여 줍니다. 매기 렌즈 조명 팔에 삽입 됩니다. 여기 레이저 광선 광학 섬유 및 (그림의 오른쪽)에 연결 하는 광섬유를 통해 조명 팔으로 전송 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 매기 렌즈. (A)이이 패널 표시 소유자의 직교 계획 주택 레이저 광선 확대 렌즈 (단위: mm). 이 디자인은 조명 팔에 맞게 될 것입니다. (B)이이 패널에 두 개의 렌즈에서 얻을 홀더 구멍의 내부는 그림을 보여줍니다. L1은 오목 렌즈와 L2 볼록 렌즈 이며 그들 사이 거리는 그들의 초점 길이의 합. (C)이 탄 창 렌즈의 사진입니다. (D) 탄 창 렌즈를 확장 하거나 (왼쪽) 레이저 광선을 집중 조명 팔에 삽입 될 수 있다 또는 (오른쪽) 그대로 레이저 광선을 계속 제거 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 3 차원 렌즈. (A)이이 패널 표시 홀더를 바이패스 모드에 대 한 빈 원형 구멍 및 원통형 렌즈를 들고에 대 한 직사각형 구멍의 직교 계획 (단위: mm). 이 디자인은 현미경 본체에 DIC 분석기 슬라이더를 맞게 될 것입니다. (B)이 3 차원 렌즈의 사진입니다. (C)는 원통형 렌즈 난시 (왼쪽)와 PSFs를 일으킬 방출 빔 경로에 관여 될 수 있다 또는 바이패스 모드, PSFs 그대로 (오른쪽) 유지에 대 한 회피 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 방출 분배기의 다중 채널 정렬. 교정 큐브, 그리고 (C) 트리플 큐브 광학 및 빛의 방출 스플리터 (A) 바이패스 큐브, (B)에 표시 됩니다. M = 거울. 바이패스 큐브 (M5) 내부 미러 있으며 배리어 필터 휠에 방출 필터 (EF)를 함께 사용 하도록 되어 있습니다. 교정 큐브 빔 스플리터 (BS)가 모든 채널을 통해 빛을 허용 하는 있다. 트리플 큐브 3 방출 필터 뿐만 아니라 2 색 성 빔 스플리터 (DBS), 있다. (D) 이러한 세 가지 큐브의 사진입니다. (E) 방출 스플리터의 내부 표시 됩니다에 슬라이딩 큐브 (하단 패널)과 큐브 (위 패널) 없이. M3 M4 뒤 이며 사진에서 캡처되지 않습니다. 거울에 대 한 제어 손잡이 방출 스플리터 (위 패널) 위에 있습니다. (F)이이 패널 채널 정렬 DIC 아래 교정 큐브를 사용 하 여 표시 합니다. (G)이이 패널 그린 (상단 패널) 100 nm 멀티 채널 구슬과 트리플 큐브를 사용 하 여 레드 (중간 패널) 채널의 정밀한 맞춤을 보여줍니다. 두 채널의 이미지를 병합된 (하단 패널) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 대표 명함 이미지 수집. 이러한 패널 셀의 중앙 평면 위에 대표적인 DIC 이미지 (A) (B) 아래에, 또는 (C)을 표시합니다. (D)이이 패널 깜박이에 fluorophores의 PSF의 예가 나와 있습니다. 주황색 동그라미 주변 "수직" PSF. 녹색 원 주변 "수평" PSF. 파란색 원 다이아몬드 모양의 PSF, 초점된 비행기에 fluorophores 대표를 포위 한다. (E)이이 패널 대표 재건축 명함 이미지를 보여 줍니다. 작은 규제 RNA 형광 교 잡 제자리에서 붉은 염료와 함께 표시 됩니다. 흰색 테두리 셀의 가장자리를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: SR 이미징 프로그램된 데이터 수집 코드. 이 프로그래밍 가능 수집 모듈, 다양 한 실행 명령 및 현미경 제어 기능 왼쪽된 패널에 나열 되 고 프로그램된 인수 코드를 만드는 선정 될 수 있다. 명령은 위에서에서 순차적으로 실행 됩니다. 이 스크린샷에 나와 예 어디는 미리 정의 된 반복된 영상 취득의 특정 번호 인수 행 세 하 고 3 연속 이미지 프레임에 반점의 수 계산 될 때까지 실시 하 고 있습니다. 이러한 관광 명소의 평균 수 (세균 이미징에 셀 수의 50%로 정의) 임계값 이상 있다면, 이미지 수집 같은 루프에서 계속 됩니다. 경우에 임계값 아래 다음 이미지 수집 (화면 하단 컷) 강한 바이올렛 레이저 전원 사용 됩니다 다음 루프에서 계속 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 대표 피 형광 이미지. (A)이이 패널 보여줍니다 대장균 세포에 작은 규제 RNA. (B)이이 패널 U2OS 포유류 세포에 있는 mRNA를 보여줍니다. RNAs는 붉은 염료 및 형광 제자리에서 교 잡을 통해 파란 염료는 레이블이 지정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: smFRET 이미징의 예. (A) 샘플 561-nm 레이저로 흥분 했다. 녹색과 적색 염료에서 (B) 방출은 동시에 수집 하 고 그린 (오른쪽)와 레드 (왼쪽) 관광 명소, 각각 표시. (C)이이 패널 표시는 대표적인 형광 강도 대 녹색 염료의 시간 궤적 (녹색)와 레드 염색 한 분자에서 (빨간색). (D)이이 패널은 무서 워 효율 대 시간 궤적 (파란 실선) 나수락자로 계산 표시 / (나기증자 + I수락자) 샘플의 한 분자에서. 무서 워 추적 숨겨진 마르코프 모델 (빨간색 파선)와 함께 장착 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 하이브리드 현미경 시스템 여러 현미경을 구입할 필요가 없습니다. 광학 테이블, 테이블 설치 노동, 소프트웨어 및 워크스테이션을 포함 한 모든 부분에 대 한 비용 총 약 230000 달러 이다. 사용자 정의 가공 부품, 매기 렌즈 등 3 차원 렌즈 비용 약 $700 (비용은 다른 기관에서 실제 비용에 따라 달라 집니다). 전형적인 상용 통합 시스템 위한 단일 분자 검출 기반 SR 현미경 비용 이상의 $300000 ~ 400000 및 하지 쉽게 smFRET 측정에 사용할 수 있는 또는 보기의 적절 한 필드에 대 한 피 이미징 하얀 빛 없이 소스입니다. 따라서, 여기에 제시 된 접근 이미징 기능 여러 현미경 훨씬 저렴 한 비용에 해당를 얻을 수 있습니다.
이 변조 된 현미경 시스템 서로 다른 제조 업체에서 현미경 시체를 기반으로 수 있습니다. 3 차원 렌즈 방출 스플리터, 신체 내에서 현미경, 또는 필터 휠 및 객관적인 nosepiece 사이의 사용 가능한 공간에 안으로 포함 하는 배출 경로에 어떤 위치 든 지 잠재적으로 설치할 수 있습니다. 그러나, 3 차원 렌즈의 물리적 위치 3 차원 SR 이미징에 대 한 최고의 난시 효과 달성 하기 위한 그것의 초점 거리를 결정 합니다. 10 m 초점 거리와 함께 시작 하는 것이 좋습니다. 매기 렌즈는 기본적으로 빔 익 스팬 더 흥분 경로에 설치 합니다. 여기 레이저는 항공 결합 하는 경우 (즉., 광섬유 없이), 그것은 사소한 후 레이저 광선 조명을 어떤 자리에 이러한 확장을 설치 하. 여기 레이저 섬유 커플링 인 경우 다음 (한 오목 하 고 다른 하나의 볼록) 두 개의 렌즈를 설치 하려면 추가 슬롯을 찾습니다. 예를 들어 많은 상업 조명 무기는 중립 밀도 필터 슬롯이 있습니다. 두 슬롯 사이의 거리와 같은 그들의 초점 길이의 합으로 두 렌즈를 찾아. 다음, 그들은 탄 창 렌즈 기능을 삽입할 수 있습니다. 또한, 필드 횡 슬라이더에 대 한 마운트 가능한 경우 다른 장소를 수 있습니다. 매기 렌즈 이동식 카세트에 건물 하나 매기 렌즈의 방향을 틀 지 하 여 SR 이미징에 필요한 있을 수 있습니다 고성능을 달성 하기 위해 여기 레이저 초점을 사용의 추가 이점이 있다.
이 보고서에서 우리는 유연한 변조 현미경을 사용 하 여 세 가지 다른 이미징 기술 전환 시연. 이 설치 광범위 한 및 더 많은 고급 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 예를 들어 SR 구성 단일 입자 사진 전환에 라이브 셀에서 추적에 사용할 수 있습니다 또는 photoactivatable 형광 단백질은 생체의 관심18,19. SmFRET 구성 시스템20 vivo에서 에서 분자 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다. 2 SR 이미징 또는 단일 입자21을 동시에 추적을 수행 하기 위해 SR 구성과 방출 분할 기반 다중 채널 검출을 결합할 수 있습니다.
이 설정 보다 많은 변조 구성 요소를 사용 하려면 추가로 확장할 수 있습니다. 예를 들어 필터 포 탑 및 조명 구획의 또 다른 레이어 이미징 적외선 염료로 표시 하는 샘플에 대 한 적외선 (IR) 레이저 등 추가 채널에 대 한 추가 여기/방출 경로 만들 수 있도록에, 추가할 수 있습니다. 추가 영상 채널을 수 있도록, 뿐만 아니라 적외선 레이저 SR 영상 수집 이미징 또는 게시물 분석 중 단계 드리프트를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다. 드리프트 보정 영상 중, z 드리프트 보정 시스템 현미경 제조 업체에서 사용할 수 없는 경우 IR 레이저 대체 시스템 어느 homebuilt14 수 또는 제 3 자 회사에서 인수. 사후 수집 드리프트 보정에 대 한 IR 레이저 표준 마커를 추적 하는 데 사용할 수 있습니다. 22
단일 분자 검출 기반 SR 현미경 소프트웨어, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위해의 2 세트를 필요합니다. 데이터 수집을 위한 레이저 ON을 제어 하는 동안 카메라를 통해 이미지를 걸립니다 간단한 homebuilt 소프트웨어/동작을 수동으로 405 nm 레이저 전원, 예를 들면, 회전 하 여 조절 가능 명함 이미지를 생성 하기 위해 일할 수 있는 그라데이션 중립 밀도 필터 레이저 앞에 설치. 그러나,이 실험의 방법은 점멸에 관광 명소의 밀도의 실험의 주관적인 판단에 의존. 따라서,이 방법으로 객관적 이며 데이터 이미징 SR의 정량화에 대 한 사용 되 게 적당 하지 않을 수 있습니다. 여기에 사용 되는 데이터 수집 코드 포함 자리 탐지/깜박이에 반점 (그림 6)의 밀도 기반으로 하는 데이터 수집은 지속적인, 405 nm 레이저 전원의 자동 변조를 사용 하는 동안 계산 알고리즘. 요즘, 일부 현미경 제조 업체 제공 프로그램 이미징 모듈 하나, 활용 수 또는 마이크로 매니저 같은 오픈 소스에서 플러그인에 대 한 보고. 데이터 분석에 대 한 현미경 제조 업체에서 상업적으로 사용할 수 있는 분석 모듈을 사용 하 여 또는 ImageJ 같은 오픈 소스에서 플러그인을 찾고 가능 하다.
요약 하면, 여기에 제시 된 설정 높은 융통성 및 감소 된 비용에 다른 이미징 구성 및 공간에의 한 쉬운 전환 제공 합니다. 이 설정 루틴 및 다양 한 이미징 실험에 대 한 필요와 함께 생물 과학에 어떤 연구소에 의해 채택 상대적으로 쉽습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
J.F. 인정 Searle 학자 프로그램 및 NIH 감독의 새로운 혁신 상을에서 지원 합니다. 저자 폴 Selvin 연구소 (일리노이 대학, 어바나-샴페인) 3 차원 렌즈 위치에서 유용한 제안을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
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