Summary
Aqui nós apresentamos um guia prático de construção de um sistema integrado de microscopia, que mescla imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado Super-resolução imagem e deteção de único-molécula multi cor, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência de único-molécula de imagem, em um set-up de uma maneira custo-eficiente.
Abstract
Microscopia de fluorescência é uma poderosa ferramenta para detectar moléculas biológicas em situ e monitorar suas dinâmicas e interações em tempo real. Além de microscopia convencional epi-fluorescência, várias técnicas de imagem foram desenvolvidas para alcançar objetivos específicos experimentais. Algumas das técnicas amplamente utilizadas incluem único-molécula fluorescência ressonância transferência de energia (smFRET), que pode relatar mudanças conformacionais e interações moleculares com resolução de angstrom e único-molécula detecção-baseado Super resolução (SR) de imagem, que pode aumentar a resolução espacial de aproximadamente dez a vinte vezes em comparação com microscopia difração limitada. Aqui nós apresentamos um sistema integrado de cliente-projetada, que mescla vários métodos de imagem em um microscópio, incluindo imagens de epi-fluorescente convencional, único-molécula detecção-baseado SR imagem e deteção do único-molécula multi cor, incluindo smFRET de imagem. Diferentes métodos de imagem podem ser conseguidos facilmente e reproducibly elementos ópticos de comutação. Esta montagem é fácil adotar por qualquer laboratório de pesquisa em ciências biológicas com uma necessidade de rotina e diversos experimentos de imagem a um custo reduzido e espaço relativo para construir microscópios separados para fins individuais.
Introduction
Microscópios de fluorescência são ferramentas importantes para a pesquisa moderna ciência biológica e imagem fluorescente é realizada rotineiramente em muitos laboratórios de biologia. Marcando biomoléculas de interesse com fluorophores, podemos diretamente visualizá-las sob o microscópio e gravar as alterações dependentes de tempo na localização, conformação, interação e conjunto de estado em vivo ou em vitro. Microscópios de fluorescência convencional tem uma resolução espacial de difração limitada, que é ~ 200-300 nm no sentido lateral e ~ 500-700 nm no sentido axial1,2e são, portanto, limitado a imagem latente no 100s de escala de nanômetros-para-micron. A fim de revelar os detalhes mais finos na montagem molecular ou organização, desenvolveram-se vários microscopies SR que podem quebrar o limite de difração. Estratégias utilizadas para alcançar o SR incluem efeitos ópticos não lineares, tais como emissão estimulada depleção (STED) microscopia3,4 e estruturada iluminação microscopia (SIM)5,6, 7, deteção estocástica de moléculas simples, tais como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)8 e fotoativados localização microscopia (PALM)9e uma combinação de ambos, tais como MINFLUX10. Entre estes microscopies SR, microscópios de SR de detecção-baseado de único-molécula podem ser relativamente facilmente modificados de um set-up único-molécula microscópio. Com ativação repetitiva e imagem latente de photoactivatable proteínas fluorescentes (FPs) ou foto-comutável corantes marcados em biomoléculas de interesse, resolução espacial pode chegar a 10-20 nm11. Para obter informações sobre as interações moleculares e conformacional dinâmica na resolução em tempo real, angstrom-para-nanômetros é necessária. smFRET12,13 é uma abordagem para alcançar esta resolução. Geralmente, dependendo das questões biológicas da interesse, são necessários métodos de imagens com diferentes resoluções espaciais.
Normalmente, para cada tipo de imagem, configuração específica da excitação e/ou de emissão óptica é necessária. Por exemplo, um dos métodos de iluminação mais comumente usados para a deteção de único-molécula é através da reflexão interno total (TIR), em que um ângulo específico da excitação precisa ser alcançado através de um prisma ou através da lente objetiva. Para a deteção de smFRET, as emissões do dador e do aceitador corantes precisam ser espacialmente separados e direcionados para diferentes partes do elétron-multiplicando, dispositivo de carga acoplada (EMCCD), que pode ser conseguido com um conjunto de espelhos e divisores de feixe dicroicas colocado no caminho de emissão. Para tridimensional (3D) SR de imagem, um componente ótico, como uma lente cilíndrica14, é necessária para causar um efeito de astigmatismo na trajectória de emissões. Portanto, homebuilt ou microscópios integrados comercialmente disponíveis são, geralmente, funcionalmente especializados para cada tipo de método de imagem e não são flexíveis para alternar entre diferentes métodos de imagem na mesma afinação. Aqui nós apresentamos um sistema híbrido cost-effective, que fornece opções ajustáveis e reprodutíveis entre três diferentes métodos de imagem: imagem de epi-fluorescente convencional com resolução de difração limitada, SR baseado na deteção do único-molécula imagem e detecção de único-molécula multi cor, incluindo smFRET de imagem (figura 1A). Especificamente, a afinação aqui apresentada contém fibra acoplados entradas lasers para excitação de várias cor e um braço de iluminação comercial no caminho de excitação, que permite programar controle do ângulo de excitação, para alternar entre modo TIR e epi. No caminho de emissão, um estojo de lente cilíndrica de homebuilt removível é colocado dentro do corpo do microscópio para imagens 3D de SR, e um divisor de feixe comercial é colocado antes de uma câmera EMCCD que pode ser habilitada seletivamente para detectar múltiplos canais de emissão ao mesmo tempo.
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Protocol
1. montagem e Design de microscópio
-
Caminho de excitação
Nota: O caminho da excitação inclui lasers, componentes de interferência diferencial (DIC) de contraste, o corpo do microscópio e seu braço de iluminação.- Prepare uma mesa óptica isolada de vibração. Por exemplo, uma tabela de amortecimento estrutural de 48 x 96 x 12 ' dá espaço suficiente para todos os componentes.
Nota: Construa o set-up em uma sala com controle de temperatura (por exemplo, 21,4 ± 0,55 ° C). Estabilidade de temperatura é fundamental para manter o alinhamento óptico. - Instalar um corpo de microscópio equipado com um braço de iluminação para conexão de fibra óptica, um 100 X óleo-imersão TIRF objectiva e componentes DIC.
- Coloque quatro cabeças do laser (647 nm, 561 nm, 488 nm e 405 nm, cercado na figura 1B) e seu calor afunda na tabela óptica, e certifique-se que os raios laser emitido têm a mesma altura e são tão curto quanto possível garantir boa estabilidade (por exemplo, 3 ').
Nota: Se a cabeça do laser senta-se a uma altura menor do que outros lasers, colocar uma placa de alumínio com espessura adequada debaixo dela. Sempre garantir o máximo de contato entre os dissipadores de calor e a tabela de óptica para a melhor dissipação de calor (figura 1B). Os lasers precisam ser poderoso o suficiente para a imagem latente do SR. Consulte tabela de materiais. É recomendável ter filtros de limpeza do laser na frente de lasers de diodo. - Instalar uma placa de aquisição de dados através de uma interface de interconexão (PCI) componente periférico em uma estação de trabalho e conectar lasers com este cartão. Controle os comportamentos de ON/OFF dos lasers pela lógica transistor-transistor (TTL) de saída e respectivo ajustamento de poder da saída analógica do cartão (Figura 1). Instale uma adequado microscopia imaging software (comercial ou homebuilt) para controlar a placa de aquisição de dados, bem como o corpo do microscópio.
- Monte os espelhos e divisores de feixe dicroicas (590, 525 e 470 filtros passa-tempo) para suas respectivas montagens. Use o espelho muito estável montagens para os espelhos. Use divisores circulares com anéis de retenção para evitar qualquer dobra dos divisores dicroicas feixe (Figura 1).
- Coloque os espelhos e divisores de feixe dicroicas na mesa óptica para combinar os raios laser (figura 1B). Para atingir o alinhamento mais estável, fazer o arranjo todo mais compacto possível e usar mensagens óptico de 1 '-espessura. Organize os lasers para que os lasers de comprimento de onda mais curtos são mais perto para o acoplamento de fibra óptica (figura 1B), desde que o comprimento de onda curto luzes mais dissipam no ar.
- Combine feixes de laser em uma fibra óptica de modo único. Para fazer isso, construa um acoplador de fibra em um sistema de gaiola através dos seguintes passos:
- Monte uma placa de adaptador de fibra em um monte de tradução do eixo z (Figura 1E, painel mais à esquerda).
- Montar uma lente dubleto acromático (distância focal = 7,5 mm) em uma placa de gaiola (Figura 1E, segundo painel da esquerda).
- Conecte as duas partes acima por hastes de extensão para formar uma gaiola. Monte a gaiola na mesa óptica com suportes de montagem sobre os posts ópticos de 1 ' de espessura (Figura 1E, painel médio).
- Alinhe o 647-nm laser primeiro com uma fibra óptica de modo único (final FC/APC para o acoplador).
Nota: Um alinhamento áspero usando um de fibra ótica multi-modo antes de usar a fibra óptica monomodo pode ajudar o processo de alinhamento. Ajustar os ângulos dos espelhos e divisores de feixe dicroicas (Figura 1, por botões de ajuste), bem como a distância entre a lente dubleto acromático e a placa de adaptador de fibra (Figura 1E, ajustando o monte de tradução do eixo z) para obter saída de poder máxima do laser através da fibra. - Uma vez feito o alinhamento do primeiro laser, temporariamente instalar um par de íris e alinhar o resto dos lasers um por um (Figura 1F). Verificar a eficiência de alinhamento com um medidor de energia.
- Deixe uma íris na parte da frente da placa adaptadora para reduzir os reflexos dos lasers.
Nota: Forte volta reflexões podem reduzir o tempo de vida de fontes de laser. Opcionalmente, um isolador óptico pode ser instalado na frente de cada cabeça de laser para remover as reflexões completamente.
- Conecte a outra extremidade da fibra óptica para o braço de iluminação do microscópio (Figura 1 H).
- Projetar e instalar a "lente de ampliação (lente de mag)" através dos seguintes passos:
Nota: Os lasers podem ser usados para a imagem latente de epi-fluorescência da amostra, mas o tamanho do feixe estreito de cada laser limita a área iluminada da amostra para uma área várias vezes menor que o tamanho real do sensor câmera correspondente, especialmente para os mais novos câmeras (com 18,8 mm em comprimento diagonal, comparado com o convencional 11,6-mm de comprimento). Assim, é desejável para expandir o feixe para alcançar uma maior e mais plana iluminação da amostra.- Projeto da lente de mag, que pode encaixar o braço de iluminação (Figura 1 H).
Nota: O design da lente mag depende de onde ele será instalado. Figura 1 H mostra um exemplo da instalação no braço iluminação, mas ele pode ser instalado em qualquer lugar após os raios laser são colimada (ver discussão). Projetá-lo com um desenho assistido por computador e software de elaboração. - Coloque duas lentes acromática, um côncavo (distância focal = f1) e uma convexa (distância focal = f2) no suporte de lente do mag caseiras (Figura 2A e 2C), com a distância igual à soma de suas distâncias focais, f1 + f2 =-(25) + 50 = 25 mm (Figura 2B).
Nota: Com esta escolha de distâncias focais, a lente de mag expande o feixe por f2/ | f1| = 2 dobras. A lente de mag proporciona versatilidade. Pode ser removido para retomar a iluminação regular sem expandir as vigas (Figura 2D) ou inserido na direção inversa para concentrar o feixe de laser para atingir uma intensidade mais forte de excitação.
- Projeto da lente de mag, que pode encaixar o braço de iluminação (Figura 1 H).
- Prepare uma mesa óptica isolada de vibração. Por exemplo, uma tabela de amortecimento estrutural de 48 x 96 x 12 ' dá espaço suficiente para todos os componentes.
2. caminho de emissão
Nota: O caminho de emissão é composto de uma lente cilíndrica removível, uma roda de filtro de barreira, um divisor de emissão e uma câmera EMCCD (Figura 1). Para alcançar o melhor ponto de espalhar função (PSF) de moléculas simples, o prisma DIC é colocado longe da lente objetiva.
- Projete a fita de lente cilíndrica (lente 3D), que pode encaixar o manual analisador DIC inserir slot no organismo microscópio (Figura 3).
Nota: Este projeto não compromete o analisador DIC desde um bloco do analisador pode ser inserido na torre filtro. - Coloque a lente 3D de 10 m de comprimento focal na gaveta e inseri-lo no caminho do feixe de emissão para criar o efeito de astigmatismo necessário para extrair a coordenada z de cada molécula de14.
Nota: Opcionalmente, a gaveta de lente 3D pode ser colocada dentro ou fora do caminho de emissão (Figura 3). - Instale um divisor de feixe dicroicas multi-banda na torre filtro dentro do corpo do microscópio.
- Instale filtros de emissão.
Nota: Os filtros de emissão são escolhidos dependendo o fluorophores preferencial. Dependendo do módulo de imagem, filtros de emissão colocados em diferentes locais são utilizados conforme descrito abaixo:- Para sequencial multi cor epi-fluorescência imagem ou imagens de SR, use filtros de emissão colocados na roda filtro barreira conectada ao lado do corpo do microscópio para minimizar a vibração do corpo do microscópio durante interruptor de canal (Figura 1).
- Para a deteção de cor multi simultânea (por exemplo, experimentos de smFRET), coloque outro filtro definido em um divisor de emissão (verifique o passo 4 para detalhes).
Nota: Normalmente, um divisor de emissão comercial tem dois modos de comutáveis (i.e., "engajados" ou "ignorar" modos). Para separar as luzes de emissão cromaticamente para simultânea multi cor de imagem (modo "engajada"), é usado um cubo filtro segurando dois divisores de feixe dicroicas e três filtros de emissão ("triplo cubo," Figura 4 e 4 D). Um slot vazio da roda do filtro de barreira é utilizado em combinação com o cubo triplo. Por outro lado, sequencial de imagem multi-color, o cubo triplo é substituído por um cubo que tem um espelho dentro ("desvio cubo," Figura 4A e 4 D).
- Instale a câmera EMCCD como a última parte do caminho de emissão. Utilize a conexão USB-PCI para atingir uma taxa de quadros rápidos.
Nota: Uma câmera EMCCD é recomendada para a deteção de único-molécula mais sensível, mas uma câmera avançada de sCMOS pode ser uma alternativa.
3. difração limitada de imagem com Epi-excitação
- Ajuste o ângulo de incidental dos lasers de excitação epi-modo no braço iluminação.
- Desengate a lente 3D se noivo (Figura 3, painel direito).
- Inserir o cubo de desvio no separador de emissão (Figura 4A e 4E, painel inferior).
- (Opcional) Inserir a lente mag para uma área de iluminação ampliado (Figura 2D, painel esquerdo).
Nota: Com o uso de uma lente de mag e uma 100 X lente objetiva de imersão de óleo, cerca de 91 x 91 µm2 pode ser iluminado uniformemente, eliminando a necessidade de usar uma fonte de luz branca e vários cubos de filtro. - Use uma software de tomar multi-canal, de imagem de microscopia e/ou Z-pilha, e/ou imagens de lapso de tempo.
Nota: Existem vários programas disponíveis para geração de imagens de microscopia, não só de fabricantes de microscópio, mas também de empresas de terceiros ou desenvolvedores de código aberto.
4. multi-canal único-molécula de imagem incluindo smFRET
Nota: Mova-se para uma posição "vazia" da roda do filtro de barreira, para que toda a emissão com qualquer comprimento de onda pode chegar ao segundo conjunto de filtros/dicroicas divisores de feixe no separador de emissão.
- Para configurar multi cor único-molécula deteção de moléculas de superfície-imobilizado15 usando excitação TIRF, incluindo medição de smFRET, ajuste o ângulo incidental dos lasers excitação para o ângulo TIRF. Desengate a lente de mag e a lente 3D.
- O modo de três canais dedicam separador de emissão (Figura 1) através dos seguintes passos:
- Substituir o cubo de desvio com um cubo de"calibração" que permite que a luz passar por todos os canais (Figura 4B e 4E).
- Ligue a câmera sob DIC (ou seja, sem filtro de emissão da roda do filtro de barreira) e ajustar a abertura do separador de emissão até três canais totalmente separados aparecem na tela.
Nota: Realizar esta etapa com a luz do quarto acesa, para Visualizar todos os canais. - Ativar os botões de controle de ajuste vertical/horizontal o divisor de emissão e aproximadamente alinhar três canais (Figura 4E e 4F).
- Desligue a câmera e substituir o cubo de calibração com um cubo triplo (Figura 4 e 4E).
- Coloca uma amostra com 100 nm grânulos multicanais em cima a 100 X lente objetiva e foco na amostra.
- Ligue a câmera e o laser de 488 nm, zoom em um dos grânulos brilhantes e finamente alinhar três canais rodando os controle botões de ajuste novamente (Figura 4E e 4G).
Nota: grânulos multicanais 100 nm emitem diferentes comprimentos de onda da luz sobre a excitação de 488 nm, permitindo o alinhamento de três canais.
- Ligue a câmera e lasers, foco e, em seguida, encontrar uma boa posição, com uma densidade razoável do ponto. Ajuste o tempo de alimentação e exposição do laser para atingir níveis aceitáveis de sinal-ruído e fotobranqueamento. Use o software de imagem de microscopia para tirar imagens de lapso de tempo.
5. SR Imaging
Nota: Esta é a microscopia de SR de detecção-baseado de único-molécula.
- Para definir as imagens de SR, inserir a lente 3D e remover a lente de mag. Defina o tempo de exposição da câmera nos canais apropriados do laser (por exemplo, 5-60 ms). Determinar e definir manualmente o ângulo de incidental dos lasers excitação ideal para ser o ângulo TIRF.
- Coloque a amostra no SR tampão16de imagem. Permitir que o buffer para equilibrar pelo menos 10 minutos antes da imagem latente.
Nota: Buffer de imagem de SR expira após cerca de 1 h, então fazer SR novo buffer de imagem em conformidade. - Pegue uma imagem DIC antes de imagem do SR. A fim de encontrar a altura adequada e objetiva para o SR, que otimiza o efeito de astigmatismo, use DIC de imagem para localizar o avião médio das células. Identificar o avião pela altura em que as células de transição de "luz" para imagens "escuras" e parecem tornar-se transparente (Figura 5A, 5Be 5C). Uma vez que o plano focal desejado é determinado, envolver o sistema de correção de z-drift (figura 1A).
- Imagem de SR de conduta. Altere o poder do laser 405 nm para manter uma densidade razoável de pontos 'piscando-on'.
Nota: Embora seja possível alterar o laser 405 nm manualmente, é mais conveniente executar um código de aquisição de dados programados para manter a densidade dos pontos "piscando-na". Aqui está um exemplo de como isso é realizado automaticamente. O código fonte está disponível mediante solicitação (Figura 6).- Inicie a aquisição de imagens com poder de laser violeta 0 W/cm2 .
- Conte o número de pontos piscando-em um determinado período.
- Module a energia de laser violeta para que o número de pontos piscando-na é mantido acima de um user-defined "contagem limite" no campo de visão. Aumente a potência do laser violeta quando o número de pontos piscando-na cair abaixo do limite de contagem.
- Quando o número de pontos piscando-na cair abaixo do limite de contagem usando a potência máxima do laser violeta, finalizar a aquisição.
Nota: O máximo pode ser configurado de forma diferente dependendo do brilho da amostra, mas não superior a 130 W/cm2. Dependendo o objetivo real da imagem SR, este código de aquisição automática pode ser finalizado manualmente em qualquer ponto desejado.
- Verificar o comportamento piscando e PSFs dos pontos logo após o início da aquisição.
Nota: Se o comportamento piscando não é ideal, alterar ângulo incidental dos lasers da excitação ou substituir o buffer de imagem. Espere uma amostragem de "vertical", "horizontal" e "diamante" formas de FSP, representando fluorophores abaixo, acima e dentro do plano focal, respectivamente (Figura 5). Se a maioria das manchas mostram PSFs verticais ou horizontais, então o plano focal é fora do centro das células, então encerrar o experimento e ajustar o plano focal novamente. Uma presença de bolha de ar, o óleo de imersão ou outros fatores locais pode afetar a qualidade do PSF, então pode ser necessário substituir o óleo ou mudar para uma área diferente da imagem latente da amostra. - Para a análise de dados, use código aberto (em NIH ImageJ plugins) ou códigos disponíveis comercialmente para detectar centroides de cada ponto em cada quadro de imagem e extrair z-valores de cada ponto de larguras x - e y14.
Nota: Neste relatório, um código-fonte desenvolvido originalmente em um do primeiros single-molécula detecção-baseado SR8 foi modificado para a deteção de 3-d16 e foi usado. - No caso de duas cores imagem, imagem o fluoróforo com o comprimento de onda da excitação mais longo, seguido por aquele com o menor comprimento de onda de excitação. Execute o código de aquisição automatizada similarmente ao descrito na etapa 5.4, mas com um laser de imagem diferente.
Nota: a aberração cromática deve ser corrigida entre imagens com fluorophores diferentes (por exemplo, corante vermelho e corante amarelo-verde). Aqui estão os passos.- Imobilize vários grânulos de multicanais 100 nm sobre a lamela de vidro, evitando a formação de aglomerados.
- Tirar fotos deles em canais diferentes de excitação.
- Extrato de sua (X, Y, Z) as coordenadas por software (etapa 5.6).
- Lote ΔXeu = X1i - X2i e ΔYi = Y1i - Y2i (é para contas diferentes, e 1 e 2 são os canais de cores diferentes) separadamente e encaixá-los com funções. Salve as funções.
Nota: Funções lineares são suficientes na maioria dos casos. Uma vez que essas funções são determinadas, essa medida não precisa ser repetido cada vez de imagem. - Na imagem de SR de duas cores real de uma amostra de interesse, aplicam-se as funções para correta (X, Y) a aberração cromática. Para z-direcional a aberração cromática, conduzi-la, obtendo ΔZ = Z1 - Z2 para grânulos multicanais ou referência conhecida multicanal amostras semeadas juntamente com a amostra de interesse.
Nota: ao contrário de (X, Y) a aberração cromática, a aberração cromática z-direcional não é bem pode ser reproduzido em cada experimento, principalmente devido à manutenção do foco de z-direcional incompleto ao mudar de canal. Assim, recomenda-se realizar a correção de cada vez. ΔZ = Z1 - Z2 é na maior parte independente de (X, Y), então apenas alguns grânulos ou amostras de referência seria suficientes por cada amostra de área de interesse. Plotar as imagens finais de duas cores SR, construídas, em um software de visualização em 3D e verificar ΔZ manualmente.
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Representative Results
Este microscópio permite flexível e reprodutível de alternar entre diferentes métodos de imagem. Aqui nós mostramos imagens de amostra coletadas com cada módulo de imagem.
A Figura 5 demonstra o PSF da molécula piscando-na durante a aquisição do SR. Milhares de tais imagens são reconstruídos para gerar a imagem final do SR (Figura 5E). Figura 5E mostra as mesmas RNAs regulatórios bacterianas como mostrado na imagem epi-fluorescência na Figura 7A. A Figura 7 mostra as imagens de epi-fluorescência representativo de um pequeno RNA reguladora em células de Escherichia coli e um mRNA em células de mamíferos U2OS. Ambos os RNAs são rotulados com o fluoróforo-Tag do oligo DNA através em situ da hibridação17. A Figura 8 mostra a medição de smFRET representante de moléculas de RNA dobradas rotulado com tintura do doador (tintura verde) e tintura aceitador (corante vermelho). Os complexos são imobilizados sobre a lâmina de microscópio e animados pela iluminação TIRF. Trajetórias de intensidade de fluorescência podem ser extraídas de moléculas individuais simples, gerando eficiência FRET em função do tempo.
Figura 1: O design de armação a microscópio. (A), este painel mostra um diagrama de afinação. M = espelho, DBS = divisor de feixe dicroicas, LCF = filtro de limpeza do laser, eu = íris, L = lente, AP = placa adaptadora, ZTM = eixo z translacional montar, de = fibra óptica, OFC = fibra óptica acoplamento, CL = lente cilíndrica, TL = tubo de lente, EF = emissão filtro (s), Obj = objetivo lente e SM = motor de passo. O sistema de correção de z-drift se move o motor de passo o inalador nasal da lente objetiva para o sentido oposto da z-tração, que é calculado pelo sinal gerado pelo seu próprio LED e detectado pelo seu próprio detector infravermelho (IR). (B), este painel mostra a montagem de excitação do laser. Quatro lasers são combinados através de espelhos e divisores de feixe dicroicas e então serão direcionados para uma fibra óptica através de uma lente de focalização e uma placa de adaptador sentado em um monte de translação (parte inferior da imagem). (C), este painel mostra a modulação do laser. Dois cabos de baioneta Neill-Concelman (BNC) estão ligados a cada um do laser (a cabeça ou o controlador, dependendo do fabricante) para TTL e modulação analógica (painel mais à esquerda). Cabos BNC são combinados em um único cabo (painel central), que é conectado a uma placa de aquisição de dados em uma estação de trabalho (painel à direita) para controle de computador. (D), este painel mostra o espelho e divisor de feixe dicroicas monta. (E) construir um acoplador de fibra em um sistema de gaiola. Uma placa de adaptador de fibra (AP) é montada em um monte de tradução do eixo z (ZTM) para que sua distância à lente dupla acromática (L1, vista lateral mostrada) pode ser modulada. AP e ZTM têm correspondência tópicos, mesmo que a L1 e a placa de gaiola. (F), A par da íris (circunda) são instalados durante o procedimento de alinhamento para vários lasers. Eles são usados para garantir que o laser de 647-nm (painel esquerdo) e o laser de 561-nm (painel direito) percorrer o mesmo caminho. (G) uma parte parcial do caminho de emissão é mostrada. Fora do corpo do microscópio, a roda do filtro de emissões, o divisor de emissão e a câmera EMCCD são instalados em ordem. (H), este painel mostra a montagem do braço de iluminação. A lente de mag é inserida no braço de iluminação. Os feixes de laser de excitação são enviados para o braço de iluminação através de fibra óptica e a fibra óptica de acoplamento (no lado direito da imagem). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A lente de mag. (A), este painel mostra projeções ortográficas do titular lentes de habitação para ampliação de raios laser (unidade: mm). Este projeto destina-se a estar apto para o braço de iluminação. (B) este painel mostra um desenho interno do furo no suporte onde entrem duas lentes. L1 é uma lente côncava e L2 é uma lente convexa, e a distância entre eles é a soma de suas distâncias focais. (C) esta é uma foto da lente mag. (D) a lente de mag pode ser inserida no braço iluminação para expandir ou concentrar os raios laser (à esquerda) ou pode ser removida para manter os feixes de laser inalterados (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A lente 3D. (A), este painel mostra projeções ortográficas do titular tendo um orifício circular em branco para o modo bypass e um furo Retangular para segurar a lente cilíndrica (unidade: mm). Este projeto destina-se a estar apto para o slider de analisador DIC no corpo de um microscópio. (B) esta é uma foto da lente 3D. (C) o cilíndrico lente pode ser acoplado no caminho do feixe de emissão a causar PSFs com astigmatismo (à esquerda) ou pode ser desactivado para o modo bypass, mantendo a PSFs intacto (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: alinhamento de multi-canal do separador de emissão. Esquemas de óptica e o trajeto da luz são mostradas no separador de emissão com o (A), um cubo de desvio, (B) um cubo de calibração e (C) um triplo cubo. M = espelho. O cubo de desvio tem um espelho dentro (M5) e é suposto ser usado com um filtro de emissão (EF) da roda do filtro de barreira. O cubo de calibração tem divisores de feixe (BS) que permitem que as luzes percorrer todos os canais. O cubo triplo tem dois divisores de feixe dicroicas (DBS), bem como três filtros de emissão. (D) Estas são fotos dos três cubos. (E) o interna do separador de emissão é mostrada sem um cubo (painel superior) e com um cubo (painel inferior) deslizando em. M3 é atrás de M4 e não capturado na foto. Botões de controlo para os espelhos estão em cima do divisor de emissão (painel superior). (F), este painel mostra o alinhamento do canal usando o cubo de calibração sob DIC. (G), este painel mostra um bom alinhamento do verde (painel superior) e canais de vermelho (painel central) usando grânulos multicanais 100 nm e um cubo triplo. Uma imagem mesclada de dois canais também é mostrada (painel inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: aquisição de imagem de representante do SR. Estes painéis mostram uma DIC imagem representativa (A) abaixo, (B) a, ou (C) acima do plano central das células. (D), este painel mostra um exemplo do PSF do fluorophores piscando-na. O círculo laranja rodeia um PSF "vertical". O círculo verde envolve um PSF "horizontal". O círculo azul rodeia um PSF em forma de diamante, representando fluorophores em um avião focado. (E), este painel mostra que um representante reconstruída a imagem do SR. Um pequeno RNA reguladora é rotulado com hibridação in situ da fluorescência com corante vermelho. As bordas brancas marcam as bordas das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: um código de aquisição de dados programados para a imagem latente do SR. Neste módulo programável aquisição, vários comandos de execução e funções de controle do microscópio são listadas no painel da esquerda em podem ser selecionadas para criar código de aquisição programada. Os comandos são executados sequencialmente de cima para baixo. Esta imagem mostra um exemplo onde um predefinidos que certo número de aquisições de imagens iteradas é conduzido até a aquisição é colocada e o número de pontos em três quadros de imagem sequencial é calculado. Se o número médio destes pontos está acima do limiar (definido como 50% do número de células bacterianas de imagem), a aquisição da imagem continua no mesmo circuito. Se abaixo do limiar, então a aquisição da imagem continua no próximo ciclo onde é usado o mais forte poder de laser violeta (cortado na parte inferior da tela). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: imagens de representante epi-fluorescência. (A), este painel mostra um pequeno RNA reguladora em células de Escherichia coli . (B), este painel mostra um mRNA em células de mamíferos U2OS. RNAs são rotulados com corante vermelho e corante azul através de hibridação de fluorescência in situ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: exemplo de imagem de smFRET. (A) amostras ficaram empolgada com o laser de 561-nm. (B) emissões dos corantes verdes e vermelhos são coletadas simultaneamente e mostradas como verde (à direita) e manchas vermelhas (à esquerda), respectivamente. (C), este painel mostra o representante fluorescência intensidade vs trajetórias de tempo da tintura verde (verde) e corante vermelho (vermelho) de uma molécula. (D) este painel mostra o traste eficiência vs a trajetória do tempo (linha azul contínua) calculada como euaceitador/ (eudoador + Iaceitador) de uma molécula da amostra. O rastreamento FRET é equipado com o modelo de Markov ocultos (tracejado vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este sistema de microscópio híbrido elimina a necessidade de adquirir vários microscópios. O custo total para todas as partes, incluindo a mesa óptica, trabalho de instalação de mesa, software e estação de trabalho, é de cerca de US $230.000. Peças usinadas personalizado, incluindo o mag lente e lente 3D, custam cerca de US $700 (o custo varia de acordo com as cargas reais nos diferentes institutos). Típico comercialmente disponíveis sistemas integrados para microscopia de SR de detecção-baseado de único-molécula custou mais de US $300.000 ~ 400.000 e não prontamente disponível para a medição de smFRET, ou epi-imagem latente para um campo de visão razoável, sem luz branca fonte. Assim, a abordagem apresentada aqui pode alcançar capacidades de imagem equivalentes a vários microscópios, a um custo significativamente reduzido.
Este sistema modulado microscópio pode basear-se em corpos de microscópio de diferentes fabricantes. A lente 3D potencialmente pode ser instalada em qualquer posição na trajectória de emissões, incluindo dentro o divisor de emissão, dentro do corpo do microscópio, ou no espaço disponível entre a roda de filtro e o objetivas. No entanto, o local físico da lente 3D irá determinar a sua distância focal para alcançar o melhor efeito de astigmatismo para imagens 3D do SR. Recomendamos começar com um comprimento focal de 10 m. A lente de mag é essencialmente um expansor de feixe instalado no caminho da excitação. Se os lasers de excitação são acoplados ar (i. e., sem fibra óptica), é trivial instalar tal um expansor em qualquer lugar após os raios laser são colimados. Se os lasers de excitação são acoplados fibra, então olhe para slots extras para instalar duas lentes (um côncavo e outro convexo). Por exemplo, muitos braços de iluminação comercial tem slots para filtros de densidade neutra. Encontre duas lentes com a soma de suas distâncias focais igual à distância entre os dois slots. Então, eles podem ser inseridos para funcionar como uma lente de mag. Alternativamente, um suporte para o controle deslizante do diafragma de campo pode ser outro lugar, se disponível. Construção da lente de mag em uma gaveta removível tem a vantagem adicional de permitir focar os lasers de excitação para alcançar o poder superior, que pode ser necessário para a imagem latente de SR, por simplesmente invertendo a orientação da lente mag.
Neste relatório, demonstrámos flexível de comutação entre três diferentes técnicas de imagem usando um microscópio modulado. Esta configuração pode ser usada para aplicações mais amplas e mais avançadas. Por exemplo, a configuração do SR pode ser usada para único-partícula, em células vivas, em foto-comutável de rastreamento ou photoactivatable biomoléculas com tag proteína fluorescente de interessam18,19. A configuração de smFRET pode ser usada para estudar interações moleculares na vivo sistemas20. A detecção de multi-canal baseada em divisor de emissão pode ser combinada com a configuração do SR para executar duas cores de imagem SR ou único-partícula simultaneamente de controle21.
Esta configuração pode ser expandida ainda mais para habilitar mais modulados componentes. Por exemplo, outra camada de filtro da torreta e iluminação do compartimento pode ser adicionada, para que os caminhos de excitação/emissão adicionais podem ser criados para canais adicionais, como um com um laser de infravermelho (IR) para a imagem latente amostras rotuladas com corantes de IR. Além de permitir que o canal de imagem adicionado, lasers de IR podem ser usados para corrigir a deriva de palco em imagiologia SR durante a aquisição de imagem ou durante a análise de post. Para a correção de deriva durante a aquisição de imagens, se o sistema de correção de z-drift não estiver disponível do fabricante de microscópio, um sistema alternativo com laser IR pode ser qualquer homebuilt14 ou adquiridos de empresas de terceiros. Para correção de deriva pós-aquisição, um laser de IR pode ser usado para rastreamento de marcadores fiduciais. 22
Microscopia de SR de detecção-baseado de único-molécula requer dois conjuntos de software, um para aquisição de dados e um para análise de dados. Para aquisição de dados, mesmo um simples homebuilt software que leva de imagens através da câmera enquanto controla ON dos lasers/OFF comportamentos podem trabalhar para gerar imagens de SR, enquanto é possível manualmente modular a energia de laser 405 nm, por exemplo, girando uma filtro de densidade neutra gradiente instalado na frente do laser. No entanto, esta maneira de conduzir o experimento é dependente de julgamento subjetivo do experimentador da densidade de pontos piscando-na. Assim, desta forma não é objectiva e não pode ser apropriada para serem utilizados para a quantificação de dados de imagem de SR. O código de aquisição de dados utilizado aqui inclui ponto deteção / um algoritmo de contagem enquanto a aquisição de dados está em curso, permitindo a modulação automática da potência do laser 405 nm baseado na densidade da piscando em pontos (Figura 6). Hoje em dia, alguns fabricantes de microscópio fornecem módulos de imagem programáveis, então pode-se utilizar estas, ou procure por plugins de fontes abertas como Microgerente. Para a análise de dados, é possível usar os módulos de análise comercialmente disponíveis de fabricantes de microscópio ou procurar plugins de fontes abertas como ImageJ.
Em resumo, o cenário apresentado aqui oferece grande versatilidade e fácil troca entre espaço e diferentes configurações de imagem a um custo reduzido. Esta montagem é relativamente fácil de adoptar por qualquer laboratório de pesquisa em ciências biológicas com uma necessidade de rotina e diversos experimentos de imagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
J.F. reconhece o apoio do programa estudiosos Searle e o diretor do NIH New Innovator Award. Os autores reconhecem sugestões úteis do laboratório de Paul Selvin (Universidade de Illinois, Urbana-Champaign) para posicionar a lente 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
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