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Medicine

गैर रेडियोधर्मी एल azidohomoalanine लेबलिंग विधि द्वारा नवजात प्रोटीन संश्लेषण विश्लेषण के लिए प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स का अलगाव

Published: October 23, 2018 doi: 10.3791/58323
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 2, 2, 2, 2,3,4
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 4Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम स्वस्थ और कार्यात्मक प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । गैर रेडियोधर्मी लेबलिंग सब्सट्रेट द्वारा यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के लिए निर्देश जिगर में ऊर्जा चयापचय homeostasis के संदर्भ में अंतर्निहित प्रोटीन संश्लेषण तंत्र को समझने में मदद प्रदान की गई.

Abstract

हेपैटोसाइट्स जिगर की कोशिकाओं को parenchymal है और संश्लेषण और प्रणालीगत ऊर्जा homeostasis के लिए आवश्यक प्रोटीन के स्राव सहित कई चयापचय कार्यों, संलग्न हैं । प्राथमिक हेपैटोसाइट्स murine जिगर से अलग कार्यात्मक गुण या जिगर में होने वाले परिवर्तन को समझने के लिए एक मूल्यवान जैविक उपकरण का गठन । साथ ही हम एक दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक प्रदर्शन और प्रोटीन चयापचय की जांच के लिए उनके उपयोग पर चर्चा के द्वारा प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन । एक वयस्क माउस के जिगर क्रमिक रूप से ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस tetraacetic एसिड (EGTA) और collagenase, घनत्व ढाल बफर के साथ हेपैटोसाइट्स के अलगाव के बाद के साथ perfused है । इन पृथक हेपैटोसाइट्स संस्कृति प्लेटों पर व्यवहार्य है और हेपैटोसाइट्स की संपंन विशेषताओं के बहुमत बनाए रखने । इन हेपैटोसाइट्स गैर रेडियोधर्मी रिएजेंट के साथ नवजात प्रोटीन संश्लेषण सहित प्रोटीन चयापचय के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम बताते है कि अलग हेपैटोसाइट्स आसानी से नियंत्रित कर रहे है और एक उच्च गुणवत्ता और प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा चयापचय से जुड़े एक Tetramethylrhodamine (तमृ) प्रोटीन के साथ chemo चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया का उपयोग करके की मात्रा स्थिरता शामिल डिटेक्शन मेथड और वेस्टर्न सोख्ता िरा । इसलिए, इस विधि यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा homeostasis से जुड़े की जांच के लिए मूल्यवान है । निंनलिखित प्रोटोकॉल सामग्री और उच्च गुणवत्ता वाले प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स और नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के अलगाव के लिए तरीकों की रूपरेखा ।

Introduction

प्रोटीन एक महत्वपूर्ण पोषण तत्व है और एक मानव शरीर के शुष्क वजन के लगभग ५०% प्रोटीन है जो कई जैविक लक्षण और1कार्य किया है से बना है । नतीजतन, प्रोटीन संश्लेषण सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली घटनाओं में से एक है और प्रोटीन चयापचय में परिवर्तन अत्यधिक चयापचय रोगों2,3,4सहित रोगों के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । जिगर में, लगभग 20 के लिए प्रोटीन संश्लेषण खातों-कुल ऊर्जा की खपत का 30%5,6. इसके अलावा, प्रोटीन न केवल निष्क्रिय या इमारत जिगर के ब्लॉकों के रूप में कार्य करते हैं, लेकिन यह भी सक्रिय संकेत मध्यस्थता कारकों intracellularly या extracellularly प्रणालीगत चयापचय को विनियमित करने के लिए7. उदाहरण के लिए, सीरम एल्ब्युमिन के कम स्तर, जो संश्लेषित और जिगर द्वारा स्रावित और8प्लाज्मा में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है, प्रकार का खतरा बढ़ जाता है 2 मधुमेह विकास9,10, 11, जबकि सीरम एल्ब्युमिन की एक उच्च एकाग्रता चयापचय सिंड्रोम12के विकास के खिलाफ सुरक्षात्मक है । इसके अलावा, परेशान या स्रावी या झिल्ली के विघटन-बाध्य यकृत प्रोटीन, जो लिपो, LDLR, और LRP1 सहित कोलेस्ट्रॉल homeostasis, मॉडुलन इंसुलिन प्रतिरोध, hyperlipidemia, या atherosclerosis के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 13. इसलिए, आणविक pathophysiological तंत्र की पहचान है कि जिगर में प्रोटीन चयापचय अशांति में शामिल है और इसके संबद्ध चयापचय जटिलताओं उपंयास औषधीय खोज के लिए उपयोगी हो सकता है मंदबुद्धि शुरू करने के लिए दृष्टिकोण या ऐसे इंसुलिन प्रतिरोध, मधुमेह, और गैर शराबी फैटी लीवर के रूप में चयापचय रोगों का इलाज ।

प्रोटीन संश्लेषण कसकर सेलुलर ऊर्जा की स्थिति से जुड़ा हुआ है (जैसे, प्रोटीन संश्लेषण के बढ़ाव कदम के दौरान एक पेप्टाइड बॉण्ड के गठन की आवश्यकता है 4 phosphodiester बांड14) और आणविक रास्ते द्वारा विनियमित है कि भावना अंतर और इंट्रा सेलुलर पोषक तत्वों की उपलब्धता15,16. AMP-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (AMPK) intracellular ऊर्जा सेंसरों कि ऊर्जा homeostasis17बनाए रखने में से एक है । एक बार AMPK सक्रिय है जब सेलुलर ऊर्जा का स्तर कम हो जाते हैं, AMPK और इसके लक्षित सब्सट्रेट समारोह catabolic रास्ते को उत्तेजित करने के लिए और रोकना प्रोटीन संश्लेषण18,19सहित anabolic प्रक्रियाओं । प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन के कई अनुवाद कारकों और राइबोसोमल प्रोटीन20के फास्फारिलीकरण द्वारा मध्यस्थता है. नोट, rapamycin परिसर 1 (mTORC1), प्रोटीन संश्लेषण का एक प्रमुख चालक के स्तनधारी लक्ष्य,21AMPK के मुख्य लक्ष्य में से एक है । mTORC1 मार्ग के सक्रियकरण प्रोटीन अनुवाद और autophagy20,21उत्तेजक द्वारा सेल विकास और प्रसार को बढ़ाता है । इसलिए, यह तार्किक है कि AMPK के सक्रियकरण mTORC1-मध्यस्थता प्रोटीन संश्लेषण22को बाधित कर सकते हैं । दरअसल, AMPK प्रतिक्रिया के सक्रियकरण और सीधे threonine अवशेषों पर phosphorylates mTORC1 २४४६ (२४४६) अपनी निष्क्रियता23 और प्रोटीन के दमन के लिए अग्रणी24। इसके अलावा, AMPK परोक्ष रूप से फास्फारिलीकरण और कंद स्केलेरोसिस परिसर 2 (TSC2)25 जो mTORC1 संकेतन झरना के ऊपर नियामक है के सक्रियकरण द्वारा mTORC1 समारोह को बाधित कर सकते हैं । संक्षेप में, जिगर में इन रास्ते के dysregulation अक्सर चयापचय रोगों के विकास के लिए जुड़ा हुआ है और इसलिए ऊर्जा के विनियमन में इन रास्ते की भूमिका की जांच करने के लिए प्रभावी प्रयोगात्मक उपकरण स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है और हेपैटोसाइट्स में प्रोटीन चयापचय ।

अलग प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के कार्यात्मक गुणों के बीच एक मजबूत समानता है और vivo हेपैटोसाइट्स में साथ इन विट्रो जिगर से व्युत्पंन सेल लाइनों26,27,28। यह दिखाया गया है कि प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स हिस्सा ७७ जिगर बायोप्सी के साथ% समानता, जबकि HepG2 कोशिकाओं है, जो अच्छी तरह से विभेदित यकृत कैंसर कोशिकाओं और व्यापक रूप से यकृत कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, के संदर्भ में कम से ४८% प्रदर्शन जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल29. इसलिए, प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के उपयोग के बजाय अमरता संस्कृति कोशिकाओं, यकृत समारोह और शरीर विज्ञान की जांच में महत्वपूर्ण महत्व का है, और कई प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक हेपैटोसाइट्स की संस्कृति के लिए उपलब्ध हैं विशेष रूप से चूहों30,31से । जबकि चूहे हेपैटोसाइट्स कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत अधिक उपज के साथ उपयोगी होते हैं, माउस हेपैटोसाइट्स आनुवंशिक रूप से संग्राहक चूहों की व्यापक उपलब्धता की वजह से कई वैज्ञानिक पहलुओं में एक बड़ी क्षमता है । हालांकि, सेलुलर और आणविक आधारित आकलन के लिए चूहों से स्वस्थ और प्रचुर मात्रा में प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने में कई तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं: पहला, प्रवेशनी सम्मिलन perfuse करने के लिए बफर रिएजेंट के साथ जिगर को संभालना बहुत मुश्किल है छोटे और पतले माउस पोर्टल नस या अवर वेना कावा के कारण; दूसरा, अलगाव के दौरान कोशिकाओं की एक लंबी हेरफेर समय कोशिका मात्रा और गुणवत्ता में कमी पैदा कर सकता है; तीसरा, गैर एंजाइमी यांत्रिक जुदाई तरीकों गंभीर नुकसान में परिणाम और व्यवहार्य पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स३२,३३की एक कम उपज का उत्पादन कर सकते हैं । 1980 के दशक में, collagenase छिड़काव तकनीक३४पशुओं के जिगर से अलग हेपैटोसाइट्स के लिए शुरू की गई थी । इस विधि जिगर३५,३६,३७, कैल्शियम chelator समाधान३८,३९, एंजाइमी पाचन के साथ जिगर की अर्क के collagenase छिड़काव पर आधारित है और यकृत पैरेन्काइमा३५के यांत्रिक पृथक्करण । पहले चरण में, एक माउस जिगर एक कैल्शियम के साथ perfused है [ca2 +] एक युक्त मुक्त बफर [ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic एसिड, EDTA) । दूसरे चरण में, माउस जिगर सेलुलर-extracellular मैट्रिक्स बातचीत hydrolyze करने के लिए एक collagenase-युक्त बफर के साथ perfused है. चरण एक में प्रयोग किया जाता बफर के विपरीत, दूसरे चरण के बफर में [Ca2 +] आयनों की उपस्थिति प्रभावी collagenase गतिविधि के लिए आवश्यक है, जिसके बाद पचा जिगर को आगे धीरे और यांत्रिक रूप से संदंश के बीच का उपयोग कर अलग हो गया है यकृत कैप्सूल और parenchymatous ऊतक । अंत में, संयोजी ऊतक फ़िल्टरिंग द्वारा निकाल दिया जाता है, और बाद के केंद्रापसारक दोनों गैर parenchymal कोशिकाओं और गैर-घनत्व ढाल बफर४०,४१ के उपयोग के साथ hepatocyte रहने से व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स अलग ,४२. वर्तमान अध्ययन में, हम प्रोटीन संश्लेषण के विश्लेषण के लिए एक माउस जिगर से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने के लिए एक संशोधित दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक दिखाते हैं ।

प्रोटीन की radiolabeling व्यापक रूप से अभिव्यक्ति के स्तर, कारोबार की दर को बढ़ाता है, और प्रोटीन के जैविक वितरण४३ ४४रेडियोधर्मिता का पता लगाने की उच्च संवेदनशीलता के कारण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग अत्यधिक नियंत्रित अनुसंधान परिस्थितियों और प्रक्रियाओं४५की आवश्यकता है. वैकल्पिक गैर रेडियोधर्मी तरीके विकसित किया गया है और तेजी से लोकप्रियता में प्राप्त की है । एक Tetramethylrhodamine के साथ chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया (तमृ) प्रोटीन का पता लगाने विधि उनमें से एक है और एक chemo और azide समूहों४६, जो इस तरह के रूप में सेलुलर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के बीच alkyne चयनात्मक प्रतिक्रिया पर आधारित है एक azide समूह के साथ संशोधित नच के नवजात प्रोटीन संश्लेषण और उपवर्गों का पता लगाने. नवजात प्रोटीन संश्लेषण के लिए, एल Azidohomoalanine (एल-अहा, एक azide-संशोधित एमिनो एसिड) चयापचय प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है और तमृ प्रोटीन का पता लगाने विधि४७का उपयोग करके पता चला । प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स में इस परख का उपयोग करके, हम बताते है कि नवजात प्रोटीन संश्लेषण दर कसकर mitochondrial और AMPK सक्रियण (चित्रा 1) से एटीपी की उपलब्धता से जुड़ा हुआ है ।

सारांश में, प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के उपयोग प्रोटीन और ऊर्जा चयापचय और बढ़ाता नवजात प्रोटीन संश्लेषण की जांच के लिए महत्वपूर्ण रास्ते के विकास के लिए प्रासंगिक की शारीरिक भूमिका में अंतर्दृष्टि पाने के लिए मूल्यवान है और hepatocyte से संबंधित रोगों का ईलाज ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों का उपयोग होता है । पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं सिनसिनाटी बच्चों अस्पताल चिकित्सा केंद्र की पशु देखभाल समितियों द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स का अलगाव

  1. पूर्व अलगाव की तैयारी
    1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में ४०% घनत्व ढाल बफर के ४५० मिलीलीटर तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस (15 मिलीलीटर/
    2. 1 तालिका में वर्णित के रूप में ' विलियंस माध्यम के ५०० मिलीलीटर तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
    3. 1 तालिका में वर्णित के रूप में DMEM के ५०० मिलीलीटर तैयार करें और बर्फ पर रखें (30 एमएल/
    4. HBSS के ५०० मिलीलीटर तैयार करें (-) बफर के रूप में तालिका 1 में वर्णित है और पानी के स्नान में ४२ डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए (४० मिलीलीटर/
    5. HBSS के ५०० मिलीलीटर (+) बफर ०.३ मिलीग्राम/एमएल Collagenase प्रकार एक्स के साथ तैयार के रूप में 1 टेबल में 30 मिनट की मशीन के साथ पानी में स्नान (४० मिलीलीटर/
    6. नसों (I. V) कुंडी पैर पेडल भर में प्रशासन ट्यूबिंग रखकर और हवा के बुलबुले के बिना समाधान निस्तब्धता के प्रवाह की जाँच करके छिड़काव पंप सेट करें ।
    7. ४२डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हीटर गर्म ।
    8. 4 ° c करने के लिए केंद्रापसारक मशीन शांत हो जाओ ।
  2. संज्ञाहरण और छिड़काव
    1. काम क्षेत्रों और पंप साफ ।
    2. 10 मिनट के लिए पूरी तरह से ७०% इथेनॉल चलाकर पंप से जुड़े चतुर्थ ट्यूब कुल्ला ।
    3. DDW के साथ पूरी तरह से 10 मिनट के लिए धोने से पंप से जुड़े चतुर्थ ट्यूब अवशिष्ट इथेनॉल निकालें ।
    4. ७०% इथेनॉल के साथ कैंची और संदंश पोंछ ।
    5. एक प्लास्टिक कंटेनर में एक जाल नीचे के साथ और 2 मिलीलीटर isoflurane-जाल के नीचे लथपथ धुंध के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए माउस रखें ।
    6. पेडल पलटा (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें ।
    7. जब यह संज्ञाहरण की वांछित गहराई तक पहुंच गया है माउस निकालें ।
      ध्यान दें: संज्ञाहरण की प्रेरण समय से अधिक 1 मिनट नहीं होना चाहिए ।
    8. एक नाक कोन 1 मिलीलीटर isoflurane-लथपथ पैड के साथ एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब का उपयोग ट्यूब के अंत करने के लिए धक्का दिया ।
    9. नाक शंकु करीब या दूर माउस नाक से चलती द्वारा संज्ञाहरण की गहराई को नियंत्रित ।
    10. ventral पक्ष के साथ काम कर रहे मंच पर माउस जगह ऊपर का सामना करना पड़ ।
    11. माउस के उदर क्षेत्र पर ७०% इथेनॉल स्प्रे और फिर तेज कैंची और दांतेदार संदंश का उपयोग करके dermis और योनि के एक बड़े अनुप्रस्थ चीरा बनाने के द्वारा उदर गुहा खुला ।
    12. फिर, पेट की परतों के एक ऊर्ध्वाधर कटौती जब तक सभी उदर अंगों को पूरी तरह से तेज कैंची और दांतेदार संदंश का उपयोग करके उजागर कर रहे हैं ।
    13. जिगर, पोर्टल नस, और अवर वेना कावा (IVC) स्पष्ट रूप से उजागर कर रहे हैं जब तक autoclaved कपास टिप के साथ माउस के बाईं ओर की ओर छोटी और बड़ी आंतों हटो.
    14. बस सही गुर्दे नस के साथ विभाजन पर IVC में एक 24 ग्राम कैथेटर डालें हाथ मिलाते हुए IVC और खून बह रहा है की चोट से बचने के बिना ध्यान से ।
      नोट: यदि आप IVC में कैथेटर डालने रहे हैं, जबकि खून बह रहा है, तो आप एक पोर्टल नस में नए कैथेटर डालने के लिए प्रयास करना चाहिए ।
    15. कैथेटर की सुई निकालें और IVC से बाहर निकलने से बचने के लिए प्रवेशनी की स्थिति को नियंत्रित, तो कनेक्टर का उपयोग करके छिड़काव ट्यूब के साथ 24 जी प्रवेशनी कनेक्ट.
      नोट: छिड़काव शुरू करने से पहले हवा के बुलबुले की उपस्थिति से बचें ।
    16. गर्म HBSS के साथ जिगर के छिड़काव शुरू करें (-) 4 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर/मिनट और काट प्लीहा नस जल्दी से कैंची का उपयोग करके आंतरिक रक्त निकास के लिए ।
      नोट: यदि cannulation सफल है, जिगर IVC से यकृत नसों को बफर के backflow वितरण के कारण सफेद करने के लिए शुरू हो जाएगा । पोर्टल नस प्लीहा और बेहतर mesenteric नसों के संघ द्वारा बनाई गई है; इसलिए, यह बहुत प्लीहा नस में कटौती के बाद से यह बड़ा और जिगर से बाहर है सुरक्षित है ।
    17. जारी रखें छिड़काव के साथ ३५ मिलीलीटर की गर्म HBSS (-) ।
      नोट: जिगर रंग में पीला हो जाएगा अगर छिड़काव पर्याप्त है, और माउस अभी भी संज्ञाहरण के तहत इस स्तर पर जीवित है ।
  3. पाचन और निष्कर्षण
    1. Perfuse HBSS के गर्म ३५ मिलीलीटर के साथ माउस जिगर (+) Collagenase प्रकार एक्स सहित 4 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/
    2. हर कुछ मिनट, ~ 10 एस HBSS की पूरी मात्रा (+) जिगर के सभी संरचनात्मक भागों में फैलाना करने के लिए अनुमति देने के लिए संदंश का उपयोग करके प्लीहा नस दबाना ।
      नोट: जिगर प्लीहा बफर भीड़ के कारण नस clamping के बाद प्रफुल्लित करना शुरू होता है ।
    3. छिड़काव प्रक्रिया के अंत में १०० mm पेट्री डिश में Collagenase प्रकार एक्स के साथ तैयार गर्म HBSS (+) के 5 मिलीलीटर डालो ।
    4. शरीर के बाकी हिस्सों से perfused जिगर में कटौती करने से पहले पंप रोकने के लिए जिगर में रक्त की backflow से बचने के लिए, संदंश द्वारा पित्ताशय की थैली को हटाने, और फिर एक कागज तौलिया के साथ धीरे जिगर पोंछ खून निकालने के लिए ।
    5. पेट्री डिश जो तैयार गर्म HBSS (+) के 5 मिलीलीटर शामिल है और धीरे सीधे-इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर लीवर कैप्सूल हटाने के लिए जिगर स्थानांतरण ।
      नोट: लिवर कैप्सूल संयोजी ऊतक कि जिगर आसपास की एक पतली परत है ।
    6. संदंश का उपयोग करके parenchymal ऊतक को सावधानीपूर्वक फैलाएं । पेट्री डिश में 15 मिलीलीटर ठंडा DMEM डालें ।
      नोट: मध्यम parenchymal कोशिकाओं के कारण बादल बंद हो जाएगा अगर जिगर अच्छी तरह से पच जाता है ।
    7. फटे हुए जिगर को धीरे से हिलाएं मध्यम में अवशिष्ट parenchymal कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए और पेट्री डिश के लिए एक और 15 मिलीलीटर ठंड DMEM जोड़ने के लिए कोशिकाओं के आराम मिलता है ।
    8. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में १०० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से भंग जिगर के साथ DMEM स्थानांतरण और बर्फ में रहते हैं ।
  4. शोधन
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ६० एक्स जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक, ध्यान से वैक्यूम आकांक्षा द्वारा supernatant हटाने और 10 मिलीलीटर DMEM में गोली resuspend ।
    2. ४०% घनत्व ढाल बफर के शीर्ष पर एक पतली परत के रूप में resuspend गोली जोड़ें, और 4डिग्री सेल्सियस पर ब्रेक के बिना 10 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. ध्यान से ऊपरी परत (DMEM) और मध्यम परत (मृत या गैर parenchymal कोशिकाओं), लेकिन नहीं निचली परत (गोली: प्राथमिक parenchymal हेपैटोसाइट्स) सहित supernatant निकालें ।
    4. 2 – 3 एमएल विलियम के मध्यम ई के साथ प्राथमिक कोशिकाओं को पुनर्स्थगित, और ट्यूब की दीवार पर मृत कोशिकाओं के संदूषण से बचने के लिए नई ५० एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    5. जोड़ें 7-8 मिलीलीटर विलियम मध्यम ई, धीरे मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. ध्यान से निर्वात आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें और फिर गोली फिर से सस्पेंड 10, 20 या 30 के साथ है विलियम मध्यम ई के एमएल (गोली के आकार के अनुसार) ।
    7. किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
    8. विलियम के माध्यम से बीज ई, 2-3 एच के लिए ३७डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली रखने के लिए, तो विरोधी के साथ मध्यम with10% FBS DMEM मध्यम की जगह-विरोधी मृत या संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन के लिए ।
    9. अगले दिन, प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार हैं ।

2. Chemo-नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के लिए चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया परख

  1. चयापचय लेबलिंग
    1. (पूर्व उपचार) ३७ ° c गर्म पंजाबियों के साथ दो बार प्राथमिक हेपैटोसाइट्स धोने और cytoplasmic methionine भंडार को चूस करने के लिए 30 मिनट के लिए methionine मुक्त DMEM माध्यम जोड़ें ।
      नोट: एल-Azidohomoalanine, एक एमिनो एसिड और methionine के अनुरूप है, एक azido moiety कि प्रोटीन में सेलुलर प्रोटीन के संश्लेषण के दौरान शामिल किया जा सकता है इतना है कि cytoplasmic methionine की कमी खिलाने और निगमन में वृद्धि होगी शामिल के एल-Azidohomoalanine के नव संश्लेषित प्रोटीन में संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक हेपैटोसाइट्स.
    2. उपचार ३७ ° c गर्म पंजाबियों के साथ दो बार प्राथमिक हेपैटोसाइट्स धोने और 25 माइक्रोन अहा (एल Azidohomoalanine) के साथ methionine मुक्त DMEM मध्यम जोड़ने के लिए 4-6 एच ।
    3. किसी भी विशिष्ट रासायनिक जोड़ें (यानी 10 माइक्रोन रोटेनोन) के लिए मध्यम में 4-6 एच अहा की उपस्थिति में आदेश नवजात प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर अपने प्रभाव की जांच करने के लिए ।
    4. मशीनीकरण के बाद, वैक्यूम आकांक्षा द्वारा मध्यम निकालें और ठंडे पंजाबियों के साथ प्राथमिक हेपैटोसाइट्स तीन बार धो लें ।
    5. थाली के लिए २०० μL lysis बफर जोड़ें और बर्फ पर 15-30 मिनट के लिए मशीन, तो प्लेट झुकाव और १.७ मिलीलीटर ट्यूब में पूरे सेल lysate ले ।
      नोट: आप सेल कटाई के दौरान सेल lysate बहुत चिपचिपा है कि निरीक्षण करना चाहिए ।
    6. प्रोटीन को solubilize करने और डीएनए को फैलाने के लिए एक जांच sonicator का प्रयोग करके 5 एस तीन बार के लिए बर्फ पर सेल lysate Sonicate ।
    7. भंवर 5 मिनट के लिए सेल lysate, २१,१३० x जी पर 10 मिनट के लिए 4 ओसी में सेल lysate के केंद्रापसारक और फिर एक नया ट्यूब में स्पष्ट supernatant हस्तांतरण । दो बार प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
      नोट: इस स्तर पर, प्रोटीन के नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c दो सप्ताह के लिए यदि वे तुरंत इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं ।
  2. Azide-संशोधित नवजात प्रोटीन लेबलिंग
    1. घटक (a) घटक (b) के ६० μL को जोड़कर घटक (a + b) तैयार करें ।
      नोट: समाधान करने के लिए (B) घटक जोड़ने के बाद रंग में चमकीले गुलाबी करने के लिए बदल जाता है ।
    2. प्रोटोकॉल के अनुसार बफ़र्स (D) और (E) तैयार करें ।
    3. 20 लो-40 μg सेल lysate और जोड़ें ५० μL 2x प्रतिक्रिया बफर (घटक ए + बी), तो ८० μL के लिए DDW और भंवर जोड़कर मात्रा को समायोजित करें 5 एस ।
    4. 5 μL CuSO4 (घटक सी), और भंवर 5 एस के लिए जोड़ें ।
    5. जोड़ें 5 μL प्रतिक्रिया बफर additive 1 (नए सिरे से तैयार घटक डी), तो भंवर के लिए 5 एस और 3 मिनट के लिए रुको ।
    6. जोड़ें 10 μL पुनर्गठन प्रतिक्रिया बफर additive 2 (घटक ई), तो 5 एस के लिए भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूने एक बहु रोटेटर मशीन का उपयोग करके घुमाएँ ।
      नोट: समाधान घटक (E) जोड़ने के बाद रंग में चमकीले नारंगी करने के लिए बदल जाता है । रोटेशन के दौरान नमूनों को प्रकाश से सुरक्षित किया जाना चाहिए ।
    7. 5 एस के लिए ३०० μL मेथनॉल और भंवर जोड़ें, 5 एस के लिए ७५ μL क्लोरोफॉर्म और भंवर जोड़ें, फिर 5 एस के लिए २०० μL DDW और भंवर जोड़ें ।
    8. २१,१३० x g और 5 मिनट के लिए 4डिग्री सेल्सियस पर नमूनों के केंद्रापसारक, तो जलीय supernatant त्यागें और गोली रखो ।
    9. जोड़ें २५० μL ट्यूब, भंवर के लिए मेथनॉल, और स्पिन फिर से 5 मिनट के लिए २१,१३० x g पर
    10. supernatant त्यागें, तो एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ नमूनों को कवर और छर्रों हवा सूखी कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. पृष्ठ विश्लेषण और पश्चिमी सोख्ता
    1. Solubilize के 20 μL में गोली β-mercaptoethanol, 10 मिनट के लिए भंवर के बिना , 10 मिनट के लिए हीट ब्लॉक का उपयोग करके ७० डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । इसके बाद नमूनों को Tetramethylrhodamine (तमृ) डिटेक्शन के लिए 10% एसडीएस जेल (१.५ mm) में लोड करें ।
    2. अहा संकेत का पता लगाने के नवजात प्रोटीन की सटीक quantitation के लिए एक चर मोड लेजर स्कैनर का उपयोग कर ।
    3. 15 मिनट के लिए DDW के साथ जेल धो लें ।
    4. फिर, एक तेज और संवेदनशील coomassie के साथ 10% एसडीएस जेल दाग-डाई एजेंट 15 के लिए-60 मिनट एक नियंत्रण के रूप में कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए ।
    5. De-दाग 1 के लिए DDW के साथ जेल-2 एच और एक यूवी प्रतिदीप्ति imager का उपयोग करके छवि प्राप्त ।

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Representative Results

प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स आइसोलेशन परिणाम लगभग 20 x 106 कुल कोशिकाओं की एक उपज में माउस/ Histologically, लाइव और संलग्न प्राथमिक हेपैटोसाइट्स 24 एच मशीन (चित्रा 2) के बाद स्पष्ट रूप से उल्लिखित झिल्लीदार सीमा के साथ आकार में बहुभुज या ठेठ षट्कोण दिखाई देते हैं ।

यह पुष्टि करने के लिए कि अलग कोशिकाओं प्राथमिक हेपैटोसाइट्स हैं, हम अलग प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स (PMHs), माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs), एक माउस hepatoma सेल लाइन (Hepa 1-6), और माउस जिगर में एल्ब्युमिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तर की तुलना में । एल्ब्युमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स और माउस जिगर में पाया गया था, लेकिन या तो MEFs या Hepa 1-6 कोशिकाओं (चित्रा 3) में detectable नहीं था ।

यकृत AMP सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (AMPK) सक्रियण पर रोटेनोन के प्रभाव सेल स्वायत्त है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, हम जंगली प्रकार माउस के एक जिगर से अलग प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के समय पर निर्भर प्रतिक्रिया की तुलना में. प्राथमिक हेपैटोसाइट्स बिना या 0, 4 या 6 एच के लिए 10 माइक्रोन रोटेनोन के साथ इलाज किया गया । इन कोशिकाओं में, रोटेनोन उपचार मजबूती से प्रेरित AMPK सक्रियकरण, के रूप में AMPK-T172 vivo४८ (चित्रा 4) में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह की वृद्धि हुई फास्फारिलीकरण स्तर से पता चला ।

सीधे प्राथमिक हेपैटोसाइट्स में नवजात प्रोटीन संश्लेषण पर रोटेनोन उपचार के प्रभाव को मापने के लिए, गैर रेडियोधर्मी अहा प्रोटीन में 5 से अधिक एच chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया परख प्रदर्शन करके मूल्यांकन किया गया था । 5 एच के लिए 10 माइक्रोन रोटेनोन के साथ उपचार इलाज प्राथमिक हेपैटोसाइट्स में नवजात प्रोटीन संश्लेषण पर गहरा निरोधात्मक प्रभाव था जब अनुपचारित प्राथमिक हेपैटोसाइट्स (चित्रा 5) की तुलना में.

Figure 1
चित्रा 1: एक उदाहरण प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स अलगाव, पश्चिमी दाग विश्लेषण, और chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया प्रक्रियाओं के कदम से पता चलता है ।

Figure 2
चित्रा 2: प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के चरण कंट्रास्ट रूपात्मक छवियां । पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के प्रतिनिधि चित्रों को चढ़ाना के बाद 2, 12, 24, और ७२ ज में अधिग्रहीत किया गया । स्केल बार्स = १०० माइक्रोन ।

Figure 3
चित्रा 3: प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स में एल्ब्युमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण । पश्चिमी दाग विश्लेषण की लोडिंग के साथ आयोजित किया गया था 10 μg प्रोटीन/लेन से प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स (PMHs), माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs), Hepa 1-6 कोशिकाओं, और माउस जिगर । एक तरह से ANOVA MEF या Hepa 1-6 कोशिकाओं की तुलना में PMHs में एक महत्वपूर्ण एल्ब्युमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाया । मूल्यों का मतलब है ± SEM के समूह आकार (n = 3) । *p, #p < 0.001 vs. Hepa 1-6 या MEFs, क्रमशः । $ P < 0.001 vs. जिगर lysate.

Figure 4
चित्रा 4: रोटेनोन-इलाज प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स में AMPK के फास्फारिलीकरण की प्रेरण । एक जंगली प्रकार माउस जिगर से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के लिए 10 माइक्रोन रोटेनोन के साथ इलाज किया गया 0, 4 या 6 ज. AMPK के फास्फारिलीकरण स्तर पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाया गया था और β-actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (10 μg प्रोटीन लोड किया गया था/लेन). दोहराया माप 2-way ANOVA से पता चला कि उपचार phospho-अनुपचारित प्राथमिक हेपैटोसाइट्स की तुलना में AMPK के प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई । मूल्यों का मतलब है ± SEM के समूह आकार (n = 3) । *P < 0.001 vs. अनुपचारित हेपैटोसाइट्स ।

Figure 5
चित्रा 5: रोटेनोन उपचार के बाद यकृत नवजात प्रोटीन अभिव्यक्ति की कमी । एक जंगली प्रकार के माउस जिगर से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स 10 के लिए माइक्रोन रोटेनोन के साथ इलाज किया गया एच, गैर रेडियोधर्मी अहा विधि के साथ एक नवजात प्रोटीन संश्लेषण परख के बाद । प्रोटीन संश्लेषण के स्तर तमृ प्रतिदीप्ति का पता लगाने के एक लेज़र स्कैनर द्वारा मूल्यांकन किया गया । इस परख के लिए कुल प्रोटीन लोडिंग स्तर coomassie डाई रिएजेंट द्वारा पता लगाया गया ।

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Discussion

हालांकि कई अमर यकृत कोशिका लाइनों का प्रस्ताव किया गया है और जिगर कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया४९,५०,५१,५२, इन कोशिकाओं को आम तौर पर महत्वपूर्ण और मौलिक अभाव सामान्य हेपैटोसाइट्स के कार्य, जैसे एल्ब्युमिन की अभिव्यक्ति (चित्रा 3). यह व्यापक रूप से मांयता प्राप्त है, इसलिए, कि प्राथमिक हेपैटोसाइट्स का उपयोग संस्कृति में जिगर फिजियोलॉजी और चयापचय की जांच के लिए एक मूल्यवान विकल्प है, संवर्धन की चुनौतियों और इन कोशिकाओं को बनाए रखने के बावजूद । साथ ही, हमारे अध्ययन एक अपेक्षाकृत सुविधाजनक और कुशल तरीके से एक दो कदम collagenase विधि का आयोजन करके प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के सफल अलगाव विवरण । इन प्रक्रियाओं के माध्यम से, संस्कृति के भीतर पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के बहुमत उनके चयापचय कार्यक्षमता और रूपात्मक स्थिरता बनाए रखने और प्रोटीन चयापचय, gluconeogenesis सहित यकृत कार्यों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और mitochondrial संवेदनाएं ।

पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक यकृत ऊर्जा चयापचय के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए उपकरण हैं । रोटेनोन mitochondria में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसर मैं गतिविधि और ब्लॉक ऑक्सीडेटिव एटीपी५३के सीमित संश्लेषण के साथ फास्फारिलीकरण, के रूप में AMPK (चित्रा 4) के सक्रियण के द्वारा सबूत के साथ हस्तक्षेप । AMPK सक्रियण सेलुलर अनुकूली प्रतिक्रियाओं कि anabolic तंत्र को दबाने के लिए रोटेनोन-प्रेरित ऊर्जा की कमी तनाव की भरपाई चलाता है । इस हालत के तहत, हम सफलतापूर्वक एक तमृ प्रोटीन का पता लगाने विधि (चित्रा 5) के साथ एक गैर रेडियोधर्मी, chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया का उपयोग प्राथमिक हेपैटोसाइट्स में नवजात प्रोटीन संश्लेषण के स्तर की भारी कमी का पता लगाया. इन परिणामों के प्राथमिक हेपैटोसाइट्स में उपयुक्त प्रोटीन संश्लेषण के लिए mitochondria से ऊर्जा की आपूर्ति के महत्व की पुष्टि । इन तकनीकों को स्वस्थ और रोगग्रस्त स्थितियों के यकृत प्रोटीन संश्लेषण के संदर्भ में चिकित्सकीय प्रासंगिक सांद्रता के भीतर एक दवा कार्रवाई या विषाक्तता के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए उपयोगी होते हैं । इसके अलावा, इन तकनीकों को आनुवंशिक रूप से हेरफेर चूहों से पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स का विश्लेषण करके प्रोटीन और ऊर्जा चयापचय नियमन विशिष्ट रास्ते की भूमिका की जांच के लिए लागू कर रहे हैं ।

सामांय में, कम उपज और कोशिका व्यवहार्यता प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के उपयोग की प्रमुख कमियां हैं । इन मुद्दों ऐसे प्रारंभिक cannulation, HBSS के साथ अपर्याप्त धोने, collagenase, या लंबी छिड़काव अवधि के अनुचित एकाग्रता के रूप में कई कारणों की वजह से कर रहे हैं । हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल इन कई चरणों का अनुकूलन और 20 मिलियन/जिगर/वयस्क चूहों के आसपास एक उच्च उपज और व्यवहार्य कोशिकाओं को पाने के लिए सुराग । विशेष रूप से, वहां दो महत्वपूर्ण कदम हैं: एक के तापमान और उचित collagenase एकाग्रता के साथ पचा बफ़र्स के प्रवाह की दर को समायोजित करने के लिए 15 में यकृत पैरेन्काइमा कुशलतापूर्वक पचा रहा है-प्रवेशनी प्रविष्टि से 20 मिनट तक जिगर उत्पाद, और एक और इन नमूनों का इलाज जल्दी प्रक्रिया के रूप में वर्णित करने के लिए स्वस्थ हालत में कोशिकाओं को रखने के लिए है collagenases । जबकि पृथक हेपैटोसाइट्स आधारित अध्ययन कई प्रकाशित आंकड़ों में ४८ ज समय सीमा के भीतर आयोजित किया गया है, प्राथमिक हेपैटोसाइट्स हमारी प्रक्रियाओं के साथ अलग लंबी अवधि के संस्कृति सहना (चित्रा 2) । इन कोशिकाओं के साथ, हम chemo के माध्यम से यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण की मजबूत लेबल-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया परख दिखाने के लिए, हालांकि एकाग्रता और प्रोटोकॉल में अहा के साथ गर्मी समय के लिए फिर से अलग जैविक में अनुकूलित हो सकता है कोशिकाओं की शर्तें (जैसे शारीरिक बनाम रोग, जंगली-प्रकार बनाम ट्रांसजेनिक या पीटा/। । ।

संक्षेप में, हम एक गैर रेडियोधर्मी तरीके से नवजात प्रोटीन संश्लेषण के लिए प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रियाओं की स्थापना की है । इन कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रतिक्रिया mitochondrial तनाव और AMPK मार्ग के सक्रियण के साथ प्रोटीन संश्लेषण के प्रदर्शन दमन । इस प्रकार, इन अलग हेपैटोसाइट्स यकृत प्रोटीन और ऊर्जा चयापचय पूर्व vivoके pathophysiology की जांच के लिए मूल्यवान मॉडल हैं ।

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Disclosures

लेखक संकेत देते है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम डीआरएस को धंयवाद । Joonbae एसईओ और विवियन Hwa उनके वैज्ञानिक इनपुट और चर्चा के लिए । इस काम को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) (R01DK107530) ने सपोर्ट किया था । T.N. को जापान की साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी से सफ़ाई ने सपोर्ट किया था । इस अध्ययन का एक हिस्सा NIH (P30DK078392) से सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान कोर सेंटर के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24 G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple - Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps

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चिकित्सा अंक १४० प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स नवजात प्रोटीन संश्लेषण AMPK संकेतन रोटेनोन एल-Azidohomoalanine गैर रेडियोधर्मी विधि
गैर रेडियोधर्मी एल azidohomoalanine लेबलिंग विधि द्वारा नवजात प्रोटीन संश्लेषण विश्लेषण के लिए प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स का अलगाव
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