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Medicine

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

Published: October 23, 2018 doi: 10.3791/58323
* These authors contributed equally

Summary

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

Abstract

Hepatocytes 간 parenchymal 세포 고 합성 및 조직의 에너지 항상성에 필수적인 단백질의 분 비를 포함 한 여러 대사 기능을 갖습니다. 기본 hepatocytes murine 간에서 고립 된 간에서 발생 하는 변경 또는 기능 속성을 이해 하는 귀중 한 생물 도구를 구성 합니다. 여기 우리는 2 단계 콜라 관류 기법을 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 문화와 격리 하는 방법을 설명 하 고 단백질 대사 조사에 대 한 그들의 사용을 토론. 성인 마우스의 간은 순차적으로 에틸렌 글리콜-두번째 tetraacetic 산 (EGTA)와 콜라, hepatocytes 밀도 그라데이션 버퍼의 다음 끼얹는다. 이러한 격리 hepatocytes 문화 접시에 가능한 고 hepatocytes의 부여 특성의 대부분을 유지 한다. 이러한 hepatocytes 단백질 대사 비 방사성 시 약으로 초기 단백질 합성 등의 평가 대 한 사용할 수 있습니다. 우리는 격리 hepatocytes 쉽게 제어 하 고 구성 하는 단백질 합성 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응을 이용 하 여 에너지 대사에 연결의 높은 품질과 볼륨 안정성을 보여 탐지 방법 그리고 서쪽 더 럽 히 분석입니다. 따라서,이 방법은 간 초기 단백질 합성에 에너지 항상성 연결을 조사 하는 데 유용 합니다. 다음 프로토콜 재료와 높은-품질 기본 마우스 hepatocytes의 격리 및 초기 단백질 합성의 검출을 위한 방법을 설명합니다.

Introduction

단백질 중요 한 영양 요소 이며 인체의 건조 중량의 약 50%는 여러 생물 학적 특성과 기능1단백질으로 구성 되어 있습니다. 따라서, 단백질 합성은 대부분 에너지 소모 이벤트 중 하나 이며 단백질 대사에 변경 매우 개발과 관련 된 대사 질환2,,34를 포함 하 여 질병의. 총 에너지 소비5,6의 약 20-30%는 간 단백질 생 합성을 차지 하 고. 또한, 단백질 기능 뿐만 아니라 수동 또는 빌딩 블록 또한 활성 신호를 중재 요인 하지만 간 침으로 또는 extracellularly7조직 물질 대사 조절 한다. 혈 청 알 부 민, 합성 고 간 및 플라즈마8에서 가장 풍부한 단백질 분 비의 감소 된 수준 2 형 당뇨병 개발9,10, 의 위험을 증가 하는 예를 들어, 11, 높은 혈 청 알 부 민 농도 변화 증후군12개발에 대 한 보호. 또한, 방해 또는 분 비 또는 막 도약 간장 단백질, 지 단백질, LDLR, 및 LRP1를 포함 하 여 콜레스테롤 항상성 조절의 인슐린 저항, 고 지 혈 증, 또는 동맥 경화 증의 발전으로 이어질 수 있습니다. 13. 따라서, 간 및 그것의 관련된 대사 합병증에 단백질 대사 장애에 관련 된 분자 pathophysiological 메커니즘의 식별에 유용할 수 있습니다 소설 약리 발견 발병 지체 또는 인슐린 저항, 당뇨병, 비알코올 지방 간 등 대사 질환 치료에 접근 한다.

단백질 합성 세포 에너지 상태에 밀접 하 게 연결 (예를들면, 단백질 합성의 신장 단계 동안 한 펩 티 드 결합의 형성 필요 4 phosphodiester 채권14) 분자 경로 감지 하 여 규제 인테르-와 intra-cellular 양분 가용성15,16. AMP 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (AMPK) 에너지 항상성17유지 세포내 에너지 센서 중 하나입니다. AMPK는 세포 에너지 레벨 낮은 될 때 활성화 됩니다, 일단 AMPK 및 그 타겟된 기판 catabolic 경로 자극 하 여 단백질 합성18,19를 포함 하 여 동화 작용 과정을 억제 기능. 단백질 합성의 규칙은 여러 번역 요인과 ribosomal 단백질20의 인 산화에 의해 중재 됩니다. 메모의 포유류의 대상이 rapamycin 복잡 한 1 (mTORC1), 단백질 합성의 주요 드라이버 AMPK21의 주요 목표 중 하나입니다. MTORC1 통로의 활성화는 자극 단백질 번역과 autophagy20,21여 세포 성장과 확산을 향상 시킵니다. 따라서, AMPK의 활성화가 중재 하는 mTORC1 단백질 합성22를 억제할 수 있는 논리적 이다. 사실, AMPK의 활성화 중화 하 고 직접 트레오닌 잔류물 2446 (Thr2446)의 비활성화23 및 단백질 생 합성24의 억제에 mTORC1 phosphorylates. 또한, AMPK 수 직접 억제 하지 인 산화 그리고 활성화의 결 절 경화 증 복합 2 (TSC2)25 mTORC1 신호 폭포의 상류 레 귤 레이 터는 mTORC1 기능. 즉, 이러한 경로에 dysregulation 종종 대사 질환의 발전에 연결 되어, 따라서 에너지의 규정에 이러한 통로의 역할을 조사 하기 위해 효과적인 실험 도구를 설치 하는 중요 한 필요 하 고 hepatocytes에 단백질 대사입니다.

고립 된 기본 hepatocytes의 기능적 속성과 vivo에서 hepatocytes 보다 생체 외에서 간 파생 셀 라인26,,2728와 사이 강한 유사성이 있다. 그것은 보였다 주 인간의 hepatocytes 간 biopsies의 77% 유사성을 공유 HepG2 세포를 잘 분화 된 간 암 세포는 간 기능을 조사 하기 위해 널리 사용 되의 맥락에서 48% 미만 표시 하는 반면 유전자 발현29프로필. 따라서, 불멸 하 게 문화 셀, 보다는 오히려 기본 hepatocytes, 활용의 중요 간 기능과 생리학, 조사 이며 여러 프로토콜 분리와 기본 hepatocytes의 문화에 대 한 사용할 수 있습니다. 특히 쥐30,31에서 쥐 hepatocytes 셀의 상대적으로 높은 수익률으로 유용한 동안, 마우스 hepatocytes 유전자 변조 된 쥐의 넓은 가용성 때문에 많은 과학적 측면에서 큰 잠재력을 있다. 그러나, 세포 및 분자 기반 평가 대 한 마우스에서 건강 하 고 풍부한 기본 hepatocytes 격리에 여러 기술 도전이 있다: 첫째, 버퍼 시 약으로 간 perfuse에 캐 뉼 러 삽입은 매우 처리 하기 어려운 작고 얇은 마우스 문맥 또는 열 등 한 베 나 정 맥; 둘째, 격리 하는 동안 세포의 더 긴 조작 시간을 일으킬 수 있습니다 감소 셀 수량 및 품질; 셋째, 효소 비 기계적 분리 방법 심각한 손상 하 고 가능한 격리 기본 hepatocytes32,33의 낮은 수익률을 생산할 수 있습니다. 1980 년대, 콜라 관류 기술 hepatocytes 동물34의 간은에서 격리 하기 위한 도입 되었습니다. 이 메서드는 간35,,3637, 칼슘 chelator 솔루션38,39, 효소 소화와 간 주입의 콜라 관류에 기반 하 고 간 실질35의 기계적 분리. 첫 번째 단계에서 마우스 간은 칼슘 [Ca2 +] 무료 버퍼를 포함 하는 [캘리포니아2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic 산, EDTA) 끼얹는다. 두 번째 단계에서 마우스 간 세포-기질 상호 작용은 하 콜라 포함 된 버퍼와 함께 끼얹는다는. 1 단계에서 사용 되는 버퍼와는 달리 [캘리포니아2 +] 두 번째 단계의 버퍼에서 이온의 존재는 효과적인 콜라 활동, 후 소화 간 더 부드럽게 그리고 기계적으로 분리 될 사이 집게를 사용 하는 필요는 간장 캡슐 그리고 parenchymatous 조직입니다. 마지막으로, 결합 조직, 필터링 하 여 제거 되 고 후속 원심 분리 가능한 hepatocytes에서 모두 비 parenchymal 세포 및 비-생활 hepatocyte 밀도 그라데이션 버퍼40,41 사용 42. 현재 연구에서 우리는 기본 hepatocytes에서 단백질 합성의 분석에 대 한 마우스 간 격리 수정된 2 단계 콜라 관류 기술을 보여줍니다.

단백질의 radiolabeling 널리 이용 된다 계량 식 레벨, 이직 률, 방사능44의 탐지의 높은 감도 때문에 단백질43 의 생물 분포 결정 하. 그러나, 방사성 동위 원소를 사용 하 여 매우 제어 연구 상황 및 절차45를 요구 한다. 다른 비 방사능 방법 개발 되었습니다 하 고 점점 더 인기를 얻고 있다. Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질 검출 방법으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 그들 중 하나 이며 사이 아 지 드와 alkyne 그룹46와 같은 휴대 전화 이벤트를 분석 하는 이용 될 수 있는 선택적 항 암 치료 반응에 따라 초기 단백질 합성 및 glycoproteins 수정 아 지 드 그룹의 하위 클래스를 감지 합니다. 초기 단백질 합성에 대 한 L-Azidohomoalanine (L-아 하, 아 지 드 수정 아미노산) 수 metabolically 단백질에 통합 되며 TAMRA 단백질 검출 방법47를 사용 하 여 감지. 기본 마우스 hepatocytes에서이 분석 결과 사용 하 여 우리 초기 단백질 합성 속도 미토 콘 드리 아에서 ATP의 가용성에 밀접 하 게 연결 되어 표시 및 AMPK 활성화 (그림 1).

요약 하자면, 기본 마우스 hepatocytes의 활용 조사 단백질 및 에너지 대사에 중요 한 이며 초기 단백질 합성 측정 경로 개발에 관련 된 생리 적 역할에 대 한 통찰력을 확보 하는 데 유용 하 고 hepatocyte 관련 된 질병의 치료입니다.

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Protocol

이 프로토콜에는 실험실 쥐를 사용 하 여를 포함 되어 있습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 신시내티 아동 병원 의료 센터의 동물 보호 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1입니다. 기본 마우스 Hepatocytes의 격리

  1. 사전 격리 준비
    1. 표 1 및 4 ° C (15 mL/마우스)에서 계속에 설명 된 대로 40% 밀도 그라데이션 버퍼의 450 mL를 준비 합니다.
    2. 표 1 에 설명 된 대로 윌리엄스 매체의 500 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 계속
    3. 표 1 에 설명 된 대로 DMEM의 500 mL를 준비 하 고 얼음 (30 mL/마우스)에 계속.
    4. 표 1 과 물 탕 (40 mL/마우스)에서 42 ° C에서 유지에 설명 된 대로 HBSS (-) 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.
    5. 물 목욕에서 42 ° C에서 30 분 외피와 함께 표 1 에 설명 된 대로 HBSS (+) 0.3 mg/mL와 버퍼의 500 mL 콜라 유형 X 준비 (40 mL/마우스).
    6. 래칭 발 페달에 걸쳐 정 맥 (테타) 관리 튜브를 배치 하 여 및 기포 없이 솔루션을 내 뿜 기의 흐름을 확인 하 여 재 관류 펌프를 설정 합니다.
    7. 워밍업-42에서 튜브 히터° c.
    8. 진정 4 ° c 원심 분리기 기계
  2. 마 취와 관류
    1. 작업 영역 및 펌프 청소.
    2. 철저 하 게 10 분 동안 70% 에탄올을 실행 하 여 펌프 연결 IV 관을 씻어.
    3. 10 분 동안 완전히 DDW와 rinsing 하 여 펌프 연결 4 관에서 잔여 에탄올을 제거 합니다.
    4. 70% 에탄올과 집게와가 위를 닦아냅니다.
    5. 플라스틱 용기와 직접 접촉을 피하기 위해 메쉬 밑 2 mL isoflurane 젖은 거 즈 메쉬 바닥에 마우스를 놓습니다.
    6. 엉덩이 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취의 깊이.
    7. 마 취의 원하는 깊이 도달 하면 마우스를 제거 합니다.
      참고: 마 취 유도 시간의 1 분 이상 수 없습니다.
    8. 코 콘 1 mL isoflurane 젖은 패드는 튜브의 끝에 15 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여 구성 합니다.
    9. 가까이 또는 마우스 콧구멍에서 코 콘을 이동 하 여 마 취의 깊이 제어 합니다.
    10. 복 부 면이 위로 향하도록 작업 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
    11. 마우스의 복 부 지역에 70% 에탄올을 스프레이 한 다음 이빨된 집게 날카로운가 위를 사용 하 여 진 피와 복 막의 큰 가로 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다.
    12. 모든 복 부 장기는 날카로운가 위 이빨된 집게를 사용 하 여 완전히 노출 될 때까지 다음, 복 층의 수직 컷을 확인 합니다.
    13. 작은 이동 및 압력가 면 팁까지 간, 문맥, 그리고 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 마우스의 왼쪽을 향해 큰 창 자 명확 하 게 노출 됩니다.
    14. 24 G 카 테 터에 삽입 IVC 오른쪽 신장 정 맥을 분기에 신중 하 게 IVC 및 출혈의 부상을 피하기 위해 악수 하지 않고.
      참고: 경우 출혈 IVC로 카 테 터를 삽입 하는 동안, 그럼 당신은 하려고 한다 포털 정 맥에 새로운 카 테 터를 삽입.
    15. 카 테 터의 바늘을 제거 하 고 IVC, 아웃 되지 않도록 정 맥의 위치 제어 다음 24 G 정 관류 튜브 커넥터를 사용 하 여 연결.
      참고:은 재 관류를 시작 하기 전에 공기 방울의 존재를 피하십시오.
    16. 4 mL/min의 유량에 따뜻한 HBSS (-)와 함께 간의 관류를 시작 하 고 신속 하 게가 위를 사용 하 여 내부 혈액 밖으로 배출 하는 비장 정 맥을 잘라.
      참고:는 cannulation 성공적 이면 간 간 맥 IVC에서 버퍼의 혈 류 분포 때문에 희게 시작 됩니다. 포털 정 맥 비장 하 고 우수한 mesenteric 정 맥;의 조합에 의해 형성 된다 따라서, 그것은 이후 큰 간에서 원심 비장 정 맥을 잘라 꽤 안전입니다.
    17. 계속 따뜻한 HBSS (-)의 35 mL를 관류 한다.
      참고: 간이이 단계에서 경우는 관류, 적절 한 색상과 마우스 마 취에서 아직 살아 창백 됩니다.
  3. 소화 및 추출
    1. HBSS (+)의 따뜻한 35 mL와 4 mL/min의 유량에 콜라 유형 X를 포함 한 마우스 간 perfuse
    2. 몇 분 마다 10 ~ 집게를 사용 하 여 비장 정 맥을 클램프 HBSS 간 모든 해 부 부분으로 확산 (+)의 전체 볼륨을 허용 하는 s.
      참고: 간 버퍼 정체로 인해 비장 정 맥을 클램핑 후 팽창 하기 시작 합니다.
    3. 100 mm 페 트리 접시 관류 프로세스의 끝에에 콜라 종류 x 준비 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 붓으십시오.
    4. 간으로 혈액의 역류를 방지, 집게, 여 쓸 개를 제거 하 고 혈액을 제거 하려면 종이 타월로 부드럽게 간 다음 닦아 펌프를 중지 하기 전에 시체의 나머지 부분에서 perfused 간 차단.
    5. 준비 된 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 간 전송 하 고 똑바로 밀고 집게를 사용 하 여 부드럽게 간 캡슐을 제거 합니다.
      참고: 간 캡슐 그 간 둘러싼 결합 조직의 얇은 층 이다.
    6. 집게를 사용 하 여이 신중 하 게 분산 parenchymal 조직. 15 mL을 추가 찬 DMEM 배양 접시에.
      참고: 매체가 바뀝니다 흐린 parenchymal 세포 인 간 잘 소화 하는 경우.
    7. 찢어진된 간 매체에 잔여 parenchymal 세포를 추가 하는 또 다른 15 mL를 부드럽게 흔들어 세포의 나머지를 페 트리 접시에 차가운 DMEM.
    8. 50 mL 원뿔 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 녹은 간 DMEM 전송 및 얼음에 계속.
  4. 정화
    1. 60 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 신중 하 게는 상쾌한 진공 포부에 의해 제거 하 고 10 ml DMEM 펠 릿 resuspend.
    2. 40% 밀도 그라데이션 버퍼, 위에 얇은 층으로 resuspended 펠 릿을 추가 하 고 4에서 800 g x 브레이크 없이 10 분에 원심° c.
    3. 하위 레이어의 하지 하지만 상쾌한 상위 레이어 (DMEM) 등 중간 레이어 (죽은 또는 비 parenchymal 세포)를 조심 스럽게 제거 (펠 렛: 기본 parenchymal hepatocytes).
    4. 2-3 mL 윌리엄의 중간 e, 1 차 셀을 resuspend 하 고 튜브의 벽에서 죽은 세포의 오염을 피하기 위하여 새로운 50 mL 튜브에 전송.
    5. 7-8 mL 윌리엄의 매체 E를 추가 하 고 부드럽게, 혼합 하 고, 4 ° c.에 1 분 동안 800 x g에서 원심
    6. 진공 포부에 의해 상쾌한을 조심 스럽게 제거 하 고 다시 윌리엄의 매체 E (에 따라 펠 릿의 크기)의 10, 20 또는 30 mL와 펠 릿 resuspend.
    7. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산.
    8. 윌리엄의 매체 E와 종자, 37에서 인큐베이터에 접시를 계속° C 2-3 h는 다음 매체 with10% FBS DMEM 매체 대체 방지 죽 었 거 나 부착 되지 않은 세포를 제거 하 고 37 ° c.에 야간 보육에 대 한
    9. 다음 날, 주 마우스 hepatocytes 실험적인 사용을 위해 준비 되어 있다.

2. 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 분석 결과 초기 단백질 합성의 검출에 대 한

  1. 신진 대사 라벨
    1. (전처리) 37 ° C 따뜻한 PBS 가진 기본 hepatocytes를 두번 세척 하 고 세포질 메티오닌 고갈 30 분 메티오닌 무료 DMEM 매체 보유 추가.
      참고: L-Azidohomoalanine, 아미노산은 메티오닌을 아날로그, 통합 될 수 있는 단백질으로 세포 단백질의 생 합성 중 세포질 메티오닌의 고갈 먹이 향상 시킬 것입니다 그렇게 azido moiety 및 법인 포함 L-Azidohomoalanine 교양된 기본 hepatocytes의 새로 합성된 단백질으로.
    2. (치료) 37 ° c 워시 기본 hepatocytes PBS를 두 번 따뜻하게 하 고 4-6 h 25 μ M AHA (L-Azidohomoalanine)와 메티오닌 무료 DMEM 매체를 추가 합니다.
    3. 초기 단백질 표정 수준에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 아 하의 존재에 4-6 h에 대 한 매체에서 어떤 특정 화학 물질 (즉, 10 μ M로 테 논) 추가 합니다.
    4. 부 화, 후 진공 포부에 의해 매체를 제거 하 고 씻어 차가운 PBS 가진 기본 hepatocytes 세 번.
    5. 접시 200 μ 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 얼음에 15-30 분 동안 품 어 다음 접시를 기울기 하시고 전체 세포 lysate 1.7 mL 튜브에 하십시오.
      참고: 당신은 그 세포 lysate 셀 수확 하는 동안 매우 끈 적는 관찰 해야 한다.
    6. 5 얼음에 세포 lysate를 sonicate 세 번 프로브 sonicator solubilize 단백질 및 DNA 분산 사용 하 여 s.
    7. 소용돌이 5 분, lysate 셀 세포 lysate에서 21,130 x g 4 oC에서 10 분 원심 하 고 맑은 상쾌한 새로운 튜브로 전송. 두 번 단백질 농도 측정 합니다.
      참고:이 단계에서 단백질 견본 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 2 주 동안 그들은 즉시 사용 하지 않는 경우.
  2. 아 지 드 수정 초기 단백질 라벨
    1. 60 μ의 구성 요소 (A) (B)를 추가 하 여 구성 요소 (A + B)를 준비 합니다.
      참고: 솔루션 (A)를 (B) 구성 요소를 추가한 후 색상에서 밝은 분홍색으로 변합니다.
    2. 버퍼 (D)와 (E)에 따라 준비 하는 프로토콜.
    3. 20-40 μ g 세포 lysate 고 추가 반응 버퍼 x 50 μ 2 (구성 요소 A + B), 다음 DDW 5 소용돌이 추가 하 여 80 μ에 볼륨 조정 s.
    4. 추가 5 μ CuSO4 (구성 요소 C), 그리고 5와 동 s.
    5. 5 μ 반응 버퍼 첨가제 1 (갓된 구성 D), 그리고 5 s 소용돌이 3 분 대기를 추가 합니다.
    6. 10 μ 재구성 반응 버퍼 첨가제 2 (전자 부품), 5 s에 대 한 다음 소용돌이 및 다중 회전 기계를 사용 하 여 4 ° C에서 20 분에 대 한 회전 예제를 추가 합니다.
      참고: 솔루션 구성 요소 (E)를 추가한 후 밝은 오렌지 컬러로 바뀝니다. 샘플은 회전 하는 동안 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
    7. 추가 300 μ 메탄올과 소용돌이 5 s, 75 μ 클로 프롬 및 5 소용돌이 추가 s, 다음 200 μ DDW와 5 소용돌이 추가 s.
    8. 21,130 g x 4에서 샘플 원심° C 5 분, 다음 수성 상쾌한 삭제 하 고 펠 릿을 유지.
    9. 250 μ 메탄올 튜브, 소용돌이, 그리고 21,130 x g. 에서 5 분 동안 다시 스핀에 추가
    10. 상쾌한, 삭제 후 보풀 조직으로 샘플을 커버 하 고 실 온에서 15 분 동안 건조를 펠 릿을 허용.
  3. 페이지 분석 및 서 부 럽
    1. 10 분 동안 열 블록을 사용 하 여 버퍼 없이 β-mercaptoethanol, 10 분 동안 소용돌이, 70 ° C에서 열 로드의 20 μ에 펠 릿 solubilize 그런 다음 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 탐지에 대 한 10 %SDS 젤 (1.5 m m)로 샘플을 로드.
    2. 초기 단백질의 정확한 정량에 대 한 가변 모드 레이저 스캐너를 사용 하 여 AHA 신호를 감지 합니다.
    3. 15 분 동안 DDW와 젤을 씻어.
    4. 그런 다음 컨트롤으로 총 단백질을 검출 하기 위하여 15-60 분에 대 한 빠르고 민감한 coomassie 염료 시 약 10 %SDS 젤 얼룩.
    5. 제 1-2 h DDW와 젤 얼룩 하 고 UV 형광 영상 장치를 사용 하 여 이미지를 획득.

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Representative Results

기본 마우스 hepatocytes 격리 약 20 x 106 총 셀/마우스의 수율에서 결과. 조직학, 라이브 및 연결 된 기본 hepatocytes 표시 다각형 또는 전형적인 육각형 모양에 명확 하 게 설명 막 경계 후에 24 시간 보육 (그림 2).

고립 된 세포 주 hepatocytes 인지를 확인 하려면 우리는 고립 된 기본 마우스 hepatocytes (PMHs), 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 마우스는 셀 라인 (Hepa 1-6), 및 마우스 간은 알 부 민 단백질의 표현 수준 비교. 알 부 민 단백질 식 기본 마우스 hepatocytes에 마우스 간을 검색 되었습니다 하지만 MEFs 또는 Hepa에 감지 했다 1-6 셀 (그림 3).

여부를 확인 간 AMP 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (AMPK) 활성화에로 테 논의 효과 셀 자치, 우리는 기본 hepatocytes 야생-타입 마우스의 간에서 고립의 시간에 따른 응답을 비교. 기본 hepatocytes 치료 없이 또는 0, 4 또는 6 h 10 μ M로 테 논. AMPK T172 비슷합니다에 인 산화 증가 수준에 의해 감지로 테 논 치료 이러한 세포에서 AMPK 활성화, 튼튼하게 유도 본 vivo에서48 (그림 4).

직접 측정 하려면 기본 hepatocytes에서 초기 단백질 합성에로 테 논 치료의 효과, 단백질 5 h 이상으로 비 방사성 AHA의 설립 선택적 화학 결 찰 반응 분석 결과 수행 하 여 평가 되었다. 5 h 10 μ M로 테 논 치료 치료 기본 hepatocytes (그림 5)에 비해 처리 기본 hepatocytes에서 초기 단백질 합성에 깊은 억제 효과 했다.

Figure 1
그림 1: 그림 hepatocytes 절연, 서쪽 오 점 분석 및 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 절차 기본 마우스의 단계를 보여줍니다.

Figure 2
그림 2: 단계 대조 기본 마우스 hepatocytes의 형태학 이미지. 고립 된 기본 hepatocytes의 대표 사진 도금 후 2, 12, 24, 그리고 72 h에 인수 했다. 바 규모 = 100 μ m.

Figure 3
그림 3: 서쪽 오 점 분석 기본 마우스 hepatocytes에 알 부 민 단백질 식. 서쪽 오 점 분석에서 기본 마우스 hepatocytes (PMHs), 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), Hepa 1-6 셀 및 마우스 간 10 μ g 단백질/레인 로드와 함께 실시 했다. 일방통행 ANOVA 보여주었다 PMHs에 중요 한 알 부 민 단백질 표정 MEF 또는 Hepa에 비해 1-6 셀. 값은 수단 ± SEM의 그룹 크기 (n = 3). P, #P < 0.001 vs. Hepa 1-6 또는 MEFs, 각각. $ P < 0.001 vs. 간 lysate입니다.

Figure 4
그림 4:로 테 논 처리 기본 마우스 hepatocytes에서 AMPK의 인 산화의 유도. 야생-타입 마우스 간에서 주 hepatocytes AMPK의 0, 4 또는 6 헤 인 산화 수준 서쪽 blotting에 의해 발견 된 및 β-말라 로드 제어로 사용 되었다 10 μ M로 테 논으로 치료 했다 (10 μ g 단백질은 로드/레인). 반복된 측정 2-방법은 ANOVA 치료의 치료 기본 hepatocytes에 비해 인 AMPK 단백질 표정에 상당한 증가 발생 했다. 값은 수단 ± SEM의 그룹 크기 (n = 3). P < 0.001 vs. 치료 hepatocytes입니다.

Figure 5
그림 5:로 테 논 치료 후 간 초기 단백질 발현의 감소. 야생-타입 마우스 간에서 주 hepatocytes 초기 단백질 합성 분석 결과 비 방사성 AHA 방법으로 다음 5 h 10 μ M로 테 논으로 대우 되었다. 단백질 합성 수준 TAMRA 형광을 검출 하는 레이저 스캐너에 의해 평가 됐다. 이 분석 결과 대 한 총 단백질 로드 수준은 coomassie 염료 시 약에 의해 감지 되었다.

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Discussion

비록 여러 불멸 하 게 간 셀 라인 제안 되 고 간 기능49,50,,5152를 조사 하는 데 사용, 이러한 세포 일반적으로 중요 하 고 근본적인 부족 알 부 민 (그림 3)의 식 등 정상적인 hepatocytes의 기능. 그것은 널리 인식, 따라서 기본 hepatocytes 활용 하는 것이 간 생리학, 문화, 경작 하 고 이러한 세포의 유지의 전에 불구 하 고 신진 대사 검사를 위한 중요 한 옵션입니다. 여기, 우리의 연구는 상대적으로 편리 하 고 효율적인 방식으로 2 단계 콜라 메서드를 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 성공적인 절연을 자세히 설명 합니다. 이러한 절차를 통해 문화 안에 고립 된 기본 hepatocytes의 대부분 그들의 신진 대사 기능 및 형태 안정성을 유지 하 고 단백질을 포함 하 여 간 기능을 조사 하 고 사용할 수 있다 물질 대사, gluconeogenesis, 미토 콘 드리 아 호흡 하 고입니다.

격리 된 기본 hepatocytes 간 에너지 대사의 분자 메커니즘을 검사 하는 강력한 실험 도구는. 로 테 논 복잡 한 전자 전송 체인 나 미토 콘 드리 아에서 활동 방해 하 고 AMPK (그림 4)의 활성화에 의해 입증으로 ATP53의 제한 된 합성 산화 인 산화를 막는다. AMPK 활성화로 테 논 유도 에너지 결핍 스트레스를 보상 하기 위하여 동화 작용 메커니즘을 억제 하는 세포 적응 응답을 트리거합니다. 이 조건, 우리는 성공적으로 방사성 비, 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 TAMRA 단백질 검출 방법 (그림 5)와 함께 사용 하 여 기본 hepatocytes에서 초기 단백질 합성 레벨의 급격 한 감소 감지. 이러한 결과 기본 hepatocytes에 적절 한 단백질 합성에 미토 콘 드리 아에서 에너지 공급의 중요성을 확인합니다. 이러한 기술은 약물 행동 또는 건강 하 고 질병의 간장 단백질 합성의 맥락에서 관련 치료 농도에서 독성에 관한 정보를 제공 하기 유용 합니다. 또한, 이러한 기술을 특정 경로 조절 단백질의 역할을 조사 하기 위한 적용 이며 기본 hepatocytes에서 고립 된 유전자를 분석 하 여 에너지 대사 조작 쥐.

일반적으로, 낮은 수율 및 세포 생존 능력 기본 hepatocytes의 사용의 주요 단점이 있습니다. 이러한 문제는 초기 cannulation, HBSS, 콜라, 또는 긴-관류 시기의 부적절 한 농도와 세척 부족 등 여러 가지 이유로 인해. 우리의 현재 프로토콜 이러한 여러 단계를 최적화 하 고 높은 수율 및 20 백만/간/성인 쥐 주위 실행 가능한 세포를 얻고 리드. 특히, 2 개의 중요 한 단계가 있다: 하나는 온도 적절 한 콜라 농도까지 간 절단, 캐 뉼 러 삽입에서 15-20 분에 효율적으로 간 실질 소화와 소화 버퍼의 유량을 조정 하는 고 또 다른 건강 한 상태에 있는 세포를 유지 하기 위하여 설명 하는 대로 신속 하 게 처리 하는 collagenases 샘플을 처리 하는. 많은 게시 된 데이터에서 48 h 시간 내 격리 hepatocytes 기반 연구가 실시 되어, 하는 동안 기본 hepatocytes 우리의 절차와 격리 견딜 장기 문화 (그림 2). 이러한 세포와 우리 보여 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 분석 결과 통해 간 초기 단백질 합성의 강력한 라벨 프로토콜에 AHA와 농도 및 부 화 시간 다시 다른 생물에 최적화 할 수 있습니다 비록 셀의 조건 (예: 대 생리 병리학, 야생-타입 유전자 변형 또는 녹아웃 대/셀 아래로).

요약 하자면, 우리는 초기 단백질 합성에 대 한 기본 마우스 hepatocytes 방사성 비 방식으로 분석 하는 절차를 설립 했다. 이러한 세포는 미토 콘 드리 아 스트레스에 잘 반응 하 고 AMPK 통로의 활성화와 단백질 합성의 억제를 전시. 따라서, 이러한 격리 hepatocytes 조사 간장 단백질 및 에너지 신진 대사 vivo ex의 이상에 대 한 중요 한 모델이 있습니다.

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Disclosures

저자 들은 관심의 없습니다 충돌을 나타냅니다.

Acknowledgments

우리가 그들의 과학적인 입력 및 토론에 대 한 박사 Joonbae 서 장 훈과 비비 안 화 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (R01DK107530)에 의해 지원 되었다. T.N. 일본 과학과 기술 기관에서 프레스 토에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부는 소화 질병 연구 핵심 센터 신시내티에 대 한 NIH (P30DK078392)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24 G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple - Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps

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의학 문제 140 기본 마우스 hepatocytes 초기 단백질 합성 AMPK 신호로 테 논 L-Azidohomoalanine 비 방사능 메서드
비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연
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