Summary
Здесь мы представляем протокол для изоляции здоровых и функциональных мыши гепатоцитов. Инструкции для обнаружения синтеза гепатопротеинов зарождающейся нерадиоактивные маркировки субстрата были предоставлены помочь понять механизмы, лежащие в основе синтеза белка в контексте гомеостаза энергии метаболизма в печени.
Abstract
Гепатоциты Паренхиматозный клетки печени и заниматься несколько метаболические функции, в том числе синтез и секрецию белков, необходимых для системного энергетического гомеостаза. Основная гепатоцитов, изолированных из мышиных печени являются ценные биологические инструментом для понимания функциональных свойств или изменений, происходящих в печени. Здесь мы описывают метод для изоляции и культуры мыши гепатоцитов, выполняя двухэтапный метод коллагеназы перфузии и обсудить их использования для изучения метаболизма белков. Печень взрослой мыши последовательно увлажненную с этиленгликоль бис tetraacetic кислоты (EGTA) и коллагеназы, следуют изоляции гепатоцитов с буфером градиента плотности. Эти изолированных гепатоцитов жизнеспособной на культуре тарелки и сохранить большинство обеспеченных характеристики гепатоцитов. Эти гепатоцитов могут использоваться для оценки белкового обмена, включая синтез зарождающейся белка с нерадиоактивных реагентов. Мы покажем, что изолированных гепатоцитов легко контролируются и включать более высокие качество и объем стабильности синтеза белка, связаны с энергии метаболизма, используя реакции перешнуровки химио селективный с протеином тетраметилродамина (ТАМРА) метод обнаружения и западных blotting анализы. Таким образом этот метод является ценным для расследования синтеза гепатопротеинов зарождающейся, связаны с энергетического гомеостаза. Следующий протокол изложены материалы и методы для изоляции высокого качества первичных мыши гепатоцитов и выявление зарождающихся белкового синтеза.
Introduction
Белок является важным элементом питания и примерно 50% от сухого веса тела человека состоит из белков, которые имеют несколько биологических черт и функции1. Следовательно синтез белка является одним из наиболее энергии много событий и изменения в метаболизме белков высоко связан с развитием заболеваний, включая болезни обмена веществ2,3,4. В печени биосинтез белка приходится приблизительно 20 – 30% от общей энергии потребления5,6. Кроме того, функция белки не только пассивно или строительные блоки печени, но также активное посредничество сигнал факторы внутриклеточно или внеклеточно регулировать системного метаболизма7. Например, снижение уровня сывороточного альбумина, который синтезируется и выделяется печени и наиболее распространенных белка в плазме8, увеличивает риск типа 2 диабет развития9,10, 11, тогда как более высокой концентрации сывороточного альбумина защитные против развивающихся метаболический синдром12. Кроме того нарушается или нарушение секреторной или мембраны граница печени белков, которые модулируют гомеостаза холестерин, липопротеиды, LDLR и LRP1, может привести к развитию сопротивление инсулина, гиперлипидемия, или атеросклероза 13. Таким образом, Идентификация молекулярных патофизиологических механизмов, которые участвуют в нарушение метаболизма белка в печени и ее связанные метаболических осложнений может быть полезным для обнаружения Роман фармакологической подходы к задержать наступление или лечения метаболических заболеваний, таких как сопротивление инсулина, диабет и безалкогольные жирная печень.
Синтез белка тесно связан с состоянием клеточной энергии (например, формирование одной облигации пептид во время удлинения шага синтеза белка требует 4 Фосфодиэфирная облигации14) и регулируется молекулярные пути, которые чувствуют и внутри cellular наличия питательных веществ15,16. Активирована AMP протеин киназы (AMPK) — один из датчиков внутриклеточных энергии, которые поддерживают энергетического гомеостаза17. AMPK активируется при клеточном уровнях энергии снижаются, AMPK и его целевых субстратов функция стимулирования катаболические пути и подавляют анаболических процессов, включая синтез белков18,19. Регуляции синтеза белка при посредничестве фосфорилирование несколько факторов перевод и рибосомных белки20. Следует отметить млекопитающих цель rapamycin комплекс 1 (mTORC1), основной движущей силой синтеза белка, является одной из основных целей AMPK21. Активации пути mTORC1 повышает клеточный рост и распространение путем стимулирования белка перевод и autophagy20,21. Таким образом вполне логично, что активация AMPK может ингибировать синтез белка mTORC1-опосредованной22. Действительно активация AMPK противодействует и непосредственно фосфорилирует mTORC1 на треонин остатков 2446 (2446чет) приводит к инактивации23 и подавление биосинтеза белка24. Кроме того AMPK косвенно может ингибировать mTORC1 функции фосфорилирования и активации клубневые склероз комплекс 2 (TSC2)25 -вверх регулятор mTORC1 сигнальный Каскад. Короче говоря, регуляции этих путей в печени часто связан с развитием метаболических заболеваний и поэтому крайне необходимо создать эффективные инструменты экспериментально расследовать роль этих путей регулирования энергии и метаболизм белков в гепатоцитах.
Есть сильнее сходство между функциональными свойствами изолированных гепатоцитов первичной и гепатоцитов в естественных условиях чем с в vitro печени производные клеток линии26,27,28. Было доказано, что первичного человека гепатоцитов разделяют 77% сходства с этим биопсии печени, тогда как HepG2 клеток, которые являются высокодифференцированных раковых клеток печени и широко используется для изучения функции печени, отображения менее 48% в контексте Экспрессия генов профилей29. Таким образом использование первичных гепатоцитов, а не увековечен культуры клеток, имеет жизненно важное значение в расследовании функции печени и физиологии, и доступны несколько протоколы изоляции и культуры первичной гепатоцитов особенно от крыс30,31. Хотя гепатоцитов крыс полезны с относительно более высокой доходности клеток, мыши гепатоциты имеют больший потенциал во многих научных аспектах благодаря широкой доступности генетически модулированного мышей. Однако, есть несколько технических проблем в изоляции здоровым и обильные первичной гепатоцитов от мышей для сотовых и молекулярно-на основе оценок: во-первых, очень трудно справиться канюля вставки к perfuse печени с буфера реагентов из-за малого и тонкий мыши воротной вены или нижней полой вены; Во-вторых более длительное время манипуляции клеток во время изоляции может вызвать сокращение клеток и их качество; в-третьих, неферментативного Механическое разделение методы могут привести к серьезному повреждению и производить низкая доходность жизнеспособных изолированных гепатоцитов первичной32,33. В 1980-х коллагеназа перфузии техника была введена для изоляции гепатоцитов из печень животных34. Этот метод основан на коллагеназы перфузии печени35,,3637, настой печени с кальция хелатором решения38,39, ферментативного пищеварения и механический диссоциации печеночной паренхимы35. На первом шаге мыши печени является увлажненную с кальция [Ca2 +] Бесплатная буфер, содержащий [Ca2 +] хелатором (Этилендиамин tetraacetic кислота, ЭДТА). На втором шаге мыши печени является увлажненную с буфером коллагеназы содержащих для гидролизуют сотовых внеклеточная матрица взаимодействия. В отличие от буфер, используемый на шаге 1, требуется наличие ионов [Ca2 +] в буфере второй шаг для деятельности эффективной коллагеназы, после чего усваивается печень должна быть далее осторожно и механически разделяются с помощью щипцов между печеночная капсулу и паренхиматозных тканях. Наконец соединительной ткани удаляется путем фильтрации, и последующим центрифугированием отделяет жизнеспособных гепатоцитов из не Паренхиматозный клеток, так и неживых гепатоцитов с использованием плотности градиента буфера40,41 ,42. В настоящем исследовании мы покажем перфузии коллагеназы модифицированных двухэтапный способ изолировать первичной гепатоцитов из печени мыши для анализа синтеза белка.
Radiolabeling белков широко используется для количественной оценки уровни выражения, текучесть кадров и определить биологические распределение43 белков из-за высокой чувствительность обнаружения радиоактивности44. Однако использование радиоактивных изотопов требует высоко контролируемых исследований обстоятельств и процедур,45. Альтернативные Нерадиоактивные методы были разработаны и получили все большую популярность. Реакции перешнуровки химио селективный с методом обнаружения белка тетраметилродамина (ТАМРА) является одним из них и основывается на химио селективные реакции между азид и алкины группы46, который может быть использован для анализа сотовой событий, таких как Обнаружение зарождающейся белкового синтеза и подклассы гликопротеинов, изменение с азидом группой. Для зарождающейся белкового синтеза L-Azidohomoalanine (L-AHA, аминокислота азид модифицированные) можно метаболически включены в белки и обнаружить с помощью метода обнаружения ТАМРА белка47. Используя этот assay мыши гепатоцитов, мы показываем, что тариф синтеза зарождающейся белок тесно связана с наличия СПС от митохондриальных и AMPK активации (рис. 1).
В целом, использование первичных мыши гепатоцитов имеет решающее значение для изучения метаболизма белка и энергии и количественной синтез новых белков является ценным для получения понимание Физиологическая роль путей, относящихся к развитию и лечение заболеваний, связанных с гепатоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол содержит использования лабораторных мышей. Уход за животными и экспериментальной процедуры выполнялись в соответствии с процедурами, утвержденными животных ухода комитетов Цинциннати детей больница медицинского центра.
1. изоляция первичного мыши гепатоцитов
- Подготовка предварительной изоляции
- Подготовьте 450 мл 40% плотности градиента буфера, как описано в таблице 1 и хранить при 4 ° C (15 мл/мышь).
- Подготовка 500 мл среды Уильямс, как описано в таблице 1 и хранить при 4 ° C.
- Подготовка 500 мл DMEM, как описано в таблице 1 и держать на льду (30 мл/мышь).
- Подготовка 500 мл буфера HBSS (-), как описано в таблице 1 и держать при 42 ° C на водяной бане (40 мл/мышь).
- Подготовка 500 мл HBSS (+) буфер с 0.3 мг/мл коллагеназы типа X, как описано в таблице 1 с 30 минут инкубации при 42 ° C на водяной бане (40 мл/мышь).
- Настройка перфузионного насоса, поместив внутривенного (I.V) администрация трубы через защелкой педали и проверив поток промывочного раствора без пузырьков воздуха.
- Разминка трубки отопителя в 42° C.
- Охладьте вниз центрифуги машины до 4 ° C.
- Анестезия и перфузии
- Чистота области работы и насоса.
- Промойте насос подключен трубки IV, запустив 70% этанол тщательно за 10 мин.
- Удаление остаточного этанола из насоса подключен трубки IV промыв с DDW полностью за 10 мин.
- Протрите ножницы и щипцы с 70% этиловом спирте.
- Поместите указатель мыши в пластиковый контейнер с сеткой внизу и изофлюрановая пропитанной марлей 2 мл под сеткой, чтобы избежать прямого контакта.
- Ослов глубины анестезии на педаль рефлекс (фирмы мыс сжатие).
- Удаление мыши, когда он достиг желаемой глубины анестезии.
Примечание: Время индукции анестезии должно быть не более 1 мин. - Постройте носовой конус с помощью конической трубки 15 мл с 1 мл изофлюрановая пропитанной pad, толкнул к концу трубки.
- Контроль глубины анестезии, перемещая носовой конус ближе или дальше от мыши ноздри.
- Поместите курсор мыши на рабочей платформе с вентральной стороне, обращенной.
- Спрей на 70% спирте над брюшной области мыши, а затем открыть брюшной полости, сделав большой поперечный разрез дермы и брюшины с помощью острых ножниц и зубчатый щипцами.
- Затем сделайте вертикальный разрез брюшной слои до тех пор, пока все органы брюшной полости полностью предоставляются с помощью острых ножниц и зубчатый щипцами.
- Маленький шаг и толстой кишки к левой стороне мыши с наконечником из хлопка до печени, портальной вены и нижней полой вены (IVC) явно подвергаются.
- Вставьте 24 G катетер IVC только на бифуркации с правом почечной Вены тщательно без пожимая руки, чтобы избежать травм МКВ и кровотечения.
Примечание: Если кровотечение возникает при вставке катетер в МКВ, то вы должны попытаться вставить новый катетер в Вену портал. - Удаление иглы катетера и контролировать положение канюля, чтобы избежать попадания из МКВ, затем подключите 24 G канюля с перфузии трубки с помощью соединителя.
Примечание: Избегайте наличия пузырьков воздуха перед началом перфузии. - Запустите перфузии печени с теплой HBSS (-) при скорости потока 4 мл/мин и отрезать селезеночной вен быстро, чтобы слить внутреннего крови с помощью ножниц.
Примечание: Если катетеризации является успешным, печень начнет бланшировать из-за распределения обратного потока буфера от IVC печеночных вен. Воротной вены формируется путем объединения селезеночной и Улучшенный брыжеечных вен; Таким образом это довольно безопасно отрезать селезеночной вены, так как он большой и дистальной из печени. - Продолжать перфузии с 35 мл теплой HBSS (-).
Примечание: Печень станет бледно цвета при адекватной перфузии, и мышь еще жив под наркозом на данном этапе.
- Пищеварение и добыча
- Perfuse мыши печени с теплой 35 мл HBSS (+) включая коллагеназы типа X со скоростью потока 4 мл/мин.
- Каждые несколько минут, зажим селезеночной вен с помощью щипцов для ~ 10 s разрешить весь объем HBSS (+) для диффузного во все анатомические части печени.
Примечание: Печень начинает набухать после пережатия селезеночной вены из-за перегруженности буфера. - Налейте 5 мл подготовленные теплым HBSS (+) с коллагеназы типа X 100 мм Петри в конце процесса перфузии.
- Отрежьте перфузии печени от остальной части тела перед остановкой насос, чтобы избежать обратного потока крови в печени, удаления желчного пузыря, щипцов, а затем протрите печени нежно с бумажным полотенцем для удаления крови.
- Передать печени Петри, которая содержит 5 мл подготовленные теплым HBSS (+) и удаления печени капсула, аккуратно с помощью прямой наконечником щипцы.
Примечание: Капсулы печени является тонкий слой соединительной ткани, что окружающие печени. - Разогнать Паренхиматозный тканей тщательно, используя пинцет. Добавить 15 мл холодной среде DMEM на Петри блюдо.
Примечание: Средство превратит облачно благодаря Паренхиматозный клетки если печени хорошо усваивается. - Встряхнуть разорванный печени осторожно, чтобы выпустить остаточное Паренхиматозный клетки в среду и добавить еще один 15 мл холодной DMEM на Петри блюдо для получения остальной части клетки.
- Передача DMEM с растворенными печени через 100 мкм ячейки сита в 50 мл Конические трубки и держать во льду.
- Очистка
- Центрифуга суспензию клеток на 60 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, тщательно удалить супернатант, вакуум-аспирации и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл DMEM.
- Добавить ресуспензированы гранулы как тонким слоем на вершине 40% плотности градиента буфер и центрифуги на 800 x g 10 мин без тормозов в 4° C.
- Тщательно удалить супернатант, включая верхний слой (DMEM) и средний слой (мертвых или не Паренхиматозный клетки), но не нижнего слоя (гранулы: первичный Паренхиматозный гепатоцитов).
- Ресуспензируйте Главные ячейки с 2 – 3 мл Уильям средних E и передать новый Тюбик 50 мл, чтобы избежать загрязнения мертвых клеток на стенке трубки.
- Добавление 7-8 мл Уильям среднего E, осторожно перемешать и центрифуги на 800 x г за 1 мин при 4 ° C.
- Тщательно удалить супернатант, вакуум-аспирации и затем Ресуспензируйте Пелле снова с 10, 20 или 30 мл среды E Уильяма (в зависимости от размера гранул).
- Подсчет ячеек с помощью счетчика автоматизированные ячейки.
- Семена с средних Уильяма Е, Держите пластины в инкубаторе 37° C в течение 2-3 ч, затем заменить средний with10% среднего FBS DMEM с анти анти для удаления мертвых или неприсоединенной клеток и для ночи инкубации при температуре 37 ° C.
- На следующий день мыши гепатоцитов готовы для экспериментального использования.
2. химио селективный лигирование реакции Assay для обнаружения зарождающейся белкового синтеза
- Метаболические маркировки
- (Предварительная обработка) Вымойте первичной гепатоцитов с 37 ° C теплой PBS дважды и добавить запасы метионин бесплатно DMEM среднего за 30 мин до разрушающим цитоплазматических метионина.
Примечание: L-Azidohomoalanine, аминокислоты и аналого-метионина, содержит azido части молекулы, которые могут быть включены в белков во время биосинтеза клеточных белков, так что истощение цитоплазматических метионина повысит кормления и включение от L-Azidohomoalanine в вновь синтезируемых белков культивировали первичной гепатоцитов. - (Лечение) Мойка первичного гепатоцитов с 37 ° C теплая PBS дважды и добавить средство DMEM метионин бесплатно с 25 мкм AHA (L-Azidohomoalanine) для 4-6 ч.
- Добавьте любые конкретные химические (т.е. 10 мкм ротенон) в средстве для 4-6 ч в присутствии Ана для того, чтобы изучить ее влияние на уровнях выражения протеина нарождающейся.
- После инкубации удалите средство, вакуум-аспирации и мыть первичной гепатоцитов с холодной PBS три раза.
- Добавить 200 мкл буфера lysis к пластине и Инкубируйте 15-30 минут на льду, затем наклонить тарелку и принимать клеточных lysate в 1,7 мл трубку.
Примечание: Вы должны соблюдать что lysate клетки очень важно во время сбора урожая клеток. - Sonicate lysate клетки на льду для 5 s три раза с помощью зонда sonicator чтобы солюбилизировать протеины последнего и дисперсных ДНК.
- Вихревой ячейки lysate за 5 мин, центрифуга lysate на 21,130 x g 10 мин на 4 oC ячейки, а затем передать ясно супернатант в новой трубки. Измерьте концентрацию белка дважды.
Примечание: На данном этапе, образцы протеина могут храниться при температуре-20 ° C в течение двух недель если они не используются немедленно.
- (Предварительная обработка) Вымойте первичной гепатоцитов с 37 ° C теплой PBS дважды и добавить запасы метионин бесплатно DMEM среднего за 30 мин до разрушающим цитоплазматических метионина.
- Маркировка азид модифицированные зарождающейся белка
- Подготовка компонентов (A + B), добавив 60 мкл компонент (A) компонент (B).
Примечание: Решение превращается в яркий розовый цвет после добавления компонента (A) (B). - Подготовьте буферов (D) и (E) в соответствии с протоколом.
- Возьмите 20 – 40 мкг клеток lysate и добавьте 50 мкл 2 x буфер реакции (компонент A + B), затем отрегулируйте громкость до 80 мкл, добавляя DDW и вихревые для 5 s.
- Добавить 5 мкл CuSO4 (компонент C) и вихрь 5 s.
- Добавьте 5 мкл буфера реакции добавка 1 (свежеприготовленные компонента D), затем Вортекс для 5 s и ждать 3 мин.
- Добавьте 10 мкл воссоздана реакции буфера добавка 2 (компонент E), затем Вортекс для 5 s и поворот образцов для 20 минут при температуре 4 ° C с помощью Мульти-ротатор машины.
Примечание: Решение превращается в яркий оранжевый цвет после добавления компонента (E). Образцы должны быть защищены от света во время вращения. - Добавить 300 мкл метанола и вихревые для 5 s, добавьте 75 мкл хлороформе и вихревые для 5 s, затем добавить 200 мкл DDW и вихревые для 5 s.
- Центрифугуйте образцы на 21,130 x g и 4° C за 5 мин, затем отменить водный супернатант и держать гранулы.
- Добавить 250 мкл метанола в трубки, вихрь и спина снова за 5 минут на 21,130 x g.
- Отменить супернатанта, затем накрыть образцы безворсовой салфеткой и гранулы высохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Подготовка компонентов (A + B), добавив 60 мкл компонент (A) компонент (B).
- Анализ страницы и Западный blotting
- Солюбилизировать последнего Пелле в 20 мкл загрузки буфера без β-меркаптоэтанол, вихревые за 10 мин, тепла при 70 ° C с помощью блока тепла на 10 мин. Затем загрузите образцы в 10% геля SDS (1,5 мм) для обнаружения тетраметилродамина (ТАМРА).
- Определения AHA сигнала с помощью переменной режим лазерный сканер для точный количественный зарождающейся белков.
- Промойте гель с DDW за 15 мин.
- Затем пятно 10% гель SDS с реактивом быстро и чувствительных Кумасси краситель для 15-60 мин для определения общего белка как элемент управления.
- Снять пятно гель с DDW для 1-2 ч и приобрести изображение с помощью флуоресценции УФ-формирователь изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основная мышь гепатоцитов изоляции приводит к урожайности приблизительно 20 х 106 всего клетки мыши. Гистологически живой и придает первичной гепатоцитов появляются полигональные или типичные гексагональной формы с четко изложены мембранное границы после 24 ч инкубации (рис. 2).
Чтобы подтвердить ли изолированных клеток первичного гепатоцитов, мы сравнили уровни выражения белка альбумина в изолированных мыши гепатоцитов (аутоксии), мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), линии клеток гепатомы мыши (Hepa 1-6) и печень мыши. Выражение протеина альбумина был обнаружен в гепатоциты мыши и мыши печень, но не было обнаружено в MEFs или Hepa 1-6 клеток (рис. 3).
Чтобы определить, является ли последствия ротенон гепатопротеинов активирована AMP киназы (AMPK) активации клеток автономная, мы сравнили зависящих от времени реакции первичных гепатоцитов, изолированный от печени одичал тип мыши. Основная гепатоцитов относились без или с 10 мкм ротенон 0, 4 или 6 часов. В этих клетках, ротенон лечения энергично индуцированной активации AMPK, как обнаружено увеличение фосфорилирование уровнями на AMPK-T172 аналогичны видели в vivo48 (рис. 4).
Непосредственно измерить эффекты лечения ротенон на синтез белка зарождающейся в первичной гепатоцитов, включение нерадиоактивные AHA в белок свыше 5 h оценивалась, выполняя пробирного реакции химио селективный перевязки. Лечения с 10 мкм ротенон для 5 h имел глубокие ингибирующее влияние на синтез новых белков в обработанных первичных гепатоцитов, когда по сравнению с необработанными первичной гепатоцитов (рис. 5).
Рисунок 1: Иллюстрация показывает шаги первичной мыши гепатоцитов изоляции, Западный анализ помаркой и химио селективный лигирование реакции процедур.
Рисунок 2: фаза контраст морфологических изображения мыши гепатоцитов. Представитель фотографии изолированных первичной гепатоцитов были приобретены на 2, 12, 24 и 72 ч после покрытия. Масштаб баров = 100 мкм.
Рисунок 3: Западный анализ помаркой для выражения белка альбумина в первичной мыши гепатоцитов. Вестерн-блот анализ был проведен с загрузкой 10 мкг белка/Лейн из первичных мыши гепатоцитов (аутоксии), мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), Hepa 1-6 клеток и мыши печень. Односторонний дисперсионный анализ показал, что выражение значительный альбумин белка в аутоксии по сравнению с MEF или Hepa 1-6 клеток. Значения являются средства ± SEM размер группы (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 или MEFs, соответственно. $ P < 0,001 vs. печень lysate.
Рисунок 4: индукция фосфорилирования AMPK в гепатоцитах ротенон лечение первичных мыши. Основная гепатоцитов из печени одичал тип мыши лечили 10 мкм ротенон 0, 4 или 6 х. фосфорилирование уровни AMPK были обнаружены на Западный blotting и β-актина был использован в качестве элемента управления загрузкой (10 мкг белка был загружен/пер.). Повторные измерения 2-полосная ANOVA показали, что лечение вызвало значительное увеличение экспрессии белка фосфо AMPK по сравнению с необработанными первичной гепатоцитов. Значения являются средства ± SEM размер группы (n = 3). P < 0,001 vs. Неочищенные гепатоцитов.
Рисунок 5: сокращение зарождающейся гепатопротеинов выражения после лечения ротенон. Основная гепатоцитов из печени одичал тип мыши лечили 10 мкм ротенон для 5 h, следуют пробирного синтез зарождающейся белков методом нерадиоактивные AHA. Лазерный сканер обнаружения флуоресценции ТАМРА были оценены уровни синтеза белка. Общий белок уровни загрузки для этот assay были обнаружены реагент Кумасси краситель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя несколько увековечен печеночных клеток линии были предложены и использованы для изучения функции печени49,50,51,52, эти клетки, как правило, недостает важных и основополагающих функции нормальной гепатоцитов, такие как выражение альбумина (рис. 3). Широко признается, таким образом, что используя первичный гепатоцитов является ценным вариантом для изучения печени физиологии и метаболизм в культуре, несмотря на проблемы культивирования и поддержание этих клеток. Здесь наше исследование подробности успешной изоляции первичных мыши гепатоцитов, проводя двухэтапный метод коллагеназы довольно удобным и эффективным образом. Через эти процедуры, большинство отдельных первичных гепатоцитов в рамках культуры сохраняют свои метаболические функции и морфологических стабильности и может использоваться для изучения функции печени, включая белка метаболизма, глюконеогенезе, и митохондриальное дыхание.
Изолированные первичных гепатоцитов являются мощным экспериментальный инструмент для изучения молекулярных механизмов печеночная энергии метаболизма. Ротенон мешает с сложной цепи переноса электронов активность митохондрий и блокирует Оксидативное фосфорилирование с ограниченным синтез АТФ53, о чем свидетельствует активации AMPK (рис. 4). Активации AMPK триггеров сотовой адаптационного реагирования, которые подавляют анаболические механизм для компенсации стресс индуцированной ротенон энергии недостаточным. При этом условии мы успешно обнаружен резкое сокращение уровня синтеза зарождающейся белка в первичной гепатоцитов, с использованием реакции перешнуровки нерадиоактивные, химио селективный методом обнаружения ТАМРА белка (рис. 5). Эти результаты подтверждают важность поставок энергии из митохондрий для синтеза соответствующего белка в первичной гепатоцитов. Эти методы полезны для предоставления информации относительно действия препарата или токсичности в терапевтически соответствующих концентраций синтеза гепатопротеинов здорового и больного условий в контексте. Кроме того эти методы применяются для изучения роли конкретных путей, модулирует белка и энергии метаболизма путем анализа первичных гепатоцитов, изолированных от генетически манипулировать мышей.
В целом низкой урожайностью и жизнеспособность клеток являются крупные недостатки использования первичных гепатоцитов. Эти вопросы являются по ряду причин, таких как первоначальный катетеризации, недостаточной промывки с HBSS, неуместным концентрация коллагеназы, или Лонг перфузионный периода. Наш текущий протокол оптимизирует эти несколько шагов и ведет к получению более высокую доходность и жизнеспособных клеток вокруг 20 миллионов/печени/взрослых мышей. Особенно, есть два важных шага: одна должна регулировать температуру и скорость потока переваривается буферов с концентрацией надлежащего коллагеназы переваривать печеночной паренхимы эффективно в 15 – 20 мин от канюля вставки до печени обрезания, и другой должен обрабатывать эти образцы коллагеназ рассматриваются быстро, как описано для того чтобы держать клетки в здоровом состоянии. В то время как изолированных гепатоцитов основе исследования были проведены в течение 48 ч сроки в многих опубликованных данных, первичный гепатоцитов, изолированные с нашими процедурами терпеть долгосрочные культуры (рис. 2). С этих клеток мы покажем, надежной маркировки синтеза гепатопротеинов зарождающейся через assay реакции химио селективный перевязки, хотя концентрации и инкубации время с AHA в протоколе может потребоваться повторно оптимизировать в различных биологических условия клеток (например физиологических и патологических, одичал тип против трансгенных или нокаут/вниз клетки).
Таким образом мы установили процедуры для анализа гепатоцитов мыши для синтеза новых белков в нерадиоактивные манере. Эти клетки реагируют на митохондриальной стресс и выставка Супрессия синтеза белка с активации AMPK пути. Таким образом эти изолированных гепатоцитов являются ценные модели для изучения патофизиологии гепатопротеинов и энергии метаболизма ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы указывают, что они имеют без конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Drs. Joonbae Seo и Вивиан Hwa за их научного вклада и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (НИЗ) (R01DK107530). Т.н. была поддержана ПРЕСТО из Японии науки и техники Агентство. В рамках этого исследования была поддержана гранта NIH (P30DK078392) для пищеварительной заболеваний исследовательский центр Core в Цинциннати.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
