Summary
Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.
Abstract
Hepatosit karaciğer parenkima hücrelerdir ve sentez ve sistemik enerji homeostazı için gerekli proteinlerin salgılanmasını da dahil olmak üzere birden fazla metabolik işlevleri meşgul. Birincil tetkikine fare karaciğer izole fonksiyonel özellikleri veya karaciğerde meydana gelen değişiklikleri anlamak için değerli bir biyolojik araç oluşturmaktadır. Burada bir iki adım collagenase perfüzyon teknik gerçekleştirerek yalıtım ve birincil fare tetkikine kültürü için bir yöntem tanımlamak ve protein metabolizması soruşturma için onların kullanımı tartışmak. Yetişkin bir fare karaciğer sırayla etilen glikol bis tetraacetic asit (EGTA) ve collagenase, hepatositlerin yoğunluk gradient arabelleği ile yalıtım ardından derin. Bu izole tetkikine kültür tabaklarda uygun ve donatılmış tetkikine özelliklerinin çoğunluğu korumak. Bu tetkikine doğmakta olan protein sentezi radyoaktif olmayan reaktifleri ile de dahil olmak üzere protein metabolizmasının değerlendirmeler için kullanılabilir. Biz izole tetkikine kolayca kontrol edilir ve daha yüksek bir kalite ve hacim istikrar enerji metabolizması için kemoterapi-seçici ligasyonu tepki Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein ile kullanarak bağlı protein sentezi oluşturan göstermek algılama Yöntem ve western Blot analizi. Bu nedenle, bu yöntem hepatik doğmakta olan protein sentezi için enerji homeostazı bağlantılı soruşturma için değerlidir. Aşağıdaki iletişim kuralı malzeme ve Yöntemler yüksek kaliteli birincil fare tetkikine yalıtım ve algılama doğmakta olan protein sentezi için özetliyor.
Introduction
Protein önemli bir besin öğesidir ve insan vücudu kuru ağırlığının yaklaşık % 50 birkaç biyolojik özellikleri ve işlevleri1olan proteinlerin oluşmaktadır. Sonuç olarak, protein sentezi en enerji tüketen olaylardan biri ve bir değişiklik protein metabolizması hastalıkları, metabolik hastalıklar2,3,4de dahil olmak üzere gelişimi ile son derece ilişkilidir. Karaciğerde, protein sentezi için toplam enerji tüketimi5,6yaklaşık % 20-30 hesapları. Buna ek olarak, proteinlerin işlevi sadece pasif veya yapı taşları da etkin sinyal arabuluculuk faktörler ama karaciğer intracellularly veya extracellularly sistemik metabolizma7düzenleyecek. Örneğin, sentezlenmiş ve karaciğer ve plazma8en bol protein tarafından salgılanan, serum albümin düşük düzeyde artar tip 2 diyabet gelişimi9,10, riskini 11, oysa serum albümin daha yüksek bir konsantrasyon metabolik sendrom12geliştirme karşı koruyucudur. Ayrıca, rahatsız veya kesintileri kolesterol homeostazı, lipoproteinler, LDLR ve LRP1, gibi modüle salgı veya membran bağlı hepatik proteinler insülin direnci, hiperlipidemi veya ateroskleroz gelişimi için yol açabilir 13. bu nedenle, protein metabolizması bozukluğu karaciğer ve onun ilişkili metabolik komplikasyonlar katılmaktadırlar moleküler patofizyolojik mekanizmaları kimliği roman farmakolojik keşfetmek için yararlı olabilir başlangıçlı geciktirir veya insülin direnci, diyabet ve non alkolik yağlı karaciğer gibi metabolik hastalıkları tedavi etmek için yaklaşıyor.
Protein sentezi sıkıca bağlı hücresel enerji durumuna (Örneğin, bir peptit bağı oluşumu sırasında protein sentezi uzama adım gerektirir 4 fosfodiester bağları14) ve hissediyorum moleküler yolları tarafından düzenlenmiştir Inter - ve Intra-net - cellular besin durumu15,16. AMP-aktive protein kinaz (AMPK) enerji homeostazı17korumak hücre içi enerji sensörler biridir. Hücresel enerji düzeyleri daha düşük olunca AMPK etkinleştirildiğinde, AMPK ve onun hedeflenen yüzeylerde katabolik yolları teşvik etmek ve protein sentezi18,19gibi anabolik işlemlere inhibe işlev. Protein sentezi düzenlenmesi, birden fazla çeviri faktörleri ve ribozomal proteinler20fosforilasyon tarafından aracılık ettiği. Belirtmek gerekirse memeli rapamycin karmaşık 1 (mTORC1), protein sentezi, büyük bir sürücü AMPK21ana hedeflerinden biri hedeftir. MTORC1 aktivasyonu hücre büyümesi ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarıcı protein çeviri autophagy20,ve21tarafından artırır. Bu nedenle, harekete geçirmek-in AMPK mTORC1-aracılı protein sentezi22inhibe olabilir mantıklı olur. Nitekim, AMPK aktivasyonu çözdüğünü ve doğrudan mTORC1 inactivation23 ve protein biyosentezi24bastırılması için önde gelen treonin kalıntı 2446 (Thr2446) üzerinde phosphorylates. Ayrıca, AMPK dolaylı olarak mTORC1 işlev fosforilasyon ve mTORC1 sinyal art arda sıralı akış yukarı regülatör olan Tüberöz skleroz karmaşık 2 (TSC2)25 aktivasyonu tarafından inhibe olabilir. Kısacası, bu yollar karaciğerde bozukluk genellikle metabolik hastalıklar gelişimine bağlı ve bu nedenle çok enerji tür ile bu yollar rolünü araştırmak için etkili deneysel araçları kurmak için kritik bir ihtiyaç ve protein metabolizmasında tetkikine.
İzole birincil tetkikine fonksiyonel özelliklerini ve daha vivo hepatosit karaciğer kaynaklı vitro hücre hatları26,27,28ile arasında daha güçlü bir benzerlik yoktur. İyi farklılaşmış hepatik kanserli hücreleri ve karaciğer fonksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılan, HepG2 hücreler daha az % 48 bağlamında görüntüler, ancak bu birincil insan hepatositlerin % 77 benzerlik Bu karaciğer biyopsi ile paylaşmak gösterilmiştir Gen ifadesinin29Tercihler. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi kültür hücreleri, yerine birincil tetkikine kullanımı araştırma hepatik fonksiyon ve Fizyoloji içinde hayati önem taşımaktadır ve yalıtım ve birincil tetkikine kültürünün çeşitli protokolleri mevcuttur özellikle30,31sıçanlar. Sıçan tetkikine hücreleri nispeten daha yüksek bir verim ile yararlı olmakla birlikte, fare tetkikine genetik olarak modüle fareler geniş durumu nedeniyle birçok bilimsel açıdan büyük bir potansiyele sahiptir. Her nasıl, var birkaç teknik sorunlar üzerinden fareler hücresel ve moleküler-temelli değerlendirmeler için sağlıklı ve bol birincil tetkikine yalıtmaya: ilk olarak, kanül ekleme arabellek reaktifleri ile karaciğer sıvı işlemek çok zordur küçük ve ince fare portal ven veya inferior vena kava nedeniyle; İkinci olarak, daha uzun bir manipülasyon zaman hücre izolasyon sırasında azaltma hücre miktar ve kalite olarak neden olabilir; Üçüncüsü, enzimatik olmayan Mekanik ayırma yöntemleri ciddi zarar görmesine neden ve düşük verim uygun izole birincil tetkikine32,33üretmek. 1980'lerde, collagenase perfüzyon tekniği tetkikine hayvanlar34karaciğerleri üzerinden yalıtmak için kullanılmaya başlandı. Bu yöntem collagenase perfüzyon karaciğer35,36,37, infüzyon ile kalsiyum şelatör çözüm38,39, enzimatik sindirim karaciğer dayanır ve Mekanik ayrışma karaciğer parankimi35. İlk adımda, bir fare karaciğer [Ca2 +] şelatör (ethylenediamine tetraacetic asit, EDTA) içeren kalsiyum [Ca2 +] boş bir arabellek ile derin. İkinci adımda, fare karaciğer cep-hücre dışı matriks etkileşimleri hidrolize için collagenase içeren arabellek ile derin. Bir adımda kullanılan arabellek [Ca2 +] İkinci adım arabellek iyonu varlığı etkili collagenase etkinlik, sonra sindirilir karaciğer vardır daha fazla yavaşça ve mekanik arasında forseps kullanarak ayrı kalmak için gereklidir Hepatik kapsül ve parenchymatous doku. Son olarak, bağ dokusu süzerek kaldırılır ve sonraki Santrifüjü hem parenkima olmayan hücrelerden uygun tetkikine ve olmayan yaşam hepatosit ayıran yoğunluk gradient arabellek40,41 kullanımı ile ,42. Bu da çalışmanın, protein sentezi analizi için bir fare karaciğer üzerinden birincil tetkikine yalıtmak için değiştirilmiş iki adım collagenase perfüzyon tekniği gösteriyoruz.
Proteinlerin radiolabeling yaygın ifade düzeyleri, ciro oranları, ölçmek ve proteinler43 radyoaktivite44tespiti yüksek duyarlılık nedeniyle biyolojik dağılımını belirlemek için kullanılır. Ancak, radyoaktif izotoplar kullanımı son derece kontrollü araştırma45şartlar ve yordamlar gerektirir. Alternatif radyoaktif olmayan yöntemler geliştirilmiştir ve giderek popülerlik kazanmıştır. Bir Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein algılama yöntemi ile kemoterapi-seçici ligasyonu reaksiyon onlardan biri ve hücresel olaylar gibi analiz etmek için kullanılan bir azid ve alkin grupları46arasında kemoterapi seçmeli reaksiyon temel alır yeni doğmakta olan protein sentezi ve bir azid grubuyla değiştiren glikoproteinlerin alt sınıflarını tespit. Yeni doğmakta olan protein sentezi için L-Azidohomoalanine (L-AHA, bir azid-modified amino asit) olabilir metabolik olarak proteinler dahil ve TAMRA protein algılama yöntemi47kullanarak algılandı. Bu tahlil birincil fare tetkikine kullanarak, biz yeni doğmakta olan protein sentez hızı sıkıca ATP kullanılabilirliğini üzerinden mitokondrial bağlantılı olduğunu göstermek ve AMPK harekete geçirmek (Şekil 1).
Özet olarak, birincil fare tetkikine kullanımı protein ve enerji metabolizması soruşturma için çok önemli ve doğmakta olan protein sentezi miktarının yolları geliştirme için ilgili fizyolojik rolü anlayışlar kazanmak için değerli ve hepatosit ile ilgili hastalıkların tedavisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler kullanımını içerir. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi hayvan bakımı komiteleri tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.
1. birincil fare tetkikine yalıtım
- Öncesi yalıtım ürünleri
- 450 mL % 40 yoğunluk gradient arabelleği Tablo 1 ve tutun 4 ° c (15 mL/fare) açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Williams ın orta 500 mL Tablo 1 ' de açıklandığı şekilde hazırlayın ve 4 ° C'de tutmak
- DMEM 500 mL Tablo 1 ' de açıklandığı şekilde hazırlayın ve buz (30 mL/fare) tutun.
- HBSS (-) arabelleği 500 mL su banyosu (40 mL/fare) 42 ° C'de tutun ve Tablo 1 açıklandığı şekilde hazırlayın.
- HBSS (+) arabellek ile 0.3 mg/mL, 500 mL Collagenase tür X 42 ° c su banyosunda 30 dk kuluçka ile Tablo 1 ' deki açıklandığı şekilde hazırlayın (40 mL/fare).
- Perfüzyon pompa kadar intravenöz (I.V) yönetim boru Mandallama ayak pedalı arasında yerleştirerek ve çözüm olmadan hava kabarcıkları yıkama akışını denetleyerek ayarlayın.
- Sıcak tüp ısıtıcı 42° C.
- Santrifüj makinesi ile 4 ° c sakin
- Anestezi ve perfüzyon
- Çalışma alanları ve pompa temiz.
- Pompa bağlı IV tüpü çıkarmak % 70 etanol iyice 10 min için durulama.
- Artık etanol ile DDW tamamen 10 dakikadır durulama tarafından pompa bağlı IV tüpünden kaldırın.
- Makas ve forseps % 70 etanol ile silin.
- Plastik bir kap ile 2 mL isoflurane batırılmış gazlı bez altında doğrudan temas önlemek için kafes kafes alt ile içinde fareyi getirin.
- Eşek pedal refleks (firma ayak tutam) tarafından anestezi derinliği.
- Anestezi istenen derinliğe ulaştığında fareyi kaldırın.
Not: Anestezi İndüksiyon zamanı 1 dk den fazla olmamalıdır. - 15 mL konik tüp ile tüp sonuna kadar itti 1 mL isoflurane bulanmış yastık kullanarak bir burun konisi inşa.
- Anestezi derinliği daha yakın veya uzak fare burun deliklerini burun konisi hareket ettirerek kontrol.
- Fare çalışma platformu üzerinde ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
- % 70 etanol fare karın bölgesi sprey ve karın boşluğu keskin makas ve dişli forseps kullanarak DermIS ve karın zarını büyük bir enine kesi yaparak açın.
- Tüm karın organları tamamen keskin makas ve dişli forseps kullanarak maruz kadar sonra karın katmanların dikey bir kesim yapmak.
- Hareket küçük ve büyük bağırsak fare karaciğer, portal ven ve inferior vena kava (IVC) kadar autoclaved pamuk ipucu ile sol yana doğru açıkça maruz kalır.
- 24 G kateter IVC sadece sağ renal ven ile çatallanma dikkatle IVC ve kanama yaralanmayı önlemek için el sallayarak olmadan ekleyin.
Not: kateter IVC eklediğiniz sırada kanama meydana gelirse, o zaman yeni kateter portal ven eklemek çalışmalısınız. - İğne kateterin kaldırın ve dışarı IVC almamak için kanül konumunu kontrol sonra 24 G kanül ile perfüzyon tüp Bağlayıcısı'nı kullanarak bağlanın.
Not: hava kabarcıkları varlığı perfüzyon başlamadan önce kaçının. - 4 mL/dk debi perfüzyon karaciğer sıcak HBSS (-) ile başlatın ve hızlı bir şekilde makas kullanarak iç kan tahliye için splenik ven kesti.
Not: cannulation başarılı olursa, karaciğer IVC arabelleğinden hepatik damarlar için geri tepme dağılımı nedeniyle beyazlatmak başlayacaktır. Portal ven dalak ve superior mezenterik damarların Birliği tarafından oluşturulur; Bu nedenle, ondan beri onun büyük ve karaciğer üzerinden distal splenik ven kesmek oldukça güvenlidir. - Sıcak HBSS (-) 35 mL ile perfüzyon devam.
Not: Karaciğer bu aşamada soluk perfüzyon yeterli ise renk ve fareyi anestezi altında yaşıyor olacak.
- Sindirim ve ayıklama
- Collagenase türü X 4 mL/dk debi dahil olmak üzere fare karaciğer ile HBSS (+) sıcak 35 mL sıvı.
- Birkaç dakikada kelepçe splenik ven ~ 10 için forseps kullanarak s birimin tümü HBSS (karaciğer tüm anatomik parçaları yaygın +) izin vermek için.
Not: Karaciğer arabellek tıkanıklık nedeniyle splenik ven sıkma sonra şişmeye başlar. - Hazırlanan sıcak HBSS (+) 5 mL Collagenase türü X ile 100 mm Petri kabına perfüzyon işleminin sonunda içine dökün.
- Pompa karaciğer kan geri tepme önlemek, safra kesesi forseps tarafından çıkarın ve sonra karaciğer kan kaldırmak için yavaşça bir kağıt havlu ile silin durdurmadan önce perfused Karaciğer vücudun geri kalanından kesilmiş.
- Karaciğer 5 mL hazırlanmış sıcak HBSS (+) de içeren Petri kabına aktarmak ve karaciğer kapsülü yavaşça düz uçlu forseps kullanarak kaldırın.
Not: Karaciğer kapsülü karaciğer çevreleyen bağ dokusu ince bir tabaka olduğunu. - Parenkima dokusu dikkatle forseps kullanarak dağıtmak. 15 mL eklemek için Petri kabına soğuk DMEM.
Not: karaciğer iyi sindirmek Eğer orta parenkima hücreleri nedeniyle bulutlu dönecek. - Yavaşça kalan parenkima hücreleri Orta serbest bırakmak ve başka bir 15 mL eklemek için yırtık karaciğer sallamak soğuk DMEM Petri kabına için hücreleri almak için.
- DMEM ile çözünmüş karaciğer 100 mikron hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL konik tüp içine aktarmak ve buzun içinde tutmak.
- Arıtma
- Hücre süspansiyon 60 x g 4 ° C'de 2 min için de santrifüj kapasitesi, dikkatle süpernatant tarafından vakum aspirasyon kaldırmak ve Pelet 10 mL DMEM resuspend.
- % 40 yoğunluk gradient arabellek üstüne ince bir tabaka olarak resuspended Pelet ekleyin ve 4'te vasıl 800 g x fren olmadan 10 dk santrifüj kapasitesi° C.
- Dikkatli bir şekilde üst katmanı (DMEM) ve orta tabaka (ölü ya da parenkima olmayan hücreleri), dahil olmak üzere süpernatant değil alt tabaka çıkarın (Pelet: birincil parenkima tetkikine).
- 2-3 mL William'ın orta E ile primer hücre resuspend ve tüp duvardaki ölü hücrelerin kirlenmesini önlemek için yeni 50 mL tüp aktarın.
- 7-8 mL William'ın orta E ekleyin, karışımı yavaşça ve vasıl 800 x g 4 ° C'de 1 dk santrifüj kapasitesi
- Dikkatli bir şekilde süpernatant tarafından vakum aspirasyon çıkarın ve Öyleyse Pelet William'ın orta E (göre Pelet boyutu) 10, 20 veya 30 mL ile tekrar resuspend.
- Hücreleri saymak için bir otomatik hücre sayaç kullanma.
- Tohum ile William'ın orta E, plaka bir kuluçka makinesine 37, devam et° C için 2-3 h, sonra ölü veya ekli olmayan hücreleri kaldırmak için Anti-Anti ve 37 ° C'de gecede kuluçka için orta Tahrik tamburu %10 FBS DMEM orta yerine
- Ertesi gün, birincil fare tetkikine deneysel kullanım için hazır.
2. kemoterapi-seçici ligasyonu tepki tahlil doğmakta olan Protein sentezi tespiti için
- Metabolik etiketleme
- (Ön arıtma) Birincil tetkikine 37 ° C sıcak PBS ile iki kez yıkayın ve metionin ücretsiz DMEM orta sitoplazmik metiyonin tüketmek 30 dk için ayırır ekleyin.
Not: L-Azidohomoalanine, bir amino asit ve metionin analog, bir protein proteinlerin sentezi sırasında dahil edilebilir, böylece sitoplazmik metiyonin tükenmesi beslenme artıracaktır azido yan ve birleşme içerir L-Azidohomoalanine kültürlü birincil tetkikine yeni sentezlenmiş protein içine. - (Tedavi) Yıkama birincil tetkikine 37 ° C ile iki kez PBS sıcak ve metionin ücretsiz DMEM orta ile 25 mikron AHA (L-Azidohomoalanine) 4-6 h için ekleyin.
- Herhangi bir belirli kimyasal (yani 10 mikron Rotenon) 4-6 h için orta AHA huzurunda doğmakta olan protein ifade düzeyleri üzerindeki etkisini araştırmak için ekleyin.
- Kuluçka sonra orta tarafından vakum aspirasyon kaldırmak ve soğuk PBS ile birincil tetkikine üç kez yıkayın.
- 200 μL lizis arabellek plakasına eklemek ve için 15-30 dakika buz üzerinde kuluçkaya sonra plaka eğilme ve 1.7 mL tüp içine lysate bütün hücreye götürün.
Not: Lysate hücre hücre hasat sırasında çok yapışkan olduğunu dikkat etmelisiniz. - Buz 5 için cepten lysate solüsyon içeren temizleyicide üç kez bir sonda sonicator solubilize proteinler ve DNA'yı dağıtmak için kullanarak s.
- 5 min için lysate hücre hücre lysate, 21,130 x g 4 oC de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve ardından açık süpernatant yeni bir tüp içine aktarın. Protein konsantrasyonu iki kez ölçmek.
Not: hemen kullanılmayan bu aşamada protein örnekleri-20 ° C'de iki hafta boyunca saklanabilir.
- (Ön arıtma) Birincil tetkikine 37 ° C sıcak PBS ile iki kez yıkayın ve metionin ücretsiz DMEM orta sitoplazmik metiyonin tüketmek 30 dk için ayırır ekleyin.
- Azid-modified doğmakta olan protein etiketleme
- (A + B) bileşenleri, bileşen bileşeni (A) (B) 60 μL ekleyerek hazırlayın.
Not: Çözüm parlak pembe renk bileşeni (B) (A) için ekledikten sonra döner. - Arabellekleri (D) ve (E) göre hazırlamak için protokol.
- 20-40 μg hücre lysate alıp 50 μL 2 x reaksiyon arabellek ekleyin (bileşen A + B), sonra 80 μL için DDW ve 5 için girdap ekleyerek ses seviyesini s.
- 5 μL eklemek CuSO4 (bileşen C) ve 5 için girdap s.
- 5 μL tepki arabellek katkı 1 (taze hazırlanmış bileşeni D), o zaman 5 s için girdap ve 3 dk bekle ekleyin.
- 10 yeniden μL tepki arabellek katkı 2 (bileşen E), 5 s için sonra girdap ve döndürme örnekleri için 20 dk 4 ° C'de bir çok rotator makine kullanarak ekleyin.
Not: Çözüm parlak turuncu renk bileşeni (E) ekledikten sonra döner. Örnekleri döndürme sırasında ışıktan korunmalıdır. - 300 μL metanol ve 5 için girdap ekleyin s, 75 μL kloroform ve 5 için girdap eklemek s, daha sonra 200 μL DDW ve 5 için girdap ekleyin s.
- 21,130 g x ve 4 örnekler santrifüj kapasitesi° C 5 dk, sonra sulu süpernatant atın ve Pelet koruyun.
- Tüp, girdap ve spin 21,130 x g. , 5 min için tekrar 250 μL metanol ekleyin
- Süpernatant, atmak o zaman hav bırakmayan doku örnekleriyle kapsar ve oda sıcaklığında 15 dk kurumasını granül olanak sağlar.
- (A + B) bileşenleri, bileşen bileşeni (A) (B) 60 μL ekleyerek hazırlayın.
- SAYFA analizi ve western Blot
- Arabellek olmadan β-mercaptoethanol, 10 min için girdap, 70 ° C ısıda ısı blok 10 dakikadır kullanarak yükleme 20 μL Pelet solubilize. O zaman örnekleri Tetramethylrhodamine (TAMRA) algılama için % 10 SDS jel (1.5 mm) yükleyin.
- Yeni doğmakta olan proteinler kesin Nefelometri için bir değişken modu lazer tarayıcı kullanarak AHA sinyali algılamak.
- Jel ile DDW için 15 dakika yıkayın.
- Sonra % 10 SDS jel ile hızlı ve hassas coomassie boya reaktifi 15-60 dk toplam protein bir denetim olarak tespit etmek için leke.
- Jel DDW ile 1-2 h için de-leke ve UV floresans Imager kullanarak görüntü elde etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil fare tetkikine yalıtım yaklaşık 20 x 106 toplam hücreleri/fare bir verim içinde sonuçlanır. Histolojik olarak, canlı ve iliştirilmiş birincil tetkikine poligonal görünür veya tipik altıgen şeklinde ile açıkça membranöz sınır 24 h kuluçka (Şekil 2) sonra belirtildiği.
İzole hücrelerdir birincil tetkikine olup olmadığını doğrulamak için albumin proteini izole birincil fare tetkikine (PMHs), fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), bir fare hepatoma hücre kültürünü (Hepa 1-6) ve fare karaciğer ifade düzeyleri karşılaştırıldı. Albümin protein ifade birincil fare tetkikine ve fare karaciğer algılandı ama ya MEFs ya da Hepa algılanabilir değildi 1-6 hücreler (Şekil 3).
Hepatik AMP-aktive protein kinaz (AMPK) etkinleştirme Rotenon etkilerini hücre özerk olup olmadığını belirlemek için birincil tetkikine vahşi tipi fare karaciğer izole zamana bağımlı yanıt karşılaştırıldığında. Birincil tetkikine olmadan veya 0, 4 veya 6 s 10 mikron Rotenon ile tedavi edildi. Bu hücreler, Rotenon tedavi sağlam AMPK harekete geçirmek, AMPK-T172 benzer düzeyde artan fosforilasyon tarafından algılanan gibi indüklenen vivo içinde48 (Şekil 4) gördüm.
Doğrudan birincil tetkikine doğmakta olan protein sentezinde Rotenon tedavi etkilerini ölçmek için radyoaktif olmayan AHA birleşme protein 5 h üzerinden içine kemoterapi-seçici ligasyonu tepki tahlil gerçekleştirerek değerlendirildi. Tedavi ile 10 mikron Rotenon 5 h için tedavi edilmezse birincil tetkikine (Şekil 5) karşılaştırıldığında tedavi birincil tetkikine doğmakta olan protein sentezi üzerinde derin inhibitör etkileri var.
Resim 1: Bir birincil fare adımlardan tetkikine yalıtım, western blot Analizi ve kemoterapi-seçici ligasyonu tepki yordamları gösterilmiştir.
Şekil 2: faz kontrast birincil fare tetkikine morfolojik görüntülerini. İzole birincil tetkikine temsilcisi resimleri 2, 12, 24 ve 72 h kaplama sonra satın alınan. Ölçek çubukları 100 mikron =.
Şekil 3: Western blot analizi için albümin protein ifade birincil fare tetkikine. Western blot Analizi 10 μg protein/lane birincil fare tetkikine (PMHs), fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), Hepa 1-6 hücreler ve fare karaciğer yükleme ile yapılmıştır. Tek yönlü ANOVA PMHs önemli albumin proteini ifadede MEF ya da Hepa göre 1-6 hücreleri gösterdi. Değerler şunlardır: anlamına gelir ± SEM Grup boyutu (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 veya MEFs, anılan sıraya göre. $ P < 0,001 vs. karaciğer lysate.
Şekil 4: indüksiyon AMPK fosforilasyon birincil fare Rotenon tedavi tetkikine içinde. Bir vahşi tipi fare karaciğer üzerinden birincil tetkikine tedavi ile 10 mikron Rotenon için AMPK 0, 4 veya 6 h. fosforilasyon düzeyleri western Blot tarafından algılandı ve β-aktin yükleme denetimi olarak kullanıldı (10 μg protein olduğunu yüklü/lane). Tekrarlanan ölçüler 2 yönlü ANOVA tedavi protein ifadesi Fosfo-AMPK tedavi edilmezse birincil tetkikine göre önemli bir artış neden gösterdi. Değerler şunlardır: anlamına gelir ± SEM Grup boyutu (n = 3). P < 0,001 vs. Tedavi edilmemiş tetkikine.
Şekil 5: hepatik doğmakta olan protein ifade Rotenon tedaviden sonra azalma. Birincil tetkikine vahşi tipi fare karaciğer üzerinden 5 h, radyoaktif olmayan AHA yöntemi ile doğmakta olan protein sentezi tahlil tarafından takip için 10 mikron Rotenon ile tedavi edildi. Protein sentezi düzeyleri TAMRA floresans algılama bir lazer tarayıcısı tarafından değerlendirildi. Toplam protein yükleme düzeyleri bu tahlil için coomassie-boya reaktif tarafından tespit edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ne kadar birden fazla ölümsüzleştirdi karaciğer hücre satır önerilen ve karaciğer fonksiyonları49,50,51,52araştırmak için kullanılan, bu hücreler genellikle önemli ve temel eksikliği Albümin (Şekil 3) ifadesi gibi normal tetkikine fonksiyonları. Bu yaygın, bu nedenle, birincil tetkikine kullanan karaciğer fizyolojisi ve metabolizma kültür, kültür ve bu hücrelerin korumanın zorlukları rağmen incelenmesi için değerli bir seçenek olduğunu kabul edilmektedir. Burada, bizim çalışma birincil fare tetkikine başarılı izolasyonu nispeten uygun ve verimli bir şekilde bir iki adım collagenase yöntemi yaparak ayrıntıları. Bu yordamları aracılığıyla kültür içinde izole birincil tetkikine çoğunluğu onların metabolik işlevleri ve morfolojik istikrarı korumak ve karaciğer fonksiyonları protein de dahil olmak üzere araştırma için kullanılabilir metabolizması, gluconeogenesis, ve mitokondrial solunum.
İzole birincil hepatosit karaciğer enerji metabolizmasının moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir deneysel araçlardır. Rotenon engelleyen elektron taşıma zinciri ile ben mitokondri içinde etkinlik ve AMPK (Şekil 4) etkinleştirme tarafından kanıtlanan Oksidatif fosforilasyon ATP53, sınırlı sentezi ile blok. AMPK harekete geçirmek Rotenon kaynaklı enerji eksikliği stres telafi etmek için anabolik mekanizması bastırmak hücresel adaptif yanıt tetikler. Bu durum altında başarıyla doğmakta olan protein sentezi düzeylerinin sert düşüş içinde birincil tetkikine bir radyoaktif olmayan, kemoterapi seçici ligasyonu tepki bir TAMRA protein algılama ile (Şekil 5) yöntemiyle tespit ettik. Bu sonuçlar için birincil tetkikine uygun protein sentezi mitokondri enerji kaynağından önemini onaylayın. Bu tekniklerin bir uyuşturucu eylem veya tedavi amaçlı ilgili konsantrasyonları hepatik protein sentezi sağlıklı ve hastalıklı koşullar içinde belgili tanımlık bağlam içinde toksisitesi ile ilgili bilgi sağlamak yararlıdır. Buna ek olarak, bu tekniklerin belirli yolları protein oransal rolünü inceleyen için geçerlidir ve enerji metabolizması birincil tetkikine genetik olarak izole analiz tarafından fare manipüle.
Genel olarak, düşük verim ve hücre canlılığı birincil tetkikine kullanımı büyük sakıncaları vardır. İlk cannulation, HBSS, collagenase veya uzun-perfüzyon dönemi uygunsuz konsantrasyonu ile yıkama yetersiz gibi çeşitli nedenlerden dolayı bu sorunları vardır. Bizim geçerli iletişim kuralı birden fazla adımları en iyi duruma getirir ve daha yüksek bir verim ve hücrelerin çevresinde 20 milyon/karaciğer/yetişkin fareler kazanıyor yol açar. Özellikle, iki önemli adım vardır: biri sıcaklık ve akış hızı ile verimli bir şekilde içinde 15-20 dk kadar karaciğer eksizyon, kanül ekleme gelen karaciğer parankimi sindirmek için uygun collagenase konsantrasyon sindirilir arabellekleri ayarlamak için ve Bu tedavi collagenases örnekler hücreleri sağlıklı durumda tutmak için açıklandığı gibi hızlı bir şekilde işlemek için başka bir şeydir. 48 saat süre içinde çok sayıda yayımlanan veri içinde izole tetkikine tabanlı çalışmalar yapılmıştır iken, birincil tetkikine prosedürlerimiz ile izole uzun vadeli Kültür (Şekil 2) katlanmak. AHA konsantrasyon ve kuluçka zamanla iletişim kuralındaki farklı biyolojik yeniden optimize sahip olsa bile bu değerleri ile biz kemoterapi-seçici ligasyonu tepki tahlil ile hepatik doğmakta olan protein sentezi sağlam etiketleme göster koşulları hücre (Örneğin fizyolojik ve patolojik, vahşi-tipi vs transgenik veya nakavt/hücreleri aşağı).
Özetle, biz birincil fare tetkikine doğmakta olan protein sentezi için radyoaktif olmayan bir şekilde çözümlemek için yordamlar kurduk. Bu hücreler de mitokondrial stres yanıt ve protein sentezi bastırılması AMPK aktivasyonu ile sergilemek. Böylece, bu izole hepatosit karaciğer protein ve enerji metabolizması ex vivoPatofizyoloji soruşturma için değerli modellerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar-si olmak hayır ç›kar çat›flmalar› gösteriyor.
Acknowledgments
Biz Drs. Joonbae Seo ve Vivian Hwa onların bilimsel girdi ve tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (NIH) (R01DK107530) destek verdi. T.N. PRESTO Japonya bilim ve teknoloji ajansı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir parçası NIH (P30DK078392) sindirim hastalığı araştırma çekirdek merkezi Cincinnati için bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
