Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.
Abstract
Hepatócitos são células parenquimais do fígado e envolver várias funções metabólicas, incluindo a síntese e secreção de proteínas essenciais para a homeostase de energia sistêmica. Primários hepatócitos isolados do fígado murino constituem uma valiosa ferramenta biológica para compreender as propriedades funcionais ou alterações que ocorrem no fígado. Neste documento descrevemos um método para o isolamento e a cultura de hepatócitos primários de rato através da realização de uma técnica de perfusão de colagenase em duas fases e discutir a sua utilização para investigar o metabolismo proteico. O fígado de um rato adulto sequencialmente é perfundido com ácido etilenodiaminotetracético de glicol de etileno-bis (EGTA) e colagenase, seguido pelo isolamento dos hepatócitos com o buffer de gradiente de densidade. Estes hepatócitos isolados são viáveis em placas de cultura e mantêm a maioria das características dotadas de hepatócitos. Estes hepatócitos podem ser usados para avaliação do metabolismo de proteínas, incluindo a síntese de proteína nascente com reagentes não-radioativo. Mostramos que os hepatócitos isolados são facilmente controlados e compreendem uma maior estabilidade de volume e qualidade de síntese de proteínas ligada ao metabolismo energético, utilizando a reação de quimio-seletiva da ligadura com uma proteína de diversos (TAMRA) método de detecção e análises de mancha ocidentais. Portanto, esse método é valioso para investigar a síntese hepática da proteína nascente ligado a homeostase de energia. O protocolo seguinte descreve os materiais e métodos para o isolamento dos hepatócitos de rato primária de alta qualidade e detecção de síntese de proteína nascente.
Introduction
A proteína é um importante elemento nutricional e aproximadamente 50% do peso seco de um corpo humano é composto de proteínas que tenham vários traços biológicos e funções1. Por conseguinte, síntese de proteínas é um dos eventos que consome mais energia e uma alteração no metabolismo de proteína é altamente associada com o desenvolvimento de doenças, incluindo doenças metabólicas2,3,4. No fígado, biossíntese de proteínas é responsável por aproximadamente 20 a 30% do consumo de energia total5,6. Além disso, a função de proteínas como não só passivo ou blocos de fígado, mas também ativas fatores de mediação de sinal intracelular ou extracelularmente para regular o metabolismo sistêmico7. Por exemplo, redução dos níveis de albumina de soro, o qual é sintetizado e secretado pelo fígado e a proteína mais abundante no plasma8, aumenta o risco de tipo 2 diabetes desenvolvimento9,10, 11, Considerando que uma maior concentração de albumina é protetor contra o desenvolvimento de síndrome metabólica12. Além disso, perturbado ou interrupção de proteínas hepáticas secretoras ou membrana-limite, que modulam a homeostase do colesterol, incluindo as lipoproteínas, LDLR e LRP1, pode levar ao desenvolvimento de resistência à insulina, dislipidemia ou aterosclerose 13. portanto, a identificação de mecanismos fisiopatológicos moleculares que estão envolvidos no distúrbio de metabolismo de proteínas no fígado e suas complicações metabólicas associadas pode ser útil para descobrir o romance farmacológica abordagens para retardar o aparecimento ou tratar doenças metabólicas como resistência à insulina, diabetes e esteatose hepática não-alcoólica.
Síntese de proteínas é fortemente ligado ao estado de energia celular (por exemplo, a formação de uma ligação peptídica durante a etapa de elongação da síntese de proteínas requer 4 de ligações fosfodiéster14) e é regulada pelas vias moleculares que detetam Intere intra - cellular disponibilidade nutriente15,16. Quinase de proteína AMP-ativada (AMPK) é um dos sensores de energia intracelular que mantêm a homeostase de energia17. Uma vez que a AMPK é ativada quando os níveis de energia celulares tornam-se mais baixos, AMPK e seus substratos direcionados a função de estimular vias catabólicos e inibem processos anabólicos, incluindo a síntese de proteína18,19. A regulação da síntese de proteínas é mediada por fosforilação de múltiplos fatores de tradução e proteínas ribossomais20. De nota, mamíferos alvo de rapamicina complexo 1 (mTORC1), um grande motorista da síntese de proteínas, é um dos principais alvos da AMPK21. Ativação da via mTORC1 aumenta o crescimento celular e a proliferação de estimulante proteína Tradução e autofagia20,21. Portanto, é lógico que a ativação da AMPK pode inibir a síntese de proteínas mediada por mTORC122. Com efeito, a ativação da AMPK neutraliza e fosforila diretamente mTORC1 no resíduo de treonina 2446 (Thr2446) levando a sua inactivação23 e supressão da biossíntese de proteínas24. Além disso, AMPK indiretamente pode inibir a função de mTORC1 por fosforilação e ativação de esclerose tuberosa complexa 2 (TSC2)25 que é o regulador upstream da cascata de sinalização de mTORC1. Em suma, dysregulation dessas vias no fígado é muitas vezes ligada ao desenvolvimento de doenças metabólicas e, portanto, há uma necessidade crítica para estabelecer ferramentas experimentais eficazes para investigar o papel destas vias na regulação da energia e metabolismo proteico nos hepatócitos.
Há uma forte semelhança entre as propriedades funcionais dos hepatócitos primários isolados e hepatócitos na vivo do que em vitro derivados de fígado célula linhas26,27,.28. Tem sido demonstrado que hepatócitos humanos primários compartilham 77% de similaridade com o de biópsias hepáticas, enquanto as células HepG2, que são as células cancerosas hepáticas bem diferenciadas e amplamente utilizado para investigar as funções hepáticas, exibem menos de 48% no contexto da 29de perfis de expressão gênica. Portanto, utilização dos hepatócitos primários, ao invés de células de cultura imortalizado, é de vital importância na investigação de Fisiologia e função hepática, e vários protocolos estão disponíveis para o isolamento e a cultura de hepatócitos primários especialmente de ratos30,31. Enquanto os hepatócitos de rato são úteis com um rendimento relativamente maior de células, hepatócitos de rato teriam um potencial maior em muitos aspectos científicos devido à ampla disponibilidade de camundongos geneticamente modulados. No entanto, existem vários desafios técnicos em isolar saudáveis e abundantes hepatócitos primários de rato para celular e molecular-avaliações baseadas em: primeiro, inserção de cânula para perfundir o fígado com reagentes de buffer é muito difícil de lidar por causa da veia porta de rato pequeno e fino ou veia cava inferior; em segundo lugar, um tempo de manipulação das células durante o isolamento pode causar redução na quantidade de células e de qualidade; métodos de separação mecânica não enzimáticos, terceiro podem resultar em danos graves e produzir um baixo rendimento dos hepatócitos primários isolados viável32,33. Na década de 1980, a técnica de perfusão de colagenase foi introduzida para isolar os hepatócitos a partir de fígados de animais34. Este método baseia-se na perfusão de colagenase da hepática35,36,37, infusão de fígado com cálcio quelante solução38,39, digestão enzimática e dissociação mecânica do parênquima hepático35. Na primeira etapa, um fígado de rato é perfundido com uma reserva de cálcio [Ca2 +] livre contendo um quelante [Ca2 +] (etilenodiamina ácido etilenodiaminotetracético, EDTA). Na segunda etapa, o fígado de rato é perfundido com um buffer contendo colagenase para hidrolisar as interações da matriz extracelular-celular. Ao contrário o buffer usado no primeiro passo, a presença de íons [Ca2 +] no buffer da segunda etapa é necessária para a atividade de colagenase eficaz, após o qual o fígado digerido tem que ser ainda mais suavemente e mecanicamente separadas usando pinça entre o cápsula hepática e tecido parenquimático. Finalmente, tecido conjuntivo é removido por filtração, e posterior centrifugação separa hepatócitos viáveis de células não-parenquimatosas tanto e não-vivos hepatócito com o uso de densidade gradiente reserva40,41 ,42. No presente estudo, mostramos uma técnica de perfusão de colagenase modificados em duas etapas para isolar os hepatócitos primários de um fígado de rato para a análise da síntese de proteínas.
O radioativos das proteínas é amplamente utilizado para quantificar os níveis de expressão, taxas de rotatividade e determinar a distribuição biológica de proteínas43 devido à alta sensibilidade de detecção de radioatividade44. No entanto, o uso de isótopos radioativos requer pesquisa altamente controlada circunstâncias e procedimentos45. Métodos alternativos não-radioativo foram desenvolvidos e cada vez mais ganharam na popularidade. Reação da ligadura quimio-seletivo com um método de deteção de proteínas de diversos (TAMRA) é um deles e é baseada na reação de quimio-seletiva entre uma azida e alquino grupos46, que pode ser utilizado para analisar eventos celulares tais como detectando a síntese da proteína nascente e subclasses de glicoproteínas modificadas com um grupo de azida sódica. Para a síntese de proteína nascente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, um aminoácido azida modificado) pode ser metabolicamente incorporado em proteínas e detectado usando o de método de deteção de proteínas TAMRA47. Usando este ensaio em hepatócitos primários de rato, mostramos que a taxa de síntese de proteína nascente está fortemente ligada à disponibilidade de ATP de mitocondrial e ativação da AMPK (Figura 1).
Em resumo, utilização dos hepatócitos primários de rato é crucial para o metabolismo de proteínas e energia a investigar e quantificar a síntese da proteína nascente é valioso para obter insights sobre o papel fisiológico de caminhos relevantes para o desenvolvimento e cura de doenças relacionadas ao hepatócito.
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Protocol
Este protocolo contém o uso de ratos de laboratório. Cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelos comités de cuidados com animais de Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolamento dos hepatócitos primários de rato
- Preparações de pre-isolamento
- Prepare 450 mL de buffer gradiente de densidade de 40%, conforme descrito na tabela 1 e manter a 4 ° C (15 mL/mouse).
- Preparar 500 mL de meio de Williams, conforme descrito na tabela 1 e manter a 4 ° C.
- Preparar 500 mL de DMEM, conforme descrito na tabela 1 e manter no gelo (30 mL/mouse).
- Prepare 500 mL de tampão HBSS (-), conforme descrito na tabela 1 e mantenha a 42 ° C em banho-maria (40 mL/mouse).
- Preparar 500 mL de HBSS (+) Buffer com 0,3 mg/mL de colagenase tipo X, conforme descrito na tabela 1 , com incubação de 30 min a 42 ° C em banho-maria (40 mL/rato).
- Configure a bomba de perfusão, colocar o tubo de administração intravenosa (IV) o travamento do pedal e verificando o fluxo de solução sem bolhas de ar de lavagem.
- Aquecer o tubo aquecedor em 42° C.
- Arrefecer a máquina centrífuga para 4 ° C.
- Anestesia e perfusão
- Limpe as áreas de trabalho e a bomba.
- Lave o tubo de IV conectado a bomba executando 70% etanol abundantemente durante 10 min.
- Remova o etanol residual do tubo conectado a bomba IV enxaguando com DDW inteiramente por 10 min.
- Limpe a tesoura e pinça com etanol a 70%.
- Coloque o mouse em um recipiente de plástico com um fundo de malha e com a gaze embebida isoflurano de 2ml debaixo da malha para evitar o contato direto.
- Bundas a profundidade da anestesia por pedal reflex (pitada de dedo firme).
- Remova o mouse quando ela atingir a profundidade desejada da anestesia.
Nota: O tempo de indução da anestesia não deve ser mais de 1 min. - Construa um cone de nariz usando um tubo cônico de 15 mL com 1 mL isoflurano embebida empurrada para a extremidade do tubo.
- Controle a profundidade da anestesia, movendo o cone de nariz mais perto ou longe das narinas de rato.
- Coloque o mouse sobre a plataforma de trabalho com o lado ventral virada para cima.
- Pulverizar o etanol a 70% sobre a área abdominal do mouse e em seguida, abra a cavidade abdominal, fazendo uma grande incisão transversal da derme e peritônio usando tesoura afiada e fórceps dentado.
- Em seguida, fazer um corte vertical das camadas abdominais até que todos os órgãos abdominais são completamente expostos usando tesoura afiada e fórceps dentado.
- Movimento pequeno e intestino em direção ao lado esquerdo do mouse com ponta de algodão esterilizado até o fígado, veia porta e veia cava inferior (VCI) são claramente exposto.
- Inserir um cateter 24G IVC só na bifurcação com a veia renal direita cuidadosamente sem tremer as mãos para evitar a lesão da veia cava inferior e a sangrar.
Nota: Se o sangramento ocorre enquanto você estiver inserindo o cateter na veia cava inferior, então você deve tentar inserir o novo cateter na veia portal. - Retire a agulha do cateter e controlar a posição da cânula para evitar sair da veia cava inferior e, em seguida, conecte a cânula 24G com tubo de perfusão usando o conector.
Nota: Evite a presença de bolhas de ar antes de iniciar a perfusão. - Iniciar a perfusão do fígado com HBSS quente (-) a uma taxa de fluxo de 4 mL/min e cortar a veia esplênica rapidamente para drenar o sangue interno usando a tesoura.
Nota: Se a canulação é bem sucedida, o fígado começará a branquear devido a distribuição de refluxo do buffer do IVC para veias hepáticas. A veia porta é formada pela União das veias mesentéricas superiores e esplênica; Portanto, é bastante seguro cortar a veia esplênica, uma vez que é grande e distal do fígado. - Continue a perfusão com 35 mL de HBSS quente (-).
Nota: O fígado vai se tornar pálido na cor, se a perfusão é adequada e o mouse ainda vivo sob anestesia nesta fase.
- Digestão e extração
- Perfundir o fígado de rato com quente 35 mL de HBSS (+) incluindo colagenase tipo X com um caudal de 4 mL/min.
- Em poucos minutos, fixar a veia esplênica usando fórceps para ~ 10 s para permitir que todo o volume de HBSS (+) para difundir em todas as partes anatômicas do fígado.
Nota: O fígado começa a inchar depois apertando a veia esplênica devido ao congestionamento de reserva. - Despeje 5 mL de HBSS quente preparado (+) com colagenase tipo X 100 mm placa de Petri no final do processo de perfusão.
- Corte o fígado perfundido do resto do corpo antes de parar a bomba para evitar o refluxo de sangue para o fígado, remover a vesícula biliar por fórceps e em seguida limpe o fígado suavemente com uma toalha de papel para remover o sangue.
- Transferir o fígado para o prato de Petri, que contém 5 mL de HBSS quente preparado (+) e remova a cápsula hepática suavemente usando pinça com ponta reta.
Nota: A cápsula do fígado é uma fina camada de tecido conjuntivo que rodeia o fígado. - Disperse os tecidos parenquimatosos com cuidado usando a pinça. Adicionar 15 mL DMEM fria para o prato de Petri.
Nota: O meio ficará nublado devido às células parenquimais se o fígado é bem digerido. - Agitar o fígado rasgado suavemente para liberar as células parenquimatosas residuais entram no meio e adicionar mais 15 mL DMEM fria para o prato de Petri para pegar o resto das células.
- Transferência de DMEM com o fígado dissolvido através de filtro de célula 100 μm em um tubo cónico de 50 mL e manter em gelo.
- Purificação
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 60 x g por 2 min a 4 ° C, com cuidado, retire o sobrenadante por aspiração vácuo e resuspenda o pellet em 10 mL DMEM.
- Adicionar ressuspenso como uma fina camada no topo do buffer gradiente de densidade de 40% e centrifugar a 800 x g por 10 min sem freio em 4° C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante, incluindo a camada superior (DMEM) e a camada média (células não-parenquimatosas ou mortas), mas não a camada inferior (pelota: hepatócitos parenquimatosos primários).
- Ressuspender as células primárias com 2 – 3 mL do William E médio e transferir para o novo tubo de 50 mL, para evitar a contaminação de células mortas na parede do tubo.
- Adicionar meio de 7-8 mL William E, misture delicadamente e centrifugar a 800 x g por 1 min a 4 ° C.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração vácuo e depois Ressuspender novamente com 10, 20 ou 30 mL de meio de William E (de acordo com o tamanho da pelota).
- Conte as células usando um contador automatizado de células.
- Semente com meio de William E, manter a placa em uma incubadora a 37° C durante 2-3 h, em seguida, substitua % o médio with10 médio FBS DMEM com antipara Anti remover as células mortas ou desanexadas e para incubação overnight a 37 ° C.
- No dia seguinte, hepatócitos primários de rato estão prontos para uso experimental.
2. ensaio de reação da ligadura quimioterapia-seletiva para a detecção de síntese de proteína nascente
- Etiquetando metabólica
- (Pré-tratamento) Lavar duas vezes o primários hepatócitos com PBS quente de 37 ° C e adicionar reserva-se o meio DMEM metionina-livre por 30 min esgotar a metionina citoplasmática.
Nota: L-Azidohomoalanine, analógico-metionina é um aminoácido, contém um moiety azido que pode ser incorporado em proteínas durante a biossíntese de proteínas celulares para que a depleção de metionina citoplasmática irá melhorar a alimentação e a incorporação de L-Azidohomoalanine em proteínas recém sintetizadas de hepatócitos primários culturas. - (Tratamento) Hepatócitos primários de lavagem com 37 ° C aquecer PBS duas vezes e adicionar o meio DMEM metionina-livre com 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) para 4-6 h.
- Adicione quaisquer químicos específicos (ou seja, 10 rotenona μM) a médio para 4-6 h na presença do AHA para investigar seu efeito sobre os níveis de expressão da proteína nascente.
- Após a incubação, remover o meio por aspiração vácuo e lavar hepatócitos primários com PBS frio três vezes.
- Adicionar tampão de Lise 200 μL à placa e incubar durante 15-30 min no gelo, em seguida incline o prato e levar o lisado num tubo de 1,7 mL celular.
Nota: Você deve observar que o lisado celular é muito pegajoso durante a colheita de células. - Proceda à sonicação o lisado celular no gelo por 5 s três vezes usando um sonicador de sonda para solubilizar as proteínas e o DNA de dispersar.
- Vórtice da célula lisada por 5 min, centrifugue lisado a 21.130 x g durante 10 minutos a 4 oC o celular e depois transferir o sobrenadante claro para um tubo novo. Medir a concentração de proteína duas vezes.
Nota: Nesta fase, amostras da proteína podem ser armazenadas a-20 ° C durante duas semanas se não forem utilizados imediatamente.
- (Pré-tratamento) Lavar duas vezes o primários hepatócitos com PBS quente de 37 ° C e adicionar reserva-se o meio DMEM metionina-livre por 30 min esgotar a metionina citoplasmática.
- Marcando a proteína nascente azida modificado
- Prepare os componentes (A + B), acrescentando 60 μL de componente (A) para (B).
Nota: A solução se transforma em rosa brilhante na cor depois de adicionar o componente (A) para (B). - Preparar os amortecedores (D) e (E) de acordo com o protocolo.
- Pegue 20 – 40 μg lisado celular e adicionar 50 μL de 2 x amortecedor da reação (componente A + B), em seguida, ajuste o volume para 80 μL adicionando DDW e vórtice para 5 s.
- Adicionar 5 μL CuSO4 (componente C) e o vórtice para 5 s.
- Adicione 5 μL reação buffer 1 aditivo (componente preparada na hora D), em seguida, vórtice para 5 s e esperar por 3 min.
- Adicione 10 μL reconstituído amortecedor da reação 2 aditivo (componente E), então o vórtice para 5 s e girar amostras por 20 min a 4 ° C, usando uma máquina de rotor multi.
Nota: A solução vira laranja brilhante na cor após a adição do componente (E). As amostras devem ser protegidas da luz durante a rotação. - Adicionar 300 μL de metanol e de vórtice para 5 s, adicione 75 clorofórmio μL e vórtice por 5 s, em seguida, adicione 200 μL DDW e vórtice para 5 s.
- Centrifugar as amostras no 21.130 x g e 4° C por 5 min, em seguida, descartar o sobrenadante aquoso e manter a pelota.
- Adicionar 250 metanol μL para o tubo, vórtice e girar novamente por 5 min à 21.130 x g.
- Desprezar o sobrenadante, em seguida, cobrir as amostras com o fiapos de tecido e permitem que as pelotas secar ao ar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Prepare os componentes (A + B), acrescentando 60 μL de componente (A) para (B).
- Análise de página e mancha ocidental
- Solubilize a pelota em 20 μL de carregando buffer sem β-Mercaptoetanol, vórtice por 10 min, calor a 70 ° C usando bloco de calor por 10 min. Em seguida, carrega as amostras em gel de SDS 10% (1,5 mm) para a deteção de diversos (TAMRA).
- Detecta o sinal de AHA, usando um scanner a laser modo variável para quantificação precisa das proteínas nascentes.
- Lave o Gel com DDW por 15 min.
- Em seguida, manche o gel de SDS 10% com um reagente de coomassie-corante rápido e sensível para 15 – 60 min detectar proteínas totais como um controle.
- De manchar o Gel com DDW para 1 – 2 h e adquirir a imagem usando um gerador de imagens de fluorescência de UV.
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Representative Results
Isolamento de hepatócitos primários de rato resulta em um rendimento de aproximadamente 20 x 106 total células/rato. Histologicamente, ao vivo e anexados hepatócitos primários aparecem poligonais ou típico hexagonal em forma com claramente delineado contorno membranoso após incubação de 24h (Figura 2).
Para confirmar se a células isoladas são hepatócitos primários, comparamos os níveis de expressão da proteína albumina em hepatócitos isolados principal do rato (PMHs), fibroblastos embrionários de rato (MEFs), uma linhagem de células de hepatoma do rato (Hepa 1-6) e fígado de rato. A expressão da proteína albumina foi detectado em hepatócitos primários de rato e rato do fígado, mas não era detectável em MEFs ou Hepa 1-6 células (Figura 3).
Para determinar se os efeitos de rotenona na ativação de proteína hepática AMP-activated kinase (AMPK) é célula autónomos, comparamos a resposta dependente do tempo da primárias hepatócitos isolados de um fígado de rato selvagem-tipo. Hepatócitos primários foram tratados sem ou com a rotenona 10 μM para 0, 4 ou 6 h. Nestas células, tratamento de rotenona robustamente induzida por ativação da AMPK, detectadas por níveis de fosforilação aumentada na AMPK-T172 semelhantes aos vistos na vivo48 (Figura 4).
Para medir diretamente os efeitos do tratamento de rotenona na síntese de proteína nascente em hepatócitos primários, a incorporação da proteína mais de 5h de AHA não-radioativo foi avaliada através da realização do ensaio de reação de quimio-seletiva da ligadura. O tratamento com 10 rotenona μM para 5h teve profundos efeitos inibitórios sobre a síntese da proteína nascente em hepatócitos primários tratados em relação ao hepatócitos primários não tratados (Figura 5).
Figura 1: Ilustração mostra as etapas do mouse principal isolamento de hepatócitos, análise ocidental do Borrão e procedimentos de reação de quimio-seletiva da ligadura.
Figura 2: imagens morfológicas dos hepatócitos primários de rato de contraste de fase. Fotos representativas dos hepatócitos primários isolados foram adquiridas em 2, 12, 24 e 72 h após o chapeamento. Barras de escala = 100 μm.
Figura 3: análise ocidental do borrão para expressão de proteína albumina em hepatócitos primários de rato. Análise ocidental do borrão foi conduzido com o carregamento de 10 μg de proteína/lane de hepatócitos primários de rato (PMHs), fibroblastos embrionários de rato (MEFs), Hepa 1-6 células e fígado de rato. One-Way ANOVA mostrou que uma expressão de proteína albumina significativa em PMHs comparado ao MEF ou Hepa 1-6 células. Os valores são meios ± SEM do tamanho do grupo (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 ou MEFs, respectivamente. $ P < 0,001 vs. lisado do fígado.
Figura 4: indução da fosforilação de AMPK em hepatócitos mouse principal tratada com rotenona. Hepatócitos primários de um fígado de rato selvagem-tipo foram tratados com 10 rotenona μM para 0, 4 ou 6 níveis de fosforilação de h. de AMPK foram detectados pela mancha ocidental e β-actina foi usado como um controle de carregamento (10 μg de proteína era carregado/lane). Medidas repetidas ANOVA de 2 vias mostrou que o tratamento causou um aumento significativo na expressão da proteína de fosfo-AMPK em comparação com hepatócitos primários não tratados. Os valores são meios ± SEM do tamanho do grupo (n = 3). P < 0,001 vs. Hepatócitos não tratados.
Figura 5: redução da expressão da proteína nascente hepática após tratamento de rotenona. Hepatócitos primários de um fígado de rato selvagem-tipo foram tratados com 10 rotenona μM por 5h, seguido de um ensaio de síntese de proteína nascente com método de AHA não-radioativo. Níveis de síntese de proteína foram avaliados por um scanner a laser detectar a fluorescência TAMRA. Níveis de proteína total carregamento para este ensaio foram detectados pelo reagente corante coomassie.
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Discussion
Embora várias linhas de células hepáticas imortalizado foram propostas e usadas para investigar as funções do fígado49,50,,51,52, essas células geralmente faltam o importante e fundamental funções dos hepatócitos normais, tais como a expressão de albumina (Figura 3). É amplamente reconhecido, portanto, que utilizando hepatócitos primários é uma valiosa opção para examinar o fígado-fisiologia e metabolismo em cultura, apesar dos desafios de cultivo e manutenção destas células. Neste documento, nosso estudo detalha o isolamento bem sucedido dos hepatócitos primários de rato através da realização de um método de colagenase em duas fases de uma forma relativamente conveniente e eficiente. Através destes procedimentos, a maioria dos hepatócitos primários isolados dentro da cultura conservam a sua funcionalidade metabólica e estabilidade morfológica e pode ser usada para investigar as funções hepáticas incluindo proteína metabolismo, gliconeogênese, e a respiração mitocondrial.
Hepatócitos primários isolados são uma poderosa ferramenta experimental para examinar os mecanismos moleculares do metabolismo hepático. Rotenona interfere com a cadeia de transporte electrónico complexa eu atividade nas mitocôndrias e bloqueia a fosforilação oxidativa, com a síntese limitada de ATP53, como evidenciado pela ativação da AMPK (Figura 4). A ativação da AMPK desencadeia a resposta adaptativa celular que suprimir o mecanismo anabolizante para compensar o stress de deficiência de energia induzida por rotenona. Sob esta condição, detectamos com êxito a redução drástica dos níveis de síntese de proteína nascente em hepatócitos primários usando uma reação de ligadura não-radioativo, quimio-seletivo com um método de deteção de proteínas TAMRA (Figura 5). Estes resultados confirmam a importância do fornecimento de energia da mitocôndria para síntese de proteínas adequadas nos hepatócitos primários. Estas técnicas são úteis para fornecer as informações sobre uma ação de drogas ou toxicidade, em concentrações terapeuticamente relevantes no contexto da síntese de proteína hepática das condições saudáveis e doentes. Além disso, estas técnicas são aplicáveis para examinar o papel dos percursos específicos, modulando a proteína e metabolismo energético através da análise preliminares hepatócitos isolados de geneticamente manipulados ratos.
Em geral, baixo rendimento e viabilidade celular são as principais desvantagens do uso de hepatócitos primários. Esses problemas são devido a várias razões, tais como a canulação inicial, insuficiente lavagem com HBSS, concentração inadequada de colagenase, ou período de tempo-perfusão. Nosso protocolo atual otimiza essas etapas múltiplas e leva a ganhar um rendimento mais elevado e células viáveis em torno de 20 milhões/fígado/adulto ratos. Especialmente, há duas etapas essenciais: um é para ajustar a temperatura e o caudal de buffers digeridos com concentração de colagenase adequada para digerir o parênquima hepático eficientemente em 15 – 20 min da inserção da cânula até excisão de fígado, e outra é processar estas amostras de colagenases tratadas rapidamente como descrito a fim de manter as células em condições saudáveis. Quando foram realizados estudos baseados em hepatócitos isolados dentro de prazo de 48 h em muitos dados publicados, primários hepatócitos isolados com nossos procedimentos aguentamos a cultura de longo prazo (Figura 2). Com estas células, mostramos a rotulagem robusto de síntese hepática da proteína nascente através de ensaio de reação a quimio-seletiva da ligadura, embora o tempo de incubação e concentração com AHA no protocolo pode ter que ser re-otimizado em biológicas diferentes condições de células (por exemplo: fisiológico vs patológico, selvagem-tipo vs transgénicos ou nocaute/baixo células).
Em resumo, nós temos estabelecido procedimentos para analisar hepatócitos primários de rato para a síntese de proteína nascente de forma não-radioativo. Estas células respondem bem ao stress mitocondrial e exibem a supressão da síntese de proteínas com a ativação da via AMPK. Assim, estes hepatócitos isolados são valiosos modelos para investigar a fisiopatologia da proteína hepática e energia metabolismo ex vivo.
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Disclosures
Os autores indicam que eles têm não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos os Drs Joonbae Seo e Vivian Hwa sua entrada científica e discussão. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. foi apoiada pelo PRESTO da Japão de ciência e tecnologia da agência. Uma parte deste estudo foi suportada por uma concessão do NIH (P30DK078392) para o centro de núcleo de pesquisa de doença digestivo em Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
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