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Medicine

Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode

doi: 10.3791/58323 Published: October 23, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung von gesunden und funktionalen primäre Maustaste Hepatozyten. Anweisungen für die Erkennung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese durch nicht-radioaktiven Kennzeichnung Substrat wurden zum besseren Verständnis der Mechanismen, die Protein-Synthese im Rahmen des Energie-Stoffwechsel-Homöostase in der Leber.

Abstract

Hepatozyten parenchymal Zellen der Leber sind und mehrere metabolische Funktionen, einschließlich der Synthese und Sekretion von Proteinen essentiell für systemische energiehomöostase zu engagieren. Primäre Hepatozyten isoliert aus der murinen Leber bilden ein wertvolles biologische Tool um zu verstehen, die funktionellen Eigenschaften oder Veränderungen in der Leber auftreten. Hierin haben wir beschreiben eine Methode zur Isolierung und Kultur der primäre Maustaste Hepatozyten durch eine zweistufige Kollagenase Perfusion Technik durchführen und besprechen ihre Nutzung für die Untersuchung von Protein-Stoffwechsel. Die Leber einer Erwachsenen Maus ist mit Ethylenglykol-Bis Tetraacetic Säure (EGTA) und Kollagenase, gefolgt von der Isolation der Hepatozyten mit dem Dichte-Gradienten-Puffer nacheinander durchströmt. Diese isolierten Hepatozyten sind lebensfähig auf Kultur-Platten und pflegen die meisten dotierten Merkmale der Hepatozyten. Diese Hepatozyten können für die Beurteilung der Protein-Stoffwechsel, einschließlich der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese mit nicht-radioaktiven Reagenzien verwendet werden. Wir zeigen, dass die isolierte Hepatozyten leicht gesteuert werden und eine höhere Qualität und Volumen Stabilität der Verbindung mit Energie-Stoffwechsel umfassen durch die Nutzung der Chemo-selektive Unterbindung Reaktion mit einem Tetramethylrhodamine (TAMRA) Protein-Protein-Synthese Nachweisverfahren und western Blot Analysen. Daher ist diese Methode wertvolle für die Untersuchung von hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinsynthese energiehomöostase verbunden. Das folgende Protokoll werden die Materialien und Methoden für die Isolierung von qualitativ hochwertigen primäre Maustaste Hepatozyten und Erkennung der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese.

Introduction

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Eiweiß ist ein wichtiger Bestandteil der Ernährung und ca. 50 % des Trockengewichts des menschlichen Körpers besteht aus Proteinen, die mehrere biologische Merkmale und Funktionen1haben. Infolgedessen Proteinsynthese ist eines der meisten Energie raubend Ereignisse und eine Veränderung im Eiweißstoffwechsel ist stark verbunden mit der Entwicklung von Krankheiten, einschließlich Stoffwechselerkrankungen2,3,4. In der Leber Protein-Biosynthese entfallen ca. 20 – 30 % der Gesamtenergie Verbrauch5,6. Darüber hinaus Proteine Funktion als nicht nur passiv oder Bausteine der Leber, aber auch aktive Signal vermittelnde Faktoren intrazellulär oder extrazellulär, systemische Stoffwechsel7zu regulieren. Zum Beispiel verringerte Niveaus des Serum-Albumin, das synthetisiert und abgesondert von der Leber und das am häufigsten vorkommende Protein in der Plasma-8, erhöht das Risiko für Typ 2 Diabetes Entwicklung9,10, 11, während eine höhere Konzentration der Serum-Albumin protektiv gegen metabolische Syndrom12zu entwickeln. Darüber hinaus führen gestört oder Unterbrechung der sekretorischen oder Membrane-springen hepatischen Proteine, die Cholesterin-Homöostase, einschließlich Lipoproteine, LDLR und LRP1, modulieren die Entwicklung der Insulin-Resistenz, Hyperlipidämie oder Atherosklerose zu 13. daher die Identifizierung von molekularen pathophysiologischen Mechanismen, die Protein-Stoffwechsel-Störung in der Leber und seine metabolischen Komplikationen beteiligt sind möglicherweise hilfreich für die Entdeckung Roman pharmakologischen nähert sich, um den Ausbruch zu verzögern oder Stoffwechselerkrankungen wie Insulinresistenz, Diabetes und nicht-Alkoholische Fettleber zu behandeln.

Proteinsynthese ist eng an den zellulären Energiezustand (z. B.die Bildung einer Peptidbindung bei der Dehnung Schritt der Proteinsynthese benötigt 4 Phosphodiester-Anleihen14) und wird durch molekulare Signalwege, die Sinn geregelt Inter - und intra - zellulare nährstoffverfügbarkeit15,16. AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) gehört zu den intrazellulären energiesensoren, die Energie Homöostase17pflegen. Sobald AMPK aktiviert wird, wenn die zelluläre Energie-Level niedriger geworden, funktionieren AMPK und seine gezielte Substrate katabolischen Wege anzuregen und anabole Prozesse einschließlich Protein Synthese18,19zu hemmen. Die Regulierung der Protein-Synthese wird durch Phosphorylierung mehrerer Übersetzung Faktoren und ribosomale Proteine20vermittelt. Der Hinweis ist das Säugetier-Ziel von Rapamycin Komplex 1 (mTORC1), eine wichtige Triebkraft für die Proteinsynthese, eines der wichtigsten Ziele der AMPK21. Aktivierung des mTORC1-Signalwegs steigert das Zellwachstum und Proliferation durch stimulierende Protein Übersetzung und Autophagie20,21. Daher ist es logisch, dass die Aktivierung der AMPK mTORC1-vermittelten Protein Synthese22hemmen kann. In der Tat, Aktivierung der AMPK entgegenwirkt und direkt phosphorylates mTORC1 auf Threonin Rückstände 2446 (Thr2446) führt zu seiner Inaktivierung23 und Unterdrückung der Protein-Biosynthese-24. Darüber hinaus kann AMPK indirekt hemmen mTORC1 Funktion durch Phosphorylierung und Aktivierung des Tuberöse Sklerose Komplex 2 (TSC2)25 ist der upstream Regler von mTORC1 Signalkaskade. Kurzum, Dysregulation dieser Wege in der Leber ist oft in Zusammenhang mit der Entwicklung von Stoffwechselkrankheiten und deshalb gibt es eine kritische Notwendigkeit, wirksame experimentelle Instrumente zur Untersuchung der Rolle dieser Wege bei der Regulierung der Energie zu etablieren und Protein-Stoffwechsel in Hepatozyten.

Es gibt eine stärkere Ähnlichkeit zwischen den funktionellen Eigenschaften der isolierte primäre Hepatozyten und in Vivo Hepatozyten als mit in-vitro- Leber-abgeleitete Zelle Linien26,27,28. Es hat sich gezeigt, dass primären humanen Hepatozyten 77 % Ähnlichkeit mit derjenigen leberbiopsien, teilen während HepG2-Zellen, die sind gut differenzierte hepatische Krebszellen und weit verbreitet, hepatische Funktionen zu untersuchen, weniger als 48 % im Zusammenhang mit der Anzeige Genexpression profile29. Daher die Nutzung der primäre Hepatozyten, anstatt verewigt Zellkulturen, ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Leberfunktion und Physiologie und mehrere Protokolle stehen für die Isolation und die Kultur der primäre Hepatozyten vor allem von Ratten30,31. Während die Ratte Hepatocytes mit einer relativ höheren Ausbeute von Zellen nützlich sind, haben Maus Hepatozyten ein größeres Potenzial in vielen wissenschaftlichen Bereichen aufgrund der breiten Verfügbarkeit von genetisch modulierter Mäuse. Allerdings gibt es einige technische Herausforderungen gesunde und reichliche primäre Hepatozyten von Mäusen für Zelluläre und molekulare Basis Bewertungen zu isolieren: Erstens Kanüle einführen, die Leber mit Puffer Reagenzien durchspülen ist sehr schwierig zu handhaben wegen der kleinen und dünnen Maus Pfortader oder minderwertige Vena Cava; Zweitens kann eine längere Zeit der Manipulation von Zellen während der Isolation reduzierte Zelle Quantität und Qualität verursachen; Dritten, nicht-enzymatische Mechanische Trennverfahren können zu schweren Schäden führen und produzieren einen niedrigen Ertrag von lebensfähigen isolierte primäre Hepatozyten32,33. In den 1980er Jahren wurde Kollagenase Perfusion Technik zur Isolierung von Hepatozyten aus der Leber von Tieren34eingeführt. Diese Methode basiert auf Kollagenase Perfusion der Leber35,36,37, Infusion von der Leber mit Kalzium Chelator Lösung38,39, enzymatischen Verdauung und mechanische Dissoziation der hepatischen Parenchym35. In einem ersten Schritt ist eine Maus-Leber mit ein Kalzium [Ca2 +] freie Puffer mit ein [Ca2 +] Chelator (Ethylenediamine Tetraacetic Säure, EDTA) durchströmt. Im zweiten Schritt wird die Maus Leber mit Kollagenase-haltigen Puffer, um die Mobilfunk-extrazelluläre Matrix Interaktionen hydrolyseneigung durchströmt. Im Gegensatz zu den Puffer in Schritt 1 verwendet, das Vorhandensein von [Ca2 +] Ionen im Puffer des zweiten Schrittes ist erforderlich für effektive Kollagenase Aktivität, nach denen die verdaute Leber hat weiter sanft und mechanisch getrennt werden mit Pinzette zwischen die Hepatische Kapsel und parenchymatösen Gewebe. Zu guter Letzt Bindegewebe wird durch Filterung entfernt, und anschließende Zentrifugation trennt tragfähige Hepatozyten aus sowohl nicht-parenchymal Zellen und nicht-lebenden Hepatozyten mit dem Einsatz von Dichte Gradienten Puffer40,41 ,42. In der vorliegenden Studie zeigen wir eine modifizierte zweistufige Kollagenase Perfusion Technik, primäre Hepatozyten aus einer Maus Leber für die Analyse von Protein-Synthese zu isolieren.

Die enzymatische Proteine ist verbreitet zu quantifizieren Ausdruck Niveaus, Fluktuation, und die biologischen Verteilung von Proteinen43 wegen der hohen Empfindlichkeit der Erkennung von Radioaktivität44ermitteln. Allerdings erfordert die Verwendung von radioaktiven Isotopen streng kontrollierte Forschung Umstände und Verfahren45. Alternative nicht-radioaktiven Methoden wurden entwickelt und haben zunehmend an Popularität gewonnen. Die Chemo-selektive Unterbindung Reaktion mit einer Tetramethylrhodamine (TAMRA) Protein Erkennungsmethode ist einer von ihnen und basiert auf die Chemo-selektiven Reaktion zwischen einem azid und Alkinen Gruppen46, die genutzt werden können, wie z. B. zelluläre Ereignisse zu analysieren Erkennung von entstehenden Protein-Synthese und Unterklassen von Glykoproteinen modifiziert mit einer azid-Gruppe. Für die im Entstehen begriffene Proteinsynthese kann L-Azidohomoalanine (L-AHA, eine azid-modifizierte Aminosäure) metabolisch in Proteine aufgenommen und mithilfe der TAMRA Protein Erkennung Methode47erkannt. Durch die Verwendung dieser Assay in primäre Maustaste Hepatozyten, wir zeigen, dass die entstehenden Protein-Synthese-Rate von Mitochondrien, die Verfügbarkeit von ATP eng ist und die AMPK Aktivierung (Abbildung 1).

Zusammenfassend lässt sich sagen, Nutzung der primäre Maustaste Hepatozyten ist entscheidend für die Untersuchung von Protein und Energie-Stoffwechsel und Quantifizierung der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese ist wertvoll für Einblicke in die physiologische Rolle von Wege für die Entwicklung und Heilung von Hepatozyten-Erkrankungen.

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Protocol

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Dieses Protokoll enthält die Verwendung von Labormäusen. Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden nach Verfahren genehmigt von den Ausschüssen der Tierbetreuung des Cincinnati Children Hospital Medical Center durchgeführt.

1. Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten

  1. Pre-Isolierung-Vorbereitungen
    1. Bereiten Sie 450 mL 40 % Dichte-Gradienten-Puffer, wie in Tabelle 1 und halten bei 4 ° C (15 mL/Maus) beschrieben.
    2. 500 mL Williams' Medium wie in Tabelle 1 beschrieben vorbereiten und halten bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie 500 mL DMEM vor, wie in Tabelle 1 beschrieben, und halten Sie auf dem Eis (30 mL/Maus).
    4. Bereiten Sie 500 mL HBSS (-) Puffer, wie in Tabelle 1 und halten bei 42 ° C im Wasserbad (40 mL/Maus) beschrieben.
    5. 500 mL HBSS (+) Puffer mit 0,3 mg/mL Kollagenase Typ X vorzubereiten, wie in Tabelle 1 mit 30 min Inkubation bei 42 ° C im Wasserbad beschrieben (40 mL/Maus).
    6. Richten Sie die Perfusion Pumpe durch Platzierung den intravenöse (IV)-Verwaltung-Schlauch über das bistabile Fußpedal und Überprüfung des Spülung Lösung ohne Luftblasen.
    7. Wärmen Sie die Rohr-Heizung bei 42° C.
    8. Die Zentrifuge Maschine auf 4 ° c abkühlen
  2. Anästhesie und Durchblutung
    1. Reinigen Sie die Arbeitsbereiche und die Pumpe.
    2. Die Pumpe angeschlossen IV-Röhre mit 70 % igem Ethanol 10 min. lang gründlich ausspülen.
    3. Entfernen Sie die restliche Ethanol aus der Pumpe angeschlossen IV Tube durch Spülen mit DDW ganz für 10 min.
    4. Wischen Sie die Schere und Zange mit 70 % Ethanol.
    5. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Plastikbehälter mit einem Netz-Boden und mit 2 mL Isofluran-getränkten Gaze unter das Netz um den direkten Kontakt zu vermeiden.
    6. Esel die Tiefe der Narkose durch Pedal Reflex (feste Zehe Prise).
    7. Entfernen Sie die Maus, wenn sie die gewünschte Tiefe der Narkose erreicht hat.
      Hinweis: Die Induktionszeit der Narkose sollte nicht mehr als 1 Minute.
    8. Konstruieren Sie einen Nase Kegel mit eine 15 mL konische Röhrchen mit 1 mL Isofluran-getränkten Pad bis zum Ende des Rohres geschoben.
    9. Steuern Sie die Tiefe der Narkose durch die bugnase näher oder Weg von den Nasenlöchern Maus verschieben.
    10. Platzieren Sie den Mauszeiger auf die Arbeitsbühne mit der Bauchseite nach oben.
    11. Spray 70 % igem Ethanol über den Bauchbereich der Maus und öffnen Sie dann die Bauchhöhle machen einen großen quer-Schnitt der Dermis und Bauchfell mit scharfen Schere und gezahnten Zangen.
    12. Nehmen Sie dann einen vertikalen Schnitt der Abdominal-Schichten, bis alle Bauchorgane vollständig ausgesetzt sind, mit scharfen Schere und gezahnten Zangen.
    13. Kleine Bewegung und Dickdarm auf der linken Seite der Maus mit autoklaviert Wattetupfer bis Leber, der Pfortader und der unteren Hohlvene (IVC) sind eindeutig ausgesetzt.
    14. Legen eines Katheters 24 G in IVC nur an der Bifurkation mit rechts renal Vene sorgfältig ohne Händeschütteln zur Vermeidung von Verletzungen der IVC und Blutungen.
      Hinweis: Wenn Blutung auftritt, während Sie den Katheter in IVC einfügen, dann sollten Sie den neuen Katheter in eine Pfortader einfügen.
    15. Entfernen Sie die Nadel des Katheters und Steuern Sie die Position der Kanüle zu vermeiden, aus IVC, dann verbinden Sie 24 G Kanüle mit Perfusion Rohr mithilfe des Connectors.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Anwesenheit von Luftblasen vor Beginn der Perfusion.
    16. Starten Sie die Perfusion der Leber mit warmen HBSS (-) bei einer Durchflussmenge von 4 mL/min und die Milz Vene schnell zu internen Blut abfließen, durch mit einer Schere abgeschnitten.
      Hinweis: Wenn die Kanülierung erfolgreich ist, beginnt die Leber aufgrund der Verteilung der Rückfluss des Puffers von IVC hepatische Adern Blanchieren. Die Pfortader entsteht durch die Vereinigung von Milz und überlegenen mesenterialen Adern; Daher ist es ziemlich sicher, die Milz Vene zu schneiden, da es groß und distal aus der Leber.
    17. Perfusion mit 35 mL warmen HBSS (-) weiter.
      Hinweis: Die Leber wird blass in der Farbe reicht die Durchblutung und die Maus immer noch lebendig in Narkose in diesem Stadium.
  3. Verdauung und Extraktion
    1. Durchspülen Sie die Maus-Leber mit warmen 35 mL HBSS (+) darunter Kollagenase Typ X mit einer Durchflussrate von 4 mL/min.
    2. Alle paar Minuten, Klemmen Sie die Milz Vene mittels Zange für ~ 10 s, um das gesamte Volumen der HBSS (+) in allen anatomischen Teilen der Leber verbreiten lassen.
      Hinweis: Leber beginnt zu Schwellen nach dem Spannen der Milz Vene durch Puffer Überlastung.
    3. Gießen Sie 5 mL der zubereiteten warmen HBSS (+) in 100 mm Petrischale am Ende des Prozesses Perfusion mit Kollagenase Typ X.
    4. Schneiden Sie die PERFUNDIERTEN Leber vom Rest des Körpers vor dem Anhalten der Pumpe, um den Rückfluss des Blutes in der Leber zu vermeiden, Entfernen der Gallenblase durch Zange, und wischen dann die Leber vorsichtig mit einem Papiertuch, das Blut zu entfernen.
    5. Übertragen Sie die Leber auf der Petrischale enthält 5 mL der zubereiteten warmen HBSS (+) und entfernen Sie die Leber Kapsel vorsichtig mit geraden Spitzen Pinzette zu.
      Hinweis: Die Leber Kapsel ist eine dünne Schicht von Bindegewebe, dass rund um die Leber.
    6. Zerstreuen Sie parenchymal Gewebe sorgfältig mit der Pinzette. Geben Sie 15 mL kalte DMEM in der Petrischale.
      Hinweis: Das Medium schaltet bewölkt wegen parenchymal Zellen wenn die Leber gut verdaut wird.
    7. Schütteln Sie die zerrissene Leber sanft zur Freigabe der restlichen parenchymal Zellen in das Medium und eine weitere 15 mL kalte DMEM in der Petrischale, die restlichen Zellen zu bekommen.
    8. DMEM mit der gelösten Leber über 100 μm Zelle Sieb in ein 50 mL konische Rohr übertragen und im Eis zu halten.
  4. Reinigung
    1. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 60 X g für 2 min bei 4 ° C, sorgfältig entfernen des Überstands durch Vakuum Aspiration und das Pellet in 10 mL DMEM Aufschwemmen.
    2. Füge resuspendierte Pellet als eine dünne Schicht auf der Oberseite 40 % Dichte-Gradienten-Puffer und Zentrifugieren bei 800 x g für 10 min ohne Bremse bei 4° C.
    3. Entfernen Sie vorsichtig überstand auch die obere Schicht (DMEM) und die mittlere Schicht (tot oder nicht-parenchymal Zellen), aber nicht die untere Schicht (Pellet: primäre parenchymatösen Hepatozyten).
    4. Aufschwemmen Sie Primärzellen mit 2 – 3 mL William mittlere E, und übertragen Sie auf die neue 50 mL-Tube zur Vermeidung von Kontaminationen von abgestorbenen Zellen an der Wand des Rohres.
    5. 7-8 mL William Medium E hinzufügen, vorsichtig mischen und Zentrifugieren bei 800 X g für 1 min bei 4 ° C.
    6. Entfernen Sie vorsichtig Überstand durch Vakuum Aspiration und dann Aufschwemmen Sie Pellet wieder mit 10, 20 oder 30 mL Wilhelms Medium E (je nach Größe der Tablette).
    7. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zelle Zählers.
    8. Saatgut mit Wilhelms Medium E, halten Sie die Platte in einem Inkubator bei 37° C für ca. 2-3 h, ersetzen dann die mittlere with10 % FBS DMEM Medium mit Anti-Anti um Toten oder ungebunden Zellen zu entfernen und für Übernachtung Inkubation bei 37 ° C.
    9. Am nächsten Tag sind primäre Maustaste Hepatozyten bereit für Versuchszwecke.

2. Chemo-selektive Unterbindung Reaktion Test für den Nachweis der im Entstehen begriffenen Proteinsynthese

  1. Metabolische Kennzeichnung
    1. (Vorbehandlung) Waschen Sie primäre Hepatozyten mit 37 ° C warmen PBS zweimal und fügen Sie das Methionin-freie DMEM Medium für 30 min, zum Abbau der zytoplasmatischen Methionin behält sich.
      Hinweis: L-Azidohomoalanine, ist eine Aminosäure und Analog zu Methionin, enthält eine Azido-Verbindungsgruppe, die in Proteine bei Biosynthese von zellulären Proteinen integriert werden kann, so dass Erschöpfung der zytoplasmatischen Methionin die Fütterung verbessern und die Einbeziehung der L-Azidohomoalanine in neu synthetisierte Proteine des kultivierten primäre Hepatozyten.
    2. (Behandlung) Wash primäre Hepatozyten mit 37 ° C warme PBS zweimal und fügen Sie das Methionin-freie DMEM-Medium mit 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) für 4 – 6 h.
    3. Fügen Sie einer bestimmten Chemikalie (d.h. 10 μM Rotenon) in das Medium für 4 – 6 h in Anwesenheit von AHA um seine Wirkung auf die im Entstehen begriffene proteingehalte Ausdruck zu untersuchen.
    4. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium durch Vakuum Aspiration und waschen Sie primäre Hepatozyten mit kaltem PBS dreimal.
    5. Die Platte 200 μL Lyse Puffer hinzu und inkubieren Sie für 15-30 min auf Eis, dann kippen Sie die Platte und nehmen Sie die ganze Zelle lysate in 1,7 mL-Tube.
      Sie sollten beachten, dass diese Zelle lysate während der Zelle Ernte sehr klebrig ist.
    6. Beschallen die Zelle lysate auf Eis für 5 s dreimal mithilfe einer Sonde sonikator zu solubilisieren die Proteine und die DNA zu zerstreuen.
    7. Wirbel der Zelle lysate für 5 min zentrifugieren die Zelle lysate 21.130 x g für 10 min bei 4 oC und übertragen dann den klaren überstand in einen neuen Schlauch. Die Proteinkonzentration zweimal zu messen.
      Hinweis: In diesem Stadium können Proteinproben bei-20 ° C für zwei Wochen gespeichert, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  2. Kennzeichnung der azid-modifizierte entstehenden Proteins
    1. Bereiten Sie die Komponenten (A + B) durch Zugabe von 60 μL der Komponente (A) zu Komponente (B).
      Hinweis: Die Lösung färbt sich zu leuchtend rosa in der Farbe nach Komponente hinzufügen (A) (B).
    2. Bereiten Sie den Puffer (D) und (E) gemäß des Protokolls.
    3. Nehmen Sie 20 – 40 μg Zelle lysate und fügen 50 μL 2 x Reaktion Puffer (Komponente A + B), dann die Lautstärke auf 80 μl durch Hinzufügen von DDW und Wirbel für 5 s.
    4. Fügen Sie 5 μL CuSO4 (Komponente C), und Wirbel für 5 s.
    5. Fügen Sie 5 μL Reaktion Puffer Additiv 1 (frisch zubereitete Komponente D) dann Wirbel für 5 s und 3 min warten.
    6. Fügen Sie 10 μL rekonstituiert Reaktion Puffer Additiv 2 (Komponente E), dann Wirbel für 5 s und drehen Proben 20 min bei 4 ° C mit Hilfe einer Multi-Rotator-Maschine.
      Hinweis: Die Lösung färbt sich zu helle Orange Farbe nach dem Hinzufügen von Komponenten (E). Die Proben sollten vor Licht geschützt werden, während der Rotation.
    7. Fügen Sie 300 μL Methanol und Wirbel für 5 s, fügen 75 μl Chloroform und Wirbel für 5 s, dann fügen Sie 200 μL DDW und Wirbel für 5 s.
    8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 21.130 x g und 4° C für 5 min, dann verwerfen des wässrigen Überstands und halten das Pellet.
    9. Am Rohr, Wirbel und Spin wieder für 5 min bei 21.130 x g. 250 μL Methanol hinzufügen
    10. Verwerfen des Überstands dann decken die Proben mit einem fusselfreien Tuch und die Pellets für 15 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen.
  3. Seitenanalyse und westliche Beflecken
    1. Lösen Sie das Pellet in 20 μl Puffer ohne β-Mercaptoethanol, Wirbel für 10 min, bei 70 ° C Hitze mit Heizblock für 10 min zu laden. Laden Sie dann die Proben in 10 % SDS-Gel (1,5 mm) für Tetramethylrhodamine (TAMRA) Erkennung.
    2. Erkennen Sie AHA-Signal mit einer Variablen Modus-Laser-Scanner für präzise Quantifizierung der im Entstehen begriffenen Proteine.
    3. Waschen Sie das Gel mit DDW für 15 Minuten.
    4. Dann färben Sie das 10 % SDS-Gel mit einem schnellen und sensiblen Coomassie-Färbung-Reagenz für 15-60 min, total Proteine als Steuerelement zu erkennen.
    5. De-Fleck das Gel mit DDW für 1 – 2 h und das Bild durch die Verwendung eines UV-Fluoreszenz-Imagers zu erwerben.

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Representative Results

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Primäre Maustaste Hepatozyten Isolation ergibt sich eine Rendite von ca. 20 x 106 total Zellen/Maus. Histologisch, live und angefügte primäre Hepatozyten erscheinen polygonalen oder typische sechseckige Form mit klar umrissen membranöse Begrenzung nach 24 h Inkubation (Abbildung 2).

Um zu bestätigen, ob isolierte Zellen primäre Hepatozyten sind, verglichen wir Ausdruck Niveaus des Proteins Albumin in isolierte primäre Maustaste Hepatozyten (PMHs), Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs), eine Maus-Hepatom-Zell-Linie (Hepa 1-6) und Maus Lebern. Albumin-Protein-Expression in primäre Maustaste Hepatozyten und Maus Lebern erkannt wurde, aber war nicht nachweisbar in MEFs oder Hepa 1-6 Zellen (Abbildung 3).

Um festzustellen, ob die Auswirkungen der Rotenon auf hepatische AMP-activated Protein Kinase (AMPK) Aktivierung ist Zelle-autonom, verglichen wir die zeitabhängige Reaktion der primäre Hepatozyten isoliert aus der Leber von Wildtyp Maus. Primäre Hepatozyten wurden ohne oder mit 10 μM Rotenon für 0, 4 oder 6 h behandelt. In diesen Zellen Rotenon Behandlung robust induzierte AMPK Aktivierung, wie durch eine erhöhte Phosphorylierung auf AMPK-T172 ähnlich erkannt gesehen in Vivo48 (Abbildung 4).

Um die Auswirkungen der Rotenon Behandlung auf die im Entstehen begriffene Proteinsynthese in primäre Hepatozyten direkt zu messen, wurde die Einbeziehung von nicht-radioaktiven AHA in Protein über 5 h durch Ausführen des Chemo-selektive Unterbindung Reaktion Tests beurteilt. Behandlung mit 10 μM Rotenon für 5 h hatte profunde hemmende Effekte auf die im Entstehen begriffene Proteinsynthese in behandelten primäre Hepatozyten im Vergleich zu unbehandelten primäre Hepatozyten (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Eine Illustration zeigt die Schritte der primäre Maustaste Hepatozyten Isolation, western-Blot Analyse und Chemo-selektive Unterbindung Reaktion Verfahren.

Figure 2
Abbildung 2: Phase Kontrast morphologischen Bilder der primäre Maustaste Hepatozyten. Repräsentative Bilder isolierte primäre Hepatozyten wurden auf 2, 12, 24 und 72 h nach Beschichtung erworben. Skalieren von Balken = 100 μm.

Figure 3
Abbildung 3: Western-Blot Analyse für Albumin Protein-Expression in primäre Maustaste Hepatozyten. Western-Blot Analyse wurde mit dem Laden von 10 µg Protein/Bahn von Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs), primäre Maustaste Hepatozyten (PMHs), Hepa 1-6 Zellen und Maus Lebern durchgeführt. Einfache ANOVA zeigte eine signifikante Albumin-Protein-Expression in PMHs MEF oder Hepa 1-6 Zellen verglichen. Werte sind Mittel ± SEM der Gruppengröße (n = 3). P, #P < 0,001 Vs. HEPA 1-6 oder MEFs, beziehungsweise. $ P < 0,001 Vs. Leber lysate.

Figure 4
Abbildung 4: Induktion der Phosphorylierung von AMPK in Rotenon behandelt primäre Maustaste Hepatozyten. Primäre Hepatozyten aus einem Wildtyp Maus-Leber mit 10 μM Rotenon behandelt wurden, für 0, 4 oder 6 h. Phosphorylierung Ebenen der AMPK von westlichen Beflecken erkannt wurden und β-Aktin als ein Steuerelement laden diente (10 µg Protein war geladen/Bahn). Wiederholte Messungen zeigten 2-Way ANOVA, dass Behandlung eine deutliche Steigerung in Protein-Expression des Phospho-AMPK im Vergleich zu unbehandelten primäre Hepatozyten verursacht. Werte sind Mittel ± SEM der Gruppengröße (n = 3). P < 0,001 Vs. Unbehandelte Hepatozyten.

Figure 5
Abbildung 5: Reduzierung der hepatischen im Entstehen begriffenen Proteinexpression Nachbehandlung Rotenon. Primäre Hepatozyten von Wildtyp Maus Leber wurden mit 10 μM Rotenon für 5 h, gefolgt von einem entstehenden Protein-Synthese-Assay mit nichtradioaktiven AHA-Methode behandelt. Protein-Synthese-Ebene wurden durch einen Laser-Scanner erkennt die TAMRA Fluoreszenz bewertet. Insgesamt proteingehalte Laden dieser Assay wurden durch das Reagenz Coomassie-Färbung nachgewiesen.

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Discussion

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Obwohl mehrere verewigt hepatische Zelllinien vorgeschlagen und Leberfunktionen49,50,51,52untersucht wurden, fehlen diese Zellen in der Regel die wichtige und grundlegende Funktionen des normalen Hepatozyten, z. B. den Ausdruck von Albumin (Abbildung 3). Es ist daher allgemein anerkannt, dass primäre Hepatozyten eine wertvolle Option für die Prüfung von Leber Physiologie und Stoffwechsel in Kultur, trotz der Herausforderungen für die Kultivierung und Pflege dieser Zellen ist. Hierin beschreibt unsere Studie die erfolgreichen Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten durch die Durchführung einer zweistufigen Kollagenase-Methode in eine relativ komfortable und effiziente Weise. Durch diese Verfahren, die Mehrheit der isolierte primäre Hepatozyten innerhalb der Kultur behalten ihre metabolische Funktionen und morphologische Stabilität und kann verwendet werden, für die Untersuchung von hepatischen Funktionen einschließlich Protein Stoffwechsel, Glukoneogenese, und die mitochondriale Atmung.

Isolierte primäre Hepatozyten sind ein mächtiges experimentelles Werkzeug, Molekulare Mechanismen der hepatischen Energiestoffwechsel zu untersuchen. Rotenon stört den Elektronentransport-Kette komplexer ich Aktivität in den Mitochondrien und Oxidative Phosphorylierung mit der begrenzten Synthese von ATP53, Blöcke, wie Sie durch die Aktivierung von AMPK (Abbildung 4). Die AMPK Aktivierung löst die zellulären adaptive Reaktionen, die unterdrücken den anabolen Mechanismus um den Rotenon-induzierte Energie-defizienten Stress zu kompensieren. Unter dieser Bedingung erkannt wir erfolgreich die drastische Reduktion der im Entstehen begriffenen Protein-Synthese-Ebene in primäre Hepatozyten mit einer nicht-radioaktiven, Chemo-selektive Unterbindung Reaktion mit ein TAMRA Protein-Nachweisverfahren (Abbildung 5). Diese Ergebnisse bestätigen die Bedeutung der Energieversorgung aus den Mitochondrien für die entsprechenden Proteinsynthese in primäre Hepatozyten. Diese Techniken sind nützlich, um Informationen über eine Wirkdauer oder Toxizität in therapeutisch relevanten Konzentrationen im Zusammenhang mit der hepatischen Proteinsynthese von gesundem und krankem Bedingungen bieten. Darüber hinaus diese Techniken gelten für die Prüfung der Rolle bestimmte Signalwege modulieren Protein und Energiestoffwechsel durch die Analyse der primäre Hepatozyten isoliert von genetisch manipulierte Mäuse.

Im Allgemeinen sind geringe Ausbeute und Zellviabilität wesentliche Nachteile des Einsatzes von primäre Hepatozyten. Diese Fragen sind aus mehreren Gründen wie erste Kanülierung, unzureichende waschen mit HBSS, unangemessene Konzentration der Kollagenase, oder lang-Perfusion. Unsere aktuellen Protokoll optimiert diese mehrere Schritte und führt zu eine höhere Ausbeute und lebensfähigen Zellen um 20 Millionen/Leber/Erwachsene Mäuse zu gewinnen. Vor allem gibt es zwei wichtige Schritte: man ist die Anpassung der Temperatur und die Strömungsgeschwindigkeit des verdauten Puffer mit richtigen Kollagenase Konzentration der hepatische Parenchym effizient in 15-20 min vom Kanüle einführen bis Leber Exzision zu verdauen und ein weiteres ist verarbeiten diese Collagenases behandelt Proben schnell wie beschrieben um Zellen im gesunden Zustand zu halten. Während isolierte Hepatozyten-basierten Studien innerhalb 48 h Zeit in vielen veröffentlichten Daten durchgeführt wurden, ertragen primäre Hepatozyten mit unseren Verfahren isoliert die längerfristige Kultur (Abbildung 2). Mit diesen Zellen zeigen wir die robuste Kennzeichnung der hepatischen entstehenden Protein-Synthese durch die Chemo-selektive Unterbindung Reaktion Assay, obwohl die Konzentration und Inkubation Zeit mit AHA im Protokoll möglicherweise in verschiedenen biologischen neu optimiert werden Bedingungen der Zellen (z. B. physiologische vs. pathologische, Wild-Type vs. transgenen oder Knockout/Zellen).

Zusammenfassend haben wir Verfahren zu analysieren, primäre Maustaste Hepatozyten für die im Entstehen begriffene Proteinsynthese in gewissem Sinne nicht radioaktiv etabliert. Diese Zellen reagieren gut auf mitochondrialer Stress und Unterdrückung der Proteinsynthese mit Aktivierung des Signalwegs AMPK aufweisen. So sind diese isolierten Hepatozyten wertvolle Modelle zur Untersuchung der Pathophysiologie der hepatische Protein und Energie Stoffwechsel ex Vivo.

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Disclosures

Die Autoren weisen darauf hin, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

DRS. Joonbae Seo und Vivian Hwa danken wir für ihre wissenschaftlichen Beiträgen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health (NIH) (R01DK107530) unterstützt. T.n. wurde durch das PRESTO aus Japan Science and Technology Agency unterstützt. Ein Teil dieser Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von NIH (P30DK078392) für die Magen-Darm-Krankheit Forschungszentrum Kern in Cincinnati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24 G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple - Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps

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Isolierung der primäre Maustaste Hepatozyten für entstehende Protein Synthese Analyse von nicht-radioaktiven L-Azidohomoalanine Kennzeichnung Methode
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Salem, E. S. B., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).More

Salem, E. S. B., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).

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