Summary
Vi præsenterer her, en protokol til isolering af sunde og funktionelle primære mus hepatocytter. Instruktioner til påvisning af hepatisk spirende proteinsyntese af ikke-radioaktive mærkning substrat blev givet til at hjælpe med at forstå de mekanismer, der ligger til grund proteinsyntesen i forbindelse med energi-stofskifte homøostase i leveren.
Abstract
Hepatocytter er parenkymalt celler i leveren og engagere flere metaboliske funktioner, herunder syntese og sekretion af proteiner afgørende for systemisk energi homøostase. Primære hepatocytter isoleret fra murine leveren udgør et værdifuldt biologiske redskab for at forstå de funktionelle egenskaber eller forandringer opstår i leveren. Heri vi beskrive en metode til isolering og kultur af primære mus hepatocytter ved at udføre en to-trins collagenase perfusion teknik og diskutere deres udnyttelse for at undersøge protein metabolisme. Lever af en voksen mus er sekventielt perfunderet med ethylenglycol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, efterfulgt af isolering af hepatocytter med tæthed gradient buffer. Disse isolerede hepatocytter er levedygtige på kultur plader og vedligeholder størstedelen af begavet Karakteristik af hepatocytter. Disse hepatocytter kan bruges til vurdering af protein metabolisme herunder spirende proteinsyntese med ikke-radioaktive reagenser. Vi viser, at de isolerede hepatocytter styres let og omfatte en højere kvalitet og volumen stabilitet af proteinsyntesen knyttet til energimetabolisme ved at udnytte kemo-selektiv ligatur reaktionen med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein metode til påvisning og western blotting analyser. Derfor, denne metode er værdifuld for at undersøge hepatisk spirende proteinsyntesen knyttet til energi homøostase. Følgende protokol skitserer de materialer og metoder til isolering af høj kvalitet primære mus hepatocytter og påvisning af spirende proteinsyntesen.
Introduction
Protein er et vigtigt element, ernæringsmæssige og ca. 50% af tørvægt af en menneskelige krop er sammensat af proteiner, som har flere biologiske egenskaber og funktioner1. Derfor, proteinsyntesen er en af de mest energi forbrugende begivenheder og en ændring i protein metabolisme er stærkt forbundet med udviklingen af sygdomme, herunder metaboliske sygdomme2,3,4. I leveren, proteinsyntese tegner sig for ca. 20-30% af samlede energi forbrug5,6. Derudover proteiner funktion som ikke kun passiv eller byggeklodser af leveren, men også aktive signal-mægle faktorer intracellulært eller extracellularly at regulere den systemiske stofskifte7. For eksempel, reducerede niveauer af serum albumin, der syntetiseres og udskilles af leveren og de mest rigelige proteiner i plasma8, øger risikoen for type 2 diabetes udvikling9,10, 11, hvorimod en højere koncentration af serum albumin er beskyttende mod udvikle stofskiftesyndrom12. Desuden kan forstyrret eller afbrydelse af sekretoriske eller membran-bundet hepatisk proteiner, som modulerer kolesterol homøostase, herunder lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til udviklingen af insulinresistens, hyperlipidæmi eller åreforkalkning 13. derfor identifikation af molekylære patofysiologiske mekanismer, der er involveret i protein metabolisme forstyrrelse i leveren og dens tilknyttede metaboliske komplikationer kan være nyttig for at opdage roman farmakologiske tilgange for at forsinke starten eller behandling af metaboliske sygdomme som insulinresistens, diabetes og ikke-alkoholiske fedtlever.
Proteinsyntese er tæt knyttet til cellulære energi status (f.eks.dannelse af en peptidbinding under trinnet brudforlængelse af proteinsyntesen kræver 4 phosphodiester obligationer14) og er reguleret af molekylære processer, der fornemmer Inter - og intra cellular næringsstoftilgængelighed15,16. AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en af de intracellulære energi sensorer, at opretholde energi homøostase17. Når AMPK aktiveres når cellulære energi niveauer bliver lavere, funktion AMPK og sin målrettede substrater til at stimulere kataboliske veje og hæmme anabolske processer, herunder protein syntese18,19. Regulering af proteinsyntesen er medieret af fosforylering af flere oversættelse faktorer og ribosomale proteiner20. Af note er pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en vigtig drivkraft i proteinsyntesen, en af de vigtigste mål i AMPK21. Aktivering af mTORC1 pathway øger cellevækst og spredning af stimulerende proteiner oversættelse og autophagy20,21. Derfor er det logisk, at aktivering af AMPK kan hæmme mTORC1-medieret protein syntese22. Aktivering af AMPK modvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på Threonin rester 2446 (Thr2446) fører til dets inaktivering23 og undertrykkelse af protein biosyntesen24. Desuden kan AMPK indirekte hæmme mTORC1 funktionen ved fosforylering og aktivering af knolde sklerose komplekse 2 (TSC2)25 , som er opstrøms af mTORC1 signaling kaskade. Kort sagt, dysregulering af disse veje i leveren er ofte knyttet til udviklingen af metaboliske sygdomme og der er derfor et kritisk behov for at etablere effektive eksperimentelle værktøjer til at undersøge rollen, som disse veje i reguleringen af energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Der er en større lighed mellem de funktionelle egenskaber af isolerede primære hepatocytter og i vivo hepatocytter end med in vitro- leveren-afledte celle linjer26,27,28. Det er påvist, at primære humane hepatocytter del 77% lighed med der lever biopsier, hvorimod HepG2 celler, som er godt differentieret hepatisk kræftceller og almindeligt anvendt til at undersøge hepatisk funktioner, vise mindre end 48% i forbindelse med genekspression profiler29. Derfor, udnyttelse af primære hepatocytter, snarere end udødeliggjort kultur celler, er af vital betydning i efterforskningen af leverens funktion og fysiologi, og flere protokoller er tilgængelige for isolation og kultur af primære hepatocytter især fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttigt med et relativt højere udbytte af celler, har mus hepatocytter et større potentiale i mange videnskabelige aspekter på grund af den store tilgængelighed af genetisk moduleret mus. Der er dog flere tekniske udfordringer i isolere sund og rigelige primære hepatocytter fra mus for Cellulær og molekylær-baserede vurderinger: første kanyle indsættelse til perfuse leveren med buffer reagenser er meget vanskeligt at håndtere på grund af den lille og tynd mus portal vene eller ringere vena cava; for det andet kan længere manipulation af celler under isolation medføre reduktion i celle kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separation metoder kan resultere i alvorlige skader og producere et lavt udbytte af levedygtige isolerede primære hepatocytter32,33. I 1980 ' erne, blev collagenase perfusion teknik introduceret til isolering af hepatocytter fra lever af dyr34. Denne metode er baseret på collagenase perfusion af lever35,36,37, infusion af leveren med calcium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af hepatisk parenkym35. I det første skridt, er en mus lever perfunderet med en calcium [Ca2 +] gratis buffer indeholdende en [Ca2 +] chelator (ethylendiamin tetraacetic acid, EDTA). I andet trin af er musen leveren perfunderet med en collagenase-holdige buffer at hydrolysere cellulære-ekstracellulære matrix interaktioner. I modsætning til den buffer, der bruges i trin et, tilstedeværelsen af [Ca2 +] ioner i buffer på det andet trin er nødvendige for effektiv collagenase aktivitet, hvorefter fordøjet leveren har yderligere forsigtigt og mekanisk adskilles ved hjælp af pincet mellem den hepatisk kapsel og parenkyme væv. Endelig, bindevæv er fjernet ved filtrering, og efterfølgende centrifugering adskiller levedygtige hepatocytter fra både ikke-parenkymalt celler og ikke-levende hepatocyt med brug af tæthed gradient buffer40,41 ,42. I den foreliggende undersøgelse viser vi en modificeret totrins collagenase perfusion teknik til at isolere primære hepatocytter fra en mus lever til analyse af proteinsyntesen.
Radiolabeling af proteiner er meget udbredt at kvantificere niveauerne for udtryk, omsætning satser, og fastlægge biologiske fordelingen af proteiner43 som følge af den høje følsomhed påvisning af radioaktivitet44. Anvendelse af radioaktive isotoper kræver imidlertid meget kontrolleret forskning omstændigheder og procedurer45. Alternative ikke-radioaktive metoder er blevet udviklet og har i stigende grad vundet i popularitet. Kemo-selektiv ligatur reaktion med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein påvisningsmetode er en af dem og er baseret på den kemo-selektiv reaktion mellem et indeholder og alkyn grupper46, som kan udnyttes til at analysere cellulære begivenheder såsom påvisning af spirende proteinsyntesen og underklasser af glykoproteiner modificeret med en indeholder gruppen. For spirende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en indeholder-ændret aminosyre) metabolisk indarbejdet i proteiner og påvises ved hjælp af TAMRA protein opdagelse metode47. Ved hjælp af denne analyse i primære mus hepatocytter, vi viser, den spirende proteinsyntese sats er tæt knyttet til tilgængeligheden af ATP fra mitokondrie og AMPK aktivering (figur 1).
I Resumé, udnyttelse af primære mus hepatocytter er afgørende at undersøge protein og energi metabolisme og kvantificere spirende proteinsyntesen er værdifulde for at få indsigt i den fysiologiske rolle af veje, der er relevante for udviklingen og helbredelse af hepatocyt-relaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol indeholder brugen af laboratoriemus. Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført efter procedurer, der er godkendt af dyrs pleje udvalg af Cincinnati børn Hospital Medical Center.
1. isolering af primære mus hepatocytter
- Før isolation præparater
- Forberede 450 mL 40% tæthed gradient buffer, som beskrevet i tabel 1 og holde ved 4 ° C (15 mL/mus).
- Forberede 500 mL af Williams' Medium som beskrevet i tabel 1 og holde ved 4 ° C.
- Forberede 500 mL af DMEM som beskrevet i tabel 1 og holde på is (30 mL/mus).
- Forberede 500 mL af HBSS (-) Buffer, som beskrevet i tabel 1 og holde på 42 ° C i vandbad (40 mL/mus).
- Forberede 500 mL af HBSS (+) Buffer med 0,3 mg/mL Collagenase Type X som beskrevet i tabel 1 med 30 min inkubation ved 42 ° C i et vandbad (40 mL/mus).
- Nedsat perfusion pumpen ved at placere den intravenøse (I.V) administration slanger på tværs af latching fodpedalen og ved at kontrollere strømmen af rødmen løsning uden luftbobler.
- Varm op rør varmelegeme på 42° C.
- Køle ned centrifuge maskine til 4 ° C.
- Anæstesi og Perfusion
- Ren arbejdsområder og pumpen.
- Skyl ud pumpe-tilsluttet IV tube ved at køre 70% ethanol grundigt i 10 min.
- Fjern de resterende ethanol fra pumpe-tilsluttet IV røret ved at skylle med DDW helt op til 10 min.
- Tør saks og pincet med 70% ethanol.
- Placere musen i en plast beholder med et mesh bunden og med 2 mL isofluran-gennemblødt gaze under masken for at undgå direkte kontakt.
- Æsler dybde af anæstesi af pedal refleks (fast tå knivspids).
- Fjerne musen, når det har nået den ønskede dybde af anæstesi.
Bemærk: Forbindelse induktion af anæstesi bør ikke være mere end 1 min. - Konstruere en næsen kegle med en 15 mL konisk slange med 1 mL isofluran-gennemblødt pad skubbet til enden af røret.
- Styre dybden af anæstesi ved at flytte næsen kegle tættere eller fra mus næsebor.
- Placer musen på arbejde platform med den ventrale side opad.
- Spray 70% ethanol i abdominale område af musen og derefter åbne bughulen ved at lave en stor tværgående snit af dermis og bughinden ved hjælp af skarp saks og tandede pincet.
- Derefter gøre en lodret snit af abdominal lagene indtil alle abdominale organer er fuldstændigt eksponeret ved hjælp af skarp saks og tandede pincet.
- Flyt små og store tarmene mod venstre side af musen med autoklaveres bomuld tip indtil leveren, Vena, og ringere vena cava (IVC) er klart eksponeret.
- Indsætte en 24 G kateter i IVC lige ved tvedeling med højre nyre-vene omhyggeligt uden rystende hænder for at undgå skade af IVC og blødning.
Bemærk: Hvis blødning opstår, mens du indsætter kateteret ind IVC, så du bør prøve at indsætte den nye kateter i en portal vene. - Fjern nålen af kateteret og kontrollere placeringen af kanyle til at undgå at komme ud af IVC, så Tilslut 24 G kanyle med perfusion rør ved hjælp af stikket.
Bemærk: Undgå tilstedeværelsen af luftbobler før du starter perfusion. - Start perfusion af leveren med varm HBSS (-) med en væskehastighed på 4 mL/min og afskære den milt vene hurtigt at løbe ud den interne blod ved hjælp af saks.
Bemærk: Hvis cannulation er vellykket, leveren begynder at Blancher på grund af tilbageløb fordelingen af buffer fra IVC til hepatisk vener. Portalen vene er dannet af Unionen af milt og overlegne mesenteriallymfeknuderne vener; Derfor er det helt sikkert at skære den milt vene, da det er store og distale fra leveren. - Fortsætte perfusion med 35 mL af varm HBSS (-).
Bemærk: Leveren vil blive bleg farve hvis perfusion er tilstrækkelig, og musen stadig er i live under anæstesi på dette stadium.
- Fordøjelse og udvinding
- Perfuse mus lever med varm 35 mL af HBSS (+) herunder Collagenase Type X med en væskehastighed på 4 mL/min.
- Hvert par minutter, klemme den milt vene ved hjælp af pincet til ~ 10 s det hele omfang af HBSS (+) til diffuse i alle anatomiske dele af leveren.
Bemærk: Leveren begynder at svulme op efter fastspænding i milt vene på grund af buffer overbelastning. - Hældes 5 mL af rede varm HBSS (+) med Collagenase Type X 100 mm petriskål i slutningen af perfusion proces.
- Afskære perfused leveren fra resten af kroppen før du stopper pumpen for at undgå tilbageløb af blod i leveren, fjerner galdeblæren ved pincet og derefter tørre leveren forsigtigt med en køkkenrulle til at fjerne blod.
- Overføre leveren til petriskålen, der indeholder 5 mL af rede varm HBSS (+) og fjerne lever kapslen forsigtigt ved hjælp af straight-tippet pincet.
Bemærk: Den lever kapsel er et tyndt lag af bindevæv, omkring leveren. - Sprede parenkymalt væv omhyggeligt ved hjælp af pincet. Der tilsættes 15 mL koldt DMEM til petriskålen.
Bemærk: Medium bliver uklar på grund af parenkymalt celler hvis leveren er godt fordøjes. - Ryst revet leveren forsigtigt at frigive de resterende parenkymalt celler i mediet og tilføje en anden 15 mL koldt DMEM til petriskålen at få resten af cellerne.
- Overfør DMEM med opløst leveren gennem 100 μm celle si ind i en 50 mL konisk rør og holde i isen.
- Rensning
- Centrifugeres cellesuspension ved 60 x g i 2 min. ved 4 ° C, omhyggeligt fjernes supernatanten ved vakuum aspiration og resuspenderes i 10 mL DMEM.
- Tilføj resuspenderet pellet som et tyndt lag på toppen af 40% tæthed gradient buffer, og centrifugeres ved 800 x g i 10 min uden bremse på 4° C.
- Fjern forsigtigt supernatanten herunder det øvre lag (DMEM) og det midterste lag (døde eller ikke-parenkymalt celler), men ikke det nederste lag (Pellet: primære parenkymalt hepatocytter).
- Resuspend primærelementer med 2-3 mL William medium E, og overføre til den nye 50 mL tube til at undgå forurening af døde celler på mur af røret.
- Tilføje 7-8 mL William medium E, blandes forsigtigt og centrifugeres ved 800 x g i 1 min. ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved vakuum aspiration og derefter resuspend pellet igen med 10, 20 eller 30 mL af William's medium E (efter størrelsen af toerstoffet).
- Tælle cellerne ved hjælp af en automatiseret celle counter.
- Frø med William's medium E, holde pladen i en inkubator i 37° C i 2-3 h, derefter erstatte medium with10% FBS DMEM medium med anti-Anti at fjerne de døde eller ikke-tilknyttede celler og i natten inkubation ved 37 ° C.
- Næste dag, er primære mus hepatocytter klar til eksperimenterende brug.
2. kemo-selektiv ligatur reaktion Assay til påvisning af spirende proteinsyntese
- Metaboliske mærkning
- (Forbehandling) Vaske primære hepatocytter med 37 ° C varm PBS to gange og tilføje methionin-fri DMEM medium for 30 min til nedbryder det cytoplasmatisk methionin reserver.
Bemærk: L-Azidohomoalanine, er en aminosyre analog til methionin, indeholder en azido gruppe, der kan indarbejdes i proteiner under biosyntese af cellulære proteiner, således at nedbrydningen af cytoplasmatisk methionin vil forbedre fodring og vedtægter af L-Azidohomoalanine i nyligt syntetiserede proteiner af kulturperler primære hepatocytter. - (Behandling) Vask primære hepatocytter med 37 ° C varm PBS to gange og tilføje methionin-fri DMEM medium med 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) for 4-6 h.
- Tilføj eventuelle specifikke kemiske (dvs. 10 μM rotenon) i medium for 4-6 h i tilstedeværelse af AHA for at undersøge dens indvirkning på spirende protein udtryk niveauer.
- Efter inkubationen fjerne medium af vakuum aspiration og vaske primære hepatocytter med kolde PBS tre gange.
- Tilføje 200 μL lysisbuffer til pladen og Inkuber i 15-30 min på is, og derefter vippe pladen og tage hele cellen lysate til 1,7 mL tube.
Bemærk: Du skal observere cellen lysate er meget klistret under celle høst. - Læg instrumenterne i ultralydsbad i cellen lysate i isbad i 5 s tre gange ved hjælp af en sonde sonikator til solubilize af proteiner og sprede DNA.
- Vortex cellen lysate i 5 min, centrifugeres den lysate ved 21,130 x g i 10 min. ved 4 oC celle og derefter overføre klart supernatanten ind i et nyt rør. Måle proteinkoncentration to gange.
Bemærk: På dette stadium, protein prøver kan opbevares ved-20 ° C for to uger hvis de ikke umiddelbart anvendes.
- (Forbehandling) Vaske primære hepatocytter med 37 ° C varm PBS to gange og tilføje methionin-fri DMEM medium for 30 min til nedbryder det cytoplasmatisk methionin reserver.
- Mærkning indeholder modificerede spirende protein
- Forbered komponenter (A + B) ved at tilføje 60 μl af komponent (A) at komponent b.
Bemærk: Løsningen viser at lyse pink i farven efter at føje komponenten (A) til (B). - Forberede buffere (D) og (E) i henhold til protokollen.
- Tage 20-40 μg celle lysate og tilsættes 50 μL 2 x reaktion buffer (komponent A + B), derefter justere lydstyrken til 80 μl ved at tilføje DDW og vortex for 5 s.
- Tilsættes 5 μl CuSO4 (komponent C), og vortex for 5 s.
- Tilføj 5 μl reaktion buffer tilsætningsstof 1 (frisklavede komponent D), derefter vortex for 5 s og vente på 3 min.
- Tilsæt 10 μl rekonstitueret reaktion buffer tilsætningsstof 2 (komponent E), derefter vortex for 5 s og rotere prøver i 20 min. ved 4 ° C ved hjælp af en multi rotator maskine.
Bemærk: Løsningen viser at lyse orange farve efter tilføjer komponent (E). Prøverne skal beskyttes mod lys under rotationen. - Tilsæt 300 μl methanol og vortex for 5 s, tilføje 75 μl chloroform og vortex for 5 s, derefter tilføje 200 μl DDW og vortex for 5 s.
- Centrifugeres prøver på 21,130 x g og 4° C i 5 min, derefter supernatanten vandige og holde pelleten.
- Tilsæt 250 μL methanol til rør, vortex og spin igen for 5 min på 21,130 x g.
- Supernatanten, derefter dække prøver med en fnugfri serviet og tillade pellets blive tør til 15 min ved stuetemperatur.
- Forbered komponenter (A + B) ved at tilføje 60 μl af komponent (A) at komponent b.
- SIDERS analyse og western blotting
- Solubilize pellet i 20 μL for at indlæse buffer uden β-mercaptoethanol, vortex i 10 min, varme ved 70 ° C ved hjælp af varme blok i 10 min. Derefter indlæse prøverne i 10% SDS gel (1,5 mm) for Tetramethylrhodamine (TAMRA) påvisning.
- Registrere AHA signal ved hjælp af en variabel mode laser scanneren til præcis kvantificering af spirende proteiner.
- Vaske Gel med DDW til 15 min.
- Derefter skal pletten 10% SDS gel med en hurtig og følsomme coomassie-dye reagens for 15-60 min. til at opdage samlede proteiner som kontrol.
- De-pletten Gel med DDW for 1-2 h og erhverve billedet ved hjælp af en UV fluorescens imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære mus hepatocytter isolation medfører et udbytte på ca 20 x 106 samlede celler/mus. Histologisk, levende og vedlagte primære hepatocytter vises polygonale eller typiske sekskantede form med klart skitseret hindeagtige grænse efter 24 timers inkubation (figur 2).
For at bekræfte, om isolerede celler primære hepatocytter, forhold vi udtryk niveauer af albumin protein i isolerede primære mus hepatocytter (PMHs), mus embryonale fibroblaster (MEFs), en mus hepatoma cellelinje (Hepa 1-6) og mus lever. Albumin protein udtryk blev fundet i primære mus hepatocytter og mus lever men var ikke påviselig i enten MEFs eller Hepa 1-6 celler (figur 3).
For at afgøre, om virkningerne af rotenon på hepatisk AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) aktivering er celle-autonom, sammenlignede vi tidsafhængig svar af primære hepatocytter isoleret fra en lever af wild-type mus. Primære hepatocytter blev behandlet uden eller med 10 μM rotenon til 0, 4 eller 6 h. I disse celler, rotenon behandling håndfast induceret AMPK aktivering, som påvises ved øget fosforylering niveauer på AMPK-T172 ligner dem set i vivo48 (figur 4).
For at direkte måle virkningerne af rotenon behandling på spirende proteinsyntesen i primære hepatocytter, blev inddragelsen af ikke-radioaktive AHA i protein over 5 h vurderet ved at udføre kemo-selektiv ligatur reaktion assay. Behandling med 10 μM rotenon for 5 h havde dybe hæmmende effekter på spirende proteinsyntesen i behandlede primære hepatocytter sammenlignet med ubehandlet primære hepatocytter (figur 5).
Figur 1: En illustration viser trinene af primære mus hepatocytter isolation, western blot analyse og kemo-selektiv ligatur reaktion procedurer.
Figur 2: fase kontrast morfologiske billeder af primære mus hepatocytter. Repræsentative billeder af isolerede primære hepatocytter er anskaffet 2, 12, 24 og 72 timer efter plating. Skalere barer = 100 μm.
Figur 3: Western blot analyse for albumin protein udtryk i primære mus hepatocytter. Western blot analyse blev foretaget med indlæsning af 10 μg protein/lane fra primære mus hepatocytter (PMHs), mus embryonale fibroblaster (MEFs), Hepa 1-6 celler og mus lever. En-vejs ANOVA viste en betydelig albumin protein udtryk i PMHs i forhold til MEF eller Hepa 1-6 celler. Værdierne er middel ± SEM af gruppestørrelse (n = 3). Pedersen, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 eller MEFs, henholdsvis. $ P < 0,001 vs. lever lysate.
Figur 4: induktion af fosforylering af AMPK i rotenon-behandlede primære mus hepatocytter. Primære hepatocytter fra en wild-type mus lever blev behandlet med 10 μM rotenon for 0, 4 eller 6 h. fosforylering forvaltningsniveauer AMPK var blevet opdaget ved western blotting og β-actin blev brugt som en loading kontrol (10 μg protein blev indlæst/lane). Gentagne målinger 2-vejs ANOVA viste, at behandling forårsaget en betydelig stigning i protein udtryk for phospho-AMPK sammenlignet med ubehandlet primære hepatocytter. Værdierne er middel ± SEM af gruppestørrelse (n = 3). P < 0,001 vs. Ubehandlet hepatocytter.
Figur 5: reduktion af hepatisk spirende protein udtryk efter rotenon behandling. Primære hepatocytter fra en wild-type mus lever blev behandlet med 10 μM rotenon for 5 h, efterfulgt af en spirende protein syntese assay med ikke-radioaktive AHA metode. Protein syntese niveauer blev vurderet af en laserscanner afsløre TAMRA fluorescens. Total protein lastning niveauer for denne analyse blev opdaget af coomassie-dye reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om flere udødeliggjort hepatisk cellelinjer har været foreslået og brugt til at undersøge leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse celler generelt den vigtige og grundlæggende funktioner af normale hepatocytter, som udtryk for albumin (figur 3). Det er derfor almindeligt anerkendt, at udnytte primære hepatocytter er en værdifuld mulighed for at behandle leveren fysiologi og metabolisme i kultur, trods udfordringerne ved dyrkning og vedligeholdelse af disse celler. Heri, detaljer vores undersøgelse primære mus hepatocytter vellykket isolation ved at gennemføre en to-trins collagenase metode i en forholdsvis nem og effektiv måde. Gennem disse procedurer, størstedelen af isolerede primære hepatocytter inden for kulturen bevarer deres metaboliske funktioner og morfologiske stabilitet og kan bruges til undersøgelse af leverens funktioner herunder protein metabolisme, glukoneogenese, og mitokondriel respiration.
Isolerede primære hepatocytter er en stærkt eksperimenterende værktøj til at undersøge molekylære mekanismer af hepatisk energimetabolisme. Rotenon interfererer med elektron transportkæde kompleks aktivitet i mitokondrierne og blokerer oxidativ fosforylering med begrænset syntesen af ATP53, som det fremgår af aktivering af AMPK (figur 4). Aktiveringen af AMPK udløser de cellulære adaptive responser, der undertrykker den anabolske mekanisme til at kompensere rotenon-induceret energi-mangelfuld stress. På denne betingelse opdaget vi med held den drastiske reduktion af spirende protein syntese niveauer i primære hepatocytter ved hjælp af en ikke-radioaktiv, kemo-selektiv ligatur reaktion med en TAMRA protein påvisningsmetode (figur 5). Disse resultater bekræfter betydningen af energiforsyning fra mitokondrierne for passende proteinsyntesen i primære hepatocytter. Disse teknikker er nyttige til at give oplysninger om en stofvirkningen eller toksicitet terapeutisk relevante koncentrationer inden for rammerne af hepatisk proteinsyntese af raske og syge. Derudover disse teknikker er gældende for udvandrere fra bestemte veje modulerende protein og energimetabolisme ved at analysere primære hepatocytter isoleret fra genetisk manipulerede mus.
Generelt er lavt udbytte og cellernes levedygtighed de store ulemper ved anvendelse af primære hepatocytter. Disse spørgsmål er af flere årsager såsom indledende cannulation, utilstrækkelig vask med HBSS, upassende koncentration af collagenase, eller lang-perfusion periode. Vores nuværende protokol optimerer disse flere trin og fører til at opnå et højere udbytte og levedygtige celler omkring 20 millioner/leveren/voksen mus. Især, er der to afgørende skridt: et er at justere temperaturen og strømningshastigheden af fordøjet buffere med ordentlig collagenase koncentration at fordøje den hepatiske parenkym effektivt i 15-20 min fra kanyle indsættelse indtil leveren excision, og en anden er at behandle disse collagenases behandlet prøver hurtigt som beskrevet for at holde cellerne i sund tilstand. Mens isoleret hepatocytter-baserede undersøgelser er blevet gennemført inden for 48 timer tidsramme i mange offentliggjorte data, udholde primære hepatocytter isoleret med vores procedurer den langsigtede kultur (figur 2). Med disse celler viser vi, den robuste mærkning af hepatisk spirende proteinsyntesen gennem kemo-selektiv ligatur reaktion assay, selvom koncentration og inkubering tid med AHA i protokollen kan skal optimeres igen i forskellige biologiske betingelserne for celler (fx fysiologisk vs patologiske, wild-type vs transgene eller knockout/ned celler).
I Resumé, har vi etableret procedurer for at analysere primære mus hepatocytter for spirende proteinsyntesen i en ikke-radioaktive måde. Disse celler reagerer godt på mitokondrie stress og udstille undertrykkelse af proteinsyntese med aktivering af AMPK pathway. Således er disse isolerede hepatocytter værdifulde modeller for at undersøge Patofysiologi af hepatisk protein og energi stofskifte ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne viser, de har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Joonbae Seo og Vivian Hwa for deres videnskabelige input og drøftelser. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. blev støttet af PRESTO fra Japan videnskab og teknologi agentur. En del af denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra NIH (P30DK078392) for mave sygdom forskning Core Center i Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
