Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolasjon hepatocytes sunn og funksjonelle hovedknappen på musen. Instruksjoner for å oppdage hepatic begynnende proteinsyntese av ikke-radioaktivt merking underlaget ble gitt til å forstå mekanismene bak proteinsyntese i sammenheng med energi-metabolisme homeostase i leveren.
Abstract
Hepatocytter er parenchymal celler i leveren og engasjere flere metabolske funksjoner, inkludert syntese og sekresjon av proteiner viktig for systemisk energi homeostase. Primære hepatocytter isolert fra murine leveren utgjør et verdifullt biologiske verktøy for å forstå funksjonelle egenskaper eller endringer forekommer i leveren. Her vi beskriver en metode for isolasjon og kultur hepatocytes hovedknappen på musen ved å utføre en totrinns collagenase perfusjon teknikk og diskutere utnyttelse for å undersøke protein metabolisme. Leveren av en voksen mus er sekvensielt parfyme med etylenglykol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, etterfulgt av isolering av hepatocytter med tetthet gradert bufferen. Disse isolerte hepatocytter er levedyktig på kultur plater og opprettholde fleste utstyrt egenskaper hepatocytes. Disse hepatocytter kan brukes for vurderinger av protein metabolisme inkludert begynnende proteinsyntese med ikke-radioaktivt reagenser. Vi viser at de isolerte hepatocytter er lett kontrollert og utgjør en høyere kvalitet og volum stabilitet i proteinsyntese knyttet til energi metabolism ved å benytte chemo-selektiv ligation reaksjon med et Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein oppdagelse metode og vestlige blotting analyser. Denne metoden er derfor verdifulle for å undersøke hepatic begynnende proteinsyntese knyttet til energi homeostase. Følgende protokollen skisserer materialer og metoder for isolering av høy kvalitet hovedknappen på musen hepatocytter og påvisning av begynnende proteinsyntese.
Introduction
Protein er viktig ernæringsmessige og ca 50% av tørrvekt av en menneskekropp består av proteiner som har flere biologiske egenskaper og funksjoner1. Derfor proteinsyntese er en av de mest energi forbruker hendelsene og endring i protein metabolismen er svært knyttet til utviklingen av sykdommer, inkludert metabolske sykdommer2,3,4. I leveren, protein biosyntesen utgjør ca 20-30% av totale energi forbruk5,6. I tillegg proteiner funksjonen som ikke bare passiv eller byggesteinene i leveren, men også aktiv signal-formidling faktorer intracellulært eller extracellularly å regulere systemisk metabolisme7. For eksempel, reduserte nivåer av serum albumin, som syntetiseres og skilles ut av leveren og mest rikelig protein i plasma8, øker risikoen for type 2 diabetes utvikling9,10, 11, hvor en høyere konsentrasjon av serum albumin er beskyttende mot utvikler Metabolsk syndrom12. Videre kan forstyrret eller forstyrrelse av sekretoriske eller membran-bundet hepatic proteiner, som modulerer kolesterol homeostase, inkludert lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til utviklingen av insulinresistens, hyperlipidemi eller åreforkalkning 13. derfor identifikasjon av molekylære patofysiologiske mekanismer som er involvert i protein metabolisme forstyrrelser i leveren og dens tilknyttede metabolske komplikasjoner kan være nyttig for å oppdage romanen farmakologiske tilnærminger for å retard utbruddet eller behandle metabolske sykdommer som diabetes og insulinresistens, og alkoholfrie fettlever.
Proteinsyntese er tett knyttet til statusen celleenergien (f.eksdannelsen av en peptid obligasjon under forlengelse trinn i proteinsyntese krever 4 phosphodiester obligasjoner14) og er regulert av molekylære trasé som forstand Inter - og intra - cellular næringsstoffer tilgjengelighet15,16. AMP-aktivert protein kinase (AMPK) er en av intracellulær energi sensorer som vedlikeholder energi homeostase17. Når AMPK er aktivert når cellular energi nivåer blir lavere, fungerer AMPK og sin målrettede underlag for å stimulere katabolske veier og hemme anabole prosesser inkludert protein syntese18,19. Regulering av proteinsyntese er formidlet av fosforylering flere oversettelse faktorer og ribosomal proteiner20. Legg merke er til pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en viktig drivkraft i proteinsyntese, en av de viktigste målene for AMPK21. Aktivering av den mTORC1 veien forbedrer cellevekst og spredning av stimulerende protein oversettelsen og autophagy20,21. Derfor er det logisk at aktivering av AMPK kan hemme mTORC1-mediert protein syntese22. Faktisk aktivering av AMPK motvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på threonin rester 2446 (Thr2446) fører til inaktivering23 og undertrykkelse av protein biosyntesen24. Videre kan AMPK indirekte hemme mTORC1 funksjonen ved fosforylering og aktivering av tuberous sklerose komplekse 2 (TSC2)25 som er oppstrøms regulator av mTORC1 signalnettverk cascade. Kort sagt, feilregulering av disse i leveren er ofte knyttet til utvikling av metabolske sykdommer, og derfor er det et kritisk behov for å etablere effektive eksperimentelle verktøy for å undersøke rollen av disse i regulering av energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Det er en sterkere likhet mellom isolerte primære hepatocytter funksjonelle egenskaper og i vivo hepatocytter enn med i vitro lever-avledet cellen linjer26,27,28. Det har vist at primære menneskelige hepatocytter deler 77% likhet med at av leveren biopsier, mens HepG2 celler, som er godt differensiert hepatic kreftceller og brukte å undersøke hepatic funksjoner, vise mindre enn 48% i sammenheng med genuttrykk profiler29. Derfor utnyttelse av primære hepatocytter, i stedet for udødeliggjort kultur celler, er av avgjørende betydning i å undersøke nedsatt funksjon og fysiologi, og flere protokoller er tilgjengelig for isolasjon og kultur primære hepatocytes spesielt fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttig med en relativt høyere avkastning av celler, har musen hepatocytter større potensial i mange vitenskapelige aspekter på grunn av den bredt tilgjengeligheten av genetisk modulert mus. Det er imidlertid flere tekniske utfordringer i isolere sunn og rikelig primære hepatocytter fra mus for mobilnettet og molekylære-baserte vurderinger: først kanyle innsetting å perfuse leveren med buffer reagenser er svært vanskelig å håndtere på grunn av små og tynne mus portalen blodåre eller mindreverdig vena cava; andre kan gangen for lengre manipulasjon av celler under isolasjon forårsake reduksjon i cellen kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separasjon metoder kan føre til alvorlige skader og produsere en lav avkastning levedyktig isolert primære hepatocytter32,33. I 1980, ble collagenase perfusjon teknikken introdusert for å isolere hepatocytter fra lever av dyr34. Denne metoden er basert på collagenase perfusjon av leveren35,36,37, tilførsel av leveren med kalsium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon hepatic parenchyma35. I det første trinnet, er en mus lever parfyme med en kalsium [Ca2 +] gratis buffer inneholder en [Ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA). I det andre trinnet er musen leveren parfyme med en collagenase inneholder buffer hydrolyze mobil-ekstracellulær matrix interaksjoner. I motsetning til bufferen i trinn én, tilstedeværelsen av [Ca2 +] ioner i bufferen i det andre trinnet er nødvendig for effektiv collagenase aktivitet, hvoretter fordøyd leveren har mer forsiktig og mekanisk skilles ved hjelp av pinsett mellom de hepatic capsule og parenchymatous vev. Til slutt, bindevev fjernes ved filtrering, og påfølgende sentrifugering skiller levedyktig hepatocytter fra både ikke-parenchymal celler og ikke-levende hepatocyte med bruk av tetthet gradert buffer40,41 ,42. Studien viser vi en endret i two-step collagenase perfusjon teknikk å isolere primære hepatocytter fra en mus lever for analyse av proteinsyntese.
Radiolabeling av proteiner er mye brukt å kvantifisere uttrykk nivåene, Omsetningshastigheten, og biologiske fordelingen av proteiner43 på grunn av høy følsomheten av deteksjon av radioaktivitet44. Imidlertid krever bruk av isotopene kontrollerte forskning omstendigheter og prosedyrer45. Alternative ikke radioaktiv metoder har blitt utviklet og fått stadig i popularitet. Chemo-selektiv ligation reaksjon med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein gjenkjennings-metoden er en av dem og er basert på chemo-selektiv reaksjonen mellom en azide og alkyne grupper46, som kan benyttes til å analysere mobilnettet hendelser som registrere begynnende proteinsyntese og underklasser av glykoproteiner endret med en azide gruppe. For begynnende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en azide-modifisert aminosyre) metabolically innlemmet i proteiner og oppdaget ved hjelp av TAMRA proteinet oppdagelsen metoden47. Ved hjelp av denne analysen i hovedknappen på musen hepatocytter, viser vi at den gryende protein syntese rate er tett knyttet til tilgjengeligheten av ATP fra Mitokondrielt og AMPK Aktivisering (figur 1).
Oppsummert utnyttelse hepatocytes hovedknappen på musen er avgjørende for å undersøke den protein og energi metabolismen og kvantifisere begynnende proteinsyntese er verdifull for å få innsikt i fysiologiske rollen av relevant til utviklingen og kur av hepatocyte-relaterte sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen inneholder bruk av laboratoriet mus. Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av dyr omsorg komiteer av Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolering hepatocytes hovedknappen på musen
- Pre isolasjon forberedelser
- Forberede 450 mL 40% tetthet gradert bufferen som beskrevet i tabell 1 og holde på 4 ° C (15 mL/mus).
- Forberede 500 mL Williams' Medium som beskrevet i tabell 1 og holde på 4 ° C.
- Forberede 500 mL DMEM som beskrevet i tabell 1 og holde på is (30 mL/mus).
- Forberede 500 mL HBSS (-) bufferen som beskrevet i tabell 1 og holde på 42 ° C i vannbad (40 mL/mus).
- Forberede 500 mL HBSS (+) Buffer med 0,3 mg/mL Collagenase Type X som beskrevet i tabell 1 med 30 min incubation på 42 ° C i vannbad (40 mL/mus).
- Definere perfusjon pumpen ved å plassere intravenøs (I.V) administrasjon slangen over låsingen fotpedal og ved å kontrollere flyten av flushing løsning uten luftbobler.
- Varm opp røret ovnen på 42° C.
- Avkjøl sentrifuge maskinen til 4 ° C.
- Anestesi og perfusjon
- Rengjør arbeidsområder og pumpen.
- Skyll ut pumpe koblet IV røret ved å kjøre 70% etanol grundig i 10 min.
- Fjern gjenværende etanol fra pumpe koblet IV røret ved skylling med DDW helt i 10 min.
- Tørk av saks og tang med 70% etanol.
- Plass musen i en plastboks med en mesh i bunnen og 2 mL isoflurane-gjennomvåt gasbind under nettet for å unngå direkte kontakt.
- Esler dybden av anestesi ved pedal refleks (fast tå knip).
- Fjern musen når den har nådd ønsket dybde av anestesi.
Merk: Induksjon tidspunktet for anestesi bør ikke være mer enn 1 min. - Konstruere en nesen kjegle med et 15 mL konisk rør med 1 mL isoflurane-gjennomvåt pad presset på slutten av røret.
- Kontrollere dybden av anestesi ved å flytte nesen kjegle nærmere eller musen neseborene.
- Plass musen på arbeider plattform med ventral side vendt oppover.
- Spray 70% etanol over mageområdet museklikk og deretter åpne bukhulen gjør en stor tverrgående snitt av dermis og peritoneum med skarp saks og tenner tang.
- Deretter foreta en loddrett kutt av magesmerter lagene før alle abdominal organer er fullstendig eksponert med skarp saks og tenner tang.
- Flytte små og store tarmen mot venstre side av musen med autoklaveres bomull tips til leveren, portalen blodåre og mindreverdig vena cava (IVC) er tydelig eksponert.
- Inn et 24 G kateter IVC på bifurkasjonen med rett nyre blodåre nøye uten skjelvende hender for å unngå skade på IVC og blødninger.
Merk: Hvis blødning oppstår mens du setter inn kateter inn IVC, så bør du prøve å sette inn den nye kateter i en portalen blodåre. - Fjerne nålen av kateter kontrollere plasseringen av kanyle å unngå å få ut av IVC, og koble 24 G kanyle med perfusjon rør ved hjelp av koblingen.
Merk: Unngå tilstedeværelsen av luftbobler før perfusjonen. - Start perfusjon av leveren med varm HBSS (-) på en strømningshastighet på 4 mL/min og avskåret splenic åre raskt å tømme ut interne blodet med saks.
Merk: Hvis cannulation er vellykket, leveren vil begynne å blanch skyldes tilbakestrømming fordelingen av buffer fra IVC til hepatic årer. Portalen blodåre er dannet av unionen av splenic og overlegen hvem årer; Derfor er det helt trygt å kutte splenic åre siden det er stort og distale fra leveren. - Fortsette perfusjon med 35 mL av varm HBSS (-).
Merk: Leveren blir blek i fargen hvis perfusjonen er tilstrekkelig og musen fortsatt i live under narkose på dette stadiet.
- Fordøyelsen og utvinning
- Perfuse musen leveren med varm 35 mL HBSS (+) inkludert Collagenase Type X på en strømningshastighet på 4 mL/min.
- Noen få minutter, klemme splenic åre med tang for ~ 10 s slik at hele volumet av HBSS (+) for å spre inn i alle anatomiske deler av leveren.
Merk: Leveren begynner å hovne opp etter clamping splenic åre på grunn av buffer overbelastning. - Hell 5 mL forberedt varm HBSS (+) med Collagenase Type X i 100 mm Petriskål på slutten av perfusjon.
- Avskåret perfused leveren fra resten av kroppen før du stopper pumpen for å unngå tilbakestrømming av blodet i leveren, fjerne galleblæren av tang og tørk leveren forsiktig med et papirhåndkle fjerne blodet.
- Overføre leveren til Petriskål som inneholder 5 mL forberedt varm HBSS (+) og fjerne leveren kapselen forsiktig med straight-tipped tang.
Merk: Lever kapselen er et tynt lag av bindevev at rundt leveren. - Spre parenchymal vevet nøye ved hjelp av pinsett. Legge til 15 mL kaldt DMEM til Petriskål.
Merk: Medium slår skyet på grunn av parenchymal celler hvis leveren er godt fordøyd. - Riste revet leveren forsiktig for å frigi de gjenværende parenchymal cellene til medium og legge til en annen 15 mL kaldt DMEM til Petriskål å få resten av cellene.
- Overføre DMEM med oppløst leveren gjennom 100 μm celle sil i et 50 mL konisk rør og holde i isen.
- Rensing
- Sentrifuge celle suspensjon 60 x g i 2 minutter på 4 ° C, nøye fjerne nedbryting av vakuum aspirasjon og resuspend pellet i 10 mL DMEM.
- Legge til urinprøven som et tynt lag på 40% tetthet gradert buffer og sentrifuge på 800 x g i 10 min uten brems på 4° C.
- Fjern forsiktig nedbryting inkludert øvre laget (DMEM) og det midterste laget (død eller ikke-parenchymal celler), men ikke det nederste laget (Pellet: primære parenchymal hepatocytter).
- Resuspend primære cellene med 2-3 mL Vilhelms middels E, og overføre til den nye 50 mL tuben å unngå forurensning av døde celler på veggen av røret.
- Legge til 7-8 mL Vilhelms medium E, bland forsiktig og sentrifuge 800 x g for 1 min på 4 ° C.
- Fjern forsiktig nedbryting av vakuum aspirasjon og deretter resuspend pellets igjen med 10, 20 eller 30 mL av Vilhelms medium E (avhengig av pellet).
- Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller.
- Frø med William medium E, holde platen i en inkubator på 37° C for 2-3 h, erstatte middels with10% FBS DMEM medium med anti-Anti å fjerne død eller ikke celler og overnatting inkubasjon på 37 ° C.
- Neste dag, er hovedknappen på musen hepatocytter klar for eksperimentell bruk.
2. chemo-selektiv Ligation reaksjon analysen for påvisning av begynnende proteinsyntese
- Metabolsk merking
- (Pre-behandling) Vask primære hepatocytter med 37 ° C varmt PBS dobbelt og Legg metionin-fri DMEM mediet i 30 minutter til deplete de cytoplasmatiske metionin forbeholder seg.
Merk: L-Azidohomoalanine, er en aminosyre og analog til metionin, inneholder en azido moiety som kan innlemmes i proteiner under biosyntesen av mobilnettet proteiner slik at nedbryting av cytoplasmatiske metionin vil forbedre fôring og innlemmelse av L-Azidohomoalanine til nylig syntetisert proteiner hepatocytes kulturperler primære. - (Behandling) Vask primære hepatocytter med 37 ° C varmt PBS to ganger og legge metionin-fri DMEM mediet med 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) for 4-6 h.
- Legge noen bestemte kjemiske (dvs. 10 μM rotenon) i medium for 4-6 h i nærvær av AHA for å undersøke dets innvirkning på spirende protein uttrykk nivå.
- Etter inkubasjon fjerne mediet av vakuum aspirasjon og vask primære hepatocytter med kaldt PBS tre ganger.
- Legge til 200 μL lyseringsbuffer til plate og ruge i 15-30 min på is, så vipper plate og ta hele cellen lysate til 1,7 mL tube.
Merk: Du bør merke cellen lysate er veldig klissete under cellen høsting. - Sonicate cellen lysate på is 5 s tre ganger ved å bruke en sonde sonicator solubilize proteiner og spre DNA.
- Vortex cellen lysate i 5 minutter, sentrifuge cellen lysate 21,130 x g i 10 min på 4 oC og deretter overføre klart nedbryting inn i et nytt rør. Måle protein konsentrasjonen to ganger.
Merk: På dette stadiet, protein prøver kan lagres på 20 ° C i to uker hvis de ikke umiddelbart brukes.
- (Pre-behandling) Vask primære hepatocytter med 37 ° C varmt PBS dobbelt og Legg metionin-fri DMEM mediet i 30 minutter til deplete de cytoplasmatiske metionin forbeholder seg.
- Merking Azide endret begynnende protein
- Forberede komponentene (A + B) ved å legge til 60 μL komponent (A) til komponent (B).
Merk: Løsningen blir å lys lyserød farge etter komponent (A) til (B). - Buffere (D) og (E) i henhold til protokollen.
- Ta 20-40 μg cellen lysate og tilsett 50 μL 2 x reaksjon buffer (komponent A + B), justerer volumet til 80 μL av DDW og vortex 5 s.
- Tilsett 5 μL CuSO4 (komponent C), og vortex 5 s.
- Legg 5 μL reaksjon buffer additiv 1 (nylagde komponent D), så vortex 5 r og vente på 3 minutter.
- Legge til 10 μL rekonstituert reaksjon buffer additiv 2 (komponent E), deretter vortex 5 r og roter prøver for 20 min på 4 ° C ved hjelp av en multi rotator maskin.
Merk: Løsningen viser å lyse oransje i farge etter komponent (E). Prøvene skal beskyttes mot lys under rotasjon. - Legge til 300 μL metanol og vortex 5 s, legge til 75 μL kloroform og vortex 5 s, deretter legge 200 μL DDW og vortex 5 s.
- Sentrifuge eksemplene på 21,130 x g og 4° C i 5 minutter, deretter forkaste vandig nedbryting og holde pellet.
- Legge til 250 μL metanol rør, vortex og spinn igjen for 5 min 21,130 x g.
- Forkaste nedbryting, da dekke prøvene med lofri vevet og tillate pellets til air-dry i 15 min ved romtemperatur.
- Forberede komponentene (A + B) ved å legge til 60 μL komponent (A) til komponent (B).
- SIDEN analyse og vestlige blotting
- Solubilize pellets i 20 μL laster buffer uten β-mercaptoethanol, vortex i 10 min, varme på 70 ° C ved hjelp av varme blokk i 10 min. Deretter laste prøvene i 10% SDS gel (1,5 mm) for Tetramethylrhodamine (TAMRA) oppdagelsen.
- Gjenkjenne AHA bruker en variabel modus laser skanneren for presis kvantifisering av begynnende proteiner.
- Vask Gel med DDW i 15 min.
- Deretter flekken SDS 10% gel med en rask og følsom coomassie-dye reagens i 15-60 min å oppdage totale proteiner som en kontroll.
- De flekken Gel med DDW 1-2 h og få bildet ved hjelp av en UV fluorescens imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedknappen på musen hepatocytter isolasjon resulterer i en ytelse på ca 20 x 106 totalt celler/mus. Histologisk, live og festet primære hepatocytter vises mangekantet eller typiske Sekskantet i form med tydelig beskrevet membranous grensen etter 24-timers inkubasjon (figur 2).
For å bekrefte om isolerte celler er primære hepatocytter, sammenlignet vi uttrykk nivåer av albumin protein i isolerte hovedknappen på musen hepatocytter (PMHs), mus embryonale fibroblaster (MEFs), en mus hepatoma celle linje (Hepa 1-6) og mus lever. Albumin protein uttrykket ble oppdaget i hovedknappen på musen hepatocytter og mus lever, men var ikke i enten MEFs eller Hepa 1-6 celler (Figur 3).
For å fastslå om effekten av rotenon på hepatic AMP-aktivert protein kinase (AMPK) aktivisering celle autonome, sammenlignet vi tidsavhengige svaret primære hepatocytes isolert fra en lever av vill-type mus. Primære hepatocytter ble behandlet uten eller med 10 μM rotenon 0, 4 eller 6 h. I disse cellene, rotenon behandling robust indusert AMPK aktivisering, som oppdages av økt fosforylering nivåer på AMPK-T172 like de sett i vivo48 (Figur 4).
For å direkte måle effekten av rotenon behandling på begynnende proteinsyntese i primære hepatocytter, ble inkorporering av ikke-radioaktivt AHA protein over 5t vurdert ved å utføre chemo-selektiv ligation reaksjon analysen. Behandling med 10 μM rotenon 5 h hatt dyp hemmende effekt på begynnende proteinsyntese i behandlet primære hepatocytter sammenlignet med ubehandlet primære hepatocytter (figur 5).
Figur 1: En illustrasjon viser trinnene av hovedknappen på musen hepatocytter isolasjon og western blot analyser chemo-selektiv ligation reaksjon prosedyrer.
Figur 2: fase kontrast morfologiske bilder hovedknappen på musen hepatocytes. Representant bilder av isolerte primære hepatocytter anskaffet på 2, 12, 24 og 72 h etter plating. Skalere barer = 100 μm.
Figur 3: Western blot analyse for albumin protein uttrykk i hovedknappen på musen hepatocytter. Western blot analyse ble gjennomført med lasting av 10 μg protein/lane fra hovedknappen på musen hepatocytter (PMHs), mus embryonale fibroblaster (MEFs), Hepa 1-6 celler og mus lever. Enveis ANOVA viste en betydelig albumin protein uttrykk i PMHs forhold til MEF eller Hepa 1-6 celler. Verdiene er betyr ± SEM gruppe størrelse (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 eller MEFs, henholdsvis. $ P < 0,001 vs. lever lysate.
Figur 4: induksjon av fosforylering av AMPK i rotenon-behandlet hovedknappen på musen hepatocytter. Primære hepatocytter fra en vill-type mus lever ble behandlet med 10 μM rotenon 0, 4 eller 6 h. fosforylering nivåer av AMPK ble oppdaget av vestlige blotting og β-utgangen ble brukt som en lasting (10 μg protein var lastet/lane). Gjentatte målinger 2-veis VARIANSANALYSE viste at behandling forårsaket en betydelig økning i protein uttrykk for phospho-AMPK i forhold til ubehandlet primære hepatocytter. Verdiene er betyr ± SEM gruppe størrelse (n = 3). P < 0,001 vs. Ubehandlet hepatocytter.
Figur 5: reduksjon av hepatic begynnende protein uttrykk etter rotenon behandling. Primære hepatocytter fra en vill-type mus lever ble behandlet med 10 μM rotenon 5 h, etterfulgt av en begynnende protein syntese analysen ikke radioaktiv AHA-metode. Protein syntese nivå ble vurdert av en laser skanneren oppdager TAMRA fluorescens. Totalt protein lasting nivåer for denne analysen ble oppdaget av coomassie-dye reagensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om flere udødeliggjort hepatic cellelinjer har vært foreslått og brukes til å undersøke leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse cellene generelt viktig og grunnleggende funksjoner hepatocytes normal, som uttrykk for albumin (Figur 3). Det er allment kjent, derfor at utnytte primære hepatocytter er en verdifull mulighet for å undersøke leveren fysiologi og metabolisme i kultur, til tross for utfordringene i dyrking og vedlikehold av disse cellene. Vår studie detaljer her, vellykket isolasjon hepatocytes hovedknappen på musen ved å gjennomføre en totrinns collagenase metode i en relativt enkel og effektiv måte. Gjennom disse prosedyrene, flertallet av isolerte primære hepatocytter innen kultur beholde sine metabolske funksjonalitet og morfologiske stabilitet og kan brukes for å undersøke hepatic funksjoner inkludert protein metabolisme, Glukoneogenesen, og mitokondrie åndedrett.
Isolert primære hepatocytter er et kraftig eksperimentelle verktøy undersøke molekylære mekanismer av hepatic energi metabolism. Rotenon forstyrrer elektronet transportkjeden komplekse jeg aktivitet i mitokondrier og blokkerer oxidative fosforylering med begrenset syntesen av ATP53, som dokumentert av aktivering av AMPK (Figur 4). AMPK aktiviseringen utløser mobilnettet adaptive responsen undertrykker anabole mekanismen for å kompensere rotenon-indusert energi-mangelfull stress. Under denne tilstanden oppdaget vi har den drastiske reduksjonen av begynnende protein syntese i primære hepatocytter en ikke radioaktiv, chemo-selektiv ligation reaksjon med en TAMRA proteinet oppdagelsen metoden (figur 5). Disse resultatene bekrefter viktigheten av energiforsyningen fra mitokondrier for aktuelle proteinsyntese i primære hepatocytter. Disse teknikkene er nyttig å gi informasjon om en stoffet handling eller toksisitet i terapeutisk relevante konsentrasjoner i konteksten av hepatic proteinsyntese av friske og syke tilstander. Dessuten, disse teknikkene gjelder for undersøke rollen av bestemte stier modulerende protein og energi metabolism ved å analysere primære hepatocytter isolert fra genetisk manipulerte mus.
Lav avkastning og celle levedyktighet er generelt det større ulempene av primære hepatocytter. Disse problemene er av flere grunner som første cannulation, utilstrekkelig vask med HBSS, upassende konsentrasjon av collagenase eller lang-Perfusjonsperiode. Vår nåværende optimaliserer disse flere trinn og fører til en høyere avkastning og levedyktige cellers rundt 20 millioner/lever/voksen mus. Spesielt, det er to viktige trinn: en er å justere temperaturen og flyt av fordøyd buffere med riktig collagenase konsentrasjon å fordøye den hepatic parenchyma effektivt i 15-20 minutter fra kanyle innsetting til leveren excision, og en annen er å behandle prøvene collagenases behandlet raskt som beskrevet for å holde cellene i sunne tilstand. Mens isolert hepatocytter-baserte studier har vært gjennomført innen 48 timer tidsrom i mange publiserte data, tåle primære hepatocytter isolert med våre prosedyrer langsiktige kultur (figur 2). Med disse cellene vise vi robust merkingen av hepatic begynnende proteinsyntese gjennom chemo-selektiv ligation reaksjon analysen, selv om konsentrasjon og inkubasjon tiden med AHA i protokollen må optimaliseres igjen i forskjellige biologiske for celler (f.eks fysiologiske og patologiske, vill-type g. transgene eller knockout/ned celler).
I sammendraget, har vi etablert prosedyrer for å analysere hovedknappen på musen hepatocytter for begynnende proteinsyntese i en ikke-radioaktivt måte. Disse cellene reagerer godt på mitokondrie stress og utstillingen undertrykkelse av proteinsyntese med aktivering av den AMPK veien. Dermed er disse isolerte hepatocytter verdifulle modeller for å undersøke i Patofysiologien ved hepatic protein og energi metabolisme ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne viser de har ingen konflikter av interesse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Joonbae Seo og Vivian Hwa for sine vitenskapelige inngang og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. ble støttet av VIPs fra Japan vitenskap og teknologi byrå. En del av denne studien ble støttet av et stipend fra NIH (P30DK078392) for fordøyelses sykdommer forskning Core Center i Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
