Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.
Abstract
Hepatocitos son células parenquimatosas del hígado y realizar múltiples funciones metabólicas, incluyendo la síntesis y secreción de proteínas esenciales para la homeostasis de energía sistémica. Hepatocitos primarios aislados del hígado murino constituyen una valiosa herramienta biológica para comprender las propiedades funcionales o alteraciones que se producen en el hígado. Aquí describimos un método para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primario de ratón mediante la realización de una técnica de perfusión de colagenasa de dos etapas y discutir su utilización para la investigación de metabolismo de la proteína. El hígado de un ratón adulto secuencialmente es inundado con ácido tetraacético de glicol de etileno bis (EGTA) y colagenasa, seguido por el aislamiento de hepatocitos con el tampón de gradiente de densidad. Estos hepatocitos aislados son viables en las placas de cultivo y mantienen la mayoría de características dotadas de hepatocitos. Estos hepatocitos pueden utilizarse para la evaluación del metabolismo de proteína incluyendo la síntesis de la proteína naciente con reactivos no radiactivo. Demostramos que los hepatocitos aislados son controlados fácilmente y forman una mayor estabilidad de la calidad y el volumen de la síntesis de proteínas vinculada al metabolismo energético mediante la utilización de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva a una proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) método de detección y análisis Blot western. Por lo tanto, este método es valioso para la investigación de síntesis de la proteína naciente hepática relacionada con la homeostasis de la energía. El siguiente protocolo describe los materiales y métodos para la detección de la síntesis de la proteína naciente y el aislamiento de hepatocitos primario de alta calidad de ratón.
Introduction
La proteína es un elemento nutricional importante y aproximadamente el 50% del peso seco de un cuerpo humano está compuesto de proteínas que tienen varios rasgos biológicos y funciones1. En consecuencia, la síntesis de proteínas es uno de los eventos que la mayoría de energía y una alteración en el metabolismo de la proteína es altamente asociada con el desarrollo de enfermedades, incluyendo enfermedades metabólicas2,3,4. En el hígado, biosíntesis de la proteína representa aproximadamente 20 – 30% del total de energía consumo5,6. Además, la función de las proteínas no sólo pasiva o bloques del hígado, pero también activas factores de mediación de señal intracelular o extracelularmente para regular el metabolismo sistémico7. Por ejemplo, niveles reducidos de albúmina sérica, que es sintetizada y secretada por el hígado y la proteína más abundante en el plasma8, aumenta el riesgo de diabetes tipo 2 desarrollo9,10, 11, mientras que una mayor concentración de albúmina sérica es protectora contra el desarrollo de síndrome metabólico12. Además, disturbado o ruptura de las proteínas hepáticas secretores o membrana-limite, que modulan las homeostasis del colesterol, incluyendo lipoproteínas, LDLR y LRP1, puede conducir al desarrollo de resistencia a la insulina, hiperlipidemia y ateroesclerosis 13. por lo tanto, la identificación de los mecanismos fisiopatológicos moleculares que están involucrados en la alteración del metabolismo de proteínas en el hígado y sus complicaciones metabólicas asociadas podría ser útil para descubrir la novela farmacológica enfoques para retardar Inicio o tratar enfermedades metabólicas como la resistencia a la insulina, diabetes y hígado graso no alcohólico.
Síntesis de la proteína está estrechamente ligada a la situación de la energía celular (p. ej., la formación de un enlace peptídico durante la etapa de elongación de la síntesis proteica requiere de enlaces fosfodiéster 414) y está regulada por vías moleculares que sensación Inter y intra cellular la disponibilidad de nutrientes15,16. Quinasa activada por AMP (AMPK) es uno de los sensores de energía intracelular que mantienen la homeostasis de energía17. Una vez que la AMPK se activa cuando los niveles de energía celulares se baja, AMPK y sus sustratos específicos función para estimular vías catabólicas e inhiben los procesos anabólicos incluyendo proteína síntesis18,19. La regulación de la síntesis de proteínas está mediada por fosforilación de múltiples factores de traducción y proteínas ribosomales20. De la nota, el blanco mamífero de rapamicina complejo 1 (mTORC1), un motor importante de la síntesis de proteínas, es uno de los principales objetivos de AMPK21. Activación de la vía de la mTORC1 aumenta el crecimiento celular y la proliferación de proteína estimulante traducción y autofagia20,21. Por lo tanto, es lógico que activación de la AMPK puede inhibir la síntesis de proteína mTORC1 mediada por22. De hecho, la activación de la AMPK contrarresta y fosforila directamente mTORC1 en residuos de treonina 2446 (Thr2446) conduce a su inactivación23 y la supresión de la biosíntesis de proteína24. Por otra parte, AMPK indirectamente puede inhibir la función de mTORC1 por fosforilación y activación de esclerosis tuberosa el complejo 2 (TSC2)25 que es el regulador de aguas arriba de la cascada de señalización de mTORC1. En definitiva, desregulación de estas vías en el hígado a menudo está relacionada con el desarrollo de enfermedades metabólicas y por lo tanto hay una necesidad crítica para establecer eficaces herramientas experimentales para investigar el papel de estas vías en la regulación de energía y metabolismo de proteínas en los hepatocitos.
Existe una fuerte similitud entre las propiedades funcionales de hepatocitos primarios aislados y en vivo hepatocitos que con en vitro derivados del hígado de la célula líneas26,27,28. Se ha demostrado que hepatocitos humanos primarios comparten similitud de 77% con la de las biopsias del hígado, mientras que las células HepG2, que son las células cancerígenas hepáticas bien diferenciadas y ampliamente utilizan para investigar las funciones hepáticas, muestran menos del 48% en el contexto de 29los perfiles de expresión génica. Por lo tanto, la utilización de hepatocitos primarios, en lugar de células inmortalizadas de la cultura, es de vital importancia en la investigación de la fisiología y función hepática, y varios protocolos están disponibles para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios especialmente de las ratas30,31. Mientras que los hepatocitos de rata son útiles con un rendimiento relativamente superior de las células, hepatocitos de ratón tienen un potencial mayor en muchos aspectos científicos debido a la amplia disponibilidad de ratones genéticamente modulados. Sin embargo, hay varias dificultades técnicas en el aislamiento de hepatocitos primarias sanas y abundantes de los ratones para las evaluaciones en base celular y molecular: en primer lugar, inserción de cánula para inundar el hígado con reactivos buffer es muy difícil de manejar debido al ratón pequeño y delgado de la vena porta o vena cava inferior; en segundo lugar, un tiempo de manipulación de las células durante el aislamiento puede causar reducción en la cantidad de células y la calidad; métodos de separación mecánica en tercer lugar, no-enzimáticos pueden provocar daños graves y producir un bajo rendimiento de hepatocitos primarios aislados viable32,33. En la década de 1980, técnica de perfusión de colagenasa se introdujo para aislar hepatocitos de hígados de animales34. Este método se basa en perfusión de colagenasa de los hígado35,36,37, infusión de hígado con calcio quelante solución38,39, digestión enzimática y disociación mecánica de la parenquimia hepática35. En el primer paso, un hígado de ratón es inundado con un tampón libre de calcio [Ca2 +] que contiene un quelante de [Ca2 +] (ácido etilendiamina tetraacético EDTA). En el segundo paso, el hígado de ratón es inundado con un tampón que contienen colagenasa para hidrolizar las interacciones de la matriz extracelular a celular. A diferencia del búfer utilizado en el paso uno, la presencia de iones [Ca2 +] en el búfer de la segunda etapa se requiere para la actividad de la colagenasa eficaz, después de que el hígado digerido tiene que ser más suavemente y mecánicamente separados usando fórceps entre el la cápsula hepática y tejido parenquimatoso. Finalmente, del tejido conectivo se elimina por filtración y posterior centrifugación separa hepatocitos viables de tanto células no parenquimatosas y hepatocito no vivo con el uso de densidad gradiente buffer40,41 ,42. En el presente estudio, nos muestran una técnica de perfusión de colagenasa modificado dos pasos para aislar hepatocitos primarios de un hígado de ratón para el análisis de la síntesis de proteínas.
El radiolabeling de proteínas es ampliamente utilizado para cuantificar los niveles de expresión, tasas de rotación y determinar la distribución biológica de las proteínas43 debido a la alta sensibilidad de detección de radiactividad44. Sin embargo, el uso de isótopos radiactivos requiere de circunstancias y procedimientos de investigación altamente controlada45. Métodos no radiactivos alternativos se han desarrollado y han adquirido cada vez más en popularidad. La reacción de la ligadura selectiva de quimio con un método de detección de la proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) es uno de ellos y se basa en la reacción quimio selectiva entre una azida y alquino grupos46, que pueden ser utilizadas para analizar eventos celulares tales como detección de síntesis de la proteína naciente y subclases de glicoproteínas modificadas con un grupo de azida. Para la síntesis de la proteína naciente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un aminoácido modificado de la azida) puede incorporar proteínas metabólicamente y detectado mediante el uso de método de detección de la proteína TAMRA47. Usando este ensayo en hepatocitos primarios de ratón, muestran que la tasa de síntesis de la proteína naciente está estrechamente ligada a la disponibilidad de ATP de mitocondrial y la activación de AMPK (figura 1).
En Resumen, utilización de hepatocitos primario de ratón es fundamental para investigar el metabolismo proteico y energético y cuantificación de la síntesis de la proteína naciente es valiosa para obtener información sobre el papel fisiológico de las vías pertinentes para el desarrollo y curación de enfermedades relacionadas con el hepatocito.
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Protocol
Este protocolo contiene el uso de ratones de laboratorio. Cuidado de los animales y los procedimientos experimentales fueron realizados según los procedimientos aprobados por los comités de cuidado de los animales del Cincinnati Children s Hospital Medical Center.
1. aislamiento de hepatocitos primario de ratón
- Preparaciones pre-aislamiento
- Preparar 450 mL de buffer gradiente de densidad 40% tal como se describe en la tabla 1 y mantener a 4 ° C (15 mL/ratón).
- Preparar 500 mL de medio de Williams como se describe en la tabla 1 y guardar a 4 ° C.
- Preparar 500 mL de DMEM como se describe en la tabla 1 y mantener en hielo (30 mL/ratón).
- Preparar 500 mL de tampón HBSS (-) como se describe en la tabla 1 y mantener a 42 ° C en el baño de agua (40 mL/ratón).
- Preparar 500 mL de HBSS (+) Buffer con 0,3 mg/mL de colagenasa tipo X como se describe en la tabla 1 con 30 min de incubación a 42 ° C en el baño de agua (40 mL/ratón).
- Configurar la bomba de perfusión mediante la colocación de los tubos de administración vía intravenosa (I.V) en el enganche pedal y comprobando el flujo de lavado solución sin burbujas de aire.
- Caliente el calentador de tubo de 42° C.
- Enfriar la máquina de centrifugar a 4 ° C.
- Anestesia y perfusión
- Limpiar las áreas de trabajo y de la bomba.
- Enjuague el tubo IV bomba conectada mediante la ejecución de etanol al 70% durante 10 minutos.
- Eliminar el etanol residual del tubo IV bomba conectada aclarando con DDW completamente durante 10 minutos.
- Limpie la tijeras y pinzas con etanol al 70%.
- Coloque el ratón en un recipiente de plástico con fondo de malla y con la gasa empapada de isoflurano de 2 mL por debajo de la malla para evitar el contacto directo.
- Evaluar la profundidad de la anestesia por reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie).
- Quite el ratón cuando ha alcanzado la profundidad deseada de la anestesia.
Nota: El tiempo de inducción de la anestesia no debe ser más de 1 minuto. - Construir un cono de la nariz mediante un tubo cónico de 15 mL con 1 mL isoflurano empapada empujada hasta el final del tubo.
- Controlar la profundidad de la anestesia al mover el cono de nariz más cerca o lejos de la nariz de ratón.
- Coloque el ratón sobre la plataforma de trabajo con el lado ventral hacia arriba.
- Etanol al 70% del aerosol sobre el área abdominal del ratón y luego abrir la cavidad abdominal por hacer una gran incisión transversal de la dermis y el peritoneo utilizando unas tijeras afiladas y pinzas dentadas.
- Luego, realizar un corte vertical de las capas abdominales hasta que todos los órganos abdominales están totalmente expuestos utilizando unas tijeras afiladas y pinzas dentadas.
- Movimiento pequeño e intestinos grandes hacia el lado izquierdo del ratón con punta de algodón esterilizado hasta el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC) están claramente expuestos.
- Inserte un catéter 24 G IVC a la bifurcación con la vena renal derecha con cuidado sin agitar las manos para evitar la lesión de la vena cava inferior y sangrado.
Nota: Si se produce la hemorragia mientras se inserta el catéter en vena cava inferior, entonces usted debería intentar Inserte el nuevo catéter en una vena porta. - Retire la aguja del catéter y controlar la posición de la cánula para evitar salir de la vena cava inferior, luego conectar cánula 24 G con el tubo de perfusión mediante el conector.
Nota: Evitar la presencia de burbujas de aire antes de comenzar la perfusión. - Iniciar la perfusión del hígado con HBSS caliente (-) a un flujo de 4 mL/min y corte la vena esplénica rápidamente para drenar la sangre interna mediante el uso de tijeras.
Nota: Si la canulación es exitosa, el hígado comenzará a blanch debido a la distribución del reflujo de la solución de IVC a las venas hepáticas. La vena porta está formada por la Unión de las venas mesentéricas superiores y esplénicas; por lo tanto, es bastante seguro cortar la vena esplénica, puesto que es grande y distal desde el hígado. - Continuar perfusión con 35 mL de HBSS caliente (-).
Nota: El hígado se convertirá en pálido en color si la perfusión es adecuada y el ratón sigue vivo bajo anestesia en esta etapa.
- Digestión y extracción
- Perfusión del hígado de ratón con caliente 35 mL de HBSS (+) incluyendo colagenasa tipo X a una velocidad de flujo de 4 mL/min.
- La vena esplénica de la abrazadera de cada pocos minutos, mediante el uso de fórceps para ~ 10 s para permitir que todo el volumen de HBSS (+) para difundir en todas las partes anatómicas del hígado.
Nota: El hígado comienza a hincharse después de pinzamiento de la vena esplénica debido a la congestión de búfer. - Vierta 5 mL del preparado caliente HBSS (+) con colagenasa tipo X 100 mm plato de Petri en el final de la perfusión.
- Corte el hígado perfundido por el resto del cuerpo antes de parar la bomba para evitar el reflujo de sangre en el hígado, extirpar la vesícula biliar por fórceps y luego limpie el hígado suavemente con una toalla de papel para quitar la sangre.
- Transferir el hígado a la placa de Petri que contiene 5 mL de preparado caliente HBSS (+) y retire la cápsula hepática suavemente con unas pinzas de punta recta.
Nota: La cápsula hepática es una capa delgada de tejido conectivo que rodean el hígado. - Dispersar el tejido parénquima cuidadosamente mediante el uso de los fórceps. Añadir 15 mL DMEM frío a la caja Petri.
Nota: El medio volverá turbio debido a células parenquimatosas si el hígado se digiere bien. - Agite el hígado roto suavemente para liberar las células de parénquima residual en el medio y añadir otros 15 mL DMEM frío a la caja Petri para obtener el resto de las células.
- Transferencia de DMEM con el hígado disuelto a través de 100 μm tamiz de células en un tubo cónico de 50 mL y conservar en hielo.
- Purificación del
- Centrifugue la suspensión de células a 60 x g durante 2 min a 4 ° C, con cuidado quite el sobrenadante por aspiración al vacío y resuspender el precipitado en 10 mL DMEM.
- Añadir resuspendido como una capa delgada en la parte superior 40% buffer gradiente de densidad y centrifugar a 800 x g por 10 min sin freno en 4° C.
- Retire con cuidado el sobrenadante como la capa superior (DMEM) y la capa media (células no parenquimatosas o muertas), pero no la capa más baja (pellets: hepatocitos primarios de parénquima).
- Resuspender las células primarias con E medio de 2 – 3 mL William y transferir al nuevo tubo de 50 mL para evitar la contaminación de células muertas en la pared del tubo.
- Añadir medio de 7-8 mL Guillermo E, mezclar suavemente y centrifugar a 800 x g durante 1 min a 4 ° C.
- Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración al vacío y luego Resuspender el precipitado nuevamente con 10, 20 o 30 mL de medio de William E (según el tamaño de la pelotilla).
- Contar las células usando un contador de células automatizado.
- De semillas con medio de Guillermo E, mantenga la placa en una incubadora a 37° C para 2-3 h, entonces reemplazar el % de medio with10 medio DMEM FBS con anti-Anti para eliminar las células muertas o y para la incubación a 37 ° C.
- Al día siguiente, hepatocitos primario de ratón están listos para su uso experimental.
2. Análisis de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva para la detección de la síntesis de la proteína naciente
- Etiquetado metabólico
- (Tratamiento previo) Lavar dos veces hepatocitos primarios con PBS caliente de 37 ° C y añadir el medio DMEM libre de metionina por 30 min a agotar la metionina citoplásmica se reserva.
Nota: L-Azidohomoalanine, es un aminoácido y un análogo de metionina, contiene una molécula de azido que puede ser incorporado en las proteínas durante la biosíntesis de proteínas celulares que agotamiento de metionina citoplásmico mejorará la alimentación y la incorporación de L-Azidohomoalanine en las proteínas recién sintetizadas de hepatocitos primarios cultivadas. - (Tratamiento) Hepatocitos primarios de lavado con 37 ° C caliente PBS dos veces y añadir el medio DMEM libre de metionina con 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) por 4-6 h.
- Añadir cualquier químico específico (es decir, 10 rotenona μM) en el medio de 4 – 6 h en presencia de AHA para investigar su efecto sobre los niveles de expresión de la proteína naciente.
- Después de la incubación, el medio de extracción con bomba aspirativa Lave y hepatocitos primarios con PBS frío tres veces.
- Añadir tampón de lisis de 200 μL para la placa e incube durante 15-30 min en hielo, y luego incline la placa y el lisado a 1,7 mL de tubo de células enteras.
Nota: Se debe observar que lisado de ese celular es muy pegajoso durante la recolección de células. - Someter a ultrasonidos el lisado celular en hielo durante 5 s tres veces mediante el uso de un sonicador de sonda para solubilizar las proteínas y el ADN se dispersan.
- Mezclar la célula lisada por 5 min, centrifugar la célula lisada a 21.130 x g por 10 min a 4 oC y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Medir la concentración de proteínas dos veces.
Nota: En esta etapa, las muestras de proteína pueden almacenarse a-20 ° C durante dos semanas si no se utilizan inmediatamente.
- (Tratamiento previo) Lavar dos veces hepatocitos primarios con PBS caliente de 37 ° C y añadir el medio DMEM libre de metionina por 30 min a agotar la metionina citoplásmica se reserva.
- Etiquetado la proteína naciente modificado de la azida
- Preparar los componentes (A + B) añadiendo 60 μL de componente (A) para la componente (B).
Nota: La solución se convierte en rosa brillante en el color después de agregar el componente (A) a (B). - Preparar los buffers (D) y (E) de acuerdo al Protocolo.
- 20 – 40 μg celular lisado y añadir 50 μL de 2 x buffer de reacción (componente A + B), luego ajuste el volumen al 80 μL añadiendo DDW y agitar durante 5 s.
- Añadir 5 μL CuSO4 (componente C) y agitar durante 5 s.
- Añadir 5 buffer de reacción μL 1 aditivo (componente recién preparada D), a continuación, vortex para 5 s y espere 3 minutos.
- Añadir 10 μL reconstituido reacción tampón 2 aditivos (componente E), entonces vortex para 5 s y rotar las muestras durante 20 min a 4 ° C utilizando una máquina de rotor múltiple.
Nota: La solución se convierte en naranja brillante en color después de agregar el componente (E). Las muestras deben protegerse de la luz durante la rotación. - Añadir 300 μL de metanol y de vortex durante 5 s, agregar 75 μL cloroformo y vortex durante 5 s, luego agregar 200 μL DDW vortex durante 5 s.
- Centrifugar las muestras a 21.130 x g y 4° C durante 5 minutos, luego deseche el sobrenadante acuoso y mantener el pellet.
- Añadir 250 metanol μL al tubo, vortex y vuelta otra vez por 5 min a 21.130 x g.
- Eliminar el sobrenadante, luego cubrir las muestras con la pelusa y permita que los pellets secar al aire durante 15 min a temperatura ambiente.
- Preparar los componentes (A + B) añadiendo 60 μL de componente (A) para la componente (B).
- Análisis de la página y el borrar occidental
- Solubilizar el precipitado en 20 μL de la carga del buffer sin β-mercaptoetanol, vortex durante 10 minutos, calor a 70 º C utilizando el bloque de calor durante 10 minutos. Luego de cargar las muestras en el gel de SDS 10% (1,5 mm) para la detección de Tetramethylrhodamine (TAMRA).
- Detectar la señal de AHA utilizando un escáner de láser de modo variable para la cuantificación precisa de proteínas nacientes.
- Lavar el Gel con DDW durante 15 minutos.
- Entonces, tinción del gel de SDS 10% con un reactivo colorante coomassie rápido y sensible de 15-60 min detectar proteínas totales como control.
- La mancha el Gel con DDW para 1 – 2 h y adquirir la imagen mediante el uso de un sensor de fluorescencia UV.
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Representative Results
Aislamiento de hepatocitos primario de ratón da lugar a un rendimiento de aproximadamente 20 x 106 total células de ratón. Histológico, vivo y Unidos hepatocitos primarios aparecen poligonales o típica hexagonal en forma claramente descritos límite membranosa después de 24 h de incubación (figura 2).
Para confirmar si las células aisladas son hepatocitos primarios, se compararon los niveles de expresión de la proteína albúmina en hepatocitos aislados de ratón primario (PMHs), fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs), una línea de células de hepatoma de ratón (Hepa 1-6) y hígado de ratón. La expresión de la proteína albúmina fue detectada en hepatocitos primarios de ratón y hígados del ratón pero no era perceptible en MEFs o Hepa 1-6 células (figura 3).
Para determinar si los efectos de la rotenona en la activación de proteína hepática activados por AMP quinasa (AMPK) es la célula autónoma, comparamos la respuesta dependiente del tiempo de hepatocitos primarios aislados de hígado de ratón de tipo salvaje. Hepatocitos primarios fueron tratados sin o con la rotenona μM 10 para 0, 4 o 6 h. En estas células, tratamiento de rotenona robusta inducida por activación de la AMPK, detecta niveles de aumento de la fosforilación de AMPK-T172 similares a los vistos en vivo48 (figura 4).
Para medir directamente los efectos del tratamiento de la rotenona en la síntesis de la proteína naciente en hepatocitos primarios, se evaluó la incorporación de AHA no radiactivo en proteína más de 5 h al realizar el análisis de la reacción de la ligadura selectiva de chemo. Tratamiento con 10 rotenona μM para 5 h tuvo profundos efectos inhibitorios sobre síntesis de la proteína naciente en hepatocitos primarios tratados en comparación a los hepatocitos primarios sin tratamiento (figura 5).
Figura 1: Una ilustración muestra los pasos del ratón primario aislamiento de hepatocitos, mancha blanca /negra occidental análisis y procedimientos de reacción de la ligadura selectiva de chemo.
Figura 2: imágenes morfológicas de hepatocitos primario de ratón de contraste de fase. Cuadros representativos de hepatocitos primarios aislados fueron adquiridas en 2, 12, 24 y 72 h después de la galjanoplastia. Barras de escala = 100 μm.
Figura 3: Análisis de Western blot para la expresión de la proteína albúmina en hepatocitos primarios de ratón. Se realizaron análisis de Western blot con la carga de 10 μg proteína/carril de hepatocitos primario de ratón (PMHs), fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs), Hepa 1-6 células y el hígado de ratón. ANOVA unidireccional mostró que una expresión de la proteína albúmina significativa en PMHs comparado con MEF o Hepa 1-6 células. Los valores son medios ± SEM de tamaño del grupo (n = 3). P, #P < 0,001 vs. HEPA 1-6 o la MEFs, respectivamente. $ P < 0,001 vs. lisado de hígado.
Figura 4: inducción de la fosforilación de la AMPK en hepatocitos primario de ratón tratados con rotenona. Hepatocitos primarios de hígado de un ratón de tipo salvaje fueron tratados con rotenona μM 10 para 0, 4 ó 6 h. fosforilación los niveles de AMPK fueron detectados por borrar occidental y fue utilizado β-actina como control de carga (10 μg proteína fue cargado/carril). Mediciones repetidas ANOVA de 2 vías demostró que tratamiento provocó un aumento significativo en la expresión de la proteína de la fosfo-AMPK en comparación con hepatocitos primarios sin tratar. Los valores son medios ± SEM de tamaño del grupo (n = 3). P < 0,001 vs. Hepatocitos sin tratar.
Figura 5: reducción de la expresión de la proteína naciente hepática después del tratamiento de rotenona. Hepatocitos primarios de hígado de un ratón de tipo salvaje fueron tratados con 10 rotenona μM para 5 h, seguido de un ensayo de síntesis de la proteína naciente con método no radiactivo de AHA. Se evaluaron los niveles de síntesis de la proteína por un escáner láser de detección de la fluorescencia de TAMRA. Niveles de carga de proteína total para este ensayo fueron detectados por el reactivo colorante de coomassie.
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Discussion
Aunque varias líneas inmortalizadas de la célula hepática han sido propuestas y usados para investigar funciones hepáticas49,50,51,52, estas células carecen generalmente de la importante y fundamental funciones de los hepatocitos normales, como la expresión de albúmina (figura 3). Es ampliamente reconocido, por lo tanto, que utilizando hepatocitos primarios es una opción valiosa para el examen de fisiología hepática y metabolismo en la cultura, pese a las dificultades de cultivo y mantenimiento de estas células. Aquí, nuestro estudio detalla el aislamiento exitoso de hepatocitos primario de ratón mediante la realización de un método de colagenasa de dos pasos de una manera relativamente cómoda y eficaz. A través de estos procedimientos, la mayoría de los hepatocitos primarios aislados dentro de la cultura conservan su funcionalidad metabólica y estabilidad morfológica y puede utilizarse para investigar funciones hepáticas incluyendo proteína metabolismo, gluconeogénesis, y la respiración mitocondrial.
Hepatocitos primarios aislados son una poderosa herramienta experimental para examinar los mecanismos moleculares del metabolismo energético hepático. Rotenona interfiere con la cadena de transporte de electrones complejo y actividad de las mitocondrias y bloquea la fosforilación oxidativa con la síntesis limitada de ATP53, según lo evidenciado por la activación de AMPK (figura 4). La activación de AMPK dispara las respuestas adaptativas celulares que inhiben el mecanismo anabólico para compensar el estrés de la deficiencia de energía inducida por la rotenona. Bajo esta condición, se detectó con éxito la reducción drástica de los niveles de síntesis de la proteína naciente en hepatocitos primarios mediante una reacción de ligadura no radiactivo, quimioterapia selectiva con un método de detección de proteína TAMRA (figura 5). Estos resultados confirman la importancia del suministro energético de la mitocondria para la síntesis de proteínas adecuadas en hepatocitos primarios. Estas técnicas son útiles para proporcionar la información relativa a una acción de los fármacos o toxicidad a concentraciones terapéuticamente relevantes en el contexto de la síntesis de proteínas hepáticas de condiciones sanas y enfermas. Además, estas técnicas son aplicables para el examen del papel de vías específicas de modulación de la proteína y energía del metabolismo mediante el análisis de hepatocitos primarios aislados genéticamente manipulado ratones.
En general, bajo rendimiento y viabilidad de las células son los principales inconvenientes del uso de hepatocitos primarios. Estos problemas son debido a varias razones tales como la canalización inicial, lavar con HBSS, concentración inadecuado de colagenasa, o período largo-perfusión insuficiente. Nuestro protocolo actual optimiza estos pasos múltiples y conduce a obtener un mayor rendimiento y células viables alrededor de 20 millones/hígado/adulto ratones. Especialmente, hay dos pasos fundamentales: uno es para ajustar la temperatura y el caudal de búferes digeridos con la concentración apropiada de la colagenasa para digerir el parénquima hepático eficientemente en 15-20 min de la inserción de la cánula hasta la supresión hepática, y otra es procesar estas muestras de colagenasas tratados rápidamente como se describe para mantener las células en condiciones saludables. Mientras que se han realizado estudios basados en hepatocitos aislados dentro de plazo 48 h en muchos datos publicados, hepatocitos primarios aislados con nuestros procedimientos de soportan la cultura a largo plazo (figura 2). Con estas células, mostramos el etiquetado robusto de la síntesis hepática de proteína naciente mediante el análisis de la reacción de la ligadura selectiva de chemo, aunque el tiempo de incubación y concentración con AHA en el protocolo tenga que volver a ser optimizado en diferentes biológicos condiciones de las células (por ejemplo fisiológico vs patológica, de tipo salvaje vs transgénicos o knockout/abajo las células).
En Resumen, hemos establecido procedimientos para analizar hepatocitos primario de ratón para la síntesis de la proteína naciente de una forma no radiactiva. Estas células responden bien al estrés mitocondrial y exhiben la supresión de la síntesis proteica con activación de la vía de la AMPK. Así, estos hepatocitos aislados son valiosos modelos para investigar la patofisiología de la proteína hepática y metabolismo energía ex vivo.
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Disclosures
Los autores indican que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los Drs. Joonbae Seo y Vivian Hwa por sus contribuciones científicas y discusión. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud (NIH) (R01DK107530). T.N. fue apoyado por el PRESTO de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón. Una parte de este estudio fue apoyada por una subvención del NIH (P30DK078392) para el centro digestivo enfermedad investigación Core en Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. Jr A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
