Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 使用厌氧全细胞微生物生物传感器, 以评估不同的环境变量如何影响汞和镉对缺氧环境中细菌的生物利用度。
Abstract
汞 (汞) 对微生物的生物利用是食品网中有毒汞生物放大的关键一步。镉 (cd) 转化和细菌的生物利用度控制着主要粮食作物的积累量。这些金属的生物利用度取决于其在溶液中的形态, 尤其是在缺氧条件下, 汞被甲基化为有毒的单甲基汞 (甲基汞), 镉在根际持续存在。当金属进入细胞溶胶时, 全细胞微生物生物传感器会发出可量化的信号, 因此是评估金属生物利用度的有用工具。不幸的是, 到目前为止, 由于现有的记者蛋白在没有氧气的情况下发挥作用的能力有限, 大多数生物测井工作都被限制在氧化环境中。在这项研究中, 我们提出了我们的努力, 以开发和优化全细胞生物传感器分析能够发挥厌氧功能, 可以检测金属在缺氧条件下在准实时和数小时内。我们描述了生物传感器如何帮助评估与金属环境循环相关的化学变量如何影响其生物利用度。以下协议包括以下方法: (1) 在缺氧条件下制定汞和镉标准; (2) 在没有氧气的情况下制备生物传感器; (3) 设计和执行一项实验, 以确定一系列变量如何影响汞或镉的生物利用度, (4)量化和解释生物传感器数据。我们展示了生物传感器的线性范围, 并提供了实例, 说明该方法通过利用金属诱导菌株和本构菌株来区分金属生物利用度和毒性的能力。
Introduction
汞是一种全球污染物, 其对汞甲基化微生物的生物利用度是通过食物网实现其生物放大及其对人类和野生动物可能产生的神经毒性影响的第一步.目前人们认为, 微汞甲基化是一种细胞内过程, 需要: (一) 汞的种类必须生物利用 2、3、4、5、6、7和 ii) 细胞在生理上能够甲基化汞8,9,10。镉 (cd) 在生物体中积累生物, 但在食物网中不具有生物放大作用, 并广泛用于工业和商业过程中, 这些过程通常会导致人和环境中的急性暴露11。尽管微生物在汞在环境中的命运中起着重要作用, 但对镉地球化学和生态毒理学的研究大多集中在微生物真核生物 12上。食用农作物 (如大米) 是直接接触镉的主要来源;在这种情况下, 镉对根际微生物的生物利用度直接影响植物的积累量 13.
汞的运输途径是复杂的, 可能涉及一个活跃的运输步骤14。当涉及转运体时, 最近的工作表明, 汞ii使用锌ii或锰ii 运输机7、15、16、17。虽然 cdii被假设通过二价金属输送途径 (特别是 mnii或 znii) 不小心进入细胞溶胶, 但 cd ii 在细胞内的转运机制仍然存在投机, 并没有确定特定于 cd 的运输路径13,18。无论所涉及的运输机的性质如何, 三个机械因素最终决定了金属进入细胞的能力: i) 溶液 2、6、15中的金属形态,16,17,19,20,21,22,23、ii) 细胞膜的生物化学特性17、24、25、26、27、28、29 ,30、31和 iii) 金属进入运输地点7、32的能力。镉和汞不可能在微生物生理相关条件下作为游离离子存在, 因为它们对溶解有机物 (dom) 有很高的亲和力, 对污染物 (如edta) 有螯合, 或硫含量降低, 33, 34,35 (cdii 可以存在作为一个自由离子或形式离子对在没有这些配体的情况下)。在确定这些金属物种在与其在环境中的命运有关的条件下如何生物利用方面缺乏有效的方法。例如, 汞在厌氧条件下甲基化 14,镉和汞都是软金属 (或 b 类阳离子), 要求在保持还原硫基团完整性的条件下对其形态进行调查。
微生物生物传感器是细菌细胞, 它发出可量化的信号, 以响应金属的细胞内浓度, 在这种情况下是汞或镉。因此, 只要仔细控制暴露条件, 它们是了解金属如何进入36 细胞的理想工具。汞生物传感器通常包含 mer-operon 的调控电路 (包括转录调节剂 merra 的基因编码以及操作数的操作和启动子区域) 和报告基因 (例如,lux, gfp, lac基因)。当汞存在于细胞质中时, 它将与 merr 结合, 从而导致报告基因的转录和随后的信号产生19,37。特定的 cd 生物传感器通常是使用cadc、 cadC、znta或zntA编码转录调节器38设计的, 但值得注意的是, merr 与 cd5具有较低但可量化的亲和力。由于最常用的发光或荧光报告蛋白的有氧限制, 直到最近, 微生物生物传感器仍然无法提供对缺氧条件下金属的生物转化的洞察。这使得在与其环境归宿有关的一系列条件下, 特别是在存在氧化还原敏感配体 (例如硫化物和硫醇)的情况下, 很难对金属的生物利用度进行厌氧检测 45,39岁
为了减轻在缺氧的情况下进行实时成像的方法障碍, drepper等人.(2007) 开发了一种基于黄素的荧光蛋白 (fbfp), 该蛋白基于从pputida中获得的 sb2 蛋白的轻氧电压域。这种蛋白质家族能够在没有氧气的情况下荧光40。在 drepper等人的工作基础上, 我们的实验室设计了一个厌氧生物传感器, 可以在氧化和缺氧条件下以及在广泛的盐度17下研究汞的生物利用度. 在本论文中, 我们描述了如何制备和使用生物传感器来测试环境变量对汞或镉生物利用度的影响。虽然我们开发了汞ii生物传感器, 但我们选择用 cdii进行实验, 以此吸引读者注意, 生物传感器也可能对可能在环境中同时发生的多重压力源做出反应矩阵;在这种情况下 cdii被调查, 因为它是已知的绑定到转录调节剂 merr5。在这里, 我们展示了与任何一种金属有关的代表性校准和功能线性范围。我们还举一个例子, 当生物传感器的结果是决定性的 (镁ii 和mnii 的汞生物利用度) 和不确定的 (锌ii 关于汞的生物利用度)。
Protocol
1. 生长介质和曝光介质的制备
- 要使250毫升的生长介质:
注意: 如果跟踪元素 #1 解决方案和#2 解决方案的跟踪元素已准备好, 请跳到步骤1.1.5。- 在干净的体积瓶 (200 ml) 中制备微量元素 #1溶液, 以包含 1.5 x 10-3 mna 2 moo 4、 6.5 x 10-4 mna 2seo 4、5 x 10-3 m h3 bo的最终摩尔 3, 0.1 m naoh。
注意: 强碱 (naoh) 具有腐蚀性。在称量试剂时, 一定要确保最终的摩尔度代表关键的微量元素;莫、赛、b。 - 在无菌场下, 使用0.22μm 聚醚磺酮注射器过滤器在清洁/无菌塑料-聚四氟乙烯 (ptfe) 瓶中进行消毒。
- 在干净的体积瓶 (200 ml)中制备微量元素 #2 溶液, 以包含 0.01 m mnso 4、5 x 10-4 m MnSO4、3.25 x 10-3 m ccl 2、6.25 x 10-3 m 镍基的最终摩尔2, 和 0.1 m h2 so4。
注意: 强酸 (h2so4) 具有腐蚀性.在称量试剂时, 一定要确保最终的摩尔度代表关键的微量元素;锰、锌、公司和 ni。 - 在无菌区下, 使用0.22μm 聚醚磺酮注射器过滤器在干净的玻璃瓶中进行消毒。
- 在无菌场下, 在清洁/无菌玻璃瓶中 (最少250毫升);加入200毫升超纯水 mL 最小盐的 42.5 ml (5倍;见材料表), 2.5 ml 的 2 m 葡萄糖, 125μl 的 2 m mgso 4, 1200 微米的 0.6 m thiaminehcl, 来自冷冻 (-20°c) 的 aliquot, 1.25 ml 的 4 m nno3, 70μl 的 0.075 m l-亮素/l-异丙菊/代氨酸溶液,250μl 微量元素 #1, 250μl的微量元素 #2, 250μl 0.01 m edta 钠盐。
注: 所有步骤1.1.5 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。超纯水可以使用高压灭菌器进行消毒。 - 从1.1.5 的步骤中取出现在含有溶液的玻璃瓶, 松散地封盖, 通过厌氧室气闸循环。
- 在厌氧室中, 在 0.2 m h2so 4 中加入15μl 的 0.225 mfeso4 , 紧紧地盖瓶, 摇匀, 直到所有白色沉淀物消失。
注: 所有步骤1.1.7 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。将 0.225 m feso4放入厌氧室, 放入0.2 m h 2 so 4 中。 - 从瓶子上取下瓶盖, 等待1分钟才能换气, 从瓶子上更换瓶盖, 然后用力摇一摇。重复此步骤一次。
- 将瓶盖紧紧地固定在瓶子上, 从厌氧室取出, 并将瓶子存放在冰箱 (4°c) 中, 直至使用。
- 应通过重复 1.1.5 1.1.9 的步骤, 每周重塑一次增长媒介。
- 在干净的体积瓶 (200 ml) 中制备微量元素 #1溶液, 以包含 1.5 x 10-3 mna 2 moo 4、 6.5 x 10-4 mna 2seo 4、5 x 10-3 m h3 bo的最终摩尔 3, 0.1 m naoh。
- 要在 2 x 50 毫升锥形无菌聚丙烯离心管中制备100毫升的曝光介质:
注意: 我们建议在接触检测当天准备接触介质, 以最大限度地降低污染风险, 但可以提前制作并将其存放在冰箱中。- 在厌氧室里每50毫升离心管加入42毫升厌氧超纯水, 350μl 1 m 钠β-gylcerfice 从冷冻 (-20°c) 的 aliquot, 2 毫升 1 m mL 游离酸, 50μl 1 m (nh 4)2so4 , 25μl 的 2 m 葡萄糖, 300μl 的 2.5 m koh, 200μl 的 2.5 m naoh。
注: 所有步骤1.2.1 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。超纯水可以使用高压灭菌器进行热灭菌。2.5 m naoh 和 2.5 m naoh 必须储存在塑料瓶中。列出的所有试剂必须存放在厌氧室, 但β-基地磷酸钠除外, 它将储存在 (-20°c) 的冰柜中。一般来说, 最好的做法是将所有塑料或玻璃部件和容器留在厌氧室几天, 以确保没有氧气痕迹。 - 封盖50毫升离心管, 摇匀, 并取出10毫升的脂肪来测量 ph 值。在25°c 时, 此曝光介质的测量 ph 值必须始终为7.00±0.02.如果 ph 值不能在此范围内测量, 请重新调整添加的 2.5 m koh 的体积, 以纠正此问题。
注意: 切勿用 ph 探头滴定溶液以纠正 ph 值。ph 探头代表接触介质的污染源. ph 值必须始终是1.2.1 的步进中添加的试剂的产物。
- 在厌氧室里每50毫升离心管加入42毫升厌氧超纯水, 350μl 1 m 钠β-gylcerfice 从冷冻 (-20°c) 的 aliquot, 2 毫升 1 m mL 游离酸, 50μl 1 m (nh 4)2so4 , 25μl 的 2 m 葡萄糖, 300μl 的 2.5 m koh, 200μl 的 2.5 m naoh。
- 准备一个 5-10 mmnno 3 库存溶液, 并留在厌氧室, 以便在接触试验期间使用。
注意: 它更容易稀释一个更集中的初级 nno3标准, 而不是使 5-10 mmnno 3主要标准。
2. 制定汞和镉标准。
- 在 0.2 m h2so4中制备4-8μm 汞 (hgii) 溶液。
- 在 0.2 m h2so 4 中制备毫米 (1-10mm) hgcl2、hgno3或 hgso4溶液, 以制备汞2 +标准.
注意: 汞毒性很强, h2so-4具有腐蚀性.使用所有必需的个人防护设备在通风柜中操作。 - 在聚四氟乙烯瓶中, 从2.1.1 稀释标准。转化为 0.2 mh 2 so4, 以获得 4-8μmhh2 +范围内的浓度。
注: 所使用的酸必须是分析级h2so4。 - 应使用汞分析仪 (见材料表) 验证2.1.2 的汞浓度。
注: 可使用其他方法来验证汞浓度。
- 在 0.2 m h2so 4 中制备毫米 (1-10mm) hgcl2、hgno3或 hgso4溶液, 以制备汞2 +标准.
- 在 10mm h2 so 4 中制备 10μm cdii 溶液.
- 在 0.1 m h2 so 4 中制备 cdcl2的主要标准 (10-50 mm 范围, 用于精确称药粉末)。
- 在一系列的系列稀释在清洁酸洗20毫升硼硅酸盐玻璃瓶与黑色酚醛螺盐螺丝盖与 ptfe 面橡胶衬里, 稀释标准从2.2.1 到 10μm cd2 +。确保 h2so-4 在随后的每一次连续稀释中的浓度保持在 10 mm。
3. 厌氧暴露检测生物传感器的制备
- 平板汞诱导生物传感器 (e. 存在 pic57mer-pp爆bfp 的大肠杆菌 neb5 α) 和本构表达的生物传感器 (大肠杆菌 neb5α窝藏 puc19balch-ppfbfp) 从-80°c 的冷冻库到含有 120 ugl 安培的 lysogeny 兄弟板上。有关这些生物传感器17的生产的详细信息, 请参阅我们之前发表的作品。
- 下午4:30 至 5点, 在 lb (+ 放大器) 10 毫升中接种培养物, 并在一夜之间生长。
注: 从一个盘子开始, 需要2天的时间为接触检测准备厌氧培养 (即, 从周一下午 (下午4时至 5时) 开始的培养将在周三中午左右为接触检测做好准备) 。以下步骤是在接触试验当天准备培养物所需的微生物技术。- 从板培养中提取一个菌落, 并在无菌培养管中加入 10ml lysogeny broth (lb), 并加入100μml 的氨匹西林钠盐 100 mgml 库存溶液 (最终浓度为 210 ug/ml 放大器)。
- 将培养物放入孵化器中, 在 + 37°c 下过夜生长, 摇号为220转/分。
- 第二天早上9点至 10点, 重新悬浮培养, 全天无氧生长 (20% 接种)。
- 将培养物从孵化器 (步骤 3.2.1) 和生长介质(步骤 1.1.9) 进入厌氧室。
- 在无菌的秃头管中加入8毫升的新鲜生长培养基和氨匹西林 (210μg/ml)。
- 收集2毫升的隔夜培养物, 并转移到2毫升的微离心管。以 10, 000 rcf 步骤离心 90秒, 倾倒上清液并在2 毫升新鲜生长介质中重新悬浮。在含有8毫升新鲜生长培养基和氨匹西林的巴氏管中加入悬浮培养物。
- 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从厌氧室取出, 放在孵化器中, 在 + 37°c 下无氧生长至 3-5 pm, 在220转/分时晃动。
- 在下午3点到5点之间, 在新鲜培养基中进行1% 的厌氧接种,并在一夜之间生长。
- 将支接管 (步骤 3.3.4) 与生长介质一起放入厌氧室。在无菌支管中加入100μl培养物, 加入10毫升的新鲜培养基(1% 接种), 并在无菌的支接管中加入放大器 (210 ug/ml 放大器)。
- 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从厌氧室取出, 放置在孵化器中, 在 + 37°c 下过夜, 在220转/分的情况下晃动。
- 在上午9点到10点之间, 重新悬浮培养, 全天无氧生长 (20% 接种疫苗)。
- 将培养物从孵化器 (步骤 3.4.1) 和生长介质(步骤 1.1.9) 进入厌氧室。
- 在无菌的秃头管中加入8毫升的生长培养基和氨匹西林 (210 ug/ml 放大器)。
- 收集2米的隔夜生长培养物, 并转移到2毫升的微离心管。以 10, 000 x g 离心 90秒, 倾倒上清液, 并在2 毫升的新鲜生长介质中重新悬浮。在含有8毫升新鲜生长培养基和氨匹西林的巴氏管中加入悬浮培养物。
- 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从室中取出并放置在孵化器中, 在 + 37°c 时无氧生长, 在220转/分时晃动。
- 使用分光光度计 (步骤 3.5.4) 监测培养物的生长, 直到达到od600的 0.6.每次 od 阅读前一定要进行漩涡培养。
注意: 此步骤需要 3-4小时, 在此期间应准备接触介质(步骤 1.2) 以及接触分析(步骤 4.1)。 - 当培养达到od600 0.6 (±0.1) (3-4小时的预期生长) 时停止生长。
- 将导管放入厌氧室(步骤 3.6), 并将培养物转移到 2x 2毫升微型离心管中。以 10, 000 x g 离心 90秒, 倾倒上清液, 并在 2 x 2 毫升的新鲜接触介质中重新悬浮。
- 重复清洗步骤3.7.1。一次, 以消除任何生长介质的痕迹。
- 将细胞培养的两个微离心管 (步骤 3.7) 结合成一个7毫升 ptfe 标准小瓶, 以获得要用于暴露检测的生物传感器库存(步骤 4)。
注意: 在使用前, 请务必将生物传感器库存通过彻底而轻轻的来回移液混合。该方法可能会在这里暂停长达一个小时。
4. 曝光检测
- 设计板布局。
注意: 在开始接触试验之前, 请务必计算所有移液值和库存.如何正确设计实验以及要包括哪些控件在文本中进行了详细说明。此外, 如果厌氧监测器上标明的厌氧室有氧气, 则不应开始实验。- 根据96井模板设计板材布局。要在3的技术复制中运行实验, 这将允许32种不同的处理, 最好用 4 x 8 网格来设置小瓶 (参见图 1)。
图 1:96 井板 (左) 和相应的 4 x 8 栅格包含 ptfe 小瓶 (右), 将转移到板上.请点击这里查看此图的较大版本.
注: 在用汞诱导生物传感器测试汞吸收变量的作用时; 每个变量都需要两种处理方法:处理(生物传感器 + 汞 + 变硝酸盐) 及其处理空白(生物传感器 +可变 + 硝酸盐)。在使用本构生物传感器测试变量对细胞生理的作用时, 每个变量都需要两种处理方法:处理(生物传感器 + hg + 可变硝酸盐) 和处理空白处理 ( 生物传感器 + 变量 + hg)。汞可能会被镉所取代。在执行校准曲线时, 汞或镉将成为变量。本构和诱导生物传感器不需要同时运行 (在同一板块布局中)。表 1提供了测试镁 (可变) 浓度范围时板布局和相应的 4 x 8 网格的模板示例。
| 1 | 2 | 3个 | 4个 | 5 | 6 | 7。 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| a | 汞诱导生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0 毫米镁 | 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 0 mm mg | 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0 毫米镁 | 本构生物传感器 + hg + 0 mm mg | ||||||||
| B | 汞诱导的生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0.1 毫米镁 | 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 0.1 mm mg | 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0.1 mm mg | 本构生物传感器 + 汞 + 0.1 mm mg | ||||||||
| C | 汞诱导的生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 | 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 | 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 | 本构生物传感器 + hg + 1 毫米镁 | ||||||||
| D | 汞诱导生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 10 毫米镁 | 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 10mm mg | 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 10 毫米镁 | 本构生物传感器 + 汞 + 10 毫米镁 | ||||||||
| e | ||||||||||||
表 1: 使用生物传感器在镁梯度 (0-10 mm) 上测试汞生物利用度 (5 nm) 的示例平板布局
- 根据检测板布局设置 4 x 8 网格。
- 将7毫升聚四氟乙烯标准小瓶放入托盘中。
注: 聚四氟乙烯小瓶在使用前应进行酸洗/加热。瓶只能通过操纵小瓶的外部来处理。 - 在每个小瓶中, 添加与每个治疗相对应的曝光介质体积。
注: 在总容量为 2, 000μl (2 毫升) 的接触中, 添加的接触介质将是:接触介质μl = 2, 000μl-处理 (空白) μl (例如,接触介质μl = 2, 000-100μl (生物传感器) –40μl (硝酸盐)-100 微米 (hhg μl)a–100μl (可变 (例如, mgso4) = 1660μl)。确保测试变量添加的体积不超过最终体积的 5% (100μl)。 - 在每个小瓶中, 添加相应体积的化学变量的溶液, 以便根据板布局进行测试。
- 从步骤1.3 开始, 将硝酸盐添加到每个小瓶中, 使最终浓度为200μm (40-80μl)。排除此步骤用于本构生物传感器处理空白。
- 从步骤2.1 或2.2 中, 根据板材布局在小瓶中添加汞 (在测试变量时使用 5nm ) 或 cd (在测试变量时为 300 nm )。不包括汞诱导生物传感器处理空白的这一步骤。
- 使用汞时, 取4-8μm库存, 摇匀。将暴露介质中的溶液稀释至100-250 nm的暴露介质, 制成有效的汞溶液。从这个工作解决方案中, 在所需的小瓶中添加汞。在这种情况下, 汞的校准曲线从0到 12.5 nm 不等。
注: 在测试变量对汞或镉生物利用度的影响时, 请确保 [汞] 或 [cd] 在所有处理过程中保持不变。添加汞或镉时, 一定要使用一个移液器尖端, 但千万不要接触小瓶中的接触介质。
- 使用汞时, 取4-8μm库存, 摇匀。将暴露介质中的溶液稀释至100-250 nm的暴露介质, 制成有效的汞溶液。从这个工作解决方案中, 在所需的小瓶中添加汞。在这种情况下, 汞的校准曲线从0到 12.5 nm 不等。
- 将7毫升聚四氟乙烯标准小瓶放入托盘中。
- 手动在轨道运动中晃动。
注意: 根据汞或镉指定溶液所需的时间, 实验现在可能会暂停。如果离开超过一个小时, 将聚四氟乙烯瓶盖放在聚四氟乙烯瓶上, 以防止蒸发/污染。 - 轻轻的移液器生物传感器来回库存, 以确保均匀性。在每个小瓶中添加100μl 的生物传感器. 手动晃动。
- 准备板读取器以热身,以便按照以下标准进行读取: 37°C 温度、每 2.5-5分钟读取一次、两次读取时的动态运行时间和使用以下标准进行荧光测量. 荧光激发440纳米和 500 纳米的发射。
- 从 4 x 8 网格中的每个 ptfe 小瓶中的移液器200μl进入96井板 (黑色, 96 井透明底非结合表面微板) 的相应井。移液器来回 5次, 然后转移每200μl。
注意: 不要丢弃移液器尖端, 而是将移液器尖端放在 ptfe 小瓶中, 以跟踪移液器的进度。 - 将96井板放入盘式读取器的托盘中, 然后将盖子放在96井板上并开始检测。
5. 量化数据
- 每次处理的荧光在每个时间点必须针对每个单独的井噪声进行校正, 并将其抹掉到处理的空白处.
- 每个处理(t) 的每个时间点 (t) 的荧光必须被转换为每个井的第一个时间点的初始荧光 (t0), 然后在 3个处理复制过程中的平均值 (r1-r 3)). 然后, 必须将这种治疗平均值抹掉到以同样方式翻译的平均治疗空白(tb) (公式 1)。
荧光(t) =平均值(t r1(t) –tr1 (t 0), tr1(t) –t r1 (t0), tr3(t) –t r3(t0)) –平均值( tbr1 (t) –tbr1 (t0), tbr1(t) –tb r1( t0), tbr3(t) – tbr3(t0)) (1)
注意: 这应该作为一个电子表格函数。还应该为每个时间点计算错误的正确传播。
- 将每次处理的修正荧光绘制为时间的函数
图 2: 校正荧光数据作为时间的函数.随着时间的推移, 随着时间的推移, 在厌氧条件下添加了 hg ii (0-12.5 nm), 以大肠杆菌 neb5α发射的相对荧光单位 (rfu) 测量.在37°c 下, 荧光是3个技术复制的平均值。请点击这里查看此图的较大版本.
注: 图表上没有 0 nm 汞值, 所有其他汞浓度均被作为处理空白, 被划分为 0 nm 汞。因此, 0 nm 汞代表 x 轴, 任何正荧光表示来自汞的荧光。它是可选的, 不空白荧光以这种方式, 但荧光曲线将给出误导性荧光曲线, 如果变量测试有背景荧光 (即, 溶解的有机物本身将荧光, 如果没有处理空白含有仅细胞和溶解有机物, 增加溶解性有机物浓度会增加荧光信号)。
- 量化荧光峰值。可量化的荧光峰值通常发生在 2.5-4小时后, 即消耗所有200μm 硝酸盐作为终端电子受体所消耗的能量。这个峰值应该被量化, 并代表该特定处理的最终荧光值。
注: 如果没有观察到荧光峰值 (即没有汞的生物利用度), 则应量化在控制的荧光峰值点 (即没有添加变量或 5nm hg) 的处理荧光。或者, 如果在处理中有荧光诱导, 但荧光不会产生一个明确定义的峰值, 则可能会污染较高的亲和力电子受体, 如 o2, 并应采取措施去除所有溶液中的氧气和实验必须再次进行。
Representative Results
一旦根据步骤5.3 量化了荧光峰, 荧光峰的结果就可以根据变量浓度来绘制, 说明该变量如何影响汞或镉的相对生物利用度。例如,图 2中荧光 [hgii] 的校准曲线将产生图3 a中所示的诱导数据。对于汞ii校准, 曲线将始终包含3个汞诱导菌株的成分;荧光信号产生前约 1-2 nm 汞 ii 的阈值响应与 [hhg ii] 线性成正比, 5 nmhhii将可靠地始终处于该范围的中心, 以及一个高原, 其中增加 [hhii] 将不再增加荧光信号。本构应变的信号产生没有变化, 这表明 [hhii] 的毒性不会影响信号的产生。对于图 3b中的 cdii , 诱导菌株总是有2个成分;一个线性范围, 200-300 nm cd ii 将可靠地始终处于线性范围和高原的中心。荧光信号随 [cdii] 的增加而降低, 表明较高的镉浓度对细胞有毒, 可以解释高原后 1000 nm cdii的诱导荧光产量下降的原因。因此, 在就环境变量测试汞或镉生物利用度时, 我们建议对汞ii使用5 nm,对 cdii使用 300 nm。
在某些情况下, 信号的产生可以适当归因于汞或镉的生物利用度, 但在另一些情况下, 信号的产生可能会受到生物传感器细胞宿主生理状态变化的影响 (例如,感兴趣的金属或测试的环境条件是有毒的)。在图 4 a中, 5 nm 汞的生物利用度在锌梯度 (0-10μm) 上进行了测试。在 hg 诱导菌株和本构菌株中, 随着锌浓度的增加, 信号也有类似的减少。因此, 人们无法区分信号是由于生物利用度降低还是由于锌毒性而产生的。在图 4b 和4B 中, 5nm 汞的生物利用度在镁ii (0-10 mm) 和 mMii (0-10μm) 的梯度上进行了测试。mgii和 mnii浓度的增加降低了诱导菌株的荧光信号。另一方面, 本构菌株没有显示荧光随 mg ii 和 mnii浓度的增加 (mgii和 mnii 对fbfp 生产中的细胞有益) 而减少, 如荧光信号的增加)。这表明这些细胞是可行的, 汞诱导菌株的荧光减少是汞生物利用度降低的结果。这些数据强调了所有生物传感器检测也为整个细胞适应性提供本构测量的重要性.
图 3: 与汞和镉的生物传感器的线性范围.以相对荧光单位±1的形式测量的最大荧光值±1标准偏差, 该偏差窝藏puc57merr-pp (hg-pl-pp) 和 puc19balch-pp (成分), 并添加a) hg ii (0-15 nm)c ) cdii (0-1000 nm) 在厌氧条件下。在37°c 下, 荧光是3个技术复制的平均值。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 锌的不确定结果的例子和镁和锰的结论性结果.以相对荧光单位±1的形式测量的最大荧光值,标准偏差由大肠杆菌neb5α携带 puc57merr-pp (hg-pl-pp) 和 puc19balch-p (成分), 并添加a) znii (0-μ10 m),b)在厌氧条件下, mgii (0-10 mm) 和c) mMii (0-10μm)。[hgii] 在所有处理中被设置为 5 nm, 荧光在37°c 下平均为3个技术复制。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
微生物生物传感器是识别金属与微生物相互作用的机制的有用工具。在这里, 我们描述了一种方法, 可以厌氧量化汞 ii 和 cdii生物利用度革兰氏阴性宿主细胞 (大肠杆菌), 并在几个小时内给出一个可量化的结果。该协议的主要优点之一是, 它通过避免可能导致金属沉淀的强结合配体或成分, 允许对接触介质中的金属形态进行广泛控制。金属形态已在这种曝光介质中使用 phreeqc17进行了建模和测试, 但可能会部署其他金属形态软件。在未添加配体的情况下, 汞形态预计为97% 汞 (oh)2和3% 汞 (nh3)22 +, 而镉形态将表现为59% 的 cd-β-甘油磷酸盐、25%cd 2 +和 16% cdso4。使用一个简单的热力学建模软件, 用户可以设计曝光介质和测试感兴趣的金属的生物利用度。此外, 生物传感器宿主细胞 (大肠杆菌neb5α) 在 ph 值 (5-8.5) 和氯化钠浓度 (0-0.55 m)17的范围内是可行的。
汞甲基化是一个厌氧过程, 本研究中概述的协议对氧气没有要求, 因此可以更准确地描述金属生物利用度的厌氧代谢。这一点很重要, 因为氧气的存在改变了基因表达谱48, 49, 因此, 潜在的运输途径;因此, 与目前的好氧替代品相比, 这种方法具有优势。这里介绍的生物传感结构可能与其他厌氧宿主一起使用, 这些主机可能与汞甲基化 (例如, geobacter、脱氧氟弧菌)更相关, 但可能比大肠杆菌更容易处理。目前这里介绍的方法的一个局限性是, 与现有的有氧系统4、19、37相反,我们的检测极限尚未达到 p m 水平。然而, 需要注意的是, 要实现这些低检测限, 需要采取几个步骤44: (一) 需要增加配体, 以确保汞保持在溶液中, 不吸附在微生物细胞壁上 (汞将被不可逆转地束缚)细胞表面硫醇, 防止其生物利用度 25,27;参见图 3a) 中汞的阈值响应, (二) 对细胞密度的修改, 或 (iii) 修改基因结构, 以包括mer-operon (即mert和merT) 的运输蛋白, 增加汞的通量在50,51的牢房里这些修改将有利于检测低浓度的汞, 但在评估与环境相关的情况时不一定是理想的。虽然以前的镉生物传感器主要是作为 "原则的证明" 而存在的, 但它们是在复杂的介质中设计的, 使调查人员无法评估物种形成对生物利用度的作用41,42,43,44岁
生物传感器是一个非常有用的工具, 用于确定金属物种具有生物利用性的机制。由于宿主生物不是氢甲基化物, 因此它只能用于开发汞如何进入革兰氏阴性菌的模型, 而不是汞-甲基化物如何获取汞的确切理由。还有其他确定汞生物利用度的方法, 如甲基化, 作为吸收或使用质量平衡方法的结果 10、15、20、45、46。尽管如此, 这里提出的方法提供了在活细胞中的准实时生物利用度数据的优势。我们不建议使用这种方法来量化环境矩阵中的汞或镉总量。尽管建议使用生物传感器来确定环境中的金属浓度 36, 但还有许多更容易获得的标准方法, 如 icp-ms、fas (用于 cd 分析) 或冷蒸汽原子吸收光谱 (用于汞)分析)。然而, 生物传感器可用于确定某一环境基质是否有可能提高或阻碍生物利用度;这是通过执行标准添加来实现的。
曝光介质的 ph 值可能会被改变到5和8.5 范围内的任何地方, 前提是将 mops 游离酸 (缓冲液) 与适当的 pka 的缓冲液的备用游离酸交换 (请参见适当的缓冲液 (ferreira等人).(2015年)47), 并调整与 koh 到适当的 ph 值时, 使曝光介质。此外, 该方法不仅限于汞和镉, 还可以使用其他转录调节剂推广到其他金属。
曝光测定可以进行改进, 以探讨其他电子受体, 如o 2和富马酸盐对汞或镉生物利用度的影响。可根据要求对利用 o2和富马酸酯作为电子受体的方法进行细微修改。
总之, 我们要强调以下几点:一)必须在步骤2中知道镉或汞库存的浓度, 因为这些库存将用于校准生物传感器。ii)在暴露日, 必须在 0.6 (±0.1) 的 od600处停止细胞的生长, 并在重新悬浮细胞培养时采取谨慎措施, 因为生物传感器被校准到该细胞密度。iii)最后, 在曝光日精心制作曝光介质是非常重要的。为确保协议的成功, 应同时培育多种文化 (以规避生长失败的可能性), 并应每周改造生长介质 (以规避媒体的转移性和可能的污染)。还应当指出, 在信号产生方面, 生物复制 (多种细胞培养物) 表现出变异性。虽然荧光响应可能因培养而异, 但在许多生物复制过程中, 对给定变量的荧光响应趋势应保持不变。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢两位匿名评审员以及 poulain 实验室成员的评论, 感谢他们就厌氧生物传感器的发展进行了深刻的讨论。安大略省的早期研究员奖、发现补助金和加拿大自然科学和工程研究理事会的加速器补充资助了这项研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
| Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
| 24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
| LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
| Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
| Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
| Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
| Microplate reader | |||
| 450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
| 500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
| Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
| Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
| MA-3000 (mercury analyzer) | |||
| pH probe | Any pH probe will work | ||
| 50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
| 0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
| Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
| Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
| Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
| Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
| Lysogeny Broth | |||
| Analytical grade H2SO4 |
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