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पारा और कैडमियम का पता लगाने के लिए एक Anaerobicीय संवेदक परख

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

यहां, हम एक anaerobic पूरे सेल माइक्रोबियल जैव संवेदक का मूल्यांकन करने के लिए कैसे विभिंन पर्यावरणीय चर पारा और anoxic वातावरण में बैक्टीरिया को सीडी की जैव उपलब्धता को प्रभावित करने का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।

Abstract

पारा (पारा) रोगाणुओं को जैव उपलब्धता खाद्य जाले में विषाक्त पारा अधिक इज़ाफ़ा करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । कैडमियम (सीडी) परिवर्तनों और बैक्टीरिया को जैव उपलब्धता मात्रा है कि प्रधान खाद्य फसलों में जमा होगा नियंत्रण । इन धातुओं की जैव उपलब्धता समाधान में उनके speciation पर निर्भर है, लेकिन अधिक विशेष रूप से anoxic स्थितियों जहां पारा विषाक्त monomethylmercury (MeHg) को methylated है और सीडी rhizosphere में बनी हुई है । पूरे सेल माइक्रोबियल जैव सेंसर एक quantifiable संकेत दे जब एक धातु cytosol में प्रवेश करती है और इसलिए उपयोगी उपकरण धातु जैव उपलब्धता का आकलन कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, सबसे अधिक संवेदन प्रयास अब तक मौजूदा रिपोर्टर प्रोटीन ऑक्सीजन के अभाव में कार्य करने की सीमित क्षमता के कारण वातावरण oxic करने के लिए विवश किया गया है । इस अध्ययन में, हम अपने को विकसित करने और एक पूरी सेल anaerobically कि अर्ध में anoxic हालत वास्तविक समय और घंटे के भीतर धातुओं का पता लगा सकते है काम करने में सक्षम परख का अनुकूलन प्रयास वर्तमान । हम का वर्णन कैसे जैव सेंसर की मदद कर सकते है कैसे रासायनिक चर धातुओं की पर्यावरण साइकिल चालन के लिए प्रासंगिक उनके जैव उपलब्धता को प्रभावित । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए विधियां शामिल है (1) anoxic शर्तों के तहत पारा और सीडी मानकों को तैयार, (2) ऑक्सीजन के अभाव में जैव संवेदक तैयार, (3) डिजाइन और एक प्रयोग को लागू करने के लिए निर्धारित कैसे चर की एक श्रृंखला पारा या सीडी जैव उपलब्धता को प्रभावित करता है, और (4) को यों तो और अधिक सेंसर डेटा की व्याख्या । हम जैव सेंसर के रैखिक पर्वतमाला दिखाने के लिए और दोनों धातु-inducible और गठन उपभेदों का उपयोग करके धातु जैव उपलब्धता और विषाक्तता के बीच अंतर करने के लिए विधि की क्षमता दिखा उदाहरण प्रदान करते हैं.

Introduction

बुध (पारा) एक वैश्विक प्रदूषक और पारा methylating रोगाणुओं के लिए अपने जैव उपलब्धता है खाद्य जाले और उसके मानव और वंय जीवन में संभव neurotoxic प्रभाव के माध्यम से अपनी वृद्धि की दिशा में पहला कदम है1। यह वर्तमान में सोचा है कि माइक्रोबियल पारा मिथाइल एक intracellular प्रक्रिया की आवश्यकता है कि: i) पारा की प्रजातियों के लिए उपलब्ध हो2,3,4,5,6,7 और द्वितीय) कोशिका के लिए शारीरिक रूप से सक्षम होना methylating पारा8,9,10। कैडमियम (सीडी) जीवों में संचित, लेकिन foodwebs में biomagnifies नहीं है और व्यापक रूप से औद्योगिक और वाणिज्यिक प्रक्रियाओं है कि आमतौर पर लोगों और पर्यावरण11में तीव्र जोखिम के कारण में प्रयोग किया जाता है । हालांकि रोगाणुओं के माहौल में पारा के भाग्य में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा, सीडी geochemistry और ecotoxicology पर सबसे अधिक अध्ययन माइक्रोबियल eukaryotes12पर ध्यान केंद्रित । कृषि फसलों की खपत (जैसे, चावल) कैडमियम को प्रत्यक्ष जोखिम का मुख्य स्रोत है; इस मामले में, rhizosphere के रोगाणुओं के लिए सीडी की जैव उपलब्धता सीधे राशि पौधों13जमा कर सकते है प्रभावित करता है ।

पारा परिवहन रास्ते जटिल है और संभवतः एक सक्रिय परिवहन चरण14शामिल है । जब एक ट्रांसपोर्टर शामिल है, हाल ही में काम का सुझाव दिया है कि पाराद्वितीय एक Znद्वितीय या Mnद्वितीय ट्रांसपोर्टर7,15,16,17का उपयोग करता है । जबकि सीडीद्वितीय गलती से divalent धातु परिवहन रास्ते (विशेष रूप सेद्वितीय या Znद्वितीय), कोशिकाओं के अंदर सीडीद्वितीय परिवहन के तंत्र के माध्यम से cytosol में ले जाया जा कल्पना की है सट्टा, और कोई सीडी विशिष्ट परिवहन मार्ग13,18की पहचान की गई है । शामिल ट्रांसपोर्टरों की प्रकृति की परवाह किए बिना, तीन यंत्रवत कारकों अंततः एक सेल में प्रवेश करने के लिए धातुओं की क्षमता का निर्धारण: i) समाधान2,6,15में धातु speciation, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) कोशिका झिल्ली के biophysiochemical गुण17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, और iii) धातु के लिए एक परिवहन साइट7,३२का उपयोग करने की क्षमता । सीडी और पारा की संभावना नहीं है माइक्रोबियल शारीरिक रूप से प्रासंगिक विखंडित कार्बनिक पदार्थ (डोम), chelating संदूषण (जैसे, EDTA), या कम सल्फर moieties३३के लिए उच्च समानता के कारण स्थितियों के तहत मुक्त आयनों के रूप में मौजूद है, ३४,३५ (सीडीद्वितीय इन लाइगैंडों के अभाव में एक मुक्त आयन या फार्म आयन-जोड़े के रूप में मौजूद कर सकते हैं) । वहां कैसे इन धातु प्रजातियों के वातावरण में उनके भाग्य के लिए प्रासंगिक शर्तों के तहत उपलब्ध है निर्धारित करने में कुशल तरीकों की कमी है । उदाहरण के लिए, पारा anaerobic शर्तों14के तहत methylated है, और दोनों कैडमियम और पारा नरम धातुओं (या वर्ग बी cations) हैं, की आवश्यकता है कि उनकी speciation शर्तों के तहत जांच की है कि कम सल्फर समूहों की अखंडता बनाए रखने के ।

माइक्रोबियल जैविक संवेदी जीवाणु कोशिकाओं है कि एक धातु के intracellular सांद्रता के जवाब में एक quantifiable संकेत फेंकना, इस मामले में पारा या सीडी में हैं । जैसे, वे आदर्श उपकरण है समझने की कैसे धातुओं एक सेल३६, बशर्ते कि जोखिम शर्तों ध्यान के लिए नियंत्रित कर रहे है दर्ज करें । पारा-संवेदी आमतौर पर मेर-ऑपरोन के विनियामक सर्किट के बीच जीन फ्यूजन शामिल (प्रतिलेखन नियामक के लिए एंकोडिंग MerRas के रूप में अच्छी तरह से ऑपरेटर और ऑपरोन के प्रवर्तक क्षेत्रों सहित), और जीन रिपोर्टिंग (जैसे, लक्स, gfp, लाख जीन) । जब पारा कोशिका द्रव्य में मौजूद है, यह MerR को बांध, रिपोर्टिंग जीन और बाद में संकेत उत्पादन19,३७की प्रतिलेखन में जिसके परिणामस्वरूप होगा । विशिष्ट सीडी आमतौर पर cadC, cadAC, zntA या zntR इनकोडिंग प्रतिलेखन नियामकों३८का उपयोग कर डिजाइन किए हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य बात है कि MerR एक कम है, अभी तक quantifiable संबंध सीडी5। सबसे अधिक इस्तेमाल किया luminescent या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के एरोबिक प्रतिबंध के कारण, हाल ही में सूक्ष्म जीवाणुओं जब तक कि anoxic शर्तों के तहत धातुओं के जैविक रूपांतरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में असमर्थ रहे । यह उनके पर्यावरणीय भाग्य के लिए प्रासंगिक स्थितियों की एक सीमा से अधिक बहुत मुश्किल धातुओं जैव उपलब्धता का anaerobic पता लगाने बनाता है, विशेष रूप से redox संवेदनशील लाइगैंडों की उपस्थिति में (जैसे, सल्फाइड और thiols)4, 5 , ३९.

ऑक्सीजन के अभाव में लाइव इमेजिंग की methodological बाधा को दूर करने के लिए Drepper एट अल. (२००७) एक फ्लेविन आधारित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FbFp) विकसित किया है, SB2 प्रोटीन के प्रकाश ऑक्सीजन वोल्टेज डोमेन के आधार पर पी putidaसे । यह प्रोटीन परिवार ऑक्सीजन४०के अभाव में fluoresce करने में सक्षम है । Drepper एट अलके काम पर बिल्डिंग, हमारी प्रयोगशाला एक anaerobic oxic और anoxic शर्तों के तहत पारा जैव उपलब्धता के अध्ययन के लिए अनुमति सेंसर डिजाइन और 17लवणता की एक विस्तृत श्रृंखला पर । वर्तमान समाचार पत्र में, हम का वर्णन कैसे तैयार करने के लिए और जैव सेंसर का उपयोग करने के लिए पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर पर्यावरण ' चर प्रभाव का परीक्षण । हालांकि हम पाराद्वितीयके लिए विकसित संवेदक, हम एक के रूप में सीडीद्वितीय के साथ प्रयोग करने का फैसला किया तथ्य यह है कि अधिक से अधिक तनाव का जवाब भी कर सकते है पाठक का ध्यान आकर्षित करने का मतलब है कि सह की संभावना है पर्यावरण में होते है matrices इस मामले में सीडीद्वितीय की जांच की गई क्योंकि यह transcriptional नियामक MerR5से बाइंड करने के लिए जाना जाता है । यहां, हम या तो धातु के संबंध में प्रतिनिधि अंशांकन और कार्यात्मक रैखिक पर्वतमाला दिखाते हैं । हम भी एक उदाहरण देते है जब जैव सेंसर के परिणाम निर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर एमजीद्वितीय और Mnद्वितीय ) और अनिर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर Znद्वितीय ) ।

Protocol

1. विकास मीडिया और एक्सपोजर मीडिया की तैयारी

  1. २५० मिलीलीटर विकास माध्यमबनाने के लिए:
    नोट: ट्रेस तत्व #1 समाधान और ट्रेस तत्व #2 समाधान पहले से ही तैयार हैं, तो चरण 1.1.5 के लिए छोड़ें ।
    1. एक साफ volumetric कुप्पी (२०० मिलीलीटर) में ट्रेस तत्वों #1 समाधान तैयार १.५ x 10 के अंतिम molarities-3 एम ना2मू4, ६.५ x 10-4 एम ना2एसईओ4, 5 एक्स 10-3 एम एच3बो शामिल करने के लिए ३, व ०.१ मी NaOH.
      चेतावनी: मजबूत कुर्सियां (NaOH) संक्षारक हैं । सुनिश्चित करें कि अंतिम molarity कुंजी ट्रेस तत्वों का प्रतिनिधित्व करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए एजेंट तौल करते हैं; मो, एसई, और बी.
    2. एक बाँझ क्षेत्र के तहत, एक साफ/बाँझ प्लास्टिक/Polytetrafluoroethylene (PTFE) बोतल में एक ०.२२ µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर.
    3. ट्रेस तत्वों को तैयार करें #2 समाधान में क्लीन volumetric कुप्पी (२०० मिलीलीटर) के अंतिम molarities में शामिल करने के लिए ०.०१ m MnSO4, 5 x 10-4 एम ZnSO4, ३.२५ x 10-3 एम CoCl2, ६.२५ x 10-3 एम NiCl 2, और ०.१ एम एच2तो4.
      चेतावनी: मजबूत एसिड (एच2तो4) संक्षारक हैं । सुनिश्चित करें कि अंतिम molarity कुंजी ट्रेस तत्वों का प्रतिनिधित्व करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए एजेंट तौल करते हैं; Mn, Zn, कं, औ नी.
    4. एक बाँझ क्षेत्र के तहत, एक साफ कांच की बोतल में एक ०.२२ µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर बंध्याकरण फिल्टर.
    5. एक बाँझ क्षेत्र के तहत, एक साफ/बाँझ कांच की बोतल में (२५० मिलीलीटर न्यूनतम); जोड़ २०० मिलि ultrapure पानी, ४२.५ मिलीलीटर की M9 न्यूनतम लवण (5x; सामग्री की तालिकादेखें), २.५ मिलीलीटर की 2 एम ग्लूकोज, १२५ µ एल के 2 एम MgSO4, १२०० µ एल के ०.६ एम Thiamine एचसीएल के एक जमे हुए (-20 ˚ सी) aliquot, १.२५ मिलीलीटर से 4 एम नैनो3 , ७७० µ l के ०.०७५ m l-leucine/l-isoleucine/वैलिन सॉल्यूशन, २५० µ l ट्रेस तत् #1, २५० µ l का एक् ट्रेस तत् #2, और २५० µ l का ०.०१ m EDTA सोडियम नमक ।
      नोट: चरण 1.1.5 में सभी एजेंट पहले तैयार किया जाना चाहिए और एक ०.२२ µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर निष्फल फिल्टर. Ultrapure पानी एक आटोक्लेव का उपयोग कर निष्फल हो सकता है ।
    6. अब कांच की बोतल ले लो कदम से समाधान युक्त 1.1.5., ढीले यह टोपी और यह anaerobic चैंबर एयर लॉक के माध्यम से चक्र ।
    7. anaerobic चैंबरमें, ०.२२५ एम FeSO4 के 15 µ एल जोड़ें ०.२ एम एच2में तो4, कैप बोतल कसकर, और हिला जब तक सभी सफेद हाला गायब हो जाते हैं ।
      नोट: चरण 1.1.7 में सभी एजेंट पहले तैयार किया जाना चाहिए और एक ०.२२ µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर निष्फल फिल्टर. स्टोर ०.२ एम एच2में ०.२२५ मीटर FeSO4 तो4 anaerobic चैंबरमें ।
    8. बोतल से टोपी निकालें, मुद्रा के लिए हवा के लिए 1 मिनट रुको, बोतल से टोपी की जगह है, और फिर जोरदार हिला । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
    9. बोतल पर कसकर टोपी जकड़ना, anaerobic चैंबरसे हटाने के लिए, और फ्रिज में स्टोर बोतल (4 ˚ C) जब तक उपयोग.
    10. विकास माध्यम 1.1.9 करने के लिए 1.1.5 कदम दोहरा कर सप्ताह में एक बार फिर से बनाया जाना चाहिए ।
  2. 2 x ५० मिलीलीटर में जोखिम मध्यम के १०० मिलीलीटर बनाने के लिए शंकु बाँझ के केंद्रापसारक ट्यूबों:
    नोट: हम अनुशंसा करते है कि जोखिम के माध्यम से जोखिम परख के दिन पर तैयार करने के लिए संदूषण के जोखिम को कम करने, लेकिन यह पहले से बनाया जा सकता है और फ्रिज में संग्रहीत ।
    1. anaerobic चैंबरमें प्रत्येक के लिए ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब जोड़ें ४२ मिलीलीटर की anaerobic ultrapure पानी, ३५० µ एल के 1 एम सोडियम बीटा-Gylcerophosphate से एक जमे हुए (-20 ˚ ग) aliquot, 2 मिलीलीटर की 1 मीटर MOPS नि: शुल्क एसिड, ५० μL की 1 मीटर (NH4)2सू4 , १२५ μL का 2 मीटर ग्लूकोज, ३०० μL का २.५ मीटर कोह, और २०० μL का २.५ मीटर NaOH ।
      नोट: चरण 1.2.1 में सभी एजेंट पहले तैयार किया जाना चाहिए और एक ०.२२ µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर निष्फल फिल्टर. Ultrapure पानी एक आटोक्लेव का उपयोग कर गर्मी निष्फल हो सकता है । २.५ मीटर NaOH और २.५ मीटर NaOH को प्लास्टिक/PTFE की बोतलों में संग्रहित करना होगा । सूचीबद्ध सभी एजेंट सोडियम बीटा-Gylcerophosphate, जो एक (-20 ˚ सी) फ्रीजर में संग्रहीत किया जा रहा है को छोड़कर anaerobic चैंबर में संग्रहीत किया जाना चाहिए । सामांय में, यह अच्छा अभ्यास के लिए anaerobic कक्ष में कई दिनों के लिए सभी प्लास्टिक या गिलास भागों और कंटेनरों को छोड़ सुनिश्चित करें कि ऑक्सीजन का कोई निशान नहीं रह गया है ।
    2. कैप ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूबों, अच्छी तरह से हिला, और एक 10 मिलीलीटर aliquot हटाने के लिए पीएच उपाय । इस जोखिम मीडिया के मापा पीएच 25 ˚ सी में हमेशा ७.०० ± ०.०२उपाय करना चाहिए पीएच इस श्रेणी के भीतर उपाय नहीं करता है, तो इस के लिए सही करने के लिए जोड़ा २.५ M KOH की मात्रा समायोजित करें ।
      नोट: एक पीएच जांच के साथ पीएच के लिए सही करने के लिए समाधान अनुमापन कभी नहीं । पीएच जांच जोखिम के माध्यमके लिए संदूषण का एक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । pH हमेशा चरण 1.2.1 में जोड़े गए एजेंट का एक उत्पाद होना चाहिए ।
  3. एक 5-10 mM नैनो3 शेयर समाधान तैयार है और anaerobic चैंबर में छोड़ जोखिम परखके समय के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: यह आसान है एक अधिक केंद्रित प्राथमिक नैनो3 मानक के रूप में एक 5-10 mM नैनो3 प्राथमिक मानक बनाने के लिए विरोध को पतला ।

2. पारा और कैडमियम मानकों की तैयारी ।

  1. ०.२ एम एच2में 4-8 µ मीटर Mercuric (पाराद्वितीय) समाधान की तैयारी करना तो4.
    1. एक millimolar (1-10 मिमी) HgCl2, HgNO3 या HgSO4 समाधान ०.२ एम एच2में तो4बनाने के द्वारा एक पारा2 + मानक तैयार करें ।
      चेतावनी: पारा अत्यधिक विषाक्त और एच2है तो4 संक्षारक है । सभी आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ धुएं डाकू में संचालित ।
    2. एक PTFE बोतल में, 2.1.1 से मानक पतला । ०.२ एम एच2में तो4 4-8 µ मीटर पारा2 +की सीमा के भीतर एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: इस्तेमाल किया एसिड विश्लेषणात्मक ग्रेड एच2तो4होना चाहिए ।
    3. 2.1.2 से पारा एकाग्रता एक पारा विश्लेषक का उपयोग कर मांय किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: पारा एकाग्रता मांय करने के लिए अंय तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. 10 मिमी एच2में एक 10 µ एम सीडीद्वितीय समाधान की तैयारी तो4.
    1. CdCl2 के एक प्राथमिक मानक तैयार (पाउडर की सटीक वजन के लिए 10-50 मिमी रेंज) में ०.१ एम एच2तो4.
    2. स्वच्छ अंल में धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला में 20 मिलीलीटर borosilicate ग्लास शीशियों के साथ काले phenolic पेंच टोपियां के साथ PTFE रबर लाइनर का सामना करना पड़ा, 2.2.1 से मानक पतला करने के लिए 10 µ एम सीडी2 +। सुनिश्चित करें कि हर बाद धारावाहिक कमजोर पड़ने में एच2तो4 की एकाग्रता 10 मिमी रहता है ।

3. Anaerobic जोखिम परख के लिए के लिए सेंसर की तैयारी

  1. प्लेट पारा inducible (ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह PUC57merR-PpFbFp) और constitutively (ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह PUC19Balch-PpFbFp) से-८० ˚ सी cryostock Lysogeny शोरबा १२० से युक्त यूजी प्लेटों पर व्यक्त की है एम्पीसिलीन/ इन16के उत्पादन पर विवरण के लिए हमारे पहले प्रकाशित काम देखें ।
  2. 4:30-5 बजे, पौंड (+ amp) के 10 मिलीलीटर में एक संस्कृति inoculate और रातोंरात विकसित ।
    नोट: एक थाली से शुरू यह 2 दिनों के लिए जोखिम परख के लिए anaerobic संस्कृति तैयार (यानी, एक संस्कृति सोमवार दोपहर को शुरू (4:30-5 बजे) के लिए बुधवार को दोपहर के आसपास में जोखिम परख के लिए तैयार हो जाएगा लगता है) । निंनलिखित कदम आवश्यक सूक्ष्मजीवविज्ञानी जोखिम परखके दिन संस्कृतियों को तैयार करने के लिए आवश्यक तकनीक हैं ।
    1. प्लेट संस्कृति से एक कॉलोनी ले लो और एक बाँझ संस्कृति ट्यूब में 10 मिलीलीटर Lysogeny शोरबा (पौंड) के 21 µ एल के साथ एक १०० मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन सोडियम नमक के स्टॉक समाधान (अंतिम एकाग्रता है २१० यूजी/
    2. एक मशीन में संस्कृति प्लेस/और २२० rpm पर मिलाते के साथ ३७ ˚ सी पर रात भर हो जाना ।
  3. अगली सुबह 9-10 बजे, संस्कृति resuspend और दिन भर में anaerobically हो जाना (20% इनोक्युलम) ।
    1. anaerobic चैंबरमें मशीन (स्टेप 3.2.1) और ग्रोथ मीडियम (step 1.1.9) से कल्चर लाएं ।
    2. एक बाँझ Balch ट्यूब में ताजा विकास मध्यम और एम्पीसिलीन (२१० μg/एमएल) के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. एक 2 मिलीलीटर Microcentrifuge ट्यूब में रातोंरात उगाया संस्कृति और हस्तांतरण के 2 मिलीलीटर लीजिए । ९० सेकंड के लिए १०,००० आरसीएफ कदम पर केंद्रापसारक, डंप supernatant और ताजा विकास माध्यमके 2 मिलीलीटर में resuspend । रिसस्पेंडेड कल्चर को Balch ट्यूब से जोड़ना जिसमें ताजा ग्रोथ मीडियम और एम्पीसिलीन की 8 मिली.
    4. बाँझ तकनीक का प्रयोग, ध्यान से Balch ट्यूब पर एक रबर डाट जगह. anaerobic चैंबर और एक मशीन में जगह से निकालें/और 3-5 बजे तक anaerobically बढ़ती + ३७ ˚ C २२० rpm पर मिलाते के साथ ।
  4. 3 और 5 के बीच, ताजा विकास माध्यम में एक 1% anaerobic इनोक्युलम प्रदर्शन और रातोंरात हो जाना ।
    1. विकास माध्यमके साथ साथ anaerobic चैंबर में Balch ट्यूब (step 3.3.4) लाएं । एक बाँझ Balch ट्यूब में amp (२१० यूजी/एमएल amp) के साथ ताजा विकास मध्यम (1% इनोक्युलम) के 10 मिलीलीटर के लिए संस्कृति के १०० µ एल जोड़ें ।
    2. बाँझ तकनीक का प्रयोग, ध्यान से Balch ट्यूब पर एक रबर डाट जगह. anaerobic कक्ष, एक मशीन में जगह से निकालें/शेखर, और २२० rpm पर मिलाते के साथ ३७ ˚ सी पर रात भर हो जाना ।
  5. 9 और 10 के बीच, दिन भर anaerobically बढ़ने के लिए संस्कृति resuspend (20% इनोक्युलम) ।
    1. anaerobic चैंबरमें मशीन (स्टेप 3.4.1) और ग्रोथ मीडियम (step 1.1.9) से कल्चर लाएं ।
    2. एक बाँझ Balch ट्यूब में विकास मध्यम और एम्पीसिलीन (२१० यूजी/एमएल amp) के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. एक 2 मिलीलीटर Microcentrifuge ट्यूब में रातोंरात उगाया संस्कृति और हस्तांतरण के 2 मीटर लीजिए । ९० सेकंड के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक, डंप supernatant, और ताजा विकास माध्यमके 2 मिलीलीटर में resuspend । रिसस्पेंडेड कल्चर को Balch ट्यूब से जोड़ना जिसमें ताजा ग्रोथ मीडियम और एम्पीसिलीन की 8 मिली.
    4. बाँझ तकनीक का प्रयोग, ध्यान से Balch ट्यूब पर एक रबर डाट जगह. एक मशीनर में चैंबर और जगह से निकालें और २२० rpm पर मिलाते के साथ ३७ ˚ सी पर anaerobically बढ़ने/
  6. एक spectrophotometer (चरण 3.5.4) का उपयोग कर संस्कृति के विकास की निगरानी जब तक एक ६०० ०.६ के आयुध डिपो तक पहुंच गया है । हो भंवर संस्कृति को यकीन है कि पहले प्रत्येक आयुध डिपो पढ़ने के लिए ।
    नोट: इस कदम 3-4 घंटे लगते हैं, और जोखिम मध्यम (कदम १.२) इस समय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जोखिम परख (चरण ४.१) के दौरान तैयार किया जाना चाहिए ।
  7. विकास बंद करो जब संस्कृति ०.६ (± ०.१ ) (3-4 घंटे की उंमीद वृद्धि) के एक आयुध डिपो ६०० तक पहुंचता है ।
    1. anaerobic चैंबर में ट्यूब लाओ (कदम ३.६) और 2 एक्स 2 मिलीलीटर Microcentrifuge ट्यूबों में संस्कृति हस्तांतरण । ९० सेकंड के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक, डंप supernatant, और 2 ताजा जोखिम मध्यमके एक्स 2 मिलीलीटर में resuspend ।
    2. दोहराएं धुलाई चरण 3.7.1 । एक बार विकास माध्यमके किसी भी निशान को हटाने के लिए ।
  8. सेल संस्कृति के दोनों microcentrifuge ट्यूबों का मिश्रण (चरण ३.७) एक 7 मिलीलीटर PTFE मानक शीशी में करने के लिए जोखिम परख (4 कदम) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
    नोट: करने के लिए अच्छी तरह से अभी तक धीरे से और आगे पीछे pipetting उपयोग के लिए पहले से अधिक सेंसर स्टॉक मिश्रण सुनिश्चित करें । विधि यहां एक घंटे तक के लिए रोका जा सकता है ।

4. एक्सपोजर परख

  1. एक प्लेट लेआउट डिजाइनिंग ।
    नोट: सभी pipetting मूल्यों की गणना और शेयरों जोखिम परख शुरू करने से पहले तैयार करने के लिए सुनिश्चित हो । कैसे ठीक से एक प्रयोग डिजाइन करने के लिए और क्या नियंत्रण शामिल करने के लिए पाठ में विस्तृत है । इसके अलावा, प्रयोग शुरू नहीं किया जाना चाहिए अगर वहां ऑक्सीजन है anaerobic चैंबर में anaerobic मॉनिटर पर संकेत दिया ।
    1. एक ९६ अच्छी तरह से टेंपलेट के अनुसार प्लेट लेआउट डिजाइन । 3 के तकनीकी प्रतिकृति में प्रयोगों चलाने के लिए, यह ३२ विभिन्न उपचार, जो सबसे अच्छा एक 4 एक्स 8 ग्रिड द्वारा की शीशियों स्थापित करने के लिए का प्रतिनिधित्व करता है के लिए अनुमति देगा ( चित्रा 1देखें).

Figure 1
चित्रा 1: एक ९६ अच्छी तरह से थाली (बाएं) और एक इसी 4 x 8 PTFE शीशियों (दाएं) युक्त ग्रिड थाली को हस्तांतरित किया जाना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नोट: बुध inducible के साथ पारा पर एक चर की भूमिका के लिए परीक्षण करते समय- संवेदी; दो उपचार प्रत्येक चर के लिए आवश्यक हैं: उपचार (सेंसर + पारा + चर + नाइट्रेट) और इसके उपचार रिक्त ( चर + नाइट्रेट) । जब कोशिका के फिजियोलॉजी पर एक चर की भूमिका के लिए परीक्षण के गठन का उपयोग कर संवेदक, दो उपचार प्रत्येक चर के लिए आवश्यक हैं: उपचार (सेंसर + पारा + चर + नाइट्रेट) और उपचार रिक्त ( सेंसर + चर + पारा) । पारा कैडमियम से बदला जा सकता है । पारा या सीडी चर जब एक अंशांकन वक्र प्रदर्शन हो जाएगा । गठित और inducible के लिए एक ही समय में (एक ही प्लेट लेआउट में) चलाने की जरूरत नहीं है । प्लेट लेआउट के लिए एक टेम्पलेट उदाहरण और इसी 4 x 8 ग्रिड जब मैग्नीशियम की एक एकाग्रता रेंज का परीक्षण (चर) 1 तालिकामें प्रदान की जाती है).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ए पारा प्रेरित-संवेदी + पारा + नाइट्रेट + 0 मिमी मिलीग्राम पारा प्रेरित सी + नाइट्रेट + 0 मिमी मिलीग्राम गठित सेंसर + पारा + नाइट्रेट + 0 मिमी मिलीग्राम गठित-संवेदी + पारा + 0 मिमी मिलीग्राम
बी पारा प्रेरित-संवेदी + पारा + नाइट्रेट + ०.१ मिमी मिलीग्राम पारा प्रेरित-संवेदी + नाइट्रेट + ०.१ मिमी मिलीग्राम गठित-संवेदी + पारा + नाइट्रेट + ०.१ मिमी मिलीग्राम गठित-संवेदी + पारा + ०.१ मिमी मिलीग्राम
सी पारा प्रेरित-संवेदी + पारा + नाइट्रेट + 1 मिमी मिलीग्राम पारा प्रेरित सी + नाइट्रेट + 1 मिमी मिलीग्राम गठित-सेंसर + पारा + नाइट्रेट + 1 मिमी मिलीग्राम गठित-संवेदी + पारा + 1 मिमी मिलीग्राम
डी पारा प्रेरित-संवेदी + पारा + नाइट्रेट + 10 मिमी मिलीग्राम पारा प्रेरित-संवेदी + नाइट्रेट + 10 मिमी मिलीग्राम गठित-सेंसर + पारा + नाइट्रेट + 10 मिमी मिलीग्राम गठित-संवेदी + पारा 10 मिमी मिलीग्राम
ई

तालिका 1: एक उदाहरण प्लेट लेआउट का उपयोग करने के लिए जैव सेंसर का परीक्षण करने के लिए पारा जैव उपलब्धता (5 एनएम) मैग्नीशियम की एक ढाल पर (0-10 mM)

  1. परख प्लेट लेआउट के अनुसार 4 x 8 ग्रिड की स्थापना की ।
    1. ट्रे में 7 मिलीलीटर PTFE मानक शीशियों को रखें ।
      नोट: PTFE शीशियों एसिड धोया/गर्मी का उपयोग करने से पहले निष्फल किया जाना चाहिए । शीशियों को शीशी के बाहर जोड़कर ही संभाला जाना चाहिए.
    2. प्रत्येक शीशी करने के लिए, प्रत्येक उपचारके लिए इसी जोखिम मध्यम मात्रा जोड़ें ।
      नोट: २,००० µ एल (2 एमएल) की कुल मात्रा के साथ एक जोखिम में, जोड़ा गया एक्सपोजर मीडियम होगा: एक्सपोजर मीडियम µ l = २,००० µ l – उपचार (blank) µ l. (उदा., एक्सपोजर मीडियम µ l = २,००० – १०० µ l (विसेंसर) – ४० µ l (नाइट्रेट) – १०० µ l (पारा ) – १०० µ l (चर (उदा., MgSO4)) = १६६० µ l). सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम परीक्षण चर का जोड़ा अंतिम वॉल्यूम के 5% (१०० µ l) से अधिक नहीं है ।
    3. प्रत्येक शीशी के लिए, रासायनिक चर के समाधान की इसी मात्रा थाली लेआउट के अनुसार परीक्षण करने के लिए जोड़ें ।
    4. १.३ कदम से, प्रत्येक शीशी में नाइट्रेट जोड़ें ताकि अंतिम एकाग्रता २०० µ मीटर (40-80 µ एल) है । गठन के लिए इस कदम को शामिल न करने वाले सेंसर उपचार कारतूस।
    5. से कदम २.१ या २.२, पारा जोड़ें (5 एनएम जब एक चर के लिए परीक्षण) या सीडी (३०० एनएम जब एक चर के लिए परीक्षण) शीशियों को प्लेट लेआउट के अनुसार । पारा inducible के लिए इस कदम को बाहर निकालें उपचार कारतूस।
      1. जब पारा का उपयोग कर, 4-8 µ मीटर शेयर ले और अच्छी तरह से हिला । एक काम पारा समाधान बनाने के लिए 100-250 एनएम के लिए एक 7 मिलीलीटर PTFE शीशी में जोखिम के माध्यम में समाधान पतला । इस काम से समाधान के लिए आवश्यक शीशियों में पारा जोड़ें । इस मामले में 0 से १२.५ एनएम को लेकर पारा के अंशांकन वक्र ।
        नोट: जब पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर एक चर प्रभाव के लिए परीक्षण, सुनिश्चित करें कि [पारा] या [सीडी] सभी उपचार में निरंतर रहता है । जब पारा या सीडी जोड़ने, एक पिपेट टिप का उपयोग करें, लेकिन कभी नहीं स्पर्श शीशियों में जोखिम मध्यम ।
  2. मैंयुअल रूप से एक कक्षीय गति में हिलाओ ।
    नोट: प्रयोग अब पारा या speciate समाधान में सीडी के लिए आवश्यक समय के आधार पर रोका जा सकता है । यदि एक घंटे से अधिक के लिए छोड़ दिया, PTFE शीशियों पर जगह PTFE टोपियां वाष्पीकरण को रोकने के लिए/
  3. धीरे पिपेट वापस और आगे के लिए एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए सेंसर स्टॉक । प्रत्येक शीशी के लिए १०० µ एल जोड़ें । कक्षा में मैंयुअल रूप से शेक ।
  4. थाली पाठक को तैयार करने के लिए निंनलिखित मानदंडों के साथ पढ़ने के लिए गर्म: तापमान 37 ˚ सी, काइनेटिक चलाने के साथ 10 घंटे के लिए पढ़ता है के बीच में कक्षा में मिलाते हुए हर 2.5-5 मिनट के साथ पढ़ता है, और एक के साथ प्रतिदीप्ति माप ४४० एनएम का प्रतिदीप्ति उत्तेजना और ५०० एनएम का उत्सर्जन।
  5. पिपेट २०० µ एल में 4 x 8 ग्रिड में प्रत्येक PTFE शीशियों से ९६ खैर प्लेट के इसी कुएं में (काला, ९६-अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे गैर बाध्यकारी सतह Microplates). पिपेट आगे और पीछे 5 बार स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक २०० µ l
    नोट: पिपेट टिप को खारिज करने के बजाय, pipetting प्रगति का ट्रैक रखने के लिए PTFE शीशी में पिपेट टिप को छोड़ दें ।
  6. प्लेट रीडर की ट्रे में ९६ अच्छी तरह से थाली प्लेस, तो ९६ अच्छी तरह से थाली पर ढक्कन जगह और परख शुरू करते हैं ।

5. डेटा को बढ़ाता है

  1. प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक उपचार के प्रतिदीप्ति प्रत्येक व्यक्ति के लिए अच्छी तरह से शोर और उपचार खाली करने के लिए खाली करने के लिए ठीक किया जाना चाहिए ।
    1. प्रत्येक समय बिंदु (टी) प्रत्येक उपचार (टी) के लिए प्रतिदीप्ति प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के लिए खाते में अनुवाद किया जाना चाहिए (एक अच्छी तरह से पहली बार बिंदु के टी0), तो 3 उपचार के पार औसत प्रतिकृति (आर1-आर3 ). यह उपचार औसत तो औसत उपचार रिक्त (टीबी) एक ही तरीके से (समीकरण 1) में अनुवादित करने के लिए रिक्त होना चाहिए ।

प्रतिदीप्ति (t) = average(tr1(t) – tr1(t0), tr2(t) – tr2 (टी 0), टीr3(टी) – टीr3(टी0)) – औसत(टीबी r1 (t) – टीबीr1(टी0), टीबीr2(टी)– टीबीr2( टी0 ), टीबीr3(टी) – टीबीr3(टी0)) (1)

नोट: यह एक स्प्रेडशीट समारोह के रूप में किया जाना चाहिए । त्रुटि के समुचित प्रोपेगेशन भी हर समय बिंदु के लिए गणना की जानी चाहिए ।

  1. ग्राफ समय के एक समारोह के रूप में प्रत्येक उपचार के सही प्रतिदीप्ति

Figure 2
चित्र 2: प्रतिदीप्ति डेटा को समय के एक फ़ंक्शन के रूप में सही किया गया । प्रतिदीप्ति रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) ई. कोलाई बंदरगाह NEB5α द्वारा उत्सर्जित pUC57merR-पीपी (Inducible तनाव) समय के साथ पाराद्वितीय के अलावा के रूप में मापा (0-12.5 एनएम) anaerobic शर्तों के तहत । प्रतिदीप्ति ३७ ˚ सी में 3 तकनीकी की नकल की औसत था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नोट: ग्राफ पर कोई 0 एनएम पारा मूल्य है, और अंय सभी पारा सांद्रता एक उपचार रिक्तके रूप में 0 एनएम पारा को खाली कर दिया गया है । इसलिए, 0 एनएम पारा x अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है और किसी भी सकारात्मक प्रतिदीप्ति पारा से प्रतिदीप्ति किसी भी चर दिया प्रतिनिधित्व करता है । यह प्रतिदीप्ति इस तरह से खाली नहीं वैकल्पिक है, लेकिन फ्लोरोसेंट घटता भ्रामक प्रतिदीप्ति घटता दे अगर चर का परीक्षण किया है पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (यानी, भंग कार्बनिक बात ही होगा fluoresce और अगर वहां नहीं है सिर्फ कोशिकाओं और भंग कार्बनिक पदार्थ युक्त उपचार रिक्त, भंग कार्बनिक पदार्थ एकाग्रता बढ़ाने फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ जाएगा).

  1. प्रतिदीप्ति चोटी को यों ही बढ़ाता है. एक quantifiable प्रतिदीप्ति पीक आम तौर पर 2.5 के बाद हो जाएगा-4 घंटे, एक टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में सभी २०० µ एम नाइट्रेट की खपत से व्यय ऊर्जा का प्रतिनिधित्व । इस चोटी quantified किया जाना चाहिए और उस विशिष्ट उपचारके अंतिम प्रतिदीप्ति मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है ।
    नोट: घटना में कोई प्रतिदीप्ति चोटी मनाया (यानी, कोई पारा जैव उपलब्धता), नियंत्रण के प्रतिदीप्ति चोटी के समय बिंदु पर उपचार के प्रतिदीप्ति (यानी, नहीं जोड़ा चर या 5nM पारा) quantified किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, अगर वहां उपचार में प्रतिदीप्ति प्रेरण है, लेकिन प्रतिदीप्ति एक अच्छी तरह से परिभाषित चोटी का उत्पादन नहीं करता है, वहां की संभावना एक उच्च समानता इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने के रूप में इस तरह के संक्रमण है ओ2 और उपाय के निशान को दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए सभी समाधान और प्रयोग से ऑक्सीजन फिर से किया जाना चाहिए ।

Representative Results

एक बार प्रतिदीप्ति चोटियों ५.३ कदम के अनुसार किया गया है quantified, प्रतिदीप्ति चोटियों के परिणाम चर एकाग्रता के अनुसार रेखांकन किया जा सकता है कि कैसे चर या तो पारा या सीडी के सापेक्ष जैव उपलब्धता को प्रभावित करता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 2 से अधिक [पाराद्वितीय] प्रतिदीप्ति के अंशांकन वक्र चित्रा 3ए में प्रस्तुत inducible डेटा निकलेगा । पाराद्वितीय अंशांकन के लिए, वक्र हमेशा पारा-inducible तनाव के लिए 3 घटकों को शामिल करेंगे; प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन से पहले के बारे में 1-2 एनएम पाराद्वितीय की दहलीज प्रतिक्रिया रेखीय [पाराद्वितीयके लिए आनुपातिक है], रैखिक सीमा जहां 5 एनएम पाराद्वितीय मज़बूती से हमेशा उस सीमा के केंद्र में होगा, और एक पठार जहां बढ़ती [पाराद्वितीय] अब प्रतिदीप्ति संकेत वृद्धि होगी । गठन पर संकेत उत्पादन में कोई परिवर्तन नहीं तनाव से पता चलता है कि [पाराद्वितीय] से विषाक्तता संकेत उत्पादन को प्रभावित नहीं करता है । चित्र 3 बीमें सीडीद्वितीय के लिए, वहां हमेशा inducible तनाव के लिए 2 घटक हैं; एक रैखिक रेंज जहां 200-300 एनएम सीडीद्वितीय मज़बूती से हमेशा रैखिक रेंज और एक पठार के केंद्र में होगा । [सीडीद्वितीय] बढ़ाने के साथ प्रतिदीप्ति संकेत में कमी से पता चलता है कि उच्च सीडी सांद्रता कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे है और १००० एनएम सीडीद्वितीयमें पठार के बाद inducible प्रतिदीप्ति उत्पादन में कमी की व्याख्या कर सकते हैं । इसलिए, जब एक पर्यावरण चर के संबंध में पारा या सीडी जैव उपलब्धता परीक्षण, हम पारा द्वितीय के लिए 5 एनएम और सीडीद्वितीय के लिए ३०० एनएमका उपयोग सुझाव है ।

कुछ उदाहरणों में, संकेत उत्पादन ठीक से पारा या सीडी जैव उपलब्धता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, लेकिन अंय मामलों में, संकेत उत्पादन जैव संवेदक सेल मेजबान के शारीरिक स्थिति में भिंनता से प्रभावित हो सकते है (जैसे, ब्याज की धातु या पर्यावरण की स्थिति का परीक्षण विषाक्त कर रहे हैं) । चित्रा 4aमें, 5 एनएम पारा जैव उपलब्धता Zn (0-10 µ m) के एक ढाल पर परीक्षण किया गया था । दोनों पारा-inducible और गठन उपभेदों में, वहां Zn सांद्रता बढ़ाने के साथ संकेत में एक समान कमी है । इसलिए, एक भेदभाव नहीं कर सकते कि संकेत कम जैव उपलब्धता से परिणाम या Zn विषाक्तता का एक परिणाम है । चित्रा 4B और 4cमें, 5nM पारा जैव उपलब्धता एमजीद्वितीय (0-10 मिमी) और Mnद्वितीय (0-10 µ मीटर) के एक ढाल पर परीक्षण किया गया था । बढ़ती मिलीग्रामद्वितीय और Mnद्वितीय सांद्रता inducible तनाव के प्रतिदीप्ति संकेत में कमी आई । दूसरी ओर, गठित तनाव एमजीद्वितीय और mn द्वितीय सांद्रता के साथ प्रतिदीप्ति में कमी नहीं दिखा था (एमजीद्वितीय और mnद्वितीय FbFp के उत्पादन में कोशिकाओं के लिए फायदेमंद हैं, के रूप में द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि) । यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को व्यवहार्य है और पारा के प्रतिदीप्ति कमी-inducible तनाव परिणाम पारा जैव उपलब्धता में कमी से । इस डेटा को बल देता है कितना महत्वपूर्ण यह सभी के लिए है सभी सेंसर परख भी समग्र सेल फिटनेस के गठन की माप प्रदान करते हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: पारा और कैडमियम के साथ सेंसर की रैखिक पर्वतमाला. अधिकतम प्रतिदीप्ति रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में मापा (RFU) ± 1 मानक विचलन ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह द्वारा उत्सर्जित pUC57merR-पीपी (पारा-Inducible) और pUC19Balch-पीपी (गठन) के अलावा एक पाराद्वितीय (0-15 एनएम) और ख) anaerobic शर्तों के तहत सीडीद्वितीय (0-1000 एनएम) । प्रतिदीप्ति ३७ ˚ सी में 3 तकनीकी की नकल की औसत था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: जस्ता और मैग्नीशियम और मैंगनीज के साथ एक निर्णायक परिणाम के साथ एक अनिर्णायक परिणाम का उदाहरण । अधिकतम प्रतिदीप्ति रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में मापा (RFU) ± 1 मानक विचलन ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह के द्वारा उत्सर्जित pUC57merR-पीपी (पारा-Inducible) और pUC19Balch-पीपी (गठन) एक के अलावा के साथ ) Znद्वितीय (0-10 µ मीटर), ख) एमजीद्वितीय (0-10 मिमी), और सी) एमएनद्वितीय (0-10 µ मीटर) के तहत anaerobic शर्तें । [पाराद्वितीय] सभी उपचार के लिए 5 एनएम के लिए निर्धारित किया गया था और प्रतिदीप्ति ३७ ˚ सी में 3 तकनीकी की नकल की औसत था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

सूक्ष्म जीवाणुओं जो धातुओं रोगाणुओं के साथ बातचीत कर रहे है तंत्र की पहचान करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं । यहां, हम एक विधि है कि एक ग्राम नकारात्मक मेजबान सेल (ई. कोलाई) और एक quantifiable परिणाम देने के लिए पाराद्वितीय और सीडीद्वितीय उपलब्धता anaerobically यों तो कुछ ही घंटों के भीतर कर सकते है वर्णन । इस प्रोटोकॉल की प्रमुख शक्तियों में से एक यह है कि यह मजबूत बाध्यकारी लाइगैंडों या घटक है कि धातु वर्षण के लिए नेतृत्व कर सकते है परहेज द्वारा जोखिम के माध्यम में धातु speciation के व्यापक नियंत्रण की अनुमति देता है । धातु speciation मॉडलिंग की है और PHREEQC17का उपयोग कर इस जोखिम मध्यम में परीक्षण किया गया है, तथापि अंय धातु speciation सॉफ्टवेयर तैनात किया जा सकता है । कोई जोड़ा लाइगैंडों के मामले में, पारा speciation को ९७% पारा (OH)2 और 3% पारा (NH3)22 +के रूप में उपस्थित होने की उंमीद है, जबकि सीडी speciation ५९% सीडी के रूप में उपस्थित होंगे-β-Glycerophosphate, 25% सीडी2 +, और 16% CdSO4। एक सरल ऊष्मा मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, उपयोगकर्ता जोखिम मीडिया और ब्याज की धातु की जैव उपलब्धता के लिए परीक्षण डिजाइन कर सकते हैं । इसके अलावा, इस (5-8.5) और NaCl एकाग्रता (0-0.55 मी)17पीएच की एक विस्तृत श्रृंखला से अधिक व्यवहार्य है, (ई. कोलाई NEB5α) सेंसर मेजबान सेल ।

पारा मिथाइल एक anaerobic प्रक्रिया है, और इस अध्ययन में उल्लिखित प्रोटोकॉल ऑक्सीजन के लिए एक आवश्यकता नहीं है, धातु जैव उपलब्धता पर anaerobic चयापचय का अधिक सटीक विवरण के लिए अनुमति देता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑक्सीजन की उपस्थिति जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल४८,४९ और इसलिए, संभावित परिवहन रास्ते बदल; इसलिए इस विधि वर्तमान में exising एरोबिक विकल्प पर एक लाभ प्रस्तुत करता है । यहां प्रस्तुत की गई संवेदना का निर्माण संभावित रूप से अन्य anaerobic होस्ट के साथ किया जा सकता है जो बुध मिथाइल (उदा., Geobacter, Desulfovibrio) के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकते हैं, लेकिन शायद ई. कोलाईसे कम हो । यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की एक मौजूदा सीमा है कि पता लगाने की हमारी सीमा अभी तक पीएम स्तर तक पहुंच नहीं है, मौजूदा एरोबिक सिस्टम के विपरीत4,19,३७। लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें कि इन कम पता लगाने की सीमा को प्राप्त करने के लिए कई कदम उठाए जाने की जरूरत है४४: i) ligand अतिरिक्त यह सुनिश्चित करना है कि पारा समाधान में रहता है और माइक्रोबियल सेल की दीवार पर adsorb नहीं है की आवश्यकता है (पारा अपरिवर्तनीय होगा बाध्य सेल सतह thiols अपनी जैव उपलब्धता को रोकने के लिए25,27; चित्रा 3ए में पारा के लिए दहलीज प्रतिक्रिया देखें), द्वितीय) सेल घनत्व में संशोधन, या iii) आनुवंशिक निर्माण के लिए मेर-ऑपरोन के परिवहन प्रोटीन शामिल करने के लिए संशोधित (अर्थात् merT और merP), बढ़ती पारा फ्लक्स कक्ष के अंदर५०,५१. ये संशोधन पारा के कम सांद्रता का पता लगाने में फायदेमंद है, लेकिन जरूरी नहीं कि आदर्श जब पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्थितियों का आकलन होगा । जबकि पिछले कैडमियम जैव सेंसर मुख्य रूप से एक "सिद्धांत का सबूत" के रूप में मौजूद हैं, वे जटिल मीडिया है कि अंवेषक की अनुमति नहीं है में डिजाइन किए गए जैव उपलब्धता४१,४२ पर speciation की भूमिका का आकलन करने के लिए, ४३ , ४४.

इस में एक अविश्वसनीय रूप से उपयोगी उपकरण है तंत्र के निर्धारण में जो धातु प्रजातियों में उपलब्ध है । क्योंकि मेजबान जीव एक पारा-methylator नहीं है, यह केवल कैसे पारा ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और नहीं कैसे पारा-methylators पारा अधिग्रहण के लिए एक निश्चित औचित्य दर्ज कर सकते है के लिए एक मॉडल विकसित किया जा सकता है । अन्य विधियां जैसे कि मिथाइल के रूप में पारा जैव उपलब्धता का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं, एक परिणाम के रूप में या एक सामूहिक संतुलन दृष्टिकोण10,15,20,४५,४६का उपयोग करें । कहा जा रहा है कि, विधि यहां प्रस्तुत व्यावहारिक कोशिकाओं में अर्ध वास्तविक समय जैव उपलब्धता डेटा का लाभ प्रदान करता है । हम अनुशंसा करते है कि इस विधि के लिए एक पर्यावरणीय मैट्रिक्स में कुल पारा या सीडी का स्तर यों तो इस्तेमाल किया जा नहीं है । ३६पर्यावरण में धातु सांद्रता निर्धारित करने के लिए, कई और अधिक आसानी से उपलब्ध मानक तरीकों जैसे आईसीपी-MS, FAAS (सीडी विश्लेषण के लिए) या शीत वाष्प परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (पारा के लिए) के रूप में उपलब्ध हैं । विश्लेषण). हालांकि एक पर्यावरण मैट्रिक्स को बढ़ाने या जैव उपलब्धता में बाधा की क्षमता है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह मानक जोड़ प्रदर्शन से प्राप्त की है ।

जोखिम मीडिया के पीएच को कहीं भी 5 और ८.५ की सीमा के भीतर बदल दिया जा सकता है, MOPS मुक्त एसिड (बफर) प्रदान की उपयुक्त pKa के साथ एक बफर के एक वैकल्पिक मुक्त एसिड के साथ विमर्श किया है (कृपया उचित बफ़र्स की सूची (फरेरा एट अल देखें । (२०१५) ४७) और उचित पीएच को KOH के साथ समायोजित जब जोखिम मीडिया बना । इसके अलावा, विधि पारा और सीडी तक ही सीमित नहीं है, लेकिन अंय प्रतिलेखन नियामकों का उपयोग कर अंय धातुओं के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

जोखिम परख जैसे हे2 और fumarate पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर अंय इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों के प्रभाव का पता लगाने के संशोधित किया जा सकता है । विधि के लिए मामूली संशोधन दोनों ओ2 और fumarate के रूप में इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने का उपयोग अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।

सारांश में हम निंनलिखित बातों पर जोर देना चाहूंगा: I) यह आवश्यक है कि सीडी या पारा शेयरों की सांद्रता चरण 2 में जाना जाता है, के रूप में इन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में इन सेंसर । जोखिम दिवस पर द्वितीय) , कोशिकाओं की वृद्धि ०.६ के एक आयुध डिपो६०० पर रोका जाना चाहिए (± ०.१) और है कि देखभाल के लिए सेल संस्कृतियों resuspend जब लिया जाता है, के रूप में इस कोशिका घनत्व के लिए पर तुले है । III) अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि जोखिम के माध्यम जोखिम दिन पर कुशलता से किया जाता है । प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कई संस्कृतियों एक साथ उगाया जाना चाहिए (विकास की विफलता की संभावना को दरकिनार करने के लिए) और विकास के माध्यम साप्ताहिक (मीडिया और संभव संदूषण के metastability को दरकिनार करने के लिए) किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जैविक प्रतिकृति (एकाधिक सेल संस्कृतियों) एक्सप्रेस परिवर्तनशीलता जब यह उत्पादन संकेत करने के लिए आता है । हालांकि फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं संस्कृति से संस्कृति के लिए भिंन हो सकते हैं, एक दिया चर के जवाब में फ्लोरोसेंट प्रवृत्तियों कई जैविक प्रतिकृति में ही रहना चाहिए ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम दो गुमनाम समीक्षक से टिप्पणी के रूप में अच्छी तरह से anaerobic के विकास पर व्यावहारिक चर्चा के लिए Poulain लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना होगा । ओंटारियो के प्रांत से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार और एक खोज अनुदान और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद से एक त्वरक पूरक A.J.P. इस अध्ययन वित्त पोषित करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४२ जैव सेंसर पारा कैडमियम Anaerobic जैव उपलब्धता धातु Speciation
पारा और कैडमियम का पता लगाने के लिए एक Anaerobicीय संवेदक परख
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Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

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