Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Bir anaerobik biyoalgılayıcı tahlil civa ve kadmiyum tespiti için

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Burada, bir anaerobik bütün hücreli mikrobiyal biyoalgılayıcı ne kadar farklı çevresel değişkenler değerlendirmek için kullanılacak iletişim kuralı mevcut Hg ve Cd bioavailability bakteri anoksik ortamlarda için etkiler.

Abstract

Civa (Hg) bioavailability mikroplar için toksik Hg biomagnification gıda ağları içinde önemli bir adımdır. Kadmiyum (Cd) dönüşümleri ve bioavailability bakteri için başlıca bir gıda bitkileri birikir tutarı kontrol eder. Bu metallerin bioavailability onların türleşme çözüm, ama nerede Hg toksik monomethylmercury (MeHg) metillenmiş ve Cd içinde rizosferde devam ederse daha özellikle anoksik koşullar altında bağlıdır. Ne zaman bir metal sitozol girer ve bu nedenle metal bioavailability değerlendirmek için yararlı araçlar bütün hücreli mikrobiyal biyosensörler ölçülebilir bir sinyal ver. Ne yazık ki, çoğu biosensing çabaları-defa var kısıtlı-oksijen yokluğu işlevine varolan muhabir proteinlerin sınırlı yeteneği nedeniyle oxic ortamlara. Bu çalışmada, anaerobik metaller anoksik koşul altında yarı gerçek zamanlı olarak hem de saat içinde tespit edebilen geliştirmek ve işleyişi yetenekli bir bütün-hücre biyoalgılayıcı tahlil optimize bizim çaba tanıtacağız. Biz nasıl biyoalgılayıcı nasıl kimyasal değişkenleri çevre metaller etkiler onların bioavailability Bisiklete binme için ilgili değerlendirmek yardımcı olabilir açıklar. Yöntemleri (1) Hg hazırlamak için aşağıdaki iletişim kuralı içerir ve Cd standartlar anoksik şartlarda, (2) oksijen, (3) tasarım yokluğunda biyoalgılayıcı hazırlamak ve değişken bir dizi Hg veya Cd bioavailability ve (4) nasıl etkilediğini belirlemek için bir deneme yürütmek ölçmek ve biyoalgılayıcı verileri yorumlamak için. Biyosensörler doğrusal aralıklarını göstermek ve yöntemin metal bioavailability ve toksisite metal-indüklenebilir ve kurucu suşları kullanarak ayırt yeteneği gösteren örnekler sağlar.

Introduction

Civa (Hg) küresel bir kirletici ve onun bioavailability mikroplar methylating Hg için gıda ağları ve olası nörotoksik etkileri insan ve vahşi yaşam1onun biomagnification yolunda ilk adım. Şu anda o mikrobiyal Hg metilasyonu gerektiren bir süreçtir hücre içi düşünülmektedir: i) biyoyararlanım2,3,4,5,6,7 olmak Hg türler ve II) Hg8,9,10methylating fizyolojik olarak yeteneğine sahip olması hücre için. Kadmiyum (Cd) bioaccumulates organizmalarda, ama değil biomagnifies foodwebs içinde yapar ve genellikle akut Etkilenmeler neden insanlar ve çevre11endüstriyel ve Ticari işlemlerde yaygın olarak kullanılır. Mikroplar Hg kaderi ortamında birkaç anahtar rolü oynar rağmen Cd Jeokimya ve ecotoxicology çoğu çalışmalar mikrobiyal Ökaryotlar12üzerinde odaklanın. Tarımsal ürün (Örneğin, pirinç) tüketimi kadmiyum doğrudan maruz ana kaynağıdır; Bu durumda, Cd bioavailability rizosferde mikroplar için doğrudan tutarı etkiler bitkiler13birikir.

HG taşıma yolları karmaşık ve muhtemelen bir aktif taşıma adım14içerir. Bir taşıyıcı, söz konusu ise son iş HgII bir Zn kullanan önerilenII veya MnII ışınlama7,15,16,17. CDII yanlışlıkla taşınacak olan ise sitozol divalent metal taşıma yolları (özellikle MnII ya da ZnII) aracılığıyla mekanizmaları CDII hücreleri kalır iç taşıma spekülatif ve Hayır Cd özel taşıma yolu tespit13,18oldu. Taşıyıcıları dahil ne olursa olsun, üç mekanik faktörler sonuçta bir hücreye girmek için yetenek metallerin sebebini: i) metal türleşme çözüm2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, II) hücre zarı17,24,25,26,27,28,29 biophysiochemical özellikleri ,30,31ve III) metal taşıma sitesi7,32erişmek için yeteneği. CD ve Hg kirletici maddeler (Örneğin, EDTA) şelat veya kükürt moieties33azalmış bulunmaktadır ücretsiz iyonları nedeniyle onların yüksek benzeşimi için çözünmüş organik madde (DOM), mikrobiyal fizyolojik ilgili koşullar altında olarak olası değildir, 34,35 (CdII var olabilir bir ücretsiz iyon veya form iyon-çiftler halinde bu ligandlar yokluğu olarak). Bu metal türler biyoyararlanım kaderlerini çevre ile ilgili koşullar altında nasılsın belirlemede etkili yöntemler olmaması. Örneğin, Hg anaerobik14altında metillenmiş ve kadmiyum ve Hg yumuşak metaller (veya sınıf B katyonlar), onların türleşme düşük kükürt grupları bütünlüğünü koşullar altında araştırılması gerektiren.

Mikrobiyal biyosensörler yanıt olarak bu durumda Hg veya Cd bir metal hücre içi konsantrasyonları ölçülebilir bir sinyal yayarlar bakteriyel hücreler vardır. Bu nedenle, onlar nasıl bir hücre36, metaller girmek koşuluyla maruz kalma koşulları dikkatle için kontrol edilir anlamak için ideal araçlardır. HG biyosensörler genellikle içeren gen füzyon merdüzenleyici devre arasında-operon (dahil genlerin transkripsiyon regülatör MerRas operon bölgelerinde de operatör ve organizatörü kodlama) ve genler raporlama (Örneğin, Lux, gfp, lac genler). Merkür sitoplazma içinde olmadığı durumlarda, Merr'e, sonraki sinyal üretim19,37ve raporlama genlerin transkripsiyon kaynaklanan bağlayacaksınız. Yinelenen belirli Cd biyosensörler, cadC, kullanarak tasarlanmış cadAC, zntA veya zntR kodlanmış transkripsiyon regülatör38ama Merr'e Cd5alt henüz ölçülebilir bir yakınlık olduğunu fazlalaştı. Son zamanlarda mikrobiyal biyosensörler metaller anoksik şartlarda Biyotransformasyon anlayışlar sunmaz kaldı kadar çoğu aerobik kısıtlaması nedeniyle Işıksaçan veya floresan muhabir proteinler, yaygın olarak kullanılan. Bu metaller bioavailability anaerobik tespiti çok zor koşulları bir dizi üzerinde ilgili redoks hassas ligandlar (Örneğin, sülfat ve thiols)4, varlığında özellikle çevre kaderlerini yapar 5 , 39.

Hafifletmek için metodolojik engel canlı görüntüleme yokluğunda oksijen, Drepper vd. (2007) bir flavin tabanlı floresan protein (FbFp) geliştirilen, P. putidaSB2 protein ışık oksijen gerilim etki alanını temel alan. Bu protein ailesi oksijen40yokluğunda bulabilsem yapabiliyor. Drepper ve ark.çalışmaları bina, bizim laboratuvar Hg bioavailability oxic ve anoksik koşullar altında ve üzerinde tuzluluk 17geniş bir çalışma için izin veren bir anaerobik biyoalgılayıcı tasarlanmış. Geçerli kağıt hazırlamak ve biyoalgılayıcı Hg veya Cd bioavailability etkisi ortam değişkenleri sınamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Her ne kadar biyoalgılayıcı HgIIiçin geliştirdiğimiz, biyosensörler Ayrıca işbirliği içinde çevre oluşma olasılığı birden çok stres yanıt aslında okuyucunun dikkatini çekmek için bir araç olarak CdII ile deneyler yerine getirmeyi seçtiniz matrisler; Transkripsiyon regülatör Merr'e5bağlamak için bilindiğinden bu durumda CdII araştırılmıştır. İşte, temsilcisi kalibrasyon ve fonksiyonel doğrusal aralıkları ile ilgili her iki metal göstermektedir. Biyoalgılayıcı'nın sonuçları kesin (MgII ve Mn Hg bioavailabilityII ) olduğunda biz de bir örnek vermek ve sonuçsuz (Zn Hg bioavailabilityII ).

Protocol

1. büyüme medya ve pozlama medyası hazırlama

  1. 250 mL büyümeorta yapmak için:
    Not: eser elementler #1 çözüm ve eser elementler #2 çözüm zaten hazırlanan 1.1.5 adıma atlayın.
    1. Eser elementler #1 çözüm temiz volumetric flask (200 mL) 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO Son molarities içeren hazır olun 3ve 0.1 M NaOH.
      Uyarı: Güçlü bazlar (NaOH) aşındırıcı. Emin ne zaman son derişim anahtar izleme öğeleri temsil eder emin olmak için reaktifleri tartım yapmak; Mo, Se ve B.
    2. Steril bir alanı altında filtre sterilize temiz/steril plastik/politetrafloroetilin (PTFE) şişede 0,22 µm polyethersulfone şırınga filtre kullanarak.
    3. Eser elementler #2 çözüm temiz volumetric flask (200 mL) 0.01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, son molarities içerecek şekilde hazırlamak 6.25 x 10-3 M NiCl 2ve 0.1 M H2kadar4.
      Dikkat: Kuvvetli asit (H2SO4) aşındırıcı vardır. Emin ne zaman son derişim anahtar izleme öğeleri temsil eder emin olmak için reaktifleri tartım yapmak; MN, Zn, Co ve Ni.
    4. Steril bir alanı altında filtre sterilize temiz cam şişede 0,22 µm polyethersulfone şırınga filtre kullanarak.
    5. Bir steril alanında altında bir temiz/steril cam şişe (250 mL en az); 200 mL Ultrasaf Su, M9 en az tuzlar (5 x; bkz: Malzemeler tablo) 42,5 mL, 2 M glikoz, 2 M MgSO4125 µL, 0.6 M tiamin HCL 1200 µL 2.5 mL donmuş bir (-20 ˚C) aliquot--dan 4 M NaNO3 1,25 mL ekleyin , 0.075 M L-lösin 770 µL / L-isoleucine / valin çözüm, 250 µL eser elementler 1, 250 µL #2 izleme unsuruve 0.01 M EDTA sodyum 250 µL tuz.
      Not: Tüm reaktifler adım 1.1.5 rahip ve 0,22 µm polyethersulfone şırınga filtre sterilize filtre hazırlanmalıdır. Ultrasaf Su bir otoklav kullanılarak sterilize.
    6. Şimdi adım 1.1.5 solüsyon içeren cam şişeyi al., gevşek o kap ve anaerobik odası hava kilidi döngüsü.
    7. 4, şişe sıkı kap ve kadar tüm beyaz precipitates ortadan sallamak içinde anaerobik odası, 15 µL 0,225 M FeSO4 0.2 M H2ekleyin.
      Not: Tüm reaktifler 1.1.7. adımda önceden ve 0,22 µm polyethersulfone şırınga filtre sterilize filtre hazırlanmalıdır. 0,225 M FeSO4 0.2 M H2' Yani depolamak4 ' te anaerobik odası.
    8. Şişe kapağını çıkarın, hava değişimi, şişe kapağı değiştirin 1 dakika bekleyin ve şiddetle çalkalanır. Bir kez bu adımı yineleyin.
    9. Kapağı sıkıca şişe tutturmak, anaerobik odasıkaldırmak ve kullanmak kadar şişe (4 ˚C) buzdolabında saklamak.
    10. Büyüme orta haftada bir kez adımlar 1.1.5 1.1.9 yineleyerek yeniden.
  2. Pozlama orta 100 mL 2 x 50 mL konik steril Polipropilen santrifüj tüpleri yapmak için:
    Not: Bu poz orta önceden yapılabilir ancak pozlama tahlil gününde bulaşma, riskini en aza indirmek için hazırlanacak ve buzdolabında saklanan önerilir.
    1. Anaerobik odasıiçinde her 50 mL santrifüj tüpü ekleyin 42 mL anaerobik Ultrasaf Su, M sodyum Beta-Gylcerophosphate gelen bir donmuş (-20 ˚C) aliquot, 1 m 2 mL 1 350 µL MOPS asit, 1 M (NH4)250 μL yani ücretsiz4 , 2 M glikoz 125 μL, 2.5 M KOH 300 μL ve 2.5 M NaOH 200 μL.
      Not: Tüm reaktifler adım 1.2.1 rahip ve 0,22 µm polyethersulfone şırınga filtre sterilize filtre hazırlanmalıdır. Ultrasaf Su bir otoklav sterilize ısı olabilir. 2.5 M NaOH ve 2.5 M NaOH plastik/PTFE şişelerde saklanmalı. Listelenen tüm reaktifler anaerobik odası dışında sodyum Beta-(-20 ˚C) dondurucuya depolanacak olan Gylcerophosphate, depolanması gerekir. Genel olarak, tüm plastik ya da cam parçaları ve kapsayıcılar oksijen izine kalmasını sağlamak için anaerobik odasında birkaç gün için bırakmak iyi bir uygulamadır.
    2. 50 mL santrifüj tüpleri kap, Iyice çalkalayınız ve pH ölçmek için bir 10 mL aliquot kaldırmak. Bu poz ortamı ölçülmüş pH her zaman 7.00 ± 25 ˚C, 0.02ölçmek gerekir. Eğer pH aralığı içinde ölçmek değil, birimin eklenen 2.5 m KOH için bu sorunu gidermek için yeniden ayarlayabilirsiniz.
      Not: Asla için pH pH probu ile düzeltmek için çözüm titre. pH Probe prob pozlama ortaiçin kirlenme kaynağı temsil eder. PH her zaman 1.2.1. adımda eklenen reaktifler bir ürün olması gerekir.
  3. 5-10 mM NaNO3 hisse senedi çözüm hazırlamak ve pozlama tahlilsüre içinde kullanılmak üzere anaerobik odası bırakın.
    Not: Bir 5-10 mM NaNO3 birincil standart yapım aksine bir daha yoğun birincil NaNO3 standart seyreltik daha kolaydır.

2. civa ve kadmiyum standartları hazırlanması.

  1. Hazırlanıyor bir 4-8 µM Merkuris (HgII) çözüm 0.2 M H2SO4.
    1. Hg2 + standart bir millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 ya da HgSO4 çözüm 0.2 M H2' yaparak hazırlamak SO4.
      Dikkat: Cıva çok zehirli olduğunu ve4 aşındırıcı bu yüzden H2. Duman Davlumbaz gerekli tüm kişisel koruyucu ekipman ile çalışmaktadır.
    2. PTFE şişede 2.1.1 Standart sulandırmak. içine 0.2 M H2SO4 bir konsantrasyon aralığı 4-8 µM Hg2 +içinde elde etmek için.
      Not: kullanılan asit çok analitik Sınıf H2olmalıdır4.
    3. 2.1.2 üzerinden Hg konsantrasyonu Merkür Çözümleyicisi kullanılarak doğrulanması gerektiğini ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Hg konsantrasyonu doğrulamak için diğer yöntemler kullanılabilir.
  2. 10 µM Cd hazırlamaII çözüm 10 mM H2SO4.
    1. CdCl2 (10-50 mM aralığı doğru toz tartmak için) birincil standart 0.1 M H2' hazırlamak SO4.
    2. Bir dizi seri dilutions temiz asit durulanır 20 ml lastik gömlekleri borosilikat cam şişeleri siyah bakalit vidalı kapakları PTFE ile karşı karşıya, 2.2.1 standart için 10 µM Cd2 +oranında seyreltin. 10 mM4 sonraki her seri seyreltme kalır bu yüzden H2konsantrasyonu sağlamak.

3. anaerobik pozlama tahlil için biyoalgılayıcı hazırlanması

  1. Merkür indüklenebilir biyoalgılayıcı (E. coli NEB5α PUC57merR-PpFbFp yataklık) ve yapısal ifade biyoalgılayıcı (E. coli NEB5α PUC19Balch-PpFbFp yataklık) üzerinden-80 ˚C cryostock 120 ug/mL ampisilin içeren Lysogeny suyu tabak üzerine plaka. Ayrıntılar için daha önce yayımlanmış çalışmalarımız bu biyosensörler17ürün üzerinde görmek.
  2. At 4:30-5 PM, 10 mL LB (+ amp) bir kültürü aşılamak ve gecede büyümek.
    Not: bir tabaktan başlatmanızı anaerobik kültür pozlama tahlil için hazırlamak için 2 gün sürer (bir kültür başladı Pazartesi öğleden sonra (4:30-5 PM)Yani, hazır olacak Çarşamba tarihinde öğle saatlerinde yanında pozlama tahlil için). Aşağıdaki adımları gerekli mikrobiyolojik kültürler pozlama tahlilgününde hazırlamak gerekli tekniklerdir.
    1. Plaka kültüründen bir koloni tutup 10 mL Lysogeny suyu (LB) 21 µL ampisilin sodyum tuzu bir steril kültür tüp (son 210 ug/mL amp bölgedir) 100 mg/mL stok çözeltisi ile ekleyin.
    2. Kültür bir kuluçka makinesi/shaker yerleştirin ve 220 devir / dakikada sallayarak ile 37 derece ˚C adlı gecede büyümek.
  3. Ertesi sabah 9-10 AM kültür resuspend ve anaerobik (% 20 inoculum) gün boyunca büyür.
    1. İnkübatör (adım 3.2.1) kültüründen ve büyüme orta (adım 1.1.9) anaerobik odasıiçine getirin.
    2. Taze büyüme orta ve ampisilin (210 μg/mL) 8 mL steril Balch tüp içine ekleyin.
    3. Gecede yetiştirilen kültür ve transfer 2 mL 2 mL Microcentrifuge tüp toplamak. 10.000 RCF adımda 90 saniye süreyle santrifüj kapasitesi, süpernatant dökümü ve 2 mL taze büyüme ortaresuspend. Resuspended kültür 8 mL taze büyüme orta ve ampisilin içeren Balch tüp ekleyin.
    4. Steril tekniği kullanarak, dikkatle kauçuk tıpa Balch televizyonda yer. Anaerobik odası kaldırmak ve bir kuluçka makinesi/shaker ve anaerobik kadar 3-5 220 devir / dakikada sallayarak ile de 37 derece ˚C büyümek.
  4. 3 ila 5 PM, taze büyüme orta % 1 anaerobik inoculum gerçekleştirmek ve bir gecede büyümek.
    1. Balch tüp (adım 3.3.4) anaerobik odası ile birlikte büyüme ortagetirmek. 100 µL kültür amp (210 ug/mL amp) steril bir Balch tüp 10 mL taze büyüme orta (%1 inoculum) ekleyin.
    2. Steril tekniği kullanarak, dikkatle kauçuk tıpa Balch televizyonda yer. Anaerobik odasıkaldırmak, bir kuluçka makinesi/shaker yerleştirin ve 220 devir / dakikada sallayarak ile 37 derece ˚C adlı gecede büyümek.
  5. 9 ve 10 arasında anaerobik (% 20 inoculum) gün boyunca büyümeye kültür resuspend.
    1. İnkübatör (adım 3.4.1) kültüründen ve büyüme orta (adım 1.1.9) anaerobik odasıiçine getirin.
    2. Büyüme orta ve ampisilin (210 ug/mL amp) 8 mL steril Balch tüp içine ekleyin.
    3. Gecede yetiştirilen kültür ve transfer 2 m 2 mL Microcentrifuge tüp toplamak. 10.000 x g 90 saniye süreyle santrifüj kapasitesi, süpernatant dökümü ve 2 mL taze büyüme ortaresuspend. Resuspended kültür 8 mL taze büyüme orta ve ampisilin içeren Balch tüp ekleyin.
    4. Steril tekniği kullanarak, dikkatle kauçuk tıpa Balch televizyonda yer. Odasından kaldırın ve bir kuluçka makinesi/shaker ve anaerobik 37 derece ˚C ile 220 devir / dakikada sallayarak, büyümek.
  6. Spektrofotometre (adım 3.5.4) kullanarak kültür gelişimini izlemek bir OD600 0,6 ulaşıncaya kadar. Girdap Kültür okuma her OD önce emin olun.
    Not: Bu adım 3-4 saat sürer ve pozlama orta (adım 1.2) maruz kalma tahlil (adım 4.1) yanı sıra bu sefer sırasında hazır olmalıdır.
  7. Kültür bir OD600 0.6 (±0.1) itibaren (3-4 saat beklenen büyüme) ulaştığında büyümesini durdurmak.
    1. Anaerobik odası (adım 3.6) tüp ve transfer kültür 2 x 2 mL Microcentrifuge tüpler içine getirin. 10.000 x g 90 saniye süreyle santrifüj kapasitesi, süpernatant dökümü ve içinde 2 x 2 mL taze pozlama ortaresuspend.
    2. Çamaşır 3.7.1 arasındaki adımları yineleyin. herhangi bir iz büyüme ortakaldırmak için bir kez.
  8. Hücre kültürü (adım 3.7) her iki microcentrifuge tüpler içine Pozlama tahlil (adım 4) kullanılmak üzere Biyoalgılayıcı hisse senedi almak için 7 mL PTFE standart şişe birleştirin.
    Not: Biyoalgılayıcı hisse senedi iyice henüz yavaşça ileri geri kullanılmadan önce pipetting tarafından mix emin olun. Yöntem burada için bir saat kadar duraklatılmış.

4. pozlama tahlil

  1. Bir plaka düzenini tasarlama.
    Not: tüm pipetting değerleri hesaplanır ve hisse senetleri başlatmadan önce hazırlanan var emin olun pozlama tahlil. Nasıl düzgün tasarım için bir deney ve ne eklemek için denetimler bölümünde ayrıntılı metin. Anaerobik monitörde gösterilen anaerobik odasında oksijen ise buna ek olarak, deneme başlatılmalıdır değil.
    1. 96 iyi şablonuna göre plaka düzeni tasarlayın. Deneyler 3 Teknik çoğaltır içinde çalıştırmak için bu 32 farklı tedaviler için (bkz. Şekil 1) şişeleri kadar ayarlamak için 4 x 8 kılavuz tarafından en iyi temsil sağlar.

Figure 1
Şekil 1: 96 de (sol) plaka ve PTFE içeren bir karşılık gelen 4 x 8 kılavuz plakasına transfer edilecek (sağ) sulandırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Not: Otelde Hg Alım Merkür indüklenebilir biyoalgılayıcı; iki tedavileri ile üzerinde bir değişken rol için test her değişken için gerekli: tedavi (biyoalgılayıcı + Hg + değişken + nitrat) ve tedavi boş (biyoalgılayıcı + değişken + nitrat). Bir değişken Hücre fizyolojisi üzerinde rol için test ederken bünye biyoalgılayıcı kullanarak iki tedaviler her değişken için gereklidir: tedavi (biyoalgılayıcı + Hg + değişken + nitrat) ve tedavi boş () biyoalgılayıcı + değişken + Hg). Cıva, kadmiyum ile değiştirilebilir. HG veya Cd değişken bir kalibrasyon eğrisi gerçekleştirirken olacak. Kurucu ve indüklenebilir biyosensörler (mizanpajda aynı plaka) aynı zamanda çalıştırılması gerekmez. Plaka düzen ve magnezyum (değişken) konsantrasyon aralığı test ederken karşılık gelen 4 x 8 kılavuz için bir şablon örnek Tablo 1' de sağlanan).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
bir HG indüklenen Hg + nitrat biyoalgılayıcı + 0 mM Mg HG indüklenen biyoalgılayıcı + nitrat + 0 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı + 0 mM Mg Hg + nitrat Bünye biyoalgılayıcı + Hg + 0 mM Mg
b HG indüklenen biyoalgılayıcı + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg HG indüklenen biyoalgılayıcı + nitrat + 0,1 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı + Hg + 0,1 mM Mg
c HG indüklenen Hg + nitrat biyoalgılayıcı + 1 mM Mg HG indüklenen biyoalgılayıcı + nitrat + 1 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı + 1 mM Mg Hg + nitrat Bünye biyoalgılayıcı + Hg + 1 mM Mg
d HG indüklenen biyoalgılayıcı, Hg + nitrat + 10 mM Mg HG indüklenen biyoalgılayıcı + nitrat + 10 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı, Hg + nitrat + 10 mM Mg Bünye biyoalgılayıcı + Hg + 10 mM Mg
e

Tablo 1: Hg bioavailability test etmek için biyoalgılayıcı kullanmak için bir örnek plaka düzeni (5 nM) magnezyum (0-10 mM) degrade üzerinde

  1. 4 x 8 kılavuz tahlil plaka düzen göre ayarlayın.
    1. 7 mL PTFE standart şişeleri tepsisine yerleştirin.
      Not: PTFE şişeleri asit yıkanmış/kullanılmadan önce sterilize ısı olmalıdır. Şişeleri sadece şişeyi dýþýna manipüle ederek ele alınmalıdır.
    2. Her şişe için tedaviher karşılık gelen pozlama orta hacim katmak.
      Not: toplam hacmi 2.000 µL (2 mL) ile bir pozlama, pozlama orta eklendi olacaktır: pozlama orta µL 2.000 µL- tedavi (boş) µL. = (Örneğin, pozlama orta µL 2.000 – 100 µL (biyoalgılayıcı) – 40 µL (nitrat) – 100 µL (Hg = ) – 100 µL ((Örneğin, MgSO4) değişken) 1660 µL =). Birim test değişken eklendi son hacmi % 5 (100 µL) fazla olamaz emin olun.
    3. Her şişe için ilgili birimin kimyasal değişken plaka düzen göre test edilmesi için çözüm ekleyin.
    4. Böylece son konsantrasyonu 200 µM (40-80 µL) 1.3 adımından nitrat her şişe ekleyin. Bu adımı bünye biyoalgılayıcı tedavibulunmasını içeren sorulardan hariç.
    5. Adımından 2.1 veya 2.2 Hg ekleyin (5 nM için bir değişken sınarken) veya Cd (300 nM için bir değişken sınarken) plaka düzen göre şişeleri için. Bu adımı Merkür indüklenebilir biyoalgılayıcı tedavibulunmasını içeren sorulardan hariç.
      1. HG kullanırken, 4-8 µM hisse senedi almak ve shake iyi. 7 mL PTFE şişe 100-250 nM çalışan bir Hg çözüm yapmak için pozlama orta çözümde sulandırmak. Bu çalışma çözümden Hg için gerekli şişeleri ekleyin. Bu durumda Hg 12,5 için 0 ile arasında bir kalibrasyon eğrisi nM.
        Not: Hg veya Cd bioavailability üzerinde bir değişkenin etkisi için sınarken, emin olun [Hg] veya [Cd] tüm tedaviler arasında sabit kalır. HG veya Cd eklerken, bir pipet ucu kullanın ama asla dokunmayın tüpleri pozlama ortamda emin olun.
  2. Yörünge bir çekimde el salla.
    Not: Deneme şimdi Hg veya Cd için speciate çözüm için gereken süreye bağlı olarak duraklatılmış. Bir saatten fazla için terk etseydi, PTFE kapaklar buharlaşma/kontaminasyonu önlemek için PTFE şişeleri yerleştirin.
  3. Yavaşça ileri geri homojenliği emin olmak için Biyoalgılayıcı hisse senedi pipet. Biyoalgılayıcı stok 100 µL her şişe ekleyin. Orbitally el salla.
  4. Aşağıdaki kriterleri ile okumak için ısınmak için plaka okuyucu hazırlamak: sıcaklık okuma yörünge sallayarak ile 2,5-5 dakikada 10 saat arasında okur için çalıştırmak 37˚C, kinetik ve floresan ölçümleri ile bir floresans uyarma, 440 nm ve bir emisyon 500 nm.
  5. Pipet 200 µL 4 x 8 kılavuz her PTFE şişeleri dan 96 iyi plaka karşılık gelen kuyu (siyah, 96-da açık-alt önkoşulsuzdur yüzey Mikroplaka). Ve geriye 5 kere pipet her 200 µL aktarmadan önce.
    Not: pipet ucu atarak yerine, pipet ucu pipetting ilerlemeyi izlemek için PTFE şişeyi bırak.
  6. 96 iyi plaka plaka okuyucu tepsisine yerleştirin sonra kapağı 96 iyi tabağa yerleştirin ve tahlil başlar.

5. veri miktarının

  1. Her tedavi , her zaman bir noktada floresans her bireysel iyi gürültü için düzeltilmiş ve için battaniye tedavi boş.
    1. Her tedavi (T) her zaman noktası (t) için floresan (r1- r3 3 tedavileri arasında ortalama olarak her şey, turistik çoğaltır hesabı için ilk kez ilk Floresan (t0) için tercüme edilmelidir ). Bu tedavi ortalama sonra aynı şekilde (denklem 1) tercüme ortalama tedavi boş (TB) kesilmesinin gerekir.

Floresan (t) Ortalama(Tr1()t) - Tr1()t0), Tr2()t) - Tr2 = ()t0), Tr3()t) - Tr3()t0)) – Ortalama(TB R1 (t) - TBr1()t0), TBr2()t)- TBr2() t0 ), TBr3()t) - TBr3()t0)) (1)

Not: Bu bir elektronik tablo işlevi yapılmalıdır. Uygun hata yayılması da her zaman noktası için hesaplanmalıdır.

  1. Grafik her tedavi düzeltilmiş floresans zamanın bir fonksiyonu olarak

Figure 2
Şekil 2: floresan veri bir fonksiyonu olarak düzeltilmiş. Floresans ölçülen E. coli NEB5α tarafından yayılan göreli floresans birimleri (RFU) olarak pUC57merR-s (indüklenebilir zorlanma) HgII ilavesi ile zaman içinde barındıran (0-12,5 nM) anaerobik koşullarda. Floresan 3 Teknik ortalamasını 37 ˚C çoğaltır yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Not: Grafik üzerinde 0 nM Hg değer yoktur ve tüm diğer Hg konsantrasyonu 0 olarak kesilmesinin nM Hg bir tedavi boşolarak. Bu nedenle, 0 nM Hg temsil x ekseni ve herhangi bir olumlu floresans temsil eder herhangi bir değişken verilen Hg den floresan. Bu şekilde floresans boş değil isteğe bağlıdır, ancak test değişkeni arka plan floresans varsa floresan eğrileri yanıltıcı floresans eğrileri verecektir (Yani, çözünmüş organik madde kendini belli ve eğer yok tedavi sadece hücreleri ve çözünmüş organik madde konsantrasyonu artan çözünmüş organik madde içeren boş floresan sinyal artacak).

  1. Floresans tepe ölçmek. Ölçülebilir floresans zirveye genellikle tüm 200 µM nitrat tüketimi elektron alıcısı olarak gelen harcanan enerji temsil eden 2.5-4 saat sonra ortaya çıkar. Bu en yüksek sayısal ve bu spesifik tedavison floresans değerini temsil eder.
    Not: olay yok floresans tepe görülmektedir (Yani, hiçbir Hg bioavailability), tedavi denetimin floresans tepe zamanda noktada Floresan (Yani, hiçbir değişken eklendi veya 5nM Hg) sayısal. Alternatif olarak, Eğer floresan indüksiyon tedavisi ama floresans iyi tanımlanmış bir tepe üretmez, işte O2 gibi daha yüksek bir benzeşme elektron alıcısı muhtemel kirlenme ve izlerinin giderilmesi için tedbirler alınmalıdır Tüm çözümler ve deneme oksijen tekrar yapılması gerekiyor.

Representative Results

Floresans doruklarına adım 5.3 göre sayısal sonra floresans zirvesinin sonuç bu değişken Hg veya Cd göreli bioavailability etkilemesi gösteren değişken konsantrasyon göre Grafiği çizilecek. Örneğin, Şekil 2 [HgII] üzerinde floresans kalibrasyon eğrisi Şekil 3Aiçinde sunulan indüklenebilir veri verecektir. HgII için kalibrasyon, eğri her zaman içeren 3 bileşenleri için Hg-indüklenebilir zorlanma; bir eşik yanıt yaklaşık 1-2 nM HgII floresans sinyal üretim önce [Hg içinII], doğrusal olarak orantılıdır doğrusal Aralık nerede 5 nM HgII güvenilir her zaman aralığını ve bir plato ortasında olacak nerede [HgII] artan artık floresans sinyali artacaktır. Herhangi bir değişiklik sinyali üretimine bünye zorlanma toksisite [HgII] üzerinden sinyal üretim etkilemez gösterir. Şekil 3BII CD için her zaman 2 bileşenleri indüklenebilir zorlanma için vardır; bir doğrusal Aralık nerede 200-300 nM CdII güvenilir her zaman doğrusal Aralık ve bir plato Merkezi'nde olacak. [CdII] artan ile floresan sinyal bir düşüş daha yüksek Cd konsantrasyonları hücrelere zehirlidir ve indüklenebilir floresans üretim azalma 1000 nM CdIIPlato sonra açıklayabilir gösterir. Bu nedenle, Hg veya Cd bioavailability ile ilgili bir çevre değişkeni sınarken, biz kullanmanızı öneririz 5 nM Hg içinII ve 300 nM Cd içinII.

Bazı durumlarda, sinyal üretim düzgün Hg veya Cd bioavailability bağlanabilir, ancak diğer durumlarda, sinyal üretim varyasyon biyoalgılayıcı hücre ana fizyolojik devlet etkilenebilir (Örneğin, faiz metalden veya çevre koşulları test zehirlidir). Şekil 4A, 5 nM Hg bioavailability Zn bir degrade üzerinde test edildi (0-10 µM). Hem Hg-indüklenebilir ve kurucu suşları, Zn konsantrasyonları artan sinyal benzer bir azalma vardır. Sinyal indirdi bioavailability sonuçları veya Zn toksisite bir sonucudur bu nedenle, bir ayrım olamaz. Şekil 4B ve 4 C, 5nM Hg bioavailability Mg bir degrade üzerinde test edildiII (0-10 mM) ve MnII (0-10 µM). Mg artanII ve MnII konsantrasyonları indüklenebilir zorlanma floresans sinyalinin azalmıştır. Öte yandan, bünye zorlanma floresans Mg artan bir düşüş görünmedi (MgII ve MnII FbFp üretiminde hücreler için yararlı tarafından gösterildiğiII ve MnII konsantrasyonları bir artış floresans sinyal). Bu hücrelerin uygun olmasına ve Hg-indüklenebilir zorlanma floresans azalma Hg bioavailability bir düşüş kaynaklanır gösterir. Da bünye ölçümleri genel hücre sağlık sağlamak tüm biyoalgılayıcı deneyleri için ne kadar önemli olduğunu bu verileri vurgular.

Figure 3
Şekil 3: doğrusal aralıkları ile civa ve kadmiyum biyoalgılayıcı. Maksimum floresans ölçülen göreli floresans birimleri (RFU) ± 1 standart sapma E. coli NEB5α tarafından yayılan pUC57merR-s (Hg-indüklenebilir) ve pUC19Balch-s (Constitutive) ilavesi ile yataklık A) HgII (0-15 nM) ve B) CdII (0-1000 nM) anaerobik koşullarda. Floresan 3 Teknik ortalamasını 37 ˚C çoğaltır yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: örnek sonuçsuz bir sonuç ile çinko ve magnezyum ve mangan ile kesin sonuç. Maksimum floresans ölçülen göreli floresans birimleri (RFU) ± 1 standart sapma E. coli NEB5α tarafından yayılan pUC57merR-s (Hg-indüklenebilir) ve pUC19Balch-s (Constitutive) ilavesi ile yataklık A) ZnII (0-10 µM) B) MgII (0-10 mM), ve C) MnII (0-10 µM) anaerobik koşullarda. [HgII] 5'e ayarlandığı tüm tedaviler ve floresan nM 3 Teknik çoğaltır, 37 ˚C ortalamasını yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Mikrobiyal biyosensörler hangi metaller mikroplar ile etkileşim vardır mekanizmaları tanımlamak için faydalı araçlardır. Burada, anaerobik Hg ölçmek bir yöntem tarifII ve CdII bioavailability bir Ayagin Gram-negatif konak hücre (E. coli) ve birkaç saat içinde ölçülebilir bir sonuç vermek için. Bu iletişim kuralı en büyük güçlerinden biri bu geniş metal türleşme kontrolünü pozlama ortamda güçlü bağlama ligandlar veya metal yağış için neden olabilir bileşenleri kaçınarak olanak sağlamasıdır. Metal türleşme modellenmiş ve diğer metal türleşme yazılım dağıtılabilir ancak bu poz orta PHREEQC17, kullanarak test edilmiştir. CD türleşme olacak iken hiçbir ekledi ligandlar, Hg türleşme %97 Hg(OH)2 ve % 3 Hg (NH3)22 +, mevcut olması bekleniyor durumunda %59 Cd-β-gliserofosfat, % 25 Cd2 +ve % 16 CdSO4sunar. Basit bir termodinamik modelleme yazılımı kullanılarak, Kullanıcı pozlama medya tasarımı ve faiz metal bioavailability için test edebilirsiniz. Buna ek olarak, biyoalgılayıcı konak hücre (E. coli NEB5α) pH (5-8,5) ve NaCl konsantrasyon geniş bir dizi üzerinde uygulanabilir (0-0.55 M)17.

HG metilasyonu anaerobik bir süreçtir ve bu çalışmada özetlenen Protokolü oksijen, metal bioavailability üzerinde anaerobik metabolizma daha ayrıntılı açıklaması için izin için bir gereklilik yoktur. Çünkü oksijen varlığı gen ifade profilleri48,49 değiştirir ve bu nedenle, potansiyel taşıma yolları önemlidir; Bu nedenle bu yöntem şu anda oluşturulamıyor aerobik alternatifler üzerinde bir avantaj sunuyor. Burada sunulan biosensing inşa etmek için cıva metilasyonu (örn, Geobacter, Desulfovibrio), ama belki daha alakalı olabilir anaerobik diğer ana bilgisayarlarla kullanılabilir daha az E. colidaha uysal. Bir geçerli burada sunulan yaklaşım limitimizi algılama henüz aksine varolan aerobik sistemleri4,19,37pM düzeyleri ulaşmadı kısıtlamasıdır. Ancak bu düşük algılama sınırları elde etmek için dikkat edilmesi gereken önemli birkaç adım44atılması gereken şey: Ben) ligand ektir Hg çözüm içinde kalır ve mikrobiyal hücre (Hg-ecek var olmak geri dönüşü olmayan bağlı duvara absorbe değil emin olmak için gerekli hücre yüzey thiols bioavailability25,27önlenmesi için; bakınız Şekil 3A' Hg için eşik yanıt), II) hücre yoğunluğu veya III) taşıma proteinleri meriçerecek şekilde genetik yapı değiştirmek-operon (yani merT ve merP), artan Hg akı içinde hücre50,51. Bu değişiklikler çevre ilgili durumlar değerlendirirken Hg düşük konsantrasyonlarda algılama yararlı ama mutlaka ideal olacaktır. Önceki kadmiyum biyosensörler öncelikle bir "kanıt, prensip" var ise, onlar türleşme tarihinde bioavailability41,42, rolünü değerlendirmek için Dedektif izin vermez karmaşık medya tasarlanmıştır 43 , 44.

Biyoalgılayıcı metal türler biyoyararlanım olan mekanizmaları belirlemede inanılmaz faydalı bir araçtır. Ana bilgisayar organizma Hg methylator olmadığı için sadece Ayagin Gram-negatif bakteri ve kesin bir gerekçe Hg girebilirsiniz nasıl nasıl Hg-methylators Hg elde etmek için için bir model geliştirmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler Hg bioavailability, metilasyon gibi bir sonuç alım veya makarna bir kütle denge yaklaşımı10,15,20,45,46kullanımı belirlemek için mevcut. Bu söyleniyor, yarı gerçek zamanlı bioavailability hücrelerin verilerde avantajı burada sunulan yöntem sunar. Bu yöntem bir çevre matris toplam Hg veya Cd düzey ölçmek için kullanılması önerilmez. Biyosensörler çevre36metal konsantrasyonlarda belirlemek için önerilen kullanılmasına rağmen pek çok daha kolayca kullanılabilir standart yöntem ICP-MS, FAAS (için Cd Analizi) veya soğuk buharı Atomik Absorpsiyon spektroskopisi (için Hg gibi kullanılabilir Analizi). Biyoalgılayıcı ancak olabilir verilen çevre matris potansiyeli geliştirmek veya bioavailability; engel olup olmadığını belirlemek için kullanılan Bu standart eklemeler yaparak elde edilir.

SÜPÜRGEYİ ücretsiz asit (arabellek) bir arabellek uygun pKa ile alternatif bir ücretsiz asit ile değiş tokuş sağlanan pozlama ortam pH için her yerde 5 ve 8.5, aralığı içinde değişmiş olabilir (lütfen uygun arabellek (Ferreira ve ark. listesini görmek (2015) 47) ve KOH ile pozlama medya yaparken uygun pH ayarlanır. Ayrıca, yöntem Hg ve Cd için sınırlı değildir, ancak diğer transkripsiyon regülatör kullanarak diğer metaller için uzun olabilir.

Pozlama tahlil O2 ve fumarat gibi diğer elektron alıcısı etkisi Hg veya Cd bioavailability üzerinde keşfetmek için değiştirilebilir. O2 ve fumarat elektron alıcısı kullanmak için yöntem küçük değişiklikler talep üzerine temin edilmektedir.

Özetle aşağıdaki noktaları vurgulamak istiyoruz: ben) bunlar biyoalgılayıcı ayarlamak için kullanılacak gibi Cd veya Hg stokları konsantrasyonları adım 2, bilinen zorunludur. II) maruz kalma gün hücrelerinin büyümesini bir OD600 0.6 (± 0,1), durdurulmalı ve hücre kültürleri, biyoalgılayıcı resuspending için bu hücre yoğunluğu kalibre edilmiş bu bakım alınır. III) son olarak, pozlama orta titizlikle pozlama gününde yapılır önemlidir. Protokolü'nün başarılı olmasını sağlamak için birden çok kültürü aynı anda (büyüme başarısızlık olasılığını engelleyecek) Yetişkin olmak ve büyüme orta haftalık (metastability medya ve olası bulaşma kaçınmak için) tekrar tekrar düzenlendi. Ayrıca üretim sinyal geldiğinde biyolojik çoğaltır (birden çok hücre kültürü) değişkenlik hızlı dikkat edilmelidir. Floresan yanıt kültür kültür değişebilir rağmen yanıt olarak belirtilen değişkeni floresan eğilimleri çok sayıda biyolojik çoğaltır boyunca aynı kalmalıdır.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Anaerobik biyoalgılayıcı gelişimi üzerinde iyi anlayışlı tartışma Poulain laboratuvar üyeleri olarak iki adsız yorumcular yorumlarına teşekkür etmek istiyorum. Ontario eyaleti ve keşif Grant gelen erken bir araştırmacı Ödülü ve A.J.P. için bir Hızlandırıcı ek-Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada bu çalışmada finanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

Türleşme Çevre Bilimleri sayı: 142 biyoalgılayıcı civa kadmiyum anaerobik Bioavailability Metal
Bir anaerobik biyoalgılayıcı tahlil civa ve kadmiyum tespiti için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter