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Um ensaio de anaeróbios Biosensor para a detecção de mercúrio e cádmio

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para usar um biosensor microbiana anaeróbia de células inteiras para avaliar como diferentes variáveis ambientais afetam a biodisponibilidade de Hg e Cd de bactérias em ambientes anóxica.

Abstract

Biodisponibilidade de mercúrio (Hg) para micróbios é um passo fundamental para tóxico bioamplificação Hg em teias alimentares. Transformações de cádmio (Cd) e biodisponibilidade para bactérias controlaram a quantidade que se acumulam em culturas de alimentos básicos. A biodisponibilidade destes metais é dependente de sua especiação em solução, mas mais particularmente sob condições anóxica onde Hg é misturado ao tóxico monomethylmercury (MeHg) e Cd persiste na rizosfera. Célula inteira microbianas biosensores dar um sinal quantificável quando um metal entra no citosol e, portanto, é ferramentas úteis para avaliar a biodisponibilidade de metal. Infelizmente, a maioria dos esforços de biosensing até agora tem sido restrita a ambientes oxic devido à capacidade limitada das proteínas existentes de repórter para função na ausência de oxigênio. Neste estudo, apresentamos o nosso esforço para desenvolver e otimizar um ensaio de células inteiras biosensor capaz de funcionar anaerobicamente que pode detectar metais sob condição anóxica em tempo quase real e dentro de horas. Descrevemos como o biosensor pode ajudar a avaliar como químicas variáveis relevantes para o ciclismo ambiental de metais afetam sua biodisponibilidade. O seguinte protocolo inclui métodos para (1) preparar Hg e Cd normas sob condições anóxica, (2) Preparem o biosensor na ausência de oxigênio, (3) o projeto e executar um experimento para determinar como uma série de variável afeta a biodisponibilidade de Hg ou Cd e (4) para quantificar e interpretar dados de biosensor. Podemos mostrar as escalas lineares das biosensores e fornecem exemplos mostrando a capacidade do método para distinguir entre metal biodisponibilidade e toxicidade, utilizando cepas de metal-inducible e constitutivas.

Introduction

Mercúrio (Hg) é um poluente global e sua biodisponibilidade para Hg misturar os micróbios é o primeiro passo para sua bioamplificação através de teias alimentares e seus possíveis efeitos neurotóxicos em humanos e animais selvagens1. Acredita-se atualmente que microbiana metilação do Hg é um processo intracelular que requer: i) a espécie de Hg a ser biodisponível2,3,4,5,6,7 e ii) para a célula fisiologicamente capaz de misturar Hg8,9,10. Bioaccumulates de cádmio (Cd) em organismos, mas é que não biomagnifies em foodwebs e é amplamente utilizado em processos industriais e comerciais que comumente causam a exposições agudas em pessoas e o meio ambiente11. Apesar de micróbios desempenham vários papéis-chave no destino do Hg no ambiente, a maioria dos estudos sobre Cd geoquímica e Ecotoxicologia focar eucariontes microbiana12. Consumo de culturas agrícolas (por exemplo, arroz) é a principal fonte de exposição direta ao cádmio; Neste caso, a biodisponibilidade de Cd para os micróbios da rizosfera influencia directamente a quantidade plantas podem acumular13.

Vias de transporte de HG são complexas e envolvem possivelmente um transporte ativo passo14. Quando se trata de um transportador, trabalho recente sugeriu que HgII usa um ZnII ou MnII transporte7,15,16,17. Considerando que o CdII é a hipótese de ser acidentalmente transportado para o citosol através de vias de transporte de metais divalentes (particularmente MnII ou ZnII), mecanismos de CdII transportam dentro das células permanecem via de transporte especulativo e não específicas do Cd tem sido identificados13,18. Independentemente da natureza dos transportadores envolvidos, três fatores mecanicistas, finalmente, determinam a capacidade dos metais de inserir uma célula: i) a metal especiação em solução2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) as propriedades de biophysiochemical do membrana celular17,24,25,26,,27,28,29 ,30,31e iii) a capacidade do metal acessar um site de transporte7,32. CD e Hg são improvável que existe como íons livres sob condições fisiologicamente relevantes microbianas, devido a sua alta afinidade para dissolvido orgânico matéria (DOM), quelantes de contaminantes (por exemplo, EDTA), ou reduzidos de enxofre metades33, 34,35 (CdII pode existir como uma enciclopédia íon ou formulário íon-pares na ausência destes ligantes). Há uma falta de métodos eficientes para determinar como estas espécies de metal são biodisponível em condições relevantes ao seu destino no ambiente. Por exemplo, Hg é misturado sob condições anaeróbicas14, e ambos cádmio e Hg são metais macios (ou cações de classe B), exigindo que a especiação ser investigadas condições de manter a integridade dos grupos reduzidos de enxofre.

Biosensores microbianos são células bacterianas que emitem um sinal quantificável em resposta às concentrações intracelulares de um metal, neste caso Hg ou Cd. Como tal, eles são ferramentas ideais para entender como metais inserir uma célula36, desde que as condições de exposição são cuidadosamente controladas para. Biosensores HG normalmente contêm fusões de gene entre os circuitos regulamentares do mer-operon (incluindo genes que codificam para o regulador de transcrição MerRas bem como o operador e o promotor regiões do operon) e relatórios de genes (por exemplo, Lux, gfp, ALC genes). Quando o mercúrio está presente no citoplasma, ele vinculará a MerR, resultando na transcrição dos genes relatórios e sinal subsequente produção19,37. Biosensores específicos do Cd normalmente são projetados usando o cadC, cadastro, zntA ou zntR codificado de reguladores de transcrição38, mas é interessante notar que MerR tem uma afinidade mais baixa, no entanto, quantificável para Cd5. Devido à restrição aeróbia da maioria comumente usado proteínas repórter luminescentes ou fluorescentes, até recentemente microbianas biosensores permaneceram incapazes de oferecer insights sobre a biotransformação de metais sob condições anóxica. Isto dificulta anaeróbica deteção da biodisponibilidade de metais sob uma variedade de condições relevantes para o seu destino ambiental, especificamente na presença de redox ligantes sensíveis (por exemplo, sulfeto e tióis)4, 5 , 39.

Para aliviar o obstáculo metodológico de viver da imagem latente na ausência de oxigênio, Drepper et al (2007) têm desenvolvido uma proteína fluorescente flavin-baseado (FbFp), baseado no domínio de tensão de oxigênio luz de SB2 proteína de p. putida. Esta família de proteína é capaz de fluorescência na ausência de oxigênio de40. Com base no trabalho de Drepper et al, nosso laboratório projetado um biosensor anaeróbica, permitindo o estudo da biodisponibilidade de Hg sob condições oxic e anóxica e sobre uma ampla gama de salinidade 17. O papel atual, descrevemos como preparar e usar o biosensor para testar a influência de variáveis ambientais na biodisponibilidade de Hg ou Cd. Embora nós desenvolvemos o biosensor para HgII, escolhemos a realizar experimentos com CdII como um meio de chamar a atenção do leitor para o fato de que os biosensores também podem responder a múltiplos estressores que provavelmente co-ocorrem em ambiental matrizes; Neste caso o CdII foi investigada porque é conhecido para ligar o regulador transcricional MerR5. Aqui, nós mostramos calibração representativa e funcional linear varia em relação a qualquer metal. Também damos um exemplo quando resultados do biosensor é conclusivos (MgII e MnII na biodisponibilidade de Hg) e inconclusivo (ZnII na biodisponibilidade de Hg).

Protocol

1. crescimento Media e preparação de meios de exposição

  1. Tornar-se 250 mL do meio de crescimento:
    Nota: Se a solução de oligoelementos #1 e solução de oligoelementos #2 já estão preparados, pule para a etapa 1.1.5.
    1. Preparar a solução de oligoelementos #1 num balão volumétrico limpo (200 mL) para conter as finais molaridades de 1,5 x 10-3 M nd2MoO4, 6,5 x 10-4 M nd2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3e NaOH 0,1 M.
      Cuidado: Bases fortes (NaOH) são corrosivas. Certifique-se de certeza quando pesar os reagentes para garantir que a molaridade final representa os principais oligoelementos; Mo, Se e B.
    2. Sob um campo estéril, filtro esterilizar usando um filtro de seringa de polietersulfona µm 0.22 em um frasco plástico estéril/limpar/politetrafluoretileno (PTFE).
    3. Preparar a solução de oligoelementos #2 num balão volumétrico limpo (200 mL) para conter as molaridades finais de 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3,25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2e 0,1 M H2então4.
      Cuidado: Ácidos fortes (H2SO4) são corrosivos. Certifique-se de certeza quando pesar os reagentes para garantir que a molaridade final representa os principais oligoelementos; MN, Zn, Co e Ni.
    4. Sob um campo estéril, filtro esterilizar usando um filtro de seringa de polietersulfona µm 0.22 num frasco de vidro limpo.
    5. Sob um campo estéril, em frasco de vidro limpo/estéril (mínimo 250 mL); Adicionar 200 mL de água ultrapura, 42,5 mL de sais mínimo M9 (5x; ver Tabela de materiais), 2,5 mL de 2 M de glicose, 125 µ l de 2m MgSO4, 1200 µ l de 0,6 M tiamina HCl de uma alíquota de congelados (-20 ˚ c), 1,25 mL de 4m NaNO3 , 770 µ l de 0,075 M L-leucina / L-isoleucina / solução de valina, 250 µ l oligoelementos #1, 250 µ l de oligoelemento #2e 250 µ l de sódio de EDTA 0,01 M de sal.
      Nota: Todos os reagentes na etapa 1.1.5 devem ser preparados antes e filtro esterilizado usando um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 µm. Água ultrapura pode ser esterilizada com uma autoclave.
    6. Leve a garrafa de vidro agora contendo a solução da etapa 1.1.5., vagamente tampá-lo e ele percorrer o bloqueio de ar câmara anaeróbica .
    7. Na câmara anaeróbica, adicione 15 µ l de 0,225 M Filipa4 em 0,2 M H2para4, cap firmemente o frasco e agitar até desaparecerem todos os precipitados brancos.
      Nota: Todos os reagentes na etapa 1.1.7 devem ser preparados antes e filtro esterilizado usando um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 µm. Armazenar a 0,225 M Filipa4 em 0,2 M H2então4 na câmara anaeróbica.
    8. Retire a tampa do frasco, Aguarde 1 minuto para o ar trocar, substituir a tampa da garrafa e em seguida agitar vigorosamente. Repita este passo uma vez.
    9. Aperte a tampa firmemente para a garrafa, retire da câmara anaeróbicae guardar a garrafa na geladeira (4 ˚ c) até o uso.
    10. Meio de cultura deve ser refeito uma vez por semana, repetindo as etapas 1.1.5 para 1.1.9.
  2. Para fazer 100 mL de meio de exposição em 2 x 50 mL, tubos de centrifuga conico de polipropileno estéril:
    Nota: Recomendamos que esse meio de exposição ser preparado no dia do ensaio de exposição , para minimizar o risco de contaminação, porém pode ser feito com antecedência e armazenados na geladeira.
    1. Na câmara anaeróbica, a cada 50 mL, tubo de centrifugação adicionar 42 mL de água ultrapura anaeróbica, 350 µ l de 1 M de sódio Beta-Gylcerophosphate de uma alíquota de congelados (-20 ˚ c), 2 mL de 1m MOPS livre de ácido, 50 μL de 1 M (NH4)2então4 , 125 μL de glicose de 2 M, 300 μL de 2,5 M de KOH e 200 µ l de NaOH 2,5 M.
      Nota: Todos os reagentes na etapa 1.2.1 devem ser preparados antes e filtro esterilizado usando um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 µm. Água ultrapura pode ser esterilizado com a autoclave de calor. 2.5 NaOH de M e 2,5 M de NaOH devem ser armazenados em frascos de plástico/PTFE. Todos os reagentes listados devem ser armazenados na câmara anaeróbica exceto sódio Beta-Gylcerophosphate, que deve ser armazenado em um freezer (-20 ˚ c). Em geral, é recomendável deixar todas as peças de plástico ou de vidro e recipientes por vários dias na câmara anaeróbica para garantir que não há vestígios de oxigênio permanecem.
    2. Os tubos de centrífuga de 50 mL do tampão, agite bem e retire uma alíquota de 10 mL para medir o pH. O pH medido da mídia exposição deve sempre medir 7,00 ± 0,02 em 25 ˚ c. Se o pH não mede dentro desta escala, reajuste o volume adicionado 2,5 m KOH para corrigir isto.
      Nota: Nunca Titule a solução para corrigir o pH com uma sonda de pH. sondas de pH representam uma fonte de contaminação para o meio de exposição. O pH deve ser sempre um produto dos reagentes adicionados na etapa 1.2.1.
  3. Prepare uma solução stock de 5-10 mM NaNO3 e deixar na câmara anaeróbia deve ser usado durante o tempo do ensaio de exposição.
    Nota: É mais fácil de diluir um padrão primário de NaNO3 , mais concentrado, em vez de fazer um 5-10 mM NaNO3 padrão primário.

2. preparação de padrões de cádmio e mercúrio.

  1. Preparar uma solução de mercúrio (HgII) 4-8 µM em 0,2 M H2SO4.
    1. Preparar um Hg2 + padrão, tornando um milimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 ou HgSO4 solução em 0,2 M H2SO4.
      Cuidado: O mercúrio é altamente tóxico e H2para4 é corrosivo. Opere em emanações coifas com equipamentos de proteção individual necessários.
    2. Em um frasco PTFE, dilua padrão de 2.1.1. em 0,2 M H2SO4 para obter uma concentração dentro da faixa de 4-8 µM Hg2 +.
      Nota: O ácido usado deve ser de qualidade analítica H2então4.
    3. A concentração de Hg de 2.1.2 deve ser validada usando um analisador de mercúrio (ver Tabela de materiais).
      Nota: Podem ser utilizados outros métodos para validar a concentração de Hg.
  2. Preparando um 10 µM CdII solução em 10 mM H2SO4.
    1. Preparar um padrão primário de CdCl2 (intervalo de 10-50 mM para pesagem precisa de pó) em 0,1 M H2SO4.
    2. Em uma série de diluições em série em ácido limpa enxaguado 20 mL frascos de vidro de borosilicato com tampas de rosca fenólicos pretos com PTFE enfrentaram os forros de borracha, diluir o padrão de 2.2.1 para 10 µM Cd2 +. Garantir que a concentração de H2para que4 em cada diluição subsequente serial permaneça 10 mM.

3. preparação do Biosensor para ensaio de exposição anaeróbica

  1. Placa do biosensor inducible do mercúrio (E. coli NEB5α abrigando PUC57merR-PpFbFp) e o biosensor constitutivamente expressado (E. coli NEB5α abrigando PUC19Balch-PpFbFp) de-80 ˚ c cryostock em placas lisogenia caldo contendo 120 ampicilina ug/mL. Ver nosso trabalho publicado anteriormente para obter detalhes sobre a produção destes biosensores17.
  2. Às 04:30-17:00, inocular uma cultura em 10 mL de LB (+ amp) e crescer durante a noite.
    Nota: A partir de uma placa leva 2 dias para preparar a cultura anaeróbia para o ensaio de exposição (ou seja, uma cultura começou na tarde de segunda-feira (04:30-17:00) estará pronto para o ensaio de exposição ao meio-dia na quarta-feira). As etapas a seguir são as técnicas microbiológicas necessárias necessárias para preparar as culturas no dia do ensaio de exposição.
    1. Tomar uma colônia da cultura placa e adicionar 10 mL de caldo de lisogenia (LB) com 21 µ l de uma solução stock de 100 mg/mL de sal sódico ampicilina (concentração final é 210 amp ug/mL) em um tubo estéril de cultura.
    2. Colocar a cultura em um incubadora/agitador e crescer durante a noite a + 37 ˚ c com agitação a 220 rpm.
  3. Na manhã seguinte às 9-10, Ressuspender a cultura e crescer anaerobicamente durante todo o dia (20% de inóculo).
    1. Trazer a cultura da incubadora (passo 3.2.1) e a média de crescimento (etapa 1.1.9) dentro da câmara anaeróbica.
    2. Adicione 8 mL de fresco médio de crescimento e ampicilina (210 μg/mL) em um tubo estéril de Balch.
    3. Colete 2 mL da cultura adulta durante a noite e transferência em um tubo de microcentrifugadora de 2ml. Centrifugar a 10.000 passo RCF durante 90 segundos, despejar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de fresco médio de crescimento. Adicione a ressuspensão de cultura para o tubo de Balch contendo 8mL de fresco médio de crescimento e ampicilina.
    4. Utilizando uma técnica estéril, cuidadosamente coloque uma rolha de borracha do tubo de Balch. Retire a câmara anaeróbica e coloque em uma incubadora/shaker e anaerobicamente crescer até 3-17:00 no + 37 ˚ c com agitação a 220 rpm.
  4. Entre 3 e 17:00, realizar um inóculo de 1% anaeróbico em fresco médio de crescimento e crescer durante a noite.
    1. Trazer o tubo de Balch (etapa 3.3.4) dentro da câmara anaeróbica , juntamente com o meio de crescimento. Adicione 100 µ l de cultura de 10ml de fresco médio de crescimento (inóculo de 1%) com amp (210 amp de ug/mL) em um tubo estéril de Balch.
    2. Utilizando uma técnica estéril, cuidadosamente coloque uma rolha de borracha do tubo de Balch. Remova a câmara anaeróbica, coloque em uma incubadora/shaker e crescer durante a noite a + 37 ˚ c com agitação a 220 rpm.
  5. Entre 9 e 10:00, Ressuspender a cultura crescer anaerobicamente durante todo o dia (20% de inóculo).
    1. Trazer a cultura da incubadora (etapa 3.4.1) e a média de crescimento (etapa 1.1.9) dentro da câmara anaeróbica.
    2. Adicione 8 mL de meio de crescimento e ampicilina (amp de 210 ug/mL) em um tubo estéril de Balch.
    3. Colete 2 m da cultura adulta durante a noite e transferência em um tubo de microcentrifugadora de 2ml. Centrifugar a 10.000 x g durante 90 segundos, despejar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de fresco médio de crescimento. Adicione a ressuspensão de cultura para o tubo de Balch contendo 8mL de fresco médio de crescimento e ampicilina.
    4. Utilizando uma técnica estéril, cuidadosamente coloque uma rolha de borracha do tubo de Balch. Remover da câmara e coloque em uma incubadora/shaker e crescer por via anaeróbia + 37 ˚ c com agitação a 220 rpm.
  6. Monitorar o crescimento da cultura usando um espectrofotômetro (etapa 3.5.4) até que seja alcançada uma OD600 de 0,6 . Certifique-se de que a cultura de vórtice antes de cada leitura de OD.
    Nota: Este passo leva 3-4 horas, e a média de exposição (etapa 1.2) deve ser preparado durante este tempo, bem como o ensaio de exposição (etapa 4.1).
  7. Pare o crescimento, quando a cultura atinge uma OD600 de 0.6 (± 0.1) (crescimento esperados de 3-4 horas).
    1. Trazer o tubo na câmara anaeróbia (passo 3.6) e cultura de transferência em 2 tubos de microcentrifuga x 2 mL . Centrifugar a 10.000 x g durante 90 segundos, despejar o sobrenadante e ressuspender em 2 x 2 mL de fresco médio de exposição.
    2. Repita a etapa de lavagem 3.7.1. vez para remover qualquer vestígio do meio de crescimento.
  8. Combine os dois tubos de microcentrifuga de cultura celular (passo 3.7) em um frasco de padrão de PTFE com 7 mL para obter o Estoque de Biosensor para ser usado no Ensaio de exposição (etapa 4).
    Nota: Certifique-se de misturar o Biosensor estoque pipetando completamente ainda suavemente para a frente e para trás antes da utilização. O método pode ser uma pausa aqui para até uma hora.

4. exposição ensaio

  1. Criando um layout de placa.
    Nota: Certifique-se de ter tudo pipetagem valores calculados e estoques preparados antes de iniciar o ensaio de exposição. Como desenhar corretamente um experimento e o que controla a incluir é detalhada no texto. Além disso, o experimento não deve ser iniciado se houver oxigênio na câmara anaeróbica indicada no monitor anaeróbico.
    1. Criar o layout de placa de acordo com um modelo bem 96. Para executar experiências em técnicas repetições de 3, isto permitirá 32 diferentes tratamentos, melhor representado por uma grade de 4 x 8 para configurar os frascos (ver Figura 1).

Figure 1
Figura 1: um 96 placa bem (esquerda) e uma grade de 4 x 8 correspondente contendo PTFE frascos (direita) para ser transferido para a placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nota: Quando testes para o papel de uma variável na captação de Hg com os biosensor inducible mercúrio; dois tratamentos são necessários para cada variável: o tratamento (biosensor Hg + variável + nitrato) e seu tratamento em branco (biosensor + variável + nitrato). Quando o teste para o papel de uma variável sobre a fisiologia da célula usando o biosensor constitutiva, dois tratamentos são necessários para cada variável: o tratamento (biosensor Hg + variável + nitrato) e em branco ( tratamento Biosensor + variável + Hg). Mercúrio pode ser substituído com cádmio. HG ou Cd se tornará a variável durante a execução de uma curva de calibração. A constitutiva e inducible biosensores não precisam ser executados ao mesmo tempo (no mesmo layout de placa). Um exemplo de modelo para o layout da placa e a grade de 4 x 8 correspondente ao testar uma gama de concentração de magnésio (variável) é fornecido na tabela 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
um HG induzido biosensor Hg + nitrato + 0 mM Mg HG induzido biosensor + nitrato + 0 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + nitrato + 0 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + 0 mM Mg
b HG induzido biosensor + Hg + nitrato + 0.1 mM Mg HG induzido biosensor + nitrato + 0.1 mM Mg Biosensor constitutiva + Hg + nitrato + 0.1 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + 0.1 mM Mg
c HG induzido biosensor Hg + nitrato + 1 mM Mg HG induzido biosensor + nitrato + 1 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + nitrato + 1 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + 1 mM Mg
d HG induzido biosensor Hg + nitrato + 10 mM Mg HG induzido biosensor + nitrato + 10 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + nitrato + 10 mM Mg Biosensor constitutiva, Hg + 10 mM Mg
e

Tabela 1: Um layout de placa de exemplo para usar o biosensor para testar a biodisponibilidade de Hg (5 nM) ao longo de um gradiente de magnésio (0-10 mM)

  1. Defina a grade de 4 x 8 de acordo com o layout de placa de ensaio.
    1. Coloque 7 mL PTFE padrão frascos na bandeja.
      Nota: PTFE frascos devem ser ácido lavado/calor esterilizado antes da utilização. Os frascos só devem ser manuseados manipulando fora do frasco.
    2. Para cada tubo de ensaio, adicione o volume médio de exposição correspondentes a cada tratamento.
      Nota: Em uma exposição com um volume total de 2.000 µ l (2 mL), o adicional médio de exposição será: médio de exposição µ l = 2.000 µ l – tratamento (em branco) µ l. (por exemplo, exposição média µ l = 2.000 – 100 µ l (biosensor) – 40 µ l (nitrato) – 100 µ l (Hg ) – 100 µ l (variável (por exemplo, MgSO4)) = 1660 µ l). Certifique-se de que o volume adicionado da variável testada não exceda 5% (100 µ l) de volume final.
    3. Para cada tubo de ensaio, adicione o volume correspondente da solução da variável química para ser testado de acordo com o layout da placa.
    4. Da etapa 1.3, adicione nitrato a cada frasco, para que a concentração final é de 200 µM (40-80 µ l). Exclua este passo para espaços em branco de tratamento biosensor constitutiva.
    5. Da etapa 2.1 ou 2.2, adicionar Hg (5 nM durante o teste de uma variável) ou Cd (300 nM durante o teste de uma variável) para os frascos de acordo com o layout da placa. Exclua este passo para espaços de tratamento do mercúrio inducible biosensor.
      1. Ao usar o Hg, pegue o estoque de 4-8 µM e agite bem. Dilua a solução em médio de exposição em um frasco PTFE de 7 mL para 100-250 nM para fazer um trabalho de solução de Hg. A partir desta solução de trabalho adicione Hg para os frascos necessários. Neste caso, uma curva de calibração de Hg, variando de 0 a 12.5 nM.
        Nota: Durante o teste de efeito da variável na biodisponibilidade de Hg ou Cd, certifique-se que o [Hg] ou [Cd] permanece constante em todos os tratamentos. Ao adicionar Hg ou Cd, certifique-se usar uma ponta da pipeta, mas nunca toque o meio de exposição em frascos.
  2. Agite em um movimento orbital manualmente.
    Nota: O experimento pode ser pausado agora dependendo do tempo necessário para o Hg ou Cd a especiação em solução. Se deixou por mais de uma hora, coloque tampas PTFE em frascos de PTFE para evitar a evaporação/contaminação.
  3. Delicadamente, pipete Biosensor estoque e para trás para garantir a homogeneidade. Adicione 100 µ l de Biosensor estoque a cada frasco. Agite orbitally manualmente.
  4. Preparar o leitor para aquecer para ler com os seguintes critérios: temperatura no 37˚C, cinética correr para 10 horas , com leituras em 2,5-5 minutos com agitação orbital entre lê e as medidas de fluorescência com um fluorescência de excitação de 440 nm e um emissão de 500 nm.
  5. Pipetar 200 µ l de cada frascos PTFE na grade de 4 x 8 para os poços correspondentes da placa de 96 bem (Clear preto, 96 poços-fundo vinculante microplacas de superfície). Pipete e volta 5 vezes antes de transferir cada 200 µ l.
    Nota: Em vez de descartar a ponta da pipeta, deixe a ponta da pipeta no frasco de PTFE de acompanhar o progresso de pipetagem.
  6. Coloque a placa bem 96 na bandeja do leitor placa, em seguida, coloque a tampa sobre a chapa bem 96 e começar o ensaio.

5. quantificar os dados

  1. A fluorescência de cada tratamento em cada ponto de tempo deve ser corrigida para cada ruído bem individual e invisíveis para o tratamento em branco.
    1. A fluorescência para cada ponto de tempo (t) de cada tratamento (T) deve ser traduzida para conta para a fluorescência inicial (t0) da primeira vez que ponto de cada poço, então a média entre os 3 tratamentos Replica (r1- r3 ). Esta média de tratamento deve então ser apagada para o médio tratamento em branco (TB) traduzido da mesma maneira (equação 1).

Fluorescência (t) = média(Tr1(t) – nt0 Tr1(), Tr2(t) - Tr2 (t0),nt Tr3() – nt0 Tr3()) – médio(TB R1 (t) – TBr1(t0), TBr2(t)- TBr2( t0 ), TBr3(t) – TBr3(t0)) (1)

Nota: Isto deve ser feito como uma função de planilha. Adequada propagação de erro também deve ser calculada para cada ponto de tempo.

  1. Gráfico a fluorescência corrigida de cada tratamento em função do tempo

Figure 2
Figura 2: corrigidos dados de fluorescência em função do tempo. Fluorescência é medida por unidades de fluorescência relativo (RFU) emitidas por Escherichia coli NEB5α abrigando o pUC57merR-Pp (estirpe Inducible) ao longo do tempo, com a adição de HgII (0-12.5 nM) em condições anaeróbias. Fluorescência foi que a média de 3 técnicos Replica em 37 ˚ c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nota: Não há nenhum valor de Hg 0 nM no gráfico, e todas as outras concentrações de Hg tem sido apagadas a 0 nM Hg como tratamento em branco. Portanto, 0 nM Hg representa o eixo x e qualquer fluorescência positiva representa fluorescência de Hg dado qualquer variável. É opcional para não em branco a fluorescência dessa maneira, mas as curvas fluorescentes dará curvas de fluorescência enganosa, se a variável testada tem fundo fluorescência (dissolvidoou seja, a matéria orgânica em si será fluorescem e se não tratamento em branco contendo células e matéria orgânica dissolvida, aumentando a concentração de matéria orgânica dissolvida aumentará o sinal fluorescente).

  1. Quantificar o pico de fluorescência. Um pico de fluorescência quantificáveis ocorrerá normalmente depois de 2.5-4 horas, que representa a energia gasta do consumo de todos os nitratos de 200 µM como um aceitador terminal de electrões. Este pico deve ser quantificado e representa o valor de fluorescência final de que o tratamentoespecífico.
    Nota: em caso nenhum pico de fluorescência é observado (ou seja, não biodisponibilidade de Hg), fluorescência do tratamento a ponto do pico de fluorescência do controle de tempo (ou seja, nenhuma variável adicionada ou Hg 5nM) devem ser quantificadas. Como alternativa, se houver indução de fluorescência no tratamento, mas a fluorescência não produz um pico bem definido, não há contaminação provável de um aceptor de elétrons maior afinidade como O2 e devem ser tomadas medidas para remover vestígios de oxigênio de todas as soluções e a experiência deve ser executado novamente.

Representative Results

Uma vez que os picos de fluorescência estar quantificados conforme item 5.3, o resultado dos picos de fluorescência pode ser graficamente de acordo com a concentração variável ilustrando como essa variável afeta a biodisponibilidade relativa de Hg ou Cd. Por exemplo, a curva de calibração da fluorescência sobre [HgII] da Figura 2 irá produzir os inducible dados apresentados na Figura 3A. Para HgII calibração, a vontade de curva sempre conter 3 componentes para a tensão induzida em Hg; uma resposta de limiar de aproximadamente 1-2 nM HgII antes da produção do sinal de fluorescência é linearmente proporcional à [HgII], o intervalo linear onde 5 nM HgII será confiável sempre no centro do intervalo e um platô onde aumentar [HgII] já não aumentará o sinal de fluorescência. Nenhuma alteração na produção do sinal sobre a tensão constitutiva mostra que a toxicidade de [HgII] não afeta a produção de sinal. Para CdII na Figura 3B, sempre existem 2 componentes para a estirpe inducible; uma escala linear, onde 200-300 nM CdII será confiável sempre no centro da faixa linear e um platô. Uma diminuição no sinal de fluorescência com o aumento da [CdII] mostra que altas concentrações de Cd são tóxicas para as células e podem explicar uma diminuição da produção de fluorescência inducible após o planalto a 1000 nM CdII. Portanto, quando o teste de biodisponibilidade Hg ou Cd em relação a uma variável de ambiente, sugerimos usar 5 nM para HgII e 300 nM para CdII.

Em alguns casos, produção de sinal pode ser corretamente atribuída a biodisponibilidade de Hg ou Cd, mas em outros casos, produção de sinal pode ser afetada pela variação no estado fisiológico do hospedeiro biosensor célula (por exemplo, o metal de interesse ou condições ambientais testadas são tóxicas). Na Figura 4A, biodisponibilidade de Hg 5 nM foi testado ao longo de um gradiente de Zn (0-10 µM). Em Hg-inducible e tensões constitutivas, há uma diminuição semelhante no sinal com o aumento da concentração de Zn. Portanto, um não pode discriminar se o sinal resulta da baixa biodisponibilidade ou é um resultado de toxicidade de Zn. Na Figura 4B e 4C, biodisponibilidade de Hg 5nM foi testada ao longo de um gradiente de MgII (0-10 mM) e MnII (0-10 µM). Aumento MgII e MnII concentrações diminuíram o sinal de fluorescência da estirpe inducible. Por outro lado, a tensão constitutiva não mostrou uma diminuição na fluorescência com o aumento da MgII e MnII concentrações (MgII e MnII são benéficos para as células na produção da FbFp, como demonstrado pelo um aumento no sinal de fluorescência). Isto demonstra que as células são viáveis e a diminuição de fluorescência da estirpe Hg-inducible resulta de uma diminuição da biodisponibilidade de Hg. Esses dados enfatiza como é importante para todos os ensaios de biosensor para também fornecer medidas constitutivas da aptidão total do celular.

Figure 3
Figura 3: escalas lineares do biosensor com mercúrio e cádmio. Fluorescência máxima medida relativa fluorescência unidades (RFU) ± 1 desvio padrão emitido por Escherichia coli NEB5α abrigando o pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) com a adição de A) HgII (0-15 nM) e B) CdII (0-1.000 nM) em condições anaeróbias. Fluorescência foi que a média de 3 técnicos Replica em 37 ˚ c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: exemplo de um resultado inconclusivo com zinco e um resultado conclusivo com magnésio e manganês. Fluorescência máxima medida relativa fluorescência unidades (RFU) ± 1 desvio padrão emitido por Escherichia coli NEB5α abrigando o pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) com a adição de A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), e C) MnII (0-10 µM) em condições anaeróbias. [HgII] foi definida como 5 nM para todos os tratamentos e fluorescência foi a média de 3 repetições de técnicas em 37 ˚ c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Biosensores microbianos são ferramentas úteis para identificar os mecanismos pelos quais os metais estão interagindo com micróbios. Aqui, descrevemos um método que por via anaeróbia pode quantificar HgII e CdII biodisponibilidade para uma célula hospedeira Gram-negativas (Escherichia coli) e dar um resultado quantificável dentro de algumas horas. Um dos principais pontos positivos deste protocolo é que permite controle extenso de especiação de metal no meio de exposição, evitando ligantes de forte ligação ou componentes que podem levar à precipitação de metais. Especiação de metal foi modelada e testada neste meio de exposição usando PHREEQC17, no entanto, outros softwares de especiação de metal podem ser implantado. No caso de não ligantes adicionados, Hg especiação é esperada para estar presente como 97% Hg(OH)2 e 3% Hg (NH3)22 +, enquanto Cd especiação será apresente como 59% Cd-β-glicerofosfato, 25% Cd2 +e 16% CdSO4. Usando um software de modelagem termodinâmica simples, o usuário pode projetar meios de exposição e testar a biodisponibilidade do metal de interesse. Além disso, a célula hospedeira biosensor (NEB5α deEscherichia coli ) é viável em uma ampla faixa de pH (5-8.5) e concentração de NaCl (0-0,55 M)17.

Metilação do HG é um processo anaeróbio, e o protocolo descrito neste estudo não tem uma exigência para o oxigênio, permitindo a descrição mais exata do metabolismo anaeróbico na biodisponibilidade de metal. Isto é importante porque a presença de oxigênio altera a expressão de gene perfis48,49 e, portanto, potencial transporte vias; Portanto, esse método apresenta uma vantagem sobre existente atualmente alternativas aeróbias. A construção de biosensing apresentada aqui pode, potencialmente, ser usada com outros hosts anaeróbicos que podem ser mais relevantes para a metilação de mercúrio (por exemplo, Geobacter, Desulfovibrio), mas talvez menos tratáveis do que e. coli. Uma limitação atual da abordagem apresentada aqui é que nosso limite de detecção ainda não atingiu níveis de pM, ao contrário do existentes sistemas aeróbio4,19,37. É contudo importante notar que para alcançar esses limites de deteção baixa várias etapas precisam ser tomadas44: eu) adição de ligante é necessária para assegurar que o Hg permanece em solução e não fixar na parede da célula microbiana (Hg será limite irreversível a célula superfície tióis, impedindo sua biodisponibilidade25,,27; Veja a resposta de limiar para Hg na Figura 3A), ii) modificações à densidade celular, ou iii) modificar a construção genética para incluir proteínas de transporte do mer-operon (ou seja, merT e merP), o crescente fluxo de Hg dentro da célula de50,51. Essas modificações seria benéfico na detecção de baixas concentrações de Hg, mas não necessariamente ideal ao avaliar situações ambientalmente relevantes. Considerando que anterior biosensores cádmio existem principalmente como uma "prova de princípio", elas foram projetadas em meios complexos que não permitem o investigador avaliar o papel da especiação na biodisponibilidade41,42, 43 , 44.

O biosensor é uma ferramenta extremamente útil na determinação de mecanismos em que espécie de metal é biodisponíveis. Porque o organismo hospedeiro não é um Hg-methylator, só pode ser usado para desenvolver um modelo para como Hg pode entrar bactérias Gram-negativas e não um fundamento definitivo para como Hg-methylators adquirem Hg. Existem outros métodos para determinar a biodisponibilidade de Hg, tais como metilação, como um resultado da captação ou a utilização de um balanço de massa abordagem10,15,20,,45,46. Sendo assim, o método apresentado aqui oferece a vantagem de quase em tempo real dados de biodisponibilidade em células viáveis. Não recomendamos que este método ser usado para quantificar os níveis totais de Hg ou Cd em uma matriz ambiental. Apesar do uso proposto de biossensores para determinar concentrações de metal no ambiente36, muitos mais prontamente disponíveis métodos padrão estão disponíveis como ICP-MS, faby (para análise de Cd) ou espectroscopia de absorção atômica de vapor frio (para Hg análise). O biosensor, no entanto, pode ser usado para determinar se uma dada matriz ambiental tem o potencial para melhorar ou prejudicar a biodisponibilidade; Isto é conseguido através da realização de adições padrão.

O pH da mídia exposição pode ser alterado para em qualquer lugar dentro do intervalo de 5 e 8,5, desde o ácido livre de MOPS (tampão) é trocado com um ácido livre alternativo de um buffer com a pKa apropriado (consulte a lista de buffers adequados (Ferreira et al (2015) 47) e ajustada com KOH ao pH adequado ao fazer a mídia de exposição. Além disso, o método não está limitado a Hg e Cd, mas poderia ser estendido a outros metais usando outros reguladores de transcrição.

O ensaio de exposição pode ser modificado para explorar a influência de outros aceitadores de electrões como O2 e fumarato na biodisponibilidade de Hg ou Cd. Pequenas modificações para o método a utilizar tanto O2 e fumarato como aceitadores de electrões estão disponíveis mediante pedido.

Em resumo, gostaríamos de salientar os seguintes pontos: eu) é imperativo que as concentrações de Cd ou Hg estoques são conhecidas na etapa 2, como estes serão usados para calibrar o biosensor. II) no dia da exposição, o crescimento das células deve ser interrompido a uma OD600 de 0.6 (± 0.1) e que é tomado quando resuspending as culturas de células, como o biosensor é calibrado para essa densidade celular. III) por último, é importante que o meio de exposição feito meticulosamente no dia da exposição. Para garantir o sucesso do protocolo, múltiplas culturas devem ser cultivadas simultaneamente (para contornar a possibilidade de falha de crescimento) e o meio de crescimento deve ser refeito semanalmente (para contornar a metaestabilidade da mídia e da possível contaminação). Também deve ser notado que réplicas biológicas (várias culturas de células) expressam a variabilidade quando se trata de produção de sinal. Embora as respostas fluorescentes podem variar de cultura para cultura, as tendências fluorescentes em resposta a uma determinada variável devem permanecer inalterado ao longo de numerosas réplicas biológicas.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer comentários de dois revisores anônimos como bem membros do laboratório Poulain para discussão perspicaz sobre o desenvolvimento do biosensor anaeróbico. Um prêmio de pesquisador precoce da província de Ontário e um subsídio de descoberta e um suplemento de accelerator de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá para A.J.P. financiado este estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

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