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Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un biosensore microbico anaerobico di cellule intere di valutare come le diverse variabili ambientali influenzano la biodisponibilità di Hg e Cd ai batteri in ambienti anossici.

Abstract

Biodisponibilità di mercurio (Hg) ai microbi è un passo fondamentale per tossici Hg biomagnificazione in reti alimentari. Trasformazioni di cadmio (Cd) e la biodisponibilità di batteri controllano la quantità che si accumula nelle colture di alimento di base. La biodisponibilità di questi metalli dipende dalla loro speciazione in soluzione, ma più specialmente sotto condizioni anossiche dove Hg è metilato per tossici monomethylmercury (MeHg) e Cd persiste nella rizosfera. Intero-cellula microbiche biosensori dare un segnale quantificabile quando un metallo entra nel citosol e quindi è strumenti utili per valutare la biodisponibilità del metallo. Purtroppo, maggior parte degli sforzi di biosensori finora sono stata vincolata agli ambienti ossidanti a causa della limitata capacità di proteine reporter esistenti di funzionare in assenza di ossigeno. In questo studio, presentiamo il nostro sforzo per sviluppare e ottimizzare un'analisi di cellule intere biosensore in grado di funzionare anaerobicamente in grado di rilevare metalli in condizioni anossiche in tempo quasi-reale ed entro le ore. Descriviamo come il biosensore può aiutare a valutare come chimiche variabili rilevanti per il ciclismo ambientale di metalli influenzano la loro biodisponibilità. Il seguente protocollo include metodi per (1) preparare Hg e Cd standard in condizioni anossiche, (2) preparare il biosensore in assenza di ossigeno, (3) progettazione ed eseguire un esperimento per determinare l'influenza di una serie di variabile biodisponibilità Hg o Cd e (4) quantificare e interpretare i dati biosensore. Mostreremo le gamme lineari dei biosensori e fornire esempi che mostrano la capacità del metodo di distinguere tra metallo biodisponibilità e tossicità utilizzando ceppi sia metallo-viscoelastico e costitutive.

Introduction

Mercurio (Hg) è un inquinante globale e la sua biodisponibilità per Hg metilazione microbi è il primo passo verso la biomagnificazione attraverso reti alimentari e suoi possibili effetti neurotossici in essere umano e della fauna selvatica1. Attualmente si pensa che la metilazione Hg microbica è un processo intracellulare che richiede: i) la specie di Hg per essere bioavailable2,3,4,5,6,7 e ii) per la cella per essere fisiologicamente in grado di metilazione Hg8,9,10. Cadmio (Cd) bioaccumulabile negli organismi, ma fa non magnificazione in foodwebs e viene ampiamente utilizzata nei processi industriali e commerciali che comunemente causano le esposizioni acute nelle persone e l' ambiente11. Anche se i microbi svolgono diversi ruoli chiave nel destino di Hg nell'ambiente, maggior parte degli studi su Cd geochimica ed ecotossicologia concentrarsi su eucarioti microbici12. Consumo di colture agricole (per esempio, riso) è la principale fonte di esposizione diretta al cadmio; in questo caso, la biodisponibilità del Cd ai microbi di rizosfera influenza direttamente la quantità piante possono accumularsi13.

Percorsi di trasporto HG sono complesse e possibilmente coinvolgono un trasporto attivo passaggio14. Quando è coinvolto un trasportatore, il lavoro recente ha suggerito che HgII utilizza un ZnII o MnII trasportatore7,15,16,17. Considerando che CdII è supposto per essere accidentalmente trasportato nel citosol attraverso percorsi di trasporto metalli bivalenti (particolarmente MnII o ZnII), meccanismi di CdII trasporto dentro le cellule rimangono via trasporto speculativa e no Cd-specifico è stato identificato13,18. Indipendentemente dalla natura dei trasportatori coinvolti, tre fattori meccanicistici in definitiva determinano la capacità dei metalli per immettere una cella: i) la speciazione del metallo nella soluzione2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) le proprietà biophysiochemical della membrana cellulare17,24,25,26,27,28,29 ,30,31e iii) la possibilità per il metallo accedere a un sito di trasporto7,32. È improbabile che esiste come ioni liberi in condizioni microbiche fisiologicamente rilevanti a causa della loro alta affinità per dissolto Organic Matter (DOM), CD e Hg chelanti contaminanti (ad esempio, EDTA), o ridotto zolfo moiety33, 34,35 (CdII può esistere come un libero dello ione o forma coppie ioniche in assenza di questi leganti). C'è una mancanza di metodi efficienti nel determinare come queste specie metalliche sono biodisponibili in condizioni pertinenti al loro destino nell'ambiente. Per esempio, Hg è metilato sotto condizioni anaerobiche14, e sia cadmio Hg sono metalli teneri (o cationi di classe B), che richiedono che i loro speciazione essere studiati in condizioni tali da mantengono l'integrità dei gruppi ridotti dello zolfo.

Microbiche biosensori sono cellule batteriche che emettono un segnale quantificabile in risposta alle concentrazioni intracellulari di un metallo, in questo caso Hg o Cd. Come tali, essi sono strumenti ideali per capire come metalli inserire una cella36, purché le condizioni di esposizione vengono accuratamente controllate per. Biosensori di Hg in genere contengono fusioni del gene fra i circuiti regolatori del mer-operone (inclusi geni codificanti per il regolatore della trascrizione Armando nonché l'operatore e promotore regioni dell'operone) e reporting geni (per esempio, Lux, gfp, lac geni). Quando il mercurio è presente nel citoplasma, assocerà al MerR, conseguente trascrizione dei geni segnalazione e successivo segnale produzione19,37. Specifiche Cd biosensori sono solitamente progettati utilizzando cadC, cadAC, zntA o zntR codificati trascrizione regolatori38, ma vale la pena notare che MerR ha un'affinità più bassa, ancora quantificabile a Cd5. A causa di restrizione aerobico della maggior parte comunemente utilizzato proteine reporter fluorescenti o luminescenti, fino a recentemente microbiche biosensori è rimasto incapace di offrire intuizioni la biotrasformazione dei metalli in condizioni anossiche. Questo rende anaerobica rilevamento della biodisponibilità di metalli molto difficile in una gamma di condizioni pertinenti al loro destino ambientale, in particolare in presenza di redox sensibili ligandi (ad es., solfuro e tioli)4, 5 , 39.

Per alleviare la transenna metodologica di live imaging in assenza di ossigeno, Drepper et al. (2007) hanno sviluppato una proteina fluorescente flavina-base (FbFp), basato su dominio di tensione di ossigeno luce della proteina SB2 da p. putida. Questa famiglia di proteine è in grado di essere flourescente in assenza di ossigeno40. Basandosi sul lavoro di Drepper et al., il nostro laboratorio progettato un biosensore anaerobico permettendo per lo studio della biodisponibilità di Hg in condizioni ossidanti e anossiche e sopra una vasta gamma di salinità 17. Nella carta attuale, descriviamo come preparare e utilizzare il biosensore per testare influenza le variabili di ambiente sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Anche se abbiamo sviluppato il biosensore per HgII, abbiamo scelto di eseguire esperimenti con CdII come un mezzo per attirare l'attenzione del lettore sul fatto che i biosensori possono anche rispondere a fattori di stress multipli che sono suscettibili di co-accadono in campo ambientale matrici; in questo caso CdII è stato studiato perché è noto da associare al regolatore trascrizionale MerR5. Qui, indichiamo calibrazione rappresentativo e funzionale lineare gamme rispetto o metallo. Diamo anche un esempio quando i risultati di biosensore sono conclusivi (MgII e MnII sulla biodisponibilità di Hg) e inconcludenti (ZnII sulla biodisponibilità di Hg).

Protocol

1. crescita Media e preparazione di terreni di esposizione

  1. Per fare 250 mL di terreno di coltura:
    Nota: Se la soluzione di oligoelementi n. 1 e soluzione di oligoelementi n. 2 sono già pronti, andare al passaggio 1.1.5.
    1. Preparare gli oligoelementi #1 soluzione in un matraccio pulito (200 mL) per contenere il molarities finale di 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6.5 x 10-4 M Na2SeO4, 5x10-3 M H3BO 3e NaOH 0,1 M.
      Attenzione: Basi forti (NaOH) sono corrosivi. Rendere sicuro quando pesatura i reagenti per garantire che la molarità finale rappresenta il chiave di oligoelementi; Mo, Se e B.
    2. Sotto un campo sterile, filtro sterilizzare utilizzando un filtro di 0,22 µm in polietersulfone siringa in una bottiglia di plastica pulita/sterile/politetrafluoroetilene (PTFE).
    3. Preparare gli oligoelementi #2 soluzione in un matraccio pulito (200 mL) per contenere il molarities finale di 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3,25 x 10-3 M CoCl2, 6.25 x 10-3 M Burundi 2e 0,1 M H2SO4.
      Attenzione: Gli acidi forti (H2SO4) sono corrosivi. Rendere sicuro quando pesatura i reagenti per garantire che la molarità finale rappresenta il chiave di oligoelementi; MN, Zn, Co e Ni.
    4. Sotto un campo sterile, filtro sterilizzare utilizzando un filtro di 0,22 µm in polietersulfone siringa in una bottiglia di vetro pulita.
    5. Sotto un campo sterile, in una bottiglia di vetro pulita/sterile (minimo 250 mL); aggiungere 200 mL di acqua ultrapura, 42,5 mL di sali minima M9 (5x; Vedi Tabella materiali), 2,5 mL di glucosio M 2, 125 µ l di 2m MgSO4, 1200 µ l di 0,6 M tiamina HCl da un'aliquota (da-20 ˚ c) congelata, 1,25 mL di 4 M NaNO3 , 770 µ l di 0.075 M L-leucina / L-isoleucina / soluzione di valina, 250 µ l oligoelementi n. 1, 250 µ l di oligoelemento #2e 250 µ l di sodio EDTA 0,01 M sale.
      Nota: Tutti i reattivi nel passaggio 1.1.5 dovrebbero essere preparati prima e filtro sterilizzato usando un filtro di siringa in polietersulfone 0,22 µm. Acqua ultrapura può essere sterilizzato con autoclave.
    6. Prendere la bottiglia di vetro ora contenente soluzione dal punto 1.1.5., vagamente dirla e scorrere il blocco di aria camera anaerobica .
    7. Nella camera anaerobica, aggiungere 15 µ l di 0,225 M FeSO4 0,2 M H2così4, richiudere ermeticamente il flacone e agitare fino a quando tutti i precipitati bianchi scompaiono.
      Nota: Tutti i reattivi nel passaggio 1.1.7 dovrebbero essere preparati prima e filtro sterilizzato usando un filtro di siringa in polietersulfone 0,22 µm. Memorizzare il FeSO 0,225 M4 0,2 M H2così4 in camera anaerobica.
    8. Rimuovere il tappo dalla bottiglia, attendere 1 minuto per aria scambiare, sostituire il tappo dalla bottiglia e poi agitare vigorosamente. Ripetere questo passaggio una volta.
    9. Serrare il tappo sulla bottiglia, rimuovere dalla camera anaerobicae conservare la bottiglia in frigo (4 ° c) fino all'utilizzo.
    10. Mezzo di crescita dovrebbe essere rifatto una volta a settimana ripetendo i passaggi 1.1.5 a 1.1.9.
  2. Per rendere 100 mL di terreno di esposizione di 2 x 50 mL provette in polipropilene sterile conica:
    Nota: Si consiglia di quel mezzo di esposizione essere preparata il giorno del test di esposizione per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, tuttavia può essere fatto in anticipo e conservato in frigorifero.
    1. Nella camera anaerobica, per ogni 50 mL provetta aggiungere 42 mL di acqua ultrapura anaerobica, 350 µ l di 1 M sodio Beta-Gylcerophosphate da un'aliquota congelata (-20 ° c), 2 mL di 1 M MOPS acido, 50 µ l di 1 M (NH4)2libero così4 , 125 μL di glucosio 2m, 300 μL di KOH 2,5 M e 200 μL di 2,5 M NaOH.
      Nota: Tutti i reattivi nel passaggio 1.2.1 dovrebbero essere preparati prima e filtro sterilizzato usando un filtro di siringa in polietersulfone 0,22 µm. Acqua ultrapura può essere sterilizzato con un'autoclave di calore. 2.5 NaOH M e 2,5 M NaOH devono essere conservati in bottiglie di plastica/PTFE. Elencati tutti i reagenti devono essere conservati nella camera anaerobica tranne sodio Beta-Gylcerophosphate, che deve essere conservato in un congelatore (-20 ° c). In generale, è buona norma lasciare tutti i contenitori e le parti di plastica o di vetro per diversi giorni nella camera anaerobica per assicurare che non rimangano tracce di ossigeno.
    2. Le provette da centrifuga 50ml di Cap, agitare bene e rimuovere un'aliquota di 10 mL per misurare il pH. Il pH misurato di questa esposizione media deve misurare sempre 7,00 ± 0.02 a 25 ˚ c. Se il pH non misura all'interno di questa gamma, regolare nuovamente il volume aggiunto 2,5 m KOH per correggere per questo.
      Nota: Mai titolare la soluzione per correggere il pH con una sonda di pH. sonde di pH rappresentano una fonte di contaminazione per mezzo di esposizione. Il pH deve essere sempre un prodotto reagente aggiunto al punto 1.2.1.
  3. Preparare una soluzione stock di 5-10 mM NaNO3 e lasciare in camera anaerobica per essere utilizzata durante il periodo del dosaggio di esposizione.
    Nota: È più facile diluire un campione di3 NaNO più concentrato primario anziché fare un 5-10 mM NaNO3 standard primario.

2. preparazione di mercurio e cadmio standard.

  1. Preparare una soluzione di mercurio (HgII) 4-8 µM in 0,2 M H2SO4.
    1. Predisporre un Hg2 + standard facendo un millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 o HgSO4 soluzione 0,2 M H2SO4.
      Attenzione: Il mercurio è altamente tossico e H2così4 è corrosivo. Operare in cappe con tutti i necessari dispositivi di protezione individuale.
    2. In una bottiglia PTFE, diluire standard da 2.1.1. in 0,2 M H2SO4 per ottenere una concentrazione all'interno della gamma di 4-8 µM Hg2 +.
      Nota: L'acido utilizzato deve essere di grado analitico H2così4.
    3. La concentrazione di Hg da 2.1.2 deve essere convalidata utilizzando un analizzatore di mercurio (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Possono essere utilizzati altri metodi per la convalida la concentrazione di Hg.
  2. Preparare un µM 10 CdII soluzione in 10 mM H2SO4.
    1. Preparare un campione primario di CdCl2 (gamma di 10-50 mM per pesatura precisa di polvere) in 0.1 M H2SO4.
    2. In una serie di diluizioni seriali pulito acido risciacquata 20 ml fiale di vetro borosilicato con tappi a vite fenolici neri con PTFE fronte rivestimenti in gomma, diluire lo standard da 2.2.1 a 10 µM Cd2 +. Verificare che la concentrazione di H2così4 in ogni successiva diluizione seriale rimane 10 mM.

3. preparazione del biosensore per l'analisi di esposizione anaerobica

  1. Piastra di biosensore viscoelastica mercurio (E. coli NEB5α che harboring PUC57merR-PpFbFp) e il biosensore costitutivamente espresso (E. coli NEB5α che harboring PUC19Balch-PpFbFp) da-80 ° c cryostock sui piatti di Lisogenesi brodo che contengono 120 ampicillina ug/mL. Vedere il nostro lavoro pubblicato in precedenza per i dettagli sulla produzione di questi biosensori17.
  2. Alle 04:30-17, inoculare una cultura in 10 mL di LB (+ amp) e crescere durante la notte.
    Nota: A partire da una piastra si prende 2 giorni per preparare la coltura anaerobica per il test di esposizione (cioè, una cultura iniziata il lunedì pomeriggio (04:30-17) sarà pronto per il test di esposizione a intorno a mezzogiorno il mercoledì). I passaggi seguenti sono le tecniche microbiologiche richieste necessari per preparare le colture il giorno del test di esposizione.
    1. Prendere una colonia dalla cultura piatto e aggiungere 10 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con 21 µ l di una soluzione di riserva di 100 mg/mL di sale di sodio ampicillina (concentrazione finale è 210 amp ug/mL) in un tubo di coltura sterile.
    2. Inserire la cultura in un incubatore/agitatore e crescere durante la notte a + 37 ° c con agitazione a 220 giri/min.
  3. La mattina successiva alle 9-10, Risospendere la cultura e crescere anaerobicamente durante tutta la giornata (20% dell'inoculo).
    1. Portare la cultura dall'incubatrice (punto 3.2.1) e il terreno di coltura (passaggio 1.1.9) nella camera anaerobica.
    2. Aggiungere 8 mL di fresco crescita medio e ampicillina (210 µ g/mL) in una provetta sterile di Balch.
    3. Raccogliere 2 mL della cultura cresciuto durante la notte e trasferimento in un tubo del Microcentrifuge da 2 mL. Centrifugare a 10.000 passo RCF per 90 secondi, dump surnatante e risospendere in 2 mL di nuovo mezzo di crescita. Aggiungere la cultura sedimento nella provetta di Balch contenente 8 mL di fresco crescita medio e ampicillina.
    4. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare un tappo di gomma sul tubo Balch. Rimuovere dalla camera anaerobica e mettere in un incubatore/shaker e crescere anaerobicamente fino a 3-17 a + 37 ° c con agitazione a 220 giri/min.
  4. Tra 3 e 17, eseguire un inoculo anaerobica di 1% in fresco crescita medio e crescere durante la notte.
    1. Portare il tubo di Balch (punto 3.3.4) nella camera anaerobica insieme a mezzo di crescita. Aggiungere 100 µ l della cultura a 10 mL di nuovo terreno di coltura (1% di inoculo) con amp (amplificatore 210 ug/mL) in una provetta sterile Balch.
    2. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare un tappo di gomma sul tubo Balch. Rimuovere dalla camera anaerobica, mettere in un incubatore/shaker e crescere durante la notte a + 37 ° c con agitazione a 220 giri/min.
  5. Tra il 9 e 10, Risospendere la cultura a crescere anaerobicamente durante tutta la giornata (20% dell'inoculo).
    1. Portare la cultura dall'incubatrice (punto 3.4.1) ed il terreno di coltura (passaggio 1.1.9) nella camera anaerobica.
    2. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura e ampicillina (amp 210 ug/mL) in una provetta sterile di Balch.
    3. Raccogliere 2 m della cultura cresciuto durante la notte e trasferimento in un tubo del Microcentrifuge da 2 mL. Centrifugare a 10.000 x g per 90 secondi, il dump surnatante e risospendere in 2 mL di nuovo mezzo di crescita. Aggiungere la cultura sedimento nella provetta di Balch contenente 8 mL di fresco crescita medio e ampicillina.
    4. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare un tappo di gomma sul tubo Balch. Rimuovere dalla camera e mettere in un incubatore/shaker e crescere anaerobicamente a + 37 ° c con agitazione a 220 giri/min.
  6. Monitorare la crescita della cultura utilizzando uno spettrofotometro (passo 3.5.4) finché non viene raggiunto un OD600 di 0,6 . Essere sicuri di cultura vortice prima di ogni lettura di OD.
    Nota: Questo passaggio richiede 3-4 ore e mezzo di esposizione (punto 1.2) dovrebbe essere preparato durante questo tempo così come il test di esposizione (punto 4.1).
  7. Fermare la crescita quando la cultura raggiunge un OD600 di 0,6 (± 0,1) (crescita di 3-4 ore previsti).
    1. Portare il tubo nella camera anaerobica (punto 3.6) e cultura di trasferimento in provette microcentrifuga di 2 x 2 mL . Centrifugare a 10.000 x g per 90 secondi, il dump surnatante e risospendere in 2 x 2 mL di nuovo mezzo di esposizione.
    2. Ripetere i passaggi di lavaggio 3.7.1. volta per rimuovere qualsiasi traccia del mezzo di crescita.
  8. Combinare entrambi microcentrifuga della coltura delle cellule (punto 3.7) in un flaconcino di standard di PTFE 7 mL per ottenere Biosensore Stock da utilizzare nel Test di esposizione (passaggio 4).
    Nota: Assicurarsi di mescolare il Biosensore Stock pipettando accuratamente ma delicatamente avanti e indietro prima dell'uso. Il metodo può essere sospeso qui per fino a un'ora.

4. l'esposizione Assay

  1. Progettazione di un layout di piastra.
    Nota: Assicuratevi di avere tutto pipettaggio valori calcolati e scorte preparate prima di iniziare la analisi esposizione. Come correttamente design un esperimento e sui controlli da includere è dettagliata nel testo. Inoltre, l'esperimento non deve essere iniziato se c'è ossigeno nella camera anaerobica indicata sul monitor anaerobico.
    1. Progettare il layout di piastra secondo un modello ben 96. Per eseguire esperimenti in tecniche replicati di 3, ciò consentirà di 32 diversi trattamenti, che è rappresentato da una griglia di 4 x 8 impostare fiale (Vedi Figura 1).

Figure 1
Figura 1: bene micropiastra A 96 (sinistra) e una griglia di 4 x 8 corrispondente contenente PTFE fiale (destra) per essere trasferiti alla piastra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nota: Quando prova per il ruolo di una variabile sull'assorbimento di Hg con i biosensore viscoelastica mercurio; due trattamenti sono necessari per ogni variabile: il trattamento (biosensore + Hg + variabile + nitrato) ed il relativo trattamento vuoto (biosensore + variabile + nitrato). Durante il test per il ruolo di una variabile sulla fisiologia della cellula utilizzando il biosensore costitutiva, due trattamenti sono necessari per ogni variabile: il trattamento (biosensore + Hg + variabile + nitrato) e trattamento ( vuoto biosensore + variabile + Hg). Mercurio può essere sostituita con cadmio. Hg o Cd diventerà la variabile quando si esegue una curva di calibrazione. La costitutiva e inducibile biosensori non devono essere eseguiti al tempo stesso (nello stesso layout piastra). Viene fornito un esempio di modello per il layout di piastra e griglia di 4 x 8 corrispondente quando si verifica una gamma di concentrazione di magnesio (variabile) nella tabella 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
un HG indotto biosensore, Hg + nitrato + 0mm Mg HG indotto biosensore + nitrato + 0mm Mg Biosensore costitutiva, Hg + nitrato + 0mm Mg Biosensore costitutiva + Hg + 0mm Mg
b HG indotto biosensore + Hg + nitrato + 0,1 mM Mg HG indotto biosensore + nitrato + 0,1 mM Mg Costitutiva biosensore + Hg + nitrato + 0,1 mM Mg Biosensore costitutiva + Hg + 0,1 mM Mg
c HG indotto biosensore, Hg + nitrato + 1 mM Mg HG indotto biosensore + nitrato + 1 mM Mg Biosensore costitutiva, Hg + nitrato + 1 mM Mg Biosensore costitutiva + Hg + 1 mM Mg
d HG indotto biosensore, Hg + nitrato + 10 mM Mg HG indotto biosensore + nitrato + 10 mM Mg Biosensore costitutiva, Hg + nitrato + 10 mM Mg Biosensore costitutiva + Hg + 10 mM Mg
e

Tabella 1: Un esempio piastra di disposizione per test biodisponibilità Hg mediante biosensore (5 nM) sopra una pendenza di magnesio (0-10 mM)

  1. Impostate la griglia di 4 x 8 in base al layout di piastra di dosaggio.
    1. Posto 7 fiale mL PTFE standard nel vassoio.
      Nota: PTFE flaconcini devono essere lavato acido/calore sterilizzati prima dell'uso. Flaconcini devono essere manipolati solo manipolando l'esterno della fiala.
    2. Ad ogni flacone, aggiungere il volume medio di esposizione corrispondente ad ogni trattamento.
      Nota: Un'esposizione con un volume totale di 2.000 µ l (2 mL), sarà aggiunto medio di esposizione : media esposizione µ l = 2.000 µ l – trattamento (vuoto) µ l. (ad es., l'esposizione media µ l = 2.000 – 100 µ l (biosensore) – 40 µ l (nitrato) – 100 µ l (Hg ) – 100 µ l (variabile (ad es., MgSO4)) = µ l 1660). Assicurarsi che il volume aggiunto della testata variabile non superi il 5% (100 µ l) del volume finale.
    3. Ad ogni flacone, aggiungere il corrispondente volume della soluzione della chimica variabile per essere testato in base al layout della piastra.
    4. Dal passaggio 1.3, è possibile aggiungere nitrato ad ogni flacone in modo che la concentrazione finale è di 200 µM (40-80 µ l). Escludere questo passaggio per spazi vuoti di trattamento biosensore costitutiva.
    5. Da passo 2.1 o 2.2, aggiungere Hg (5 nM durante il test di una variabile) o Cd (300 nM durante il test di una variabile) per le fiale in base al layout della piastra. Escludere questo passaggio per spazi vuoti di mercurio viscoelastica biosensor trattamento.
      1. Quando si utilizza Hg, prendere lo stock di 4-8 µM e agitare bene. Diluire la soluzione nel mezzo di esposizione in un flaconcino PTFE 7 mL a 100-250 nM per fare un lavoro soluzione Hg. Da questa soluzione di lavoro Aggiungi Hg per il necessario numero di flaconcini. In questo caso una curva di calibrazione di Hg che vanno da 0 a 12,5 nM.
        Nota: Quando si verifica per effetto di una variabile sulla biodisponibilità di Hg o Cd, assicurarsi che il [Hg] o [Cd] rimane costante in tutti i trattamenti. Quando si aggiungono Hg o Cd, assicurarsi di utilizzare una punta, ma non toccare mai il mezzo di esposizione nelle fiale.
  2. Agitare manualmente in un movimento orbitale.
    Nota: L'esperimento può essere messo in pausa ora a seconda del tempo richiesto per Hg o Cd per speciare in soluzione. Se lasciato per più di un'ora, è possibile applicare tappi PTFE dei flaconcini di PTFE per prevenire l'evaporazione/contaminazione.
  3. Pipettare delicatamente Biosensore Stock avanti e indietro per garantire omogeneità. Aggiungere 100 µ l di Biosensore Stock per ogni flaconcino. Agitare orbitally manualmente.
  4. Preparare il lettore di piastra di riscaldare a leggere con i seguenti criteri: temperatura a 37, cinetica eseguire per 10 ore con letture ogni 2,5-5 minuti con agitazione orbitale si legge in mezzo e misure di fluorescenza con un l'eccitazione di fluorescenza di 440 nm e un emissione di 500 nm.
  5. Pipettare 200 µ l da ogni fiale PTFE della griglia di 4 x 8 nei rispettivi pozzetti della piastra ben 96 (Clear Black, 96-Well-fondo Nonbinding superficie micropiastre). Avanti e indietro Pipettare 5 volte prima di trasferire ogni 200 µ l.
    Nota: Invece di scartare la punta della pipetta, lasciare il puntale della pipetta nel flaconcino PTFE per tenere traccia dei progressi di pipettaggio.
  6. Posizionare la piastra ben 96 nel vassoio del lettore della piastra, poi mettere il coperchio sulla piastra ben 96 e iniziare il test.

5. quantificare i dati

  1. La fluorescenza di ogni trattamento in ogni momento deve essere corretto per ogni singolo rumore ben e oscurata per il trattamento vuoto.
    1. La fluorescenza per ogni punto di tempo (t) di ogni trattamento (T) deve essere tradotta al conto per la fluorescenza iniziale (t0) della prima volta punto di ciascun pozzetto, quindi media tra i 3 trattamenti replica (r1- r3 ). Questa media di trattamento deve quindi essere annullata al medio trattamento vuoto (TB) tradotta nello stesso modo (equazione 1).

Fluorescenza (t) = medio(Tr1(t) – Tr1(t0)), Tr2(t) – Tr2 (t0)), Tr3(t) – Tr3(t0))) – medio(TB R1 (t) – TBr1(t0)), TBr2(t))– TBr2( t0 ), TBr3(t) – TBr3(t0))) (1)

Nota: Questo dovrebbe essere fatto come una funzione di foglio di calcolo. Corretta propagazione dell'errore dovrebbe anche essere calcolato per ogni punto di tempo.

  1. Grafico la fluorescenza corretto di ogni trattamento in funzione del tempo

Figure 2
Figura 2: fluorescenza dati corretti in funzione del tempo. La fluorescenza misurata come unità relativa fluorescenza (RFU) emessa da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (ceppo inducibile) nel tempo con l'aggiunta di HgII (0-12,5 nM) in condizioni anaerobiche. Fluorescenza è stata che la media di 3 tecnici replica a 37 ˚ c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nota: Non esiste alcun valore di Hg 0 nM sul grafico, e tutte le altre concentrazioni di Hg sono state cancellate al 0 nM Hg come trattamento vuoto. Di conseguenza, 0 nM Hg rappresenta l'asse x e qualsiasi fluorescenza positiva rappresenta fluorescenza da Hg dato qualsiasi variabile. È facoltativo non vuoto la fluorescenza in questo modo, ma le curve fluorescente darà curve di fluorescenza fuorvianti se la variabile testato ha fluorescenza di fondo (cioè, materia organica disciolta stesso darà fluorescenza e se non c'è nessun trattamento vuoto contenente solo le celle e la materia organica disciolta, aumentando la concentrazione di materia organica disciolta aumenterà il segnale fluorescente).

  1. Quantificare il picco di fluorescenza. Un picco di fluorescenza quantificabile in genere si verifica dopo 2,5-4 ore, che rappresenta l'energia spesa dal consumo di nitrato di µM 200 tutti come un accettore terminale di elettroni. Questo picco dovrebbe essere quantificato e rappresenta il valore di fluorescenza finale di tale specifico trattamento.
    Nota: nel caso in cui nessun picco di fluorescenza è osservato (cioè, nessuna biodisponibilità di Hg), la fluorescenza del trattamento presso il punto di tempo del picco di fluorescenza del controllo (cioè, nessuna aggiunta variabile o Hg 5nM) devono essere quantificati. In alternativa, se non c'è induzione fluorescenza nel trattamento, ma fluorescenza non produce un picco di ben definito, c'è probabile contaminazione di un accettore di elettroni maggiore affinità come O2 e misure da adottare per rimuovere tracce di ossigeno da tutte le soluzioni e l'esperimento deve essere eseguita nuovamente.

Representative Results

Una volta che i picchi di fluorescenza sono stati quantificati secondo punto 5.3, il risultato dei picchi di fluorescenza possa essere rappresentati graficamente secondo la concentrazione variabile che illustra come tale variabile influenza la biodisponibilità relativa di Hg o Cd. Ad esempio, la curva di taratura della fluorescenza sopra [HgII] dalla Figura 2 produrrà i dati viscoelastici presentati in Figura 3A. Per HgII calibrazione, la curva sarà sempre contengono 3 componenti per il ceppo Hg-inducible; una risposta di soglia di circa 1-2 nM HgII prima produzione del segnale di fluorescenza è linearmente proporzionale [HgII], la gamma lineare dove 5 nM HgII sarà affidabile sempre al centro di tale intervallo e un altopiano dove [HgII] non è più consigliabile aumentare segnale di fluorescenza. Nessun cambiamento nella produzione del segnale sul ceppo costitutivo dimostra che la tossicità da [HgII] non pregiudica la produzione del segnale. Per CdII in Figura 3B, ci sono sempre 2 componenti per il ceppo inducibile; una gamma lineare dove 200-300 nM CdII sarà affidabile sempre al centro del campo lineare e un plateau. Una diminuzione del segnale di fluorescenza con crescente [CdII] Mostra che le più alte concentrazioni di Cd sono tossiche per le cellule e possono spiegare una diminuzione della produzione di fluorescenza viscoelastica dopo l'altopiano a 1000 nM CdII. Pertanto, quando si prova Cd o Hg biodisponibilità rispetto a una variabile di ambiente, si consiglia di utilizzare 5 nM per HgII e 300 nM per CdII.

In alcuni casi, produzione del segnale può essere correttamente attribuito alla biodisponibilità Hg o Cd, ma in altri casi, la produzione del segnale può essere influenzata da variazione dello stato fisiologico della cellula ospite biosensore (ad es., il metallo di interesse o condizioni ambientali testate sono tossiche). In Figura 4A, biodisponibilità di Hg 5 nM è stato testato su una sfumatura di Zn (0-10 µM). Hg-inducible sia in ceppi costitutive, c'è una simile diminuzione nel segnale con un aumento delle concentrazioni di Zn. Di conseguenza, uno non può discriminare se il segnale deriva dalla biodisponibilità abbassata o è il risultato di tossicità di Zn. In Figura 4B e 4C, 5nM biodisponibilità di Hg è stato testato su una sfumatura di MgII (0-10 mM) e MnII (0-10 µM). Mg di aumentare le concentrazioni diII II e Mn sono diminuito il segnale di fluorescenza del ceppo inducibile. D'altra parte, il ceppo costitutivo non ha mostrato una diminuzione in fluorescenza con l'aumento di Mg concentrazioni diII II e Mn (MgII e MnII sono benefiche per le cellule nella produzione di FbFp, come dimostrato da un aumento del segnale di fluorescenza). Questo dimostra che le cellule sono vitali e la diminuzione di fluorescenza del ceppo Hg-inducible deriva da una diminuzione della biodisponibilità di Hg. Questi dati sottolinea quanto sia importante per tutti i saggi di biosensore anche fornire misurazioni costitutive della forma fisica generale delle cellule.

Figure 3
Figura 3: gamme lineari del biosensore con mercurio e cadmio. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) HgII (0-15 nM) e B) CdII (0-1.000 nM) in condizioni anaerobiche. Fluorescenza è stata che la media di 3 tecnici replica a 37 ˚ c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempio di un risultato inconcludente con zinco e un risultato conclusivo con magnesio e Manganese. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), e C) MnII (0-10 µM) in condizioni anaerobiche. [HgII] è stata impostata a 5 nM per tutti i trattamenti e fluorescenza era la media dei 3 replicati tecnici a 37 ˚ c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Microbiche biosensori sono strumenti utili per identificare i meccanismi con cui i metalli stanno interagendo con microbi. Qui, descriviamo un metodo che consente di quantificare anaerobicamente HgII e CdII biodisponibilità di una cellula ospite gram-negativi (Escherichia coli) e dare un risultato quantificabile entro poche ore. Uno dei maggiori punti di forza di questo protocollo è che permette un controllo esteso di speciazione nel mezzo di esposizione evitando di ligandi di forte legame o componenti che possono portare alla precipitazione del metallo. Speciazione è stato modellato e testato in questo mezzo di esposizione utilizzando PHREEQC17, tuttavia altri software di speciazione può essere distribuito. Nel caso di nessun aggiunto ligandi, Hg speciazione è previsto per essere presenti come 97% Hg(OH)2 e 3% Hg (NH3)22 +, mentre Cd speciazione sarà presente come 59% Cd-β-glicerofosfato, 25% Cd2 +e 16% CdSO4. Utilizzando un semplice software di modellazione termodinamico, l'utente può progettare esposizione media e testare per la biodisponibilità del metallo di interesse. Inoltre, la cellula ospite biosensore (NEB5α die. coli ) è praticabile su una vasta gamma di pH (5-8,5) e la concentrazione di NaCl (0-0,55 M)17.

Hg la metilazione è un processo anaerobico, e il protocollo descritto in questo studio non è un requisito per l'ossigeno, consentendo per la descrizione più accurata del metabolismo anaerobico sulla biodisponibilità del metallo. Questo è importante perché la presenza di ossigeno altera gene expression profili48,49 e quindi, potenziale di trasporto vie; Pertanto, questo metodo presenta un vantaggio sopra attualmente esistente aerobiche alternative. Il costrutto di biosensori presentato qui potenzialmente può essere utilizzato con altri host anaerobica che potrebbero essere più pertinenti per la metilazione di mercurio (ad esempio Geobacter, Desulfovibrio), ma forse meno trattabili di e. coli. Una limitazione di corrente dell'approccio presentato qui è che il nostro limite di rilevazione non ha ancora raggiunto i livelli di pM, contrariamente alle esistenti sistemi aerobici4,19,37. È tuttavia importante notare che per raggiungere questi limiti di rilevabilità basso diversi passaggi devono essere scattata44: io) aggiunta di legante è necessaria per assicurare che Hg rimane in soluzione e non adsorbe sulla parete della cellula microbica (Hg sarà irreversibile con associazione alla cella tioli superfici impedendo la sua biodisponibilità25,27; Vedi la risposta di soglia per Hg in Figura 3A), ii) modifiche alla densità delle cellule, o iii) modificare il costrutto genetico per includere proteine di trasporto della mer-operone (vale a dire merT e merP), crescente flusso di Hg all'interno la cella50,51. Queste modifiche sarebbe utile nella rilevazione di basse concentrazioni di Hg, ma non necessariamente ideale quando valutare situazioni ambientali rilevanti. Considerando che precedente biosensori di cadmio esistano principalmente come una "prova di principio", furono progettati nel complesso media che non permettono al ricercatore di valutare il ruolo della speciazione su biodisponibilità41,42, 43 , 44.

Il biosensore è uno strumento incredibilmente utile nel determinare meccanismi in cui specie metalliche sono biodisponibili. Perché l'organismo ospite non è un Hg-methylator, può essere utilizzato solo per sviluppare un modello per come Hg possono entrare batteri gram-negativi e non una definitiva spiegazione razionale per quanto Hg-methylators acquisire Hg. Esistono altri metodi per determinare la biodisponibilità di Hg, come metilazione, come un risultato dell'assorbimento o l'utilizzo di un bilancio di massa approccio10,15,20,45,46. Detto questo, il metodo presentato qui offre il vantaggio di quasi tempo reale biodisponibilità dati in cellule vitali. Non è consigliabile questo metodo essere utilizzato per quantificare i livelli totali di Hg o Cd in una matrice ambientale. Nonostante l'uso proposto di biosensori per determinare le concentrazioni di metalli nel ambiente36, molti più facilmente disponibili metodi standard sono disponibili quali ICP-MS, FAAS (per analisi di Cd) o spettroscopia di assorbimento atomico di vapore freddo (per Hg analisi). Il biosensore può tuttavia essere utilizzato per determinare se una data matrice ambientale ha il potenziale per migliorare o ostacolare la biodisponibilità; Ciò si ottiene eseguendo aggiunte standard.

Il pH dell'esposizione media può essere alterato per ovunque all'interno della gamma di 5 e 8.5, purché l'acido libero di MOPS (buffer) viene scambiato con un acido libero alternativo di un buffer con il pKa appropriato (si veda elenco di buffer appropriato (Ferreira et al. (2015) 47) e regolato con KOH al pH appropriato quando si effettua l'esposizione media. Inoltre, il metodo non è limitato a Hg e Cd, ma potrebbe essere esteso ad altri metalli con altri regolatori della trascrizione.

Il test di esposizione può essere modificato per esplorare l'influenza di altri accettori come O2 e fumarato sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Piccole modifiche al metodo di utilizzare sia O2 e fumarato come accettori sono disponibili su richiesta.

In sintesi ci piacerebbe sottolineare i seguenti punti: io) è imperativo che le concentrazioni di stock di Cd e Hg sono noti nel passaggio 2, questi verranno utilizzati per calibrare il biosensore. II) il giorno di esposizione, la crescita delle cellule deve essere interrotta in un OD600 di 0,6 (± 0,1) e che la cura è presa quando risospensione delle colture cellulari, come il biosensore è calibrato per la densità delle cellule. III) , infine, è importante che il mezzo di esposizione fatta meticolosamente il giorno dell'esposizione. Per garantire il successo del protocollo, le colture multiple devono essere coltivate contemporaneamente (per eludere la possibilità di guasto di sviluppo) e il mezzo di crescita dovrebbe essere rifatto settimanale (per eludere la metastabilità dei media e della possibile contaminazione). Si deve anche osservare che replicati biologici (più colture cellulari) esprimono la variabilità quando si tratta di produzione del segnale. Anche se le risposte fluorescente possono variare da cultura a cultura, le tendenze fluorescente in risposta a una determinata variabile dovrebbero rimanere lo stesso nel corso di numerose repliche biologiche.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare commenti da due revisori anonimi come ben membri del Poulain Lab per penetranti discussione sullo sviluppo del biosensore anaerobico. Un precoce Researcher Award dalla provincia dell'Ontario e una sovvenzione di Discovery e un supplemento di acceleratore da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada per A.J.P finanziato questo studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

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