Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En anaerob Biosensor analysen for påvisning av kvikksølv og kadmium

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke en anaerob hele celle mikrobiell biosensor for å vurdere hvordan ulike miljømessige variabler påvirker biotilgjengeligheten av Hg og Cd for bakterier i anoksisk miljøer.

Abstract

Kvikksølv (Hg) biotilgjengelighet for mikrober er et viktig skritt til giftige Hg biomagnification i næringskjeder. Kadmium (Cd) transformasjoner og biotilgjengelighet for bakterier styre hvor som vil akkumuleres i stift matavlinger. Biotilgjengeligheten av disse metallene er avhengig av deres artsdannelse i løsningen, men mer spesielt under anoksisk forhold der Hg er denaturert til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd vedvarer i rhizosphere. Hele celle mikrobiell biosensors gir et kvantifiserbare signal når et metall inn stoffer og er derfor nyttig verktøy å vurdere metall biotilgjengelighet. Dessverre har mest biosensing innsats så langt vært begrenset til oksisk miljøer på grunn av den begrensede evnen til eksisterende reporter proteiner til funksjonen i fravær av oksygen. I denne studien presenterer vi vår innsats for å utvikle og optimalisere en hel celle biosensor analysen kan fungere anaerob som kan oppdage metaller under anoksisk tilstand i kvasi sanntid og innen timer. Beskriver vi hvordan biosensor kan hjelpe vurdere hvordan kjemiske variabler gjelder miljømessig sykling metaller påvirker deres biotilgjengelighet. Følgende protokollen inneholder metoder for å (1) forberede Hg og Cd-standarder under anoksisk forhold, (2) – biosensor i fravær av oksygen, (3) design og gjennomføre et eksperiment for å finne ut hvordan en rekke variabel påvirker Hg eller Cd biotilgjengelighet og (4) å kvantifisere og tolke biosensor data. Vi viser lineær områdene av biosensors og gi eksempler viser metodens evne til å skille mellom metall bioavailability og toksisitet ved å benytte både metall-induserbart og konstituerende stammer.

Introduction

Kvikksølv (Hg) er en global forurensende sin biotilgjengelighet til Hg methylating mikrober er første skritt mot sin biomagnification gjennom næringskjeder og mulig nevrotoksiske effekter i menneskelig og dyreliv1. Det er tenkt at mikrobielle Hg metylering er en intracellulær prosess som krever: i) artene av Hg skal bioavailable2,3,4,5,6,7 II) for cellen være fysiologisk i stand til methylating Hg8,9,10. Kadmium (Cd) bioaccumulates i organismer, men gjør ikke biomagnifies i foodwebs og er mye brukt i industrielle og kommersielle prosesser som vanligvis forårsaker akutt eksponeringer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spille flere sentrale roller i skjebnen til Hg i miljøet, fokus de fleste studier Cd geokjemi og økotoksikologi på mikrobiell eukaryoter12. Forbruket av jordbruksprodukter (f.eks ris) er hovedkilden til direkte eksponering mot kadmium; i dette tilfellet biotilgjengeligheten av Cd for mikrober av rhizosphere direkte påvirker mengden planter kan akkumulere13.

HG transport veier er komplekse og muligens involverer en aktiv transport trinn14. Når en transporter er involvert, siste verk foreslo at HgII bruker en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er antatt transporteres tilfeldigvis i stoffer gjennom divalent metall transport veier (spesielt MnII eller ZnII) mekanismer for CdII transportere innsiden cellene forblir spekulative og ikke Cd-spesifikke transport veien har vært identifisert13,18. Uansett hva transportørene, tre mekanistisk faktorer til slutt bestemmer evne til metaller inn en celle: i) av metall artsdannelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaper av cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31og iii) muligheten for metall til en transport område7,32. CD og Hg er usannsynlig å finnes som ledig ioner under mikrobiell fysiologisk relevante forhold på grunn av deres høy affinitet for oppløst organisk saken (DOM), chelaterande forurensninger (f.eks EDTA) eller redusert svovel moieties33, 34,35 (CdII kan finnes som en gratis ion eller skjemaet ion-parene i fravær av disse ligander). Det er en mangel på effektiv metoder å avgjøre hvordan disse metall artene er bioavailable under forhold som er relevante for deres skjebne i miljøet. For eksempel Hg er denaturert under anaerobe forholdene14, og både kadmium og Hg er myke metaller (eller klasse B kasjoner), som krever at deres artsdannelse undersøkes under forhold som opprettholde integriteten til redusert svovel grupper.

Mikrobiell biosensors er bakterielle celler som avgir et kvantifiserbare signal svar intracellulær konsentrasjonen av metall, i dette tilfellet Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelt verktøy for å forstå hvordan metaller inn en celle36, forutsatt at eksponering forhold er nøye kontrollert. HG biosensors inneholder vanligvis genet fusjoner mellom regulatoriske krets av mer-operon (inkludert gener koding for transkripsjon regulator MerRas samt operatør og promoter regioner i operon) og rapportering gener (f.eks Lux, gfp, lac gener). Når kvikksølv i cytoplasma, vil det binde til MerR, noe som resulterer i transkripsjon av rapportering gener og påfølgende signal produksjon19,37. Bestemt Cd biosensors utformes vanligvis i cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transkripsjon regulatorer38, men det er verdt å merke seg at MerR har en lavere, men kvantifiserbare affinitet til Cd5. På grunn av aerobic begrensning av de fleste vanlig selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, inntil nylig mikrobiell biosensors forble ikke tilby innsikt i biotransformation av metaller under anoksisk forhold. Dette gjør anaerob påvisning av metaller biotilgjengelighet svært vanskelig over en rekke forhold gjelder for deres miljøskjebne, spesielt i nærvær av redoks følsom ligander (f.eks sulfide og thiols)4, 5 , 39.

For å avhjelpe de metodologiske hinderet å live bildebehandling i fravær av oksygen, Drepper et al. (2007) har utviklet en flavin-baserte fluorescerende protein (FbFp), basert på lys oksygen spenning domene SB2 protein fra P. putida. Denne protein familien er kjøpedyktig fluoresce i fravær av oksygen40. Bygge på arbeidet til Drepper et al., utviklet vår lab en anaerob biosensor muliggjør studiet av Hg biotilgjengelighet under oksisk og anoksisk og over et bredt spekter av saltholdighet 17. I dagens papir beskriver vi hvordan å forberede og bruke biosensor for å teste miljøvariabler innflytelse på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Selv om vi utviklet biosensor HgII, valgte vi å utføre eksperimenter med CdII å trekke leserens oppmerksomhet til det faktum at biosensors også kan svare til flere stressfaktorer som co opptrer i miljømessig matriser; i dette tilfellet CdII ble undersøkt fordi det er kjent for å binde til transcriptional regulator MerR5. Her viser vi representant kalibrering og funksjonelle lineær områder med hensyn til enten metall. Vi også gi et eksempel når den biosensor resultater er avgjørende (MgII og MnII på Hg biotilgjengelighet) og mangelfulle (ZnII på Hg biotilgjengelighet).

Protocol

1. vekst medier og eksponering Media forberedelse

  1. Foreta 250 mL vekstmediet:
    Merk: Hvis sporstoffer #1 løsning og sporstoffer #2 løsning er allerede forberedt, går du til trinn 1.1.5.
    1. Forberede sporstoffer #1 løsning i en ren volumetriske kolbe (200 mL) inneholder de siste molarities på 1,5 x 10-3 M Na2MoO4, 6.5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3og 0.1 M NaOH.
      Advarsel: Sterke baser (NaOH) er etsende. Kontroller at når veiing reagensene slik at den endelige molarity representerer spor nøkkelelementene; Mo, Se tillegg B.
    2. Under et sterilt felt, filter sterilisere bruker et 0.22 µm polyethersulfone sprøyte filter i en ren/steril plast/Polytetrafluoroethylene (PTFE) flaske.
    3. Forberede sporstoffer #2 løsning i en ren volumetriske kolbe (200 mL) inneholder de siste molarities 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3,25 x 10-3 M CoCl2, 6.25 x 10-3 M NiCl 2, og 0.1 M H2så4.
      FORSIKTIG: Sterke syrer (H2SO4) er etsende. Kontroller at når veiing reagensene slik at den endelige molarity representerer spor nøkkelelementene; MN, Zn, Co, og Ni.
    4. Under et sterilt felt, filter sterilisere bruker et 0.22 µm polyethersulfone sprøyte filter i en ren glassflaske.
    5. Under et sterilt felt i en ren/sterilt glassflaske (250 mL minimum); legge til 200 mL ultrapure vann, 42,5 mL M9 Minimal salter (5 x, se Tabellen for materiale), 2,5 mL av 2 M glukose, 125 µL av 2 M MgSO4, 1200 µL av 0.6 M Thiamin HCl fra en frossen (-20 grader) aliquot, 1,25 mL 4 M NaNO3 , 770 µL av 0.075 M L-leucine / L-isoleucin / Valin løsning, 250 µL sporstoffer #1, 250 µL av spor element #2og 250 µL av 0,01 M EDTA natrium salt.
      Merk: Alle reagenser i trinn 1.1.5 bør være forberedt før og filter sterilisert med filtere 0.22 µm polyethersulfone sprøyten. Ultrapure vann kan steriliseres ved hjelp av en autoklav.
    6. Ta glassflaske nå inneholder løsning fra trinn 1.1.5., løst cap det og det gjennom det anaerob kammer luft lås.
    7. Legg 15 µL 0.225 M FeSO4 i H 0,2 M2i det anaerob kammer, så4, cap flasken tett, og rist til alle hvite precipitates forsvinner.
      Merk: Alle reagenser i trinn 1.1.7 bør være forberedt før og filter sterilisert med filtere 0.22 µm polyethersulfone sprøyten. Lagre 0.225 M FeSO4 i H 0,2 M2så4 i det anaerob kammer.
    8. Fjern hetten fra flasken, vent 1 minutt for air å utveksle, erstatte cap fra flasken og deretter rist kraftig. Gjenta dette trinnet når.
    9. Sy hetten tett på flasken, fjerne fra anaerob kammerog lagre flasken i kjøleskapet (4 grader) til bruk.
    10. Vekstmediet skal gjenvinnes ukentlig ved å gjenta trinn 1.1.5 til 1.1.9.
  2. Å gjøre 100 mL eksponering medium i 2 x 50 mL konisk sterilt polypropylen sentrifuge rør:
    Merk: Vi anbefaler at eksponering medium være forberedt dagen eksponering analysen å minimere risikoen for forurensning, men det kan gjøres på forhånd og lagret i kjøleskapet.
    1. I det anaerob kammer, til hver 50 mL sentrifuge tube legge 42 mL anaerob ultrapure vann, 350 µL av 1 M natrium Beta-Gylcerophosphate fra en frossen (-20 grader) aliquot, 2 mL 1 M MOPPER gratis acid, 50 μL av 1 M (NH4)2så4 , 125 μL 2 M glukose og 300 μL 2.5 M KOH 200 μL av 2.5 M NaOH.
      Merk: Alle reagenser i trinn 1.2.1 bør være forberedt før og filter sterilisert med filtere 0.22 µm polyethersulfone sprøyten. Ultrapure vann kan være varme steriliseres med en autoklav. 2.5 M NaOH og 2,5 M NaOH må lagres i plast/PTFE flasker. Reagenser oppført må lagres i det anaerob kammer unntatt natrium Beta-Gylcerophosphate, som skal lagres i (-20 grader) fryser. Generelt, er det lurt å la all plast eller glass deler og beholdere i flere dager i det anaerobe kammeret slik at det fortsatt ingen spor av oksygen.
    2. Cap 50 mL sentrifuge rør, rist godt og fjerne en 10 mL aliquot for å måle pH. Målt pH i denne eksponering media må alltid måle 7.00 ± 0,02 på 25 grader. Hvis pH ikke måle innenfor dette området, kan du justere volumet av ekstra 2.5 M KOH korrigere dette.
      Merk: Aldri sjarmere løsningen å korrigere pH med en pH-sonde. pH-sonder er en kilde til forurensing for eksponering medium. PH må alltid være et produkt av ekstra reagenser i trinn 1.2.1.
  3. Forbered en 5-10 mM NaNO3 lagerløsning og la i anaerob kammer som skal brukes i løpet av eksponering analysen.
    Merk: Det er lettere å fortynne mer konsentrert NaNO3 standarder i motsetning til å gjøre en 5-10 mM NaNO3 standarder.

2. forberedelse av kvikksølv og kadmium standarder.

  1. Forberede en 4-8 µM Mercuric (HgII) løsning i H 0,2 M2SO4.
    1. Forberede en Hg2 + standard ved å lage en millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 eller HgSO4 løsning i 0,2 M H2SO4.
      FORSIKTIG: Kvikksølv er svært giftig og H2så4 er etsende. Operere i røyk hetter med alle nødvendige personlig verneutstyr.
    2. I en PTFE flaske, fortynne standarden fra 2.1.1. i H 0,2 M2SO4 for å oppnå en konsentrasjon innenfor området for 4-8 µM Hg2 +.
      Merk: Syre brukes må være analytisk klasse H2så4.
    3. Hg konsentrasjonen fra 2.1.2 skal valideres bruker en kvikksølv analyzer (se Tabell for materiale).
      Merk: Andre metoder for validering av Hg konsentrasjonen kan brukes.
  2. Forbereder en 10 µM CdII løsning i 10 mM H2SO4.
    1. Klargjør standarder av CdCl2 (10-50 mM utvalg for nøyaktig veiing av pulver) i H 0.1 M2SO4.
    2. I en rekke føljetong fortynninger i ren syre skylles 20 mL Borosilikatglass ampuller med svart fenoliske skrulokk med PTFE møtte gummi liners, fortynne standard fra 2.2.1 til 10 µM Cd2 +. Kontroller at konsentrasjonen av H2så4 i hver påfølgende føljetong fortynning fortsatt 10 mM.

3. forberedelse av Biosensor for anaerob eksponering analysen

  1. Plate kvikksølv induserbart biosensor (E. coli NEB5α skjuler PUC57merR-PpFbFp) og den constitutively uttrykt biosensor (E. coli NEB5α skjuler PUC19Balch-PpFbFp) fra-80 grader cryostock på Lysogeny suppen plater som inneholder 120 ug/mL ampicillin. Se vår tidligere publiserte arbeid for detaljer på produksjon av disse biosensors17.
  2. På 4:30-5 PM, vaksinere et kultur i 10 mL av LB (+ amp) og vokse over natten.
    Merk: Starter fra en plate det tar 2 dager å forberede den anaerob kulturen eksponering analysen (dvs. en kultur startet mandag ettermiddag (4:30-5 PM) blir klar for eksponering analysen på utpå formiddagen onsdag). Følgende trinn er nødvendige mikrobiologisk teknikker er nødvendig for å forberede kulturer ved eksponering analysen.
    1. Ta en koloni fra platen kulturen og legge til 10 mL Lysogeny kjøttkraft (LB) med 21 µL av en 100 mg/mL lagerløsning ampicillin natrium salt (siste konsentrasjon er 210 ug/mL amp) i et sterilt kultur rør.
    2. Plasser kulturen i en inkubator/shaker og vokse over natten på +37 grader med skjelvende på 220 rpm.
  3. Neste morgen kl 9-10, resuspend kultur og vokse anaerob hele dagen (20% inoculum).
    1. Bringe kulturen fra inkubator (trinn 3.2.1) og vekstmediet (trinn 1.1.9) i det anaerob kammer.
    2. Legge til 8 mL frisk oppblomstringen medium og ampicillin (210 μg/mL) i et sterilt Balch rør.
    3. Samle 2 mL overnatting vokst kultur og overføre til en 2 mL Microcentrifuge tube. Sentrifuge på 10.000 RCF trinn i 90 sekunder, dumpe nedbryting og resuspend i 2 mL av fersk oppblomstringen medium. Legge til resuspended kultur Balch røret som inneholder 8 mL frisk oppblomstringen medium og ampicillin.
    4. Bruker steril teknikk, forsiktig plassere en gummipropp på Balch tube. Fjerne fra det anaerob kammer og sted i en inkubator/shaker og vokse anaerob til 3-5 PM på +37 grader med skjelvende på 220 rpm.
  4. Mellom 3 og 5 PM, utføre en 1% anaerob inoculum i frisk oppblomstringen medium og vokse over natten.
    1. Ta Balch røret (trinn 3.3.4) i det anaerob kammer med vekst medium. Legge til 100 µL av kulturen i 10 mL av fersk oppblomstringen medium (1% inoculum) med amp (210 ug/mL amp) i et sterilt Balch rør.
    2. Bruker steril teknikk, forsiktig plassere en gummipropp på Balch tube. Fjerne fra det anaerob kammer, sett i en inkubator/shaker og vokse over natten på +37 grader med skjelvende på 220 rpm.
  5. Mellom 9 og 10 AM, resuspend kulturen å vokse anaerob hele dagen (20% inoculum).
    1. Bringe kulturen fra inkubator (trinn 3.4.1) og vekstmediet (trinn 1.1.9) i det anaerob kammer.
    2. Legge til 8 mL vekst medium og ampicillin (210 ug/mL amp) inn i et sterilt Balch rør.
    3. Samle 2 m over natten vokst kultur og overføre til en 2 mL Microcentrifuge tube. Sentrifuge 10.000 x g i 90 sekunder, dumpe nedbryting og resuspend i 2 mL av fersk oppblomstringen medium. Legge til resuspended kultur Balch røret som inneholder 8 mL frisk oppblomstringen medium og ampicillin.
    4. Bruker steril teknikk, forsiktig plassere en gummipropp på Balch tube. Fjerne fra kammeret og sted i en inkubator/shaker og vokse anaerob på +37 grader med skjelvende på 220 rpm.
  6. Overvåke veksten av kulturen med et spektrofotometer (trinn 3.5.4) til en OD600 på 0,6 er nådd. Husk å vortex kultur før hver OD lesing.
    Merk: Dette trinnet tar 3-4 timer, og eksponering medium (trinn 1.2) bør være forberedt denne gangen samt eksponering analysen (trinn 4.1).
  7. Stoppe veksten når kulturen når en OD600 på 0,6 (±0.1) (3-4 timer forventet vekst).
    1. Bringe røret i det anaerob kammer (trinn 3.6) og overføring kultur i 2 x 2 mL Microcentrifuge rør. Sentrifuge 10.000 x g i 90 sekunder, dumpe nedbryting og resuspend i 2 x 2 mL av fersk eksponering medium.
    2. Gjenta vask trinn 3.7.1. en gang for å fjerne alle spor av oppblomstringen medium.
  8. Kombinere begge microcentrifuge rør med cellekulturer (trinn 3.7) i 7 mL PTFE standard ampuller å få Biosensor lager i Eksponering analysen (trinn 4).
    Merk: Husk å blande Biosensor lager av grundig, men forsiktig pipettering frem og tilbake før bruk. Metoden kan pauses her opptil en time.

4. eksponering analysen

  1. Utforme en plate layout.
    Merk: Pass på å ha alle pipettering verdiene beregnes og aksjer forberedt før du starter det eksponering analysen. Hvordan til riktig design et eksperiment og hvilke kontroller med er beskrevet i teksten. I tillegg bør eksperimentet ikke startes hvis det er oksygen i det anaerobe kammeret angitt på den anaerob skjermen.
    1. Utforme platen etter en 96 godt mal. Hvis du vil kjøre eksperimenter i teknisk gjentak av 3, vil dette tillate 32 forskjellige behandlinger, som er best representert av en 4 x 8-rutenett til å definere ampuller (se figur 1).

Figure 1
Figur 1: en 96 godt plate (venstre) og et tilsvarende 4 x 8-rutenett inneholder PTFE ampuller (høyre) for å bli overført til plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Merk: Når testing for rollen som en variabel på Hg opptak med kvikksølv induserbart biosensor; to behandlinger er nødvendig for hver variabel: behandling (biosensor + Hg variabel ++ nitrat) og dens behandling tomt (biosensor + variabel + nitrat). Når testing for rollen som en variabel på fysiologi av cellen med grunnleggende biosensor, to behandlinger er nødvendig for hver variabel: behandling (biosensor + Hg variabel ++ nitrat) og behandling tom ( Biosensor + variabel + Hg). Kvikksølv kan erstattes med kadmium. HG eller Cd blir variabelen når du utfører en kalibreringskurven. Den grunnleggende og induserbart biosensors trenger ikke å kjøre samtidig (i oppsettet for samme plate). En mal eksempel oppsettet plate og tilsvarende 4 x 8-rutenett når du tester en konsentrasjon rekke magnesium (variabel) er gitt i tabell 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
en HG indusert biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg HG indusert biosensor, nitrat + 0 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + 0 mM Mg
b HG indusert biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg HG indusert biosensor, nitrat + 0,1 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + 0,1 mM Mg
c HG indusert biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg HG indusert biosensor, nitrat + 1 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + 1 mM Mg
d HG indusert biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg HG indusert biosensor, nitrat + 10 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg Grunnleggende biosensor + Hg + 10 mM Mg
e

Tabell 1: Et eksempel plate oppsett for å bruke biosensor for å teste Hg biotilgjengelighet (5 nM) over en forløpning magnesium (0-10 mM)

  1. Sette opp 4 x 8-rutenett i henhold til oppsettet for analysen plate.
    1. Sett 7 mL PTFE standarder i skuffen.
      Merk: PTFE ampuller skal acid vasket/varme sterilisert før bruk. Ampuller bør kun håndteres ved å manipulere utsiden av ampullen.
    2. Hvert hetteglass, legge til eksponering medium volum tilsvarer hver behandling.
      Merk: En eksponering med et totalt volum på 2000 µL (2 mL), ekstra eksponering medium være: eksponering medium µL = 2000 µL- behandling (tom) µL. (f.eks eksponering middels µL = 2000 – 100 µL (biosensor)-40 µL (nitrat)-100 µL (Hg )-100 µL (variabel (f.eks MgSO4)) = 1660 µL). Pass på at volumet til variabelen testet ikke overstiger 5% (100 µL) av det siste bindet.
    3. Hvert hetteglass, legge til det tilsvarende volumet av løsning av kjemiske variabelen skal testes i henhold til oppsettet plate.
    4. Fra trinn 1.3, legge til nitrat hvert hetteglass slik at siste konsentrasjonen er 200 µM (40-80 µL). Utelate dette trinnet for grunnleggende biosensor behandling tomme.
    5. Fra trinn 2.1 eller 2.2, legge Hg (5 nM ved testing for en variabel) eller Cd (300 nM ved testing for en variabel) til hetteglass etter oppsettet plate. Utelate dette trinnet for kvikksølv induserbart biosensor behandling tomme felt.
      1. Når du bruker Hg, ta 4-8 µM lager og rist godt. Fortynne løsningen i eksponering medium 7 mL PTFE ampuller til 100-250 nM å gjøre en fungerende Hg løsning. Fra denne fungerende løsning legge til Hg nødvendig hetteglass. I dette tilfellet en kalibreringskurven av Hg varierer fra 0 til 12,5 nM.
        Merk: Når du tester for en variabel effekt på Hg eller Cd biotilgjengelighet, at [Hg] eller [DVD] forblir konstant over alle behandlinger. Når du legger Hg eller Cd, må du bruke en pipette tips, men aldri ta eksponering mediet i hetteglass.
  2. Riste i en orbital bevegelse manuelt.
    Merk: Eksperimentet kan pauses nå avhengig kreves for Hg eller Cd til speciate i løsningen. Hvis mer enn en time, plassere PTFE caps på PTFE hetteglass å hindre fordampning/forurensning.
  3. Pipetter forsiktig Biosensor lager og tilbake for å sikre homogenitet. Legge til 100 µL Biosensor aksjer i hvert hetteglass. Rist orbitally manuelt.
  4. Forberede plate leseren å varme opp for å lese med følgende kriterier: temperaturen på 37˚C, kinetisk kjøre for 10 timer med leser hver 2,5-5 minutter med orbital skjelvende mellom leser og fluorescens målinger med en fluorescens magnetisering av 440 nm og en utslipp av 500 nm.
  5. Pipetter 200 µL fra hver PTFE ampuller i 4 x 8-rutenett i tilsvarende brønnene av 96 godt plate (svart, 96-brønns Clear-bunnen Nonbinding overflaten Microplates). Pipetter og tilbake 5 ganger før du overfører hver 200 µL.
    Merk: I stedet for forkaster pipette spissen, la pipette spissen i PTFE ampullen å holde oversikt over pipettering fremgang.
  6. Plasser 96 godt platen i skuffen for plate leseren, og sett lokket på 96 godt platen og starte analysen.

5. kvantifisering dataene

  1. Fluorescens hver behandling på hvert punkt må korrigert for hver individuelle godt støy og borte å det behandling tomt.
    1. Fluorescens for hvert tidspunkt (t) av hver behandling (T) må oversettes kontoen for den første fluorescensen (t0) for første gang punktet hver brønn, deretter gjennomsnitt over 3 behandlinger replikerer (r1- r3 ). Denne behandlingen gjennomsnitt må da være borte til gjennomsnittlig behandling tom (TB) oversatt på samme måte (formel 1).

Fluorescens (t) = gjennomsnittlig. (Tr1(t) - Tr1(t0), Tr2(t) – Tr2 (t0), Tr3(t) - Tr3(t0))- gjennomsnitt. (TB R1 (t) – TBr1(t0), TBr2(t)- TBr2( ) t0 ), TBr3(t) – TBr3(t0)) (1)

Merk: Dette bør gjøres som en regnearkfunksjon. Riktig overføring av feil skal også beregnes for hvert punkt.

  1. Grafen korrigert fluorescens hver behandling som en funksjon av tid

Figure 2
Figur 2: korrigert fluorescens data som en funksjon av tid. Fluorescens måles som relativ fluorescens enheter (RFU) slippes ut av E. coli NEB5α skjuler pUC57merR-Pp (induserbart belastning) over tid med tillegg av HgII (0-12,5 nM) under anaerob forhold. Fluorescens var gjennomsnittet av 3 teknisk replikerer på 37 grader. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Merk: Det er ingen 0 nM Hg verdi i diagrammet, og alle andre Hg konsentrasjoner har blitt borte på 0 nM Hg som behandling tomt. Derfor 0 nM Hg representerer x-aksen og noen positive fluorescens representerer fluorescens fra Hg gitt enhver variabel. Det er valgfritt å ikke fjerne fluorescens på denne måten, men fluorescerende kurvene vil gi misvisende fluorescens kurver hvis variabelen testet har bakgrunn fluorescens (dvs. oppløst organisk materiale selv vil fluoresce og hvis det er ingen behandling tomt som inneholder bare celler og oppløste organisk materiale, øke oppløst organisk materiale konsentrasjonen vil øke fluorescerende signalet).

  1. Kvantifisere fluorescens toppen. En kvantifiserbare fluorescens topp skjer vanligvis etter 2,5-4 timer, representerer energi brukt fra konsum av alle 200 µM nitrat som en terminal elektron acceptor. Denne toppen bør kvantifiseres og representerer endelige fluorescens verdien av den spesifikke behandlingen.
    Merk: I tilfelle ingen fluorescens peak er observert (dvs. ingen Hg biotilgjengelighet), fluorescens behandling på tidspunktet av fluorescens toppen av kontrollen (dvs. ingen lagt variabel eller 5nM Hg) bør være kvantifisert. Alternativt, hvis det er fluorescens induksjon i behandling, men fluorescens produserer ikke en veldefinert topp, det er sannsynlig forurensning av en høyere affinitet elektron acceptor som O2 og tiltak bør tas for å fjerne spor av oksygen fra alle løsninger og eksperimentet må utføres på nytt.

Representative Results

Når fluorescens toppene har vært kvantifisert etter trinn 5.3, kan resultatet av fluorescens toppene fremstilles grafisk ifølge variabel konsentrasjonen illustrerer hvordan variabelen påvirker relative biotilgjengeligheten av Hg eller Cd. For eksempel vil kalibreringskurven av fluorescens over [HgII] fra figur 2 gi induserbart dataene som vises i figur 3A. For HgII kalibrering kurven vil alltid inneholde 3 komponenter for Hg-induserbart belastningen; terskelen svar på ca 1-2 nM HgII før fluorescens signal produksjon er lineært proporsjonal med [HgII], lineær området der 5 nM HgII blir pålitelig alltid i midten av dette området, og et platå der økende [HgII] vil ikke øke fluorescens signal. Ingen endring i signal produksjon på konstituerende belastningen viser at toxicity fra [HgII] ikke påvirker signal produksjon. For CdII i figur 3Ber det alltid 2 komponenter for induserbart belastningen; en lineær området der 200-300 nM CdII pålitelig alltid vil være i sentrum av lineær området og et platå. En nedgang i fluorescens signal med økende [DVDII] viser at høyere Cd konsentrasjoner er giftig for cellene og kan forklare en nedgang i induserbart fluorescens produksjon etter platået på 1000 nM CdII. Derfor når testing Hg eller Cd biotilgjengelighet med hensyn til en miljømessig variabel, foreslår vi bruke 5 nM for HgII og 300 nM for CdII.

I noen tilfeller signal produksjon kan riktig tilskrives Hg eller Cd biotilgjengelighet, men i andre tilfeller signal produksjon kan påvirkes av variasjon i fysiologisk tilstand hos biosensor celle verten (f.eks metall rundt eller miljøforhold testet er giftig). I figur 4A, 5 nM Hg biotilgjengelighet ble testet over en gradient Zn (0-10 µM). Både Hg-induserbart og konstituerende stammer er det en tilsvarende reduksjon i signal med økende Zn konsentrasjoner. Derfor kan ikke en diskriminere signalet skyldes senket biotilgjengelighet eller er et resultat av Zn toksisitet. I figur 4B og 4 C, 5nM Hg biotilgjengelighet ble testet over en gradient MgII (0-10 mM) og MnII (0-10 µM). Økende MgII og MnII konsentrasjoner redusert fluorescens signalet fra induserbart belastningen. På den annen side, grunnleggende belastningen ikke viste en nedgang i fluorescens med økende MgII og MnII konsentrasjoner (MgII og MnII er gunstig for cellene i produksjon av FbFp, som demonstrert av en økning i fluorescens signalet). Dette viser at cellene levedyktig og fluorescens reduksjon av Hg-induserbart belastningen skyldes en nedgang i Hg biotilgjengelighet. Dataene understreker hvor viktig det er for alle biosensor analyser å også tilby grunnleggende målinger av cellen totalhelse.

Figure 3
Figur 3: lineær celleområder biosensor med kvikksølv og kadmium. Maksimal fluorescens måles som relativ fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvik slippes ut av E. coli NEB5α skjuler pUC57merR-Pp (Hg-induserbart) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tillegg av A) HgII (0-15 nM) og B) CdII (0-1000 nM) under anaerob forhold. Fluorescens var gjennomsnittet av 3 teknisk replikerer på 37 grader. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel på en usikker resultat med sink og en konkluderende resultat med Magnesium og mangan. Maksimal fluorescens måles som relativ fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvik slippes ut av E. coli NEB5α skjuler pUC57merR-Pp (Hg-induserbart) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tillegg av A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), og C) MnII (0-10 µM) under anaerob forhold. [HgII] ble satt til 5 nM for alle behandlinger og fluorescens var gjennomsnittet av 3 teknisk gjentak på 37 grader. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Mikrobiell biosensors er nyttige verktøy til å identifisere mekanismer som bruker metall mikrober. Her beskriver vi en metoden det anaerob kan kvantifisere HgII og CdII biotilgjengelighet Gram-negative verten celle (E. coli) og gi en målbare resultat i noen timer. En av de store styrkene til denne protokollen er at den tillater omfattende kontroll av metall artsdannelse i eksponering medium ved å unngå sterke bindende ligander eller komponenter som kan føre til metall nedbør. Metall artsdannelse er modellert og testet i denne eksponering mediet bruker PHREEQC17, men andre metall artsdannelse programvare kan distribueres. Hvis ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes å være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd artsdannelse skal presentere som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Bruker en enkel termodynamisk modellering programvare, kan brukeren design eksponering media og teste biotilgjengeligheten av metall rundt. I tillegg biosensor vert cellen (E. coli NEB5α) er levedyktig over et bredt spekter av pH (5 8.5) og NaCl konsentrasjon (0-0,55 M)17.

HG metylering er en anaerob prosess, og protokollen i denne studien har ikke et behov for oksygen, slik at mer presis beskrivelse av anaerob stoffskiftet på metall biotilgjengelighet. Dette er viktig fordi oksygeninnhold endrer genet uttrykket profiler48,49 , og dermed potensial transportere baner; Derfor presenterer denne metoden en fordel over gjeldende exising aerobic alternativer. Den biosensing konstruere presenteres her kan potensielt brukes med andre anaerob verter som er mer relevante for kvikksølv metylering (f.eks Geobacter, Desulfovibrio), men kanskje mindre tett enn E. coli. En gjeldende begrensning av tilnærming presenteres her er at våre grensen for påvisning ikke har ennå nådd pM nivåer, i motsetning til eksisterende aerobic systemer4,19,37. Det er imidlertid viktig å merke seg at for å oppnå disse lav oppdagelsen grensene flere tiltak må tas44: jeg) ligand tillegg er nødvendig for å sikre at Hg forblir i løsningen og ikke adsorberes på mikrobiell cellen veggen (Hg vil bli irreversible bundet til celle overflaten thiols hindrer sin biotilgjengelighet25,27; se terskelen svaret for Hg i figur 3A), ii) endringer celle tetthet eller iii) endre den genetiske konstruere å inkludere transport proteiner av mer-operon ( merT og merP), økende Hg fluks inni cellen50,51. Disse endringene vil være gunstig oppdage lave konsentrasjoner av Hg, men ikke nødvendigvis ideelt når vurdere miljøvennlige relevante situasjoner. Mens tidligere kadmium biosensors finnes hovedsakelig som en "proof of prinsippet", er de utformet i komplekse medier som ikke tillater etterforskeren å vurdere rollen artsdannelse på biotilgjengelighet41,42, 43 , 44.

Biosensor er en utrolig nyttig verktøyet å bestemme mekanismer som metall arter er bioavailable. Fordi verten organisme ikke er en Hg-methylator, kan det bare brukes til å utvikle en modell for hvordan Hg kan angi Gram-negative bakterier og ikke en definitiv begrunnelse for hvordan Hg-methylators skaffe Hg. Det finnes andre metoder for å bestemme Hg biotilgjengelighet, som metylering, som et resultat av opptak eller bruk av en masse balanse tilnærming10,15,20,45,46. Som blir sagt, tilbyr metoden presenteres her fordelen av kvasi sanntid biotilgjengelighet data i levedyktig celler. Vi anbefaler ikke at denne metoden brukes å kvantifisere totale Hg eller Cd nivåer i en miljømessig matrise. Til tross for den foreslåtte bruken av biosensors å bestemme metall konsentrasjonene i miljøet36, er mange lettere tilgjengelig standard metoder tilgjengelige som ICP-MS, FAAS (for Cd analyse) eller kald damp atomic absorpsjon spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan imidlertid brukes til å fastslå om en gitt miljømessige matrise har potensial til å forbedre eller hemme biotilgjengelighet; Dette oppnås ved å utføre standard filer.

PH i media eksponering kan endres til hvor som helst innen 5 og 8.5, forutsatt MOPPER gratis syre (buffer) utveksles med alternative gratis syre en buffer med den aktuelle pKa (se listen over aktuelle buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justert med KOH til riktig pH når media eksponering. I tillegg metoden er ikke begrenset til Hg og Cd, men kan bli utvidet til andre metaller med andre transkripsjon regulatorer.

Eksponering analysen kan endres for å utforske påvirkning av andre elektron acceptors som O2 og fumarate på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Mindre endringer til metoden å utnytte både O2 og fumarate som elektron acceptors er tilgjengelig på forespørsel.

Oppsummert ønsker vi å understreke følgende punkter: jeg) er det viktig at konsentrasjonen av Cd eller Hg aksjer er kjent i trinn 2, som dette vil bli brukt til å kalibrere biosensor. II) eksponering dag, veksten av celler må stoppes på et OD600 på 0,6 (± 0.1) og at omsorg tas når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibrert til denne cellen tetthet. III) endelig er det viktig at eksponering mediet er laget omhyggelig ved eksponering. For å sikre suksess for protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidig (å omgå muligheten for vekst svikt) og vekstmediet skal gjenvinnes ukentlig (for å omgå metastability av media og mulig smitte). Det bør også bemerkes at biologiske replikat (flere cellekulturer) express variasjon når det gjelder signal produksjon. Selv om fluorescerende svarene kan variere fra kultur til kultur, bør fluorescerende trender som svar på en gitt variabel forbli den samme gjennom mange biologiske gjentak.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke kommentarer fra to anonyme korrekturlesere som godt medlemmer av laboratoriet Poulain innsiktsfulle diskusjon på utviklingen av det anaerob biosensor. En tidlig forsker pris fra provinsen Ontario og Discovery stipend og en akselerator supplement fra naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada til A.J.P. finansiert denne studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

Miljøfag problemet 142 Biosensor kvikksølv kadmium anaerob biotilgjengelighet metall artsdannelse
En anaerob Biosensor analysen for påvisning av kvikksølv og kadmium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter