Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Anaerob Biosensor test för påvisande av kvicksilver och kadmium

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att använda en anaerob mikrobiell biosensor hela-cell för att utvärdera hur olika miljövariabler påverka biotillgängligheten av Hg och Cd för bakterier i syrefria miljöer.

Abstract

Kvicksilver (Hg) biotillgängligheten för mikrober är ett viktigt steg att giftiga Hg biomagnifiering i näringsvävar. Kadmium (Cd) transformationer och biotillgänglighet för bakterier styra hur mycket som kommer att ansamlas i basföda grödor. Biotillgängligheten av dessa metaller är beroende av deras artbildning i lösning, men särskilt under syrefria förhållanden där Hg är metylerad till giftiga monomethylmercury (MeHg) och Cd kvarstår i rhizosfären. Hela-cell mikrobiell biosensorer ge en mätbar signal när en metall in cytosolen och därför är användbara verktyg för att bedöma metall biotillgänglighet. Tyvärr, de flesta biosensing insatser har hittills varit begränsad till oxic miljöer på grund av den begränsade förmågan av befintliga reporter proteiner att fungera i frånvaro av syre. I denna studie presenterar vi vår strävan att utveckla och optimera en hela-cell biosensor assay kunna fungera anaerobt som kan upptäcka metaller under syrefria förhållanden i kvasi realtid och inom timmar. Vi beskriver hur biosensor kan hjälpa till att bedöma hur kemiska variabler som är relevanta till den miljömässiga cykling metaller påverkar deras biotillgänglighet. Följande protokoll innehåller metoder för att (1) förbereda Hg och CD-standarder under syrefria förhållanden, (2) förbereda biosensor i frånvaro av syre, (3) design och utföra ett experiment för att avgöra hur en rad variabel påverkar Hg eller Cd biotillgänglighet, och (4) att kvantifiera och tolka biosensor data. Vi visar de linjära spänner av biosensorer och ge exempel som visar metodens förmåga att skilja mellan metall biotillgänglighet och toxicitet genom att utnyttja både metall-inducerbara och konstituerande stammar.

Introduction

Kvicksilver (Hg) är en global förorening och dess biotillgänglighet att Hg methylating mikrober är det första steget mot dess biomagnifiering via näringsvävar och dess möjliga neurotoxiska effekter i människa och djur1. Det är för närvarande tänkt att mikrobiell Hg-metylering är en intracellulär process som kräver: i) arterna av Hg vara biotillgängliga2,3,4,5,6,7 och ii) för cellen att kunna fysiologiskt methylating Hg8,9,10. Kadmium (Cd) bioackumuleras i organismer, men gör inte biomagnifies i foodwebs och används ofta i industriella och kommersiella processer som ofta kan orsaka akuta exponeringar i människor och miljö11. Även om mikrober spelar flera viktiga roller i Hg öde i miljön, fokusera de flesta studier på Cd geokemi och ekotoxikologi på mikrobiell eukaryotes12. Konsumtionen av grödor (t.ex. ris) är den huvudsakliga källan till direkt exponering för kadmium; i det här fallet påverkar biotillgängligheten av Cd till mikrober av odlingsbädden direkt beloppet växter kan ackumulera13.

Hg transport vägar är komplexa och eventuellt innebära en aktiv transport steg14. När en transportör är inblandade, senaste arbete föreslog att HgII använder en ZnII eller MnII transportör7,15,16,17. Medan CdII är hypotesen för att transporteras av misstag in i cytosolen genom tvåvärda metall transport vägar (särskilt MnII eller ZnII), mekanismer för CdII transport inuti cellerna förblir spekulativa och inte Cd-specifika transport väg har varit identifierade13,18. Oavsett karaktären av transportörerna inblandade, tre mekanistiska faktorer i slutändan bestämma metaller förmåga att gå in i en cell: i) den metall artbildning i lösning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaper cellmembranet17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, och iii) möjligheten för metallen som åt en transport webbplats7,32. CD och Hg är osannolikt att existerar som fria joner mikrobiell fysiologiskt relevanta villkor på grund av deras hög affinitet för upplöst organiskt materia (DOM), kelaterande föroreningar (t.ex. EDTA), eller reducerade svavel beståndsdelarna33, 34,35 (CdII kan existera som en fri ion eller formuläret ion-par i avsaknad av dessa ligander). Det finns en brist på effektiva metoder för att fastställa hur dessa metall arter är biotillgängligt under förhållanden som är relevanta för deras öde i miljön. Exempelvis Hg är metylerad under anaeroba förhållanden14, och både kadmium och Hg är mjuka metaller (eller klass B katjoner), som kräver att deras artbildning utredas under förhållanden som upprätthåller integriteten för reducerade svavel grupper.

Mikrobiell biosensorer är bakterieceller som avger en mätbar signal som svar på de intracellulära koncentrationerna av en metall, i detta fall Hg eller Cd. Som sådan, är de perfekt verktyg för att förstå hur metaller in en cell36, förutsatt att exponeringsförhållanden kontrolleras noga för. Hg biosensorer innehåller vanligtvis genfusioner mellan reglerande kretsen av den mer-operon (inklusive gener som kodar för transkription regulatorn MerRas samt operatören och arrangören regioner av operon) och rapportering gener (t.ex. Lux, gfp, lac gener). När kvicksilver finns i cytoplasman, kommer det att binda till MerR, vilket resulterar i transkription av rapportering gener och efterföljande signal produktion19,37. Särskilda CD-biosensorer är oftast utformade med de cadC, cadAC, zntA eller zntR kodade transkription regulatorer38, men det är värt att notera att MerR har lägre, men mätbar affinitet till Cd5. På grund av aerob begränsning av mest vanligaste självlysande eller fluorescerande reporter proteiner, tills nyligen mikrobiell biosensorer återstod inte erbjuda insikter i metabolismen av metaller under syrefria förhållanden. Detta gör anaerob detektion av metaller biotillgänglighet mycket svårt över en rad förhållanden relevanta för deras vidare öde i miljön, särskilt i närvaro av redox känsliga ligander (t.ex. svavelväte och tioler)4, 5 , 39.

För att lindra det metodologiska hindret av live imaging i frånvaro av syre, Drepper et al. (2007) har utvecklat en flavin-baserade fluorescerande protein (FbFp), baserat på ljus syre spänning domän SB2 protein från P. putida. Detta protein familj är kunna fluorescerar i avsaknad av syre40. Vårt labb bygger på arbete av Drepper et al., och utformat en anaerob biosensor som möjliggör studier av Hg biotillgänglighet under genotoxisk och anoxiska förhållanden och över ett brett spektrum av salthalt 17. I den nuvarande papperet beskriver vi hur du bereder och använder biosensor för att testa miljövariabler inflytande på Hg eller Cd biotillgänglighet. Även om vi utvecklat biosensor för HgII, valde vi att utföra experiment med CdII som ett sätt att dra läsarens uppmärksamhet till det faktum att biosensorer kan också reagera på flera stressfaktorer som sannolikt kan Co-uppstå i miljö matriser; i detta fall CdII undersöktes eftersom det är känt att binda till transkriptionell regulatorn MerR5. Här visar vi representativa kalibrering och funktionella linjära spänner med avseende på antingen metall. Vi ger ett exempel när den biosensor resultaten är avgörande (MgII och MnII på Hg biotillgänglighet) och ofullständiga (ZnII på Hg biotillgänglighet).

Protocol

1. tillväxt medier och exponering Media förberedelse

  1. Att göra 250 mL odlingsmedium:
    Obs: Om spårämnen #1 lösning och spårämnen #2 lösning är redan förberett, hoppa till steg 1.1.5.
    1. Förbereda spårämnen #1 lösning i en ren mätkolv (200 mL) innehåller de slutliga molarities av 1,5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3och 0,1 M NaOH.
      Varning: Starka baser (NaOH) är frätande. Göra säker när väger reagenserna att säkerställa att den slutliga molariteten representerar de viktiga spårämnena. Mo, Se och B.
    2. Under ett sterilt fält sterilisera filter med 0,22 µm polyetersulfon spruta filter i en ren/sterila plast/polytetrafluoreten (PTFE) flaska.
    3. Förbereda spårämnen #2 lösning i en ren mätkolv (200 mL) innehåller de slutliga molarities av 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2, och 0,1 M H2så4.
      Varning: Starka syror (H2SO4) är frätande. Göra säker när väger reagenserna att säkerställa att den slutliga molariteten representerar de viktiga spårämnena. MN, Zn, Co, och Ni.
    4. Under ett sterilt fält sterilisera filter med 0,22 µm polyetersulfon spruta filter i en ren glasflaska.
    5. Under ett sterilt fält, i en ren/steril glasflaska (250 mL minimum); Tillsätt 200 mL ultrarent vatten, 42,5 mL M9 Minimal salter (5 x, se Tabell för material), 2,5 mL 2 M glukos, 125 µL av 2 M MgSO4, 1200 µL av 0,6 M tiamin HCl från en frysta (-20 ˚C) alikvot, 1,25 mL av 4 M NaNO3 , 770 µL av 0,075 M L-leucin / L-isoleucin / valin lösning, 250 µL spårämnen #1, 250 µL av spårämnet #2och 250 µL 0,01 M EDTA natrium salt.
      Obs: Alla reagenser i steg 1.1.5 bör förberedas före och filter steriliserad med ett 0,22 µm polyetersulfon spruta filter. Ultrarent vatten kan steriliseras med hjälp av en autoklav.
    6. Ta glasflaska nu innehållande lösning från steg 1.1.5., löst råga och igenom det den anaeroba kammare air-lock.
    7. Lägg till 15 µL av 0,225 M FeSO4 0,2 M H2i anaerob kammare, så4, cap flaskan ordentligt och skaka tills alla vita fällningar försvinner.
      Obs: Alla reagenser i steg 1.1.7 bör förberedas före och filter steriliserad med ett 0,22 µm polyetersulfon spruta filter. Lagra den 0,225 M FeSO4 0,2 M H2så4 i anaerob kammare.
    8. Ta bort locket från flaskan, vänta 1 minut för luft att utbyta, sätt tillbaka locket från flaskan och skaka kraftigt. Upprepa detta en gång.
    9. Skruva fast locket ordentligt på flaskan, bort från anaerob kammareoch Förvara flaskan i kylskåp (4 ° c) fram till användning.
    10. Odlingsmedium bör göras om en gång i veckan genom att upprepa steg 1.1.5 till 1.1.9.
  2. Att göra 100 mL exponering medium i 2 x 50 mL koniska sterilt polypropylen centrifugrör:
    Obs: Vi rekommenderar att exponering medium förberedas dagen exponering assay att minimera risken för kontaminering, men det kan göras i förväg och förvaras i kylskåp.
    1. I anaerob kammare, för varje 50 mL centrifugrör tillsätt 42 mL anaerob ultrarent vatten, 350 µL av 1 M natrium Beta-Gylcerophosphate från en alikvot som frysta (-20 ° c), 2 mL 1 m moppar fri syra, 50 μl av 1 M (NH4)2så4 , 125 μL av 2 M glukos, 300 μL av 2,5 M KOH och 200 μL av 2,5 M NaOH.
      Obs: Alla reagenser i steg 1.2.1 bör förberedas före och filter steriliserad med ett 0,22 µm polyetersulfon spruta filter. Ultrarent vatten kan vara värme steriliserad med en autoklav. 2,5 M NaOH och 2,5 M NaOH måste lagras i plast/PTFE flaskor. Alla reagenser som anges måste vara lagrad i anaerob kammare utom natrium Beta-Gylcerophosphate, som ska förvaras i frys (-20 ° c). I allmänhet är det god praxis att lämna alla plast eller glas delar och behållare för flera dagar i anaerob kammaren att se till att inga spår av syre.
    2. Mössa i 50 mL centrifugrör, skaka väl och ta bort en 10 mL alikvot för att mäta pH-värdet. Uppmätta pH-värdet i denna exponering media måste alltid mäta 7.00 ± 0,02 vid 25 ˚C. Om pH-värdet inte mäter inom detta spänner, justera volymen av extra 2,5 M KOH att rätta till detta.
      Obs: Aldrig titrera lösningen att rätta till pH med en pH-givare. pH sonder utgör en källa till kontaminering för exponering medium. PH-värdet måste alltid vara en produkt av extra reagenserna i steg 1.2.1.
  3. Bered en 5-10 mM NaNO3 lager och lämna i anaerob kammare skall användas under tid exponering assay.
    Obs: Det är lättare att späda ut en mer koncentrerad primära NaNO3 standard i stället för att göra en 5-10 mM NaNO3 primära standard.

2. beredning av kvicksilver och kadmium standarder.

  1. Förbereda en 4-8 µM kvicksilver (HgII) lösning 0,2 M H2SO4.
    1. Förbereda en Hg2 + standard genom att göra en millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 eller HgSO4 lösning i 0,2 M H2SO4.
      FÖRSIKTIGHET: Kvicksilver är mycket giftigt och H2så4 är frätande. Arbeta i dragskåp med all erforderlig personlig skyddsutrustning.
    2. I en PTFE-flaska, späd standard från 2.1.1. till 0,2 M H2SO4 för att få en koncentration inom spänna av 4-8 µM Hg2 +.
      Obs: Den syra som används måste vara analyskvalitet H2så4.
    3. Hg koncentration från 2.1.2 bör valideras med en mercury analyzer (se Tabell för material).
      Obs: Andra metoder för att validera Hg koncentrationen kan användas.
  2. Förbereda en 10 µM CdII lösning i 10 mM H2SO4.
    1. Förbereda en primär standard CdCl2 (10-50 mM intervall för noggrann vägning av pulver) i 0,1 M H2SO4.
    2. I en serie av seriella utspädningar i ren syra sköljda 20 mL borosilikatglas injektionsflaskor med svart fenoliska skruvkapsyler med PTFE inför gummi liners, späd standard från 2.2.1 till 10 µM Cd2 +. Se till att koncentrationen av H2så4 i varje efterföljande seriell utspädning förblir 10 mM.

3. beredning av Biosensor för anaerob exponering Assay

  1. Tallrik av kvicksilver inducerbara biosensor (E. coli NEB5α hysande PUC57merR-PpFbFp) och det konstitutivt uttryckta biosensor (E. coli NEB5α hysande PUC19Balch-PpFbFp) från-80 ˚C cryostock på Lysogeny buljong plattor som innehåller 120 ug/mL ampicillin. Se våra tidigare publicerade arbete för detaljer om produktionen av dessa biosensorer17.
  2. På 4:30-5 PM, Inokulera en kultur i 10 mL LB (+ amp) och växa över natten.
    Obs: Start från en platta det tar 2 dagar att förbereda den anaeroba kulturen för exponering assay (dvs. en kultur började måndag eftermiddag (4:30-17: 00) kommer att vara redo för exponering assay vid tolvtiden på onsdag). Följande steg är de krävda mikrobiologiska metoder behövs för att förbereda kulturerna dag exponering assay.
    1. Ta en koloni från plattan kulturen och lägga till 10 mL Lysogeny buljong (LB) med 21 µL av en 100 mg/mL stamlösning av ampicillin natriumsalt (slutlig koncentration är 210 ug/mL amp) i en steril kultur tub.
    2. Placera kulturen i en inkubator/shaker och växa över natten vid + 37 ˚C med skakningar vid 220 rpm.
  3. Nästa morgon klockan 9-10, Omsuspendera kulturen och växer anaerobt hela dagen (20% inokulum).
    1. Föra in kulturen från inkubatorn (steg 3.2.1) och odlingsmedium (steg 1.1.9) i anaerob kammare.
    2. Tillsätt 8 mL färsk odlingsmedium och ampicillin (210 μg/mL) i ett sterilt rör Balch.
    3. Samla 2 mL av övernattning odlade kultur och överföring till en 2 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera vid 10.000 RCF steg i 90 sekunder, dumpa supernatanten och återsuspendera i 2 mL färsk odlingsmedium. Tillsätt den återsuspenderade kulturen till Balch röret som innehåller 8 mL färsk odlingsmedium och ampicillin.
    4. Med steril teknik, Placera försiktigt en gummipropp på Balch röret. Bort från anaerob kammare och placera i en inkubator/shaker och växer anaerobt fram till 3-5 PM på + 37 ° c med skakningar vid 220 rpm.
  4. Mellan 3 och 5 PM, utföra en 1% anaerob inokulum till färska odlingsmedium och växa över natten.
    1. Ta Balch röret (steg 3.3.4) in i anaerob kammare tillsammans med odlingsmedium. Tillsätt 100 µL av kultur 10 ml av färska odlingsmedium (1% inokulum) med amp (210 ug/mL amp) i ett sterilt rör Balch.
    2. Med steril teknik, Placera försiktigt en gummipropp på Balch röret. Bort från anaerob kammare, placera i en inkubator/shaker och växa över natten vid + 37 ˚C med skakningar vid 220 rpm.
  5. Mellan 9 och 10, resuspendera kulturen att växa anaerobt hela dagen (20% inokulum).
    1. Föra in kulturen från inkubatorn (steg 3.4.1) och odlingsmedium (steg 1.1.9) i anaerob kammare.
    2. Tillsätt 8 mL odlingsmedium och ampicillin (210 ug/mL amp) i ett sterilt rör Balch.
    3. Samla ihop 2 m av övernattning odlade kultur och överföring till en 2 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera 10 000 x g i 90 sekunder, dumpa supernatanten och återsuspendera i 2 mL färsk odlingsmedium. Tillsätt den återsuspenderade kulturen till Balch röret som innehåller 8 mL färsk odlingsmedium och ampicillin.
    4. Med steril teknik, Placera försiktigt en gummipropp på Balch röret. Ta bort från kammaren och placera i en inkubator/shaker och växer anaerobt vid + 37 ˚C med skakningar vid 220 rpm.
  6. Övervaka tillväxten av kulturen med en spektrofotometer (steg 3.5.4) tills en OD600 av 0,6 nås. Tänk att vortex kultur före varje OD läsning.
    Obs: Detta steg tar 3-4 timmar, och exponering medium (steg 1.2) bör förberedas under denna tid samt exponering assay (steg 4.1).
  7. Stoppa tillväxten när kulturen når en OD600 av 0,6 (±0, 1) (3-4 timmar förväntad tillväxt).
    1. Föra in röret i anaerob kammare (steg 3.6) och överföring kultur i 2 x 2 mL mikrocentrifugrör. Centrifugera 10 000 x g i 90 sekunder, dumpa supernatanten och återsuspendera i 2 x 2 mL färsk exponering medium.
    2. Tvätt upprepa 3.7.1. en gång för att ta bort alla spår av odlingsmedium.
  8. Kombinera båda mikrocentrifugrör i cellkultur (steg 3,7) till en injektionsflaska som standard 7 mL PTFE att erhålla Biosensor lager användas i Exponering Assay (steg 4).
    Obs: Tänk på att blanda Biosensor lager genom grundligt men skonsamt pipettering och tillbaka före användning. Metoden kan pausas här för upp till en timme.

4. exponering Assay

  1. Utforma en tallrik layout.
    Obs: Var noga med att ha alla pipettering värden som beräknas och bestånd beredd före start den exponering assay. Hur att korrekt utforma ett experiment och vilka kontroller för att inkludera är detaljerad i texten. Dessutom är det inte säkert att experimentet ska startas om det finns syre i anaerob kammaren anges på anaerob bildskärmen.
    1. Utforma layouten plattan enligt en 96 väl mall. För att köra experiment i tekniska replikat av 3, kommer att detta möjliggöra 32 olika behandlingar, som bäst representeras av ett 4 x 8 rutnät att inrätta injektionsflaskor (se figur 1).

Figure 1
Figur 1: en 96 väl plåt (vänster) och ett motsvarande 4 x 8 rutnät som innehåller PTFE injektionsflaskor (höger) för att överföras till plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Obs: När testning för rollen som en variabel på Hg upptag med kvicksilver inducerbara biosensor; två behandlingar krävs för varje variabel: behandling (biosensor + Hg + variabel + nitrat) och dess behandling tomt (biosensor + variabel + nitrat). När testning för rollen som en variabel på fysiologi cellen använder den konstituerande biosensor, två behandlingar krävs för varje variabel: behandling (biosensor + Hg + variabel + nitrat) och Tom () behandling biosensor + variabel + Hg). Kvicksilver kan ersättas med kadmium. Hg eller Cd blir variabeln när du utför en kalibreringskurva. Den konstitutiva och inducerbara biosensorer behöver inte köras samtidigt (i samma skylt layout). En mall exempel för plattan layout och motsvarande 4 x 8 rutnät när du testar ett koncentrationsintervall av magnesium (variabel) ges i tabell 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
en Hg inducerad biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg Hg inducerad biosensor + nitrat + 0 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + 0 mM Mg
b Hg inducerad biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg Hg inducerad biosensor + nitrat + 0,1 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + 0,1 mM Mg
c Hg inducerad biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg Hg inducerad biosensor + nitrat + 1 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + 1 mM Mg
d Hg inducerad biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg Hg inducerad biosensor + nitrat + 10 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg Konstituerande biosensor + Hg + 10 mM Mg
e

Tabell 1: Ett exempel plattan layout för att använda biosensor för att testa Hg biotillgänglighet (5 nM) över en gradient av Magnesium (0-10 mM)

  1. Ställa in rutnätet 4 x 8 enligt assay plattan layouten.
    1. Plats 7 mL PTFE standard injektionsflaskor i facket.
      Obs: PTFE injektionsflaskor ska vara sura tvättas/värme steriliseras före användning. Injektionsflaskor ska endast hanteras genom att manipulera utsidan av injektionsflaskan.
    2. Till varje injektionsflaska, tillsätt exponering medium volym motsvarar varje behandling.
      Obs: En exponering med en total volym på 2 000 µL (2 mL), kommer det extra exponering medium att: exponering medium µL = 2 000 µL – behandling (tomt) µL. (t.ex. exponering medium µL = 2,000 – 100 µL (biosensor) – 40 µL (nitrat) – 100 µL (Hg ) – 100 µL (variabel (t.ex. MgSO4)) = 1660 µL). Tänk på att volymen av testade variabeln inte överstiger 5% (100 µL) av den slutliga volymen.
    3. Varje injektionsflaska, lägga till motsvarande volym av lösningen av kemiska variabeln ska provas enligt layouten plattan.
    4. Från steg 1.3, lägga till nitrat till varje injektionsflaska så att slutliga koncentration är 200 µM (40-80 µL). Utesluta detta steg på konstituerande biosensor behandling plantsar.
    5. Från steg 2.1 eller 2.2, lägga till Hg (5 nM vid prövning av en variabel) eller Cd (300 nM vid prövning av en variabel) till rören enligt layouten plattan. Utesluta detta steg för kvicksilver inducerbara biosensor behandling blankvärden.
      1. När du använder Hg, ta 4-8 µM beståndet och skaka väl. Späd lösningen i exponering medium i en 7 mL PTFE flaskan 100-250 nM till göra en fungerande Hg lösning. Lägga till Hg krävs skålarna från denna fungerande lösning. I detta fall en kalibreringskurva Hg sträcker sig från 0 till 12,5 nM.
        Obs: När testning för en variabel effekt på Hg eller Cd biotillgänglighet, kontrollera att den [Hg] eller [Cd] förblir konstant över alla behandlingar. När du lägger Hg eller Cd, bör du använda en pipettspetsen men aldrig röra det exponering mediet i skålarna.
  2. Skaka i en orbital rörelse manuellt.
    Obs: Experimentet kan pausas nu beroende på den tid som krävs för Hg eller Cd till speciate i lösning. Om den lämnas för mer än en timme, placera PTFE caps på PTFE injektionsflaskorna att förhindra avdunstning eller kontaminering.
  3. Pipettera försiktigt Biosensor lager fram och tillbaka för att säkerställa homogenitet. Tillsätt 100 µL Biosensor lager i varje injektionsflaska. Skaka orbitally manuellt.
  4. Förbereda plattan läsaren att värma upp för att läsa med följande kriterier: temperatur vid 37˚C, kinetic kör för 10 timmar med läser varje 2.5-5 minuter med orbital skakar däremellan läser och fluorescens mätningar med en fluorescens excitation av 440 nm och en utsläpp av 500 nm.
  5. Pipettera 200 µL från varje PTFE injektionsflaskor i rutnätet 4 x 8 i motsvarande brunnar av 96 väl plattan (svart, 96 brunnar Clear-botten icke Surface mikroplattor). Överför med pipett och tillbaka 5 gånger innan du överför varje 200 µL.
    Obs: Istället för att kasta pipettspetsen, lämna pipettspetsen i PTFE injektionsflaskan att hålla reda på pipettering framsteg.
  6. Placera 96 väl plattan i facket på plattan läsaren, sedan placera locket på 96 väl plattan och påbörja analysen.

5. kvantifiera Data

  1. Fluorescensen varje behandling vid varje tidpunkt måste korrigeras för varje enskild väl buller och raderas till den behandling tom.
    1. Fluorescensen för varje tidpunkt (t) för varje behandling (T) måste översättas till kontot för den inledande fluorescensen (t0) för första gången punkt i varje brunn, då i genomsnitt över de 3 behandlingar replikerar (r1- r3 ). Denna behandling genomsnittliga måste då vara raderas den genomsnittliga behandling tomt (TB) översatt på samma sätt (ekvation 1).

Fluorescens (t) = genomsnittliga(Tr1()t) – Tr1()t0), Tr2()t) – Tr2 ()t0), Tr3()t) – Tr3()t0)) – genomsnittliga(TB R1 ()t) – TBr1()t0), TBr2()t)– TBr2( ) t0 ), TBr3()t) – TBr3()t0)) (1)

Obs: Detta bör göras som en kalkylbladsfunktion. Ordentlig spridning av fel bör också beräknas för varje tidpunkt.

  1. Graf den korrigerade fluorescensen varje behandling som en funktion av tiden

Figure 2
Figur 2: korrigerat fluorescens data som en funktion av tiden. Fluorescens mätt som relativa fluorescens enheter (RFU) som avges av E. coli NEB5α hysande pUC57merR-Pp (inducerbara stam) över tiden med tillägg av HgII (0-12,5 nM) under anaeroba förhållanden. Fluorescens var medelvärdet av 3 tekniska replikerar vid 37 ˚C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Obs: Det finns ingen 0 nM Hg värde på grafen, och alla andra Hg koncentrationer har försvunnit till 0 nM Hg som behandling tomt. Därför 0 nM Hg representerar x-axeln och eventuella positiva fluorescens representerar fluorescens från Hg ges någon variabel. Det är frivilligt att inte tomma fluorescensen på detta sätt, men den fluorescerande kurvor ger vilseledande fluorescens kurvor om variabeln testade har bakgrunden fluorescens (dvs upplöst organiskt material själv kommer fluorescerar och om det finns ingen behandling tomt som innehåller bara celler och upplöst organiskt material, ökande upplöst organiskt material koncentration kommer att öka fluorescerande signalen).

  1. Kvantifiera fluorescens-toppen. En kvantifierbar fluorescens topp sker vanligtvis efter 2,5-4 timmar, vilket motsvarar den energi som förbrukas från konsumtion av alla 200 µM nitrat som en terminal Elektronacceptor. Denna topp bör kvantifieras och representerar slutliga fluorescens värdet av att specifika behandling.
    Obs: I händelse observeras ingen fluorescens topp (dvs ingen Hg biotillgänglighet), fluorescensen av behandling vid tidpunkten på kontroll-topp fluorescens (dvs ingen extra variabel eller 5nM Hg) bör kvantifieras. Alternativt, om det finns fluorescens induktion vid behandling, men fluorescens producerar inte en väl definierad topp, finns det sannolikt kontaminering av en högre affinitet Elektronacceptor såsom O2 och åtgärder bör vidtas för att avlägsna spår av syre från alla lösningar och experiment måste utföras igen.

Representative Results

När fluorescens topparna har beräknats enligt steg 5.3, resultatet av fluorescens topparna kan visas i diagram enligt variabel koncentrationen som illustrerar hur variabeln påverkar den relativa biotillgängligheten av antingen Hg eller Cd. Till exempel kommer att kalibreringskurvan av fluorescens över [HgII] från figur 2 ge den inducerbara uppgifter som presenteras i figur 3A. För HgII kalibrering, kurvan kommer alltid innehålla 3 komponenter för Hg-inducerbara stammen; ett tröskelvärde svar på cirka 1-2 nM HgII innan fluorescens signal produktionen är linjärt proportionell till [HgII], det linjära området där 5 nM HgII tillförlitligt alltid kommer i mitten av intervallet och en platå där ökar [HgII] ökar inte längre fluorescensen signal. Ingen förändring i signal produktion på den konstituerande stammen visar att toxicitet från [HgII] inte påverkar signalen produktion. För CdII i figur 3Bfinns det alltid 2 komponenter för den inducerbara stammen; ett linjärt intervall där 200-300 nM CdII tillförlitligt alltid kommer i mitten av det linjära området och en platå. En minskning av fluorescens signal med ökande [CdII] visar att högre Cd koncentrationer är giftiga för cellerna och kan förklara en inducerbara fluorescens produktionsminskningen efter platån vid 1000 nM CdII. Därför, när du testar Hg eller Cd biotillgänglighet med avseende på en miljö variabel, vi föreslår att du använder 5 nM för HgII och 300 nM för CdII.

I vissa fall signalen produktion ordentligt kan hänföras till Hg eller Cd biotillgänglighet, men i andra fall signalen produktion kan påverkas av variationer i det fysiologiska tillståndet av biosensor cell värden (t.ex. metall av intresse eller miljöförhållanden som testats är giftiga). I figur 4A, 5 nM Hg biotillgänglighet testades under en gradient av Zn (0-10 µM). I både Hg-inducerbara och konstituerande stammar finns det en liknande minskning signal med ökande Zn koncentrationer. Därför kan inte en diskriminera oavsett om signalen resultat från sänkt biotillgänglighet eller är ett resultat av Zn toxicitet. I figur 4B och 4 C, 5nM Hg biotillgänglighet testades under en gradient av MgII (0-10 mM) och MnII (0-10 µM). Ökande MgII och MnII koncentrationer minskade fluorescens signalen inducerbara stam. Däremot, den konstituerande stammen inte visade en minskning av fluorescens med ökande MgII och MnII koncentrationer (MgII och MnII är fördelaktigt för cellerna i produktionen av FbFp, vilket framgår av en ökning i fluorescens-signalen). Detta visar att cellerna är livskraftig och fluorescens minskningen av Hg-inducerbara stammen resultat från en minskning av Hg biotillgänglighet. Data betonar hur viktigt det är för alla biosensor analyser att också ge konstituerande mätningar av cell kondition.

Figure 3
Figur 3: linjära spänner av biosensor med kvicksilver och kadmium. Maximala fluorescens mätt som relativa fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvikelse som avges av E. coli NEB5α hysande pUC57merR-Pp (Hg-inducerbara) och pUC19Balch-Pp (DISTINCT) med tillägg av (A) HgII (0-15 nM) och B) CdII (0-1000 nM) under anaeroba förhållanden. Fluorescens var medelvärdet av 3 tekniska replikerar vid 37 ˚C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: exempel på ett osäkert resultat med zink och ett avgörande resultat med Magnesium och mangan. Maximala fluorescens mätt som relativa fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvikelse som avges av E. coli NEB5α hysande pUC57merR-Pp (Hg-inducerbara) och pUC19Balch-Pp (DISTINCT) med tillägg av (A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), och C) MnII (0-10 µM) under anaeroba förhållanden. [HgII] fastställdes till 5 nM för alla behandlingar och fluorescens var medelvärdet av 3 tekniska replikat vid 37 ˚C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Mikrobiell biosensorer är användbara verktyg för att identifiera mekanismer genom vilka metaller interagerar med mikrober. Här, vi beskriver en metod som anaerobt kan kvantifiera HgII och CdII biotillgängligheten till en gramnegativa värdcellen (E. coli) och ge ett kvantifierbara resultat inom några timmar. En av de stora styrkorna i detta protokoll är att det tillåter omfattande kontroll av metall artbildning exponering medium genom att undvika starka bindning ligander eller komponenter som kan leda till metall nederbörd. Metall artbildning har modelleras och testats i detta exponering medium använder PHREEQC17, men andra metall artbildning programvara får användas. När det gäller inga extra ligander, Hg artbildning förväntas vara närvarande som 97% Hg(OH)2 och 3% Hg (NH3)22 +, medan Cd artbildning kommer att presentera som 59% Cd-β-glycerofosfat, 25% Cd2 +och 16% CdSO4. Använder en enkel termodynamisk modellering programvara, kan användaren utforma exponering media och testa för biotillgängligheten av metall av intresse. Biosensor värdcellen (E. coli NEB5α) är dessutom livskraftig över ett brett spektrum av pH (5-8,5) och NaCl koncentration (0-0,55 M)17.

Hg-metylering är en anaerob process, och det protokoll som beskrivs i denna studie har inte ett krav för syre, vilket möjliggör mer exakt beskrivning av anaerob metabolism på metall biotillgänglighet. Detta är viktigt eftersom närvaro av syre förändrar gen uttryck profiler48,49 och därmed potential transportera utbildningsvägar. metoden utgör därför en fördel över för närvarande befintliga aerob alternativ. Den biosensing bygga presenteras här kan potentiellt användas med andra anaeroba värdar som kan vara mer relevant för kvicksilver metylering (t.ex. Geobacter, Desulfovibrio), men kanske mindre eftertraktansvärda än E. coli. En nuvarande begränsning av den strategi som presenteras här är att våra detektionsgräns inte har ännu nått pM nivåer, strider mot befintliga aeroba system4,19,37. Det är emellertid viktigt att notera att för att uppnå dessa låga detektionsgränser flera steg behöver tas44: jag) ligand tillägg krävs för att säkerställa att Hg förblir i lösning och inte adsorberas på mikrobiell cell väggen (Hg blir oåterkallelig gräns till cell surface tioler förhindra dess biotillgänglighet25,27. Se tröskel svaret för Hg i figur 3A), ii) ändringar av cell densiteten, eller iii) ändra den genetiska konstruktionen att omfatta transportproteiner av den mer-operon (nämligen merT och merP), ökande Hg flux inuti cellen50,51. Dessa ändringar skulle vara fördelaktigt att upptäcka låga koncentrationer av Hg, men inte nödvändigtvis perfekt vid bedömningen av miljömässigt relevanta situationer. Medan tidigare kadmium biosensorer finns primärt som en ”proof of principen”, utformats de i komplexa media som inte tillåter utredaren att bedöma rollen av artbildning på biotillgängligheten41,42, 43 , 44.

Biosensor är ett otroligt användbart verktyg för att fastställa mekanismer som metall arter är biotillgängliga. Eftersom värd organismen inte är en Hg-denatureringsmedel för alkohol, får det endast användas för att utveckla en modell för hur Hg kan ange gramnegativa bakterier och inte en slutgiltig motivering för hur Hg-methylators förvärvar Hg. Det finns andra metoder för att fastställa Hg biotillgänglighet, såsom metylering, som ett resultat av upptag eller användning av en massbalans metod10,15,20,45,46. Som sagt, erbjuder metoden presenteras här fördelen av quasi realtid biotillgänglighet data i viabla celler. Vi rekommenderar inte att denna metod används för att kvantifiera totalt Hg eller Cd nivåer i en miljö matris. Trots den föreslagna användningen av biosensorer att fastställa metall koncentrationer i den miljö36, finns många mer lättillgängliga standard metoder såsom ICP-MS, Falk (för CD-analys) eller kall ånga atomabsorption spektroskopi (för Hg analys). Biosensor kan dock vara används för att bestämma om en viss miljö matris har potential att förbättra eller hämma biotillgänglighet. Detta uppnås genom att utföra standardtillsats.

PH-värdet i exponering media kan ändras till någonstans inom spänna av 5 och 8,5, förutsatt moppar fri syra (buffert) är utbytt med en alternativ fri syra av en buffert med den lämpliga pKa (se lista över lämpliga buffertar (Ferreira o.a. (2015) 47) och justeras med KOH till lämpligt pH när du gör exponering media. Dessutom, metoden är inte begränsad till Hg och Cd, men skulle kunna utvidgas till andra metaller som använder andra transkription regulatorer.

Exponering analysen kan ändras för att utforska påverkan av andra Elektronacceptorer t.ex O2 och tenofovirdisoproxilfumarat på Hg eller Cd biotillgänglighet. Mindre ändringar till metoden att utnyttja både O2 och fumarat som Elektronacceptorer finns tillgängliga på begäran.

Sammanfattningsvis vill vi betona följande punkter: jag) är det absolut nödvändigt att koncentrationerna av Cd eller Hg bestånd är känd i steg 2, eftersom dessa används för att kalibrera biosensor. II) exponering dag, tillväxten av celler måste stoppas på en OD600 0,6 (± 0,1) och att man är försiktig när omblandning cellkulturer, som biosensor är kalibrerad till denna cell densiteten. III) slutligen är det viktigt att exponering mediet är minutiöst exponering dag. För att säkerställa framgången för protokollet, bör flera kulturer odlas samtidigt (till att kringgå möjligheten till tillväxt misslyckande) och odlingsmedium bör göras om varje vecka (för att kringgå metastability av media och eventuell förorening). Det bör också noteras att biologiska replikat (flera cellkulturer) uttrycka variationen när det gäller att signalera produktion. Även fluorescerande Svaren kan variera från kultur till kultur, ska fluorescerande trenderna som svar på en viss variabel vara densamma i hela många biologiska replikat.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka kommentarer från två anonyma granskare som väl medlemmar Poulain labbet för insiktsfull diskussion om utvecklingen av den anaeroba biosensor. En tidig forskare utmärkelse från provinsen Ontario och Discovery bidrag och en accelerator tillägg från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada till A.J.P. finansierade denna studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

Miljövetenskap fråga 142 Biosensor kvicksilver kadmium anaerob biotillgänglighet metall artbildning
Anaerob Biosensor test för påvisande av kvicksilver och kadmium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter