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Developmental Biology

एक सेल के आधार पर जांच करने के लिए परख गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना के माध्यम से जोड़-gastrulation संकेतन मार्ग में Drosophila S2R + कोशिकाओं

doi: 10.3791/58325 Published: August 19, 2018

Summary

यहां हम एक सिकुड़ना Drosophila S2R + कोशिकाओं का उपयोग परख का वर्णन । एक exogenous ligand के आवेदन, मुड़ा हुआ gastrulation (कोहरे), कोहरे संकेत मार्ग और सेलुलर सिकुड़ना के सक्रियण की ओर जाता है । इस परख कोहरे संकेत मार्ग में सेलुलर सिकुड़ना प्रोटीन के विनियमन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

हम एक सेल आधारित परख Drosophila कोशिकाओं का उपयोग कर विकसित किया है कि recapitulates शिखर कसना तह gastrulation (कोहरे), एक गुप्त उपकला morphogen द्वारा शुरू की । इस परख में, कोहरे एक एगोनिस्ट के रूप में प्रयोग किया जाता है एक संकेतन झरना है कि एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (धुंध), एक Gα12/13 प्रोटीन (Concertina/Cta), और एक PDZ-डोमेन युक्त guanine न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक शामिल है के माध्यम से Rho सक्रिय (RhoGEF2) । कोहरे actin cytoskeleton के तेजी से और नाटकीय पुनर्गठन में संकेत परिणाम एक सिकुड़ा बटुआ फार्म के लिए । घुलनशील कोहरा एक स्थिर सेल लाइन से एकत्र किया जाता है और S2R + कोशिकाओं के लिए ectopically लागू किया जाता है, शिखर कसना की तरह रूपात्मक परिवर्तन करने के लिए अग्रणी, एक प्रक्रिया जैसे gastrulation विकास प्रक्रियाओं के दौरान मनाया. इस परख उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदाई है और, RNAi का उपयोग कर, अतिरिक्त इस मार्ग में शामिल जीन की पहचान की सुविधा कर सकते हैं ।

Introduction

आनुवंशिक मॉडल जीवों के साथ आयोजित embryogenesis का अध्ययन कैसे कोशिकाओं के ऊतकों में इकट्ठे कर रहे हैं की हमारी समझ के लिए अमूल्य साबित कर दिया है. Drosophila melanogasterके अध्ययन, विशेष रूप से, प्रमुख जीन और जैविक सिद्धांतों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है कि प्रत्यक्ष morphogenesis और निषेचन से जीवों के विकास के लिए वयस्कता1,2 , 3. आनुवंशिक Drosophilaके साथ किए गए अनुसंधान के समानांतर में, प्रसंस्कृत कोशिका फल मक्खी ऊतकों से व्युत्पंन लाइनों भी एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में उभरा है आणविक और सेल जैविक प्रश्न4की एक विस्तृत श्रृंखला का पता, 5 , 6. Drosophila ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के रखरखाव के लिए ंयूनतम आवश्यकताओं है, के रूप में वे कमरे के तापमान पर और सह2के बिना संस्कृति रहे हैं । जैसे, वे उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उत्तरदाई हैं, और वे RNAi6,7द्वारा जीन निषेध के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री है । कई समूहों के लिए एक उपकरण के रूप में Drosophila ऊतक संस्कृति कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है कोशिका आकार परिभाषित करने में शामिल जीन की खोज, cytoskeletal गतिशीलता, व्यवहार्यता, phagocytosis, और संकेत transduction रास्ते4,8, 9,10,11. जब पूरे जानवर के साथ एक मॉडल के रूप में कार्यरत है, प्रसंस्कृत Drosophila सेल लाइनों बहुत पूरक दृष्टिकोण है कि विकास के लिए महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान में तेजी लाने और एक रूपरेखा है जिसमें करने के लिए प्रदान की एक सेट की पेशकश उनकी यंत्रवत भूमिकाओं का निर्धारण12. यहां, हम एक सेल का वर्णन करने के लिए संकेत मार्ग है कि जोड़-gastrulation (कोहरे) मार्ग13,14के माध्यम से शिखर कसना ट्रिगर का अध्ययन परख । इस सेल आधारित सिकुड़ना परख शोधकर्ताओं दोनों मार्ग संकेतन और आणविक तंत्र है कि गैर-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना को विनियमित करने की जांच करने की अनुमति देता है ।

प्रारंभिक Drosophila भ्रूण की Gastrulation उपकला morphogenesis और mesenchymal कोशिका पहचान के लिए उपकला से सेलुलर संक्रमण के लिए एक आनुवंशिक मॉडल के रूप में कई वर्षों के लिए अध्ययन किया गया है. gastrulation की प्रमुख घटनाओं में से एक morphogenesis भ्रूण ventral midline के साथ उपकला कोशिकाओं का एक सबसेट के आकार में स्तंभ से हवामहल के लिए है15,16,17,18. यह सरल कक्ष आकार परिवर्तन प्रकल्पित mesodermal कोशिकाओं के internalization में परिणाम और गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय actin नेटवर्क16,19,20के कसना के मोटर गतिविधि से प्रेरित है । आनुवंशिक अनुसंधान के दशकों इस मार्ग के आणविक घटकों की पहचान की है और क्रमिक रूप से उन्हें निम्नलिखित क्रम में रखा गया है: 1) कोहरे ventral midline में उपकला कोशिकाओं के शिखर डोमेन से स्रावित होता है; 2) जी के लिए कोहरे बांध-प्रोटीन-सह रिसेप्टर्स, धुंध और Smog, और एक heterotrimeric जी प्रोटीन Gα12/13 उपइकाई Concertina (Cta) युक्त परिसर के माध्यम से संकेत है, जो गैर द्वारा संरक्षिका है विहित जीईएफ रिक-8; 3) Cta एक guanine न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक सक्रिय करता है, RhoGEF2, जो बारी में छोटे जी प्रोटीन Rho1 को सक्रिय करता है; ४) Rho1 सक्रिय Rho कळेनासे (Rok); 5) विनियामक प्रकाश श्रृंखला (फास्फारिलीकरण) के RLC के माध्यम से शिखर डोमेन में गैर-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना को सक्रिय करता है, इस प्रकार शिखर कसना का उत्पादन(figure 1)15,21,22 Rok ,23,24,25,26,27,28,29। इन घटकों के कई में उत्परिवर्तनों सामांय gastrulation और विंग डिस्क और लार ग्रंथियों के गठन सहित अंय morphogenetic आंदोलनों, के साथ हस्तक्षेप, यह दर्शाता है कि इस मार्ग Drosophila के कई चरणों में प्रयोग किया जाता है embryogenesis30,31,३२. कोहरे मार्ग उपकला आकार देने के लिए सबसे अच्छा अध्ययन मॉडलों में से एक है और कैसे ऊतक स्तर morphogenesis जीन प्रतिलेखन से विनियमित है में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है cytoskeleton-चालित सेल आंदोलनों14,15 ,21.

हम एक सेल-आधारित सिकुड़ना परख है कि recapitulates के कई सेलुलर प्रतिक्रियाओं कोहरे कि मक्खी भ्रूण17विकसित करने में मनाया गया है के बहाव को विकसित किया । हम एक स्थिर S2 सेल लाइन है कि कोहरे के एक inducible metallothionine प्रमोटर के नियंत्रण के तहत myc के साथ अपने सी-टर्मिनस पर टैग व्यक्त करता है कि मध्यम करने के लिए तांबे सल्फेट (CuSO4) के अलावा पर काटा जा सकता है इंजीनियर । जब कोहरे कंडीशन्ड मीडिया s2 रिसेप्टर्स + (S2R +) कोशिकाओं है, जो s2 Frizzled और integrin उपइकाईयों के रूप में रिसेप्टर्स के अपने अंतर अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित कोशिकाओं की एक उपरेखा है ectopically लागू किया जाता है, कोशिकाओं के एक पुनर्गठन से गुजरना cytoskeleton अत्यधिक शिखर कसना12,17,27,३३की याद ताजा करती है । इन परिवर्तनों को चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है जिसमें कोहरे के इलाज के चरण की उपस्थिति की ओर जाता है-काले असंतोष गैर-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना में एक रेडियल वृद्धि का संकेत है, या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जहां कोहरे उपचार की ओर जाता है गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय के गठन EGFP-टैग RLC३४एक्सप्रेस कोशिकाओं में रिंगों । इन छल्ले immunostaining23,३४,३५के माध्यम से दिखाई एक मायोसिन-phosphorylated विनियामक प्रकाश श्रृंखला (pRLC) होते हैं । इस कोहरे प्रेरित प्रतिक्रिया आवश्यक Cta, RhoGEF2, Rho, और Rok; इस प्रकार, रिकॉमबिनेंट कोहरा-Myc और S2R + कोशिकाओं का उपयोग कर, हम एक ऊतक-संस्कृति आधारित प्रणाली24,25,३४में कोहरे प्रेरित कसना की जांच करने के लिए एक साधन की स्थापना की है ।

Protocol

1. Drosophila ऊतक संस्कृति कोशिकाओं का रखरखाव

  1. बनाए S2R +, S2R +: RLC-EGFP, और S2: कोहरे-कमरे के तापमान पर Myc कोशिकाओं, अधिमानतः 20 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच, ढाल में और गाया एम 3 कीट मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, १०० इकाइयों/मिलीलीटर, १०० µ g/एमएल streptomycin, और ०.२५ amphotericin B पर एक घनत्व से कम नहीं 5 x 105 कोशिकाओं/
    नोट: लोअर सेल घनत्व मौत के लिए सीसा ।
  2. जल्दी से गल क्रायो-कोशिकाओं की संरक्षित शीशियों और एक ऊतक संस्कृति कुप्पी के लिए उन्हें हस्तांतरण. एक छोटे से ऊतक संस्कृति कुप्पी के साथ शुरू (१२.५ सेमी2 या 25 सेमी2) सेल संस्कृति माध्यम के 4-5 मिलीलीटर की मात्रा में जब तक संस्कृति की स्थापना की है और कोशिका के कारण गल मौत के संकेत है ।
    नोट: कोशिका मौत के कारण गल जाने की वजह से ऊतक संस्कृति माध्यम में एक चिकनी, गोल आकार और सेलुलर मलबे के छोटे अंधेरे बिट्स का अभाव गैर-अनुयाई कोशिकाओं में शामिल हैं ।
  3. धीरे कोशिकाओं को कई दिनों के लिए परेशान हो जाना (4-8 d) के लिए १००% प्रवाह, जहां कोशिकाओं के बीच कोई जगह नहीं है और वे एक दूसरे पर ढेर शुरू करने की अनुमति से ऊतक संस्कृति के आकार पैमाने । इस १००% धाराप्रवाह छोटे १२.५-cm2 या 25-सेमी2 कुप्पी से सभी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक बड़ा ऊतक संस्कृति कुप्पी (७५ सेमी2की) सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ पूरक ।
    नोट: एक ७५-सेमी2 कुप्पी में कोशिकाओं को बनाए रखने के अधिकांश प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं निकलेगा ।
  4. सेल संस्कृति मध्यम ऊपर और नीचे pipetting द्वारा हर 3-4 घ बीतने, यह प्रयोग करने के लिए ऊतक संस्कृति प्लास्टिक से किसी भी शिथिल पालन कोशिकाओं को हटाना । इस माध्यम हस्तांतरण, अब resuspend कोशिकाओं से युक्त, एक ताजा कुप्पी में । प्रत्येक बीतने के साथ ताजा सेल संस्कृति माध्यम के साथ 1:4 कोशिकाओं को पतला और आवश्यकतानुसार दोहराएं ।

2. Drosophila S2R + कोशिकाओं का RNAi उपचार

नोट: कैसे कीट संस्कृति के लिए उपयुक्त dsRNA का उत्पादन करने पर विस्तृत निर्देशों के लिए रोजर्स और रोजर्स6 के लिए देखें ।

  1. स्थानांतरण S2R + कोशिकाओं के लिए एक 6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली व्यवहार्यता के लिए अनुकूल घनत्व पर, कोई कम से 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल, पूरा ढाल का उपयोग कर और RNAi उपचार के लिए एम 3 सेल संस्कृति मीडिया गाया ।
  2. एक ऊतक संस्कृति हुड में कार्य करना, धीरे से 6-अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली झुकाव द्वारा पुराने सेल संस्कृति माध्यम को हटाने और एक पिपेट के साथ सेल संस्कृति माध्यम aspirating । जल्दी से यह एक अच्छी तरह से pipetting द्वारा ताजा सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ इस पुराने सेल संस्कृति माध्यम की जगह ।
    नोट: यह काफी नुकसान के बिना किया जा सकता है के बाद कोशिकाओं को ढीला 30-45 मिनट के लिए सेल संस्कृति माध्यम का आदान प्रदान करने से पहले का पालन करने की अनुमति दी गई है ।
  3. जोड़ें 10 µ g/dsRNA कि रोजर्स और रोजर्स6 में विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद उत्पंन किया गया है यह सीधे RNAi हालत प्रति कोशिकाओं के प्रत्येक कुआं के टिशू कल्चर माध्यम में pipetting द्वारा ।
  4. इस कार्यविधि को प्रतिदिन दोहराएं, कक्ष संस्कृति माध्यम को ताजे मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें और RNAi शर्त के अनुसार dsRNA के 10 µ g/
    नोट: RNAi प्रयोगों आमतौर पर 7 डी के लिए किया जाता है; हालांकि, सटीक समय प्रोटीन कारोबार और dsRNA की प्रभावकारिता पर निर्भर है । RNAi उपचार के रूप में कम के रूप में 3 डी प्रभावी ढंग से कुछ प्रोटीन की कोशिकाओं को चूस, जबकि अंय लक्ष्यों को अब6उपचार की आवश्यकता है ।

3. कोहरा उत्पादन और फसल

  1. S2 के विकास को स्केल: कोहरा-Myc कोशिकाओं उंहें 4-8 डी के लिए परेशान हो जाना करने के लिए एक लगभग १००% धाराप्रवाह ७५-सेमी सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं के2 कुप्पी (या वैकल्पिक रूप से, एक १५०-सेमी2 कुप्पी सेल संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर में) मैक्सी को प्राप्त करने की अनुमति देकर mize कोहरा उत्पादन ।
  2. जोड़ें ५० µ एल के १०० मिमी CuSO4 (या १०० µ एल के १०० मिमी CuSO4 एक १५०-सेमी2 कुप्पी के लिए) लगभग १००% धाराप्रवाह ७५-सेमी2 कुप्पी के लिए metallothionine प्रमोटर की प्रेरण. कमरे के तापमान पर ४८ घंटे के लिए मशीन ।
  3. फॉग-Myc-युक्त मीडियम को टिश्यू कल्चर कुप्पी से pipetting करके निकाल लें और उसे 15 मिलीलीटर या ५० एमएल वाले शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर कर दें । 10-15 मिनट के लिए 4 ° c पर २,५०० x g पर केंद्रापसारक कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के माध्यम स्पष्ट करने के लिए ।
  4. एक नया शंकु ट्यूब के लिए मंजूरी दे दी सेल मध्यम स्थानांतरण और बर्फ पर बनाए रखने. बैचों में काम कर रहे हैं, को मंजूरी दे दी मध्यम के 5 मिलीलीटर के हस्तांतरण के साथ ३,००० मेगावाट के संकेन्द्रित के साथ पुनर्जीवित फाइबर झिल्ली और यह २,५०० में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक समय में, मध्यम ध्यान केंद्रित करने के लिए ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक बड़ा वॉल्यूम क्षमता के साथ एक संकेंद्र (५० एमएल) का इस्तेमाल किया जा सकता है । एकाग्रता के दौरान, एक गहरा रंग का माध्यम है, जो कोहरे से समृद्ध है, वी के आकार का फिल्टर के तल पर निर्माण शुरू हो जाएगा ।
  5. ध्यानी के "V" के नीचे करने के लिए पिपेट टिप डालें और केंद्रापसारक के प्रत्येक दौर के बीच गहरे रंग का मीडिया को हटाने और यह एक ताजा १.७-एमएल microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । बर्फ पर मीडिया बनाए रखें ।
  6. एक ही ध्यानी का प्रयोग, दोहराएं कदम ३.४ और ३.५ गहरे रंग का ध्यान केंद्रित कोहरा-Myc मीडिया को हटाने और इसे और अधिक स्पष्ट माध्यम के साथ की जगह है, जब तक मध्यम 1 से ध्यान केंद्रित किया गया है/10वीं की अपनी मूल मात्रा (यानी, के 10 मिलीलीटर से 1 मिलीलीटर शुरू सामग्री) ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित कोहरे-Myc स्टोर ।
    नोट: भंडारण के बाद, जीवाणु संदूषण, जो भंडारण की विस्तारित अवधि से परिणाम हो सकता है के लिए निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  8. प्रदर्शन एसडीएस-पृष्ठ 10 µ एल के मिश्रण से केंद्रित कोहरा-Myc मध्यम 10 µ एल के साथ एक denaturing एसडीएस-बफर युक्त एक lysate फार्म । चलाने के लिए एसडीएस-पृष्ठ जेल ३५ ma में लगभग 1 h. एक nitrocellulose झिल्ली (या वैकल्पिक रूप से, एक PVDF झिल्ली) के लिए 1 ज पर १२० ma के लिए जेल हस्तांतरण । १५०-केडीए बैंड का पता लगाने के लिए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Myc एंटीबॉडी का उपयोग करके एक पश्चिमी दाग निष्पादित करें.
    नोट: कोहरे की एकाग्रता-वातानुकूलित माध्यम में Myc प्रति बैच भिंन हो सकते हैं । यह आवश्यक नहीं है कोहरे की सटीक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए-Myc परख करने के लिए, लेकिन प्रत्येक बैच की प्रभावकारिता एक प्रयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।
  9. चरण ३.१-३.२ के बाद, एक लगभग १००% धाराप्रवाह ७५-सेमी2 s2 कोशिकाओं की कुप्पी (या, वैकल्पिक रूप से, एक १५० सेमी2 कुप्पी से 20 मिलीलीटर) से सेल संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर एकत्र करके नियंत्रण s2-वातानुकूलित मीडिया तैयार pipetting द्वारा । नियंत्रण S2 सेल संस्कृति मध्यम एक ताजा 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  10. चरण ३.४-३.७ के बाद, स्पष्ट (२,५०० x g पर 4 ° c में 30 मिनट के लिए एक समय में) और उसके बाद प्रकोष्ठों को मंजूरी दे दी कोशिका lysate के लिए और उंहें बैचों में नियंत्रण मध्यम ध्यान केंद्रित करने के लिए केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं और सेलुलर मलबे के lysate 1/10वीं मूल की मात्रा ।
    नोट: S2 के आवेदन-वातानुकूलित मीडिया परख में पर्याप्त सेल सिकुड़ना के लिए नेतृत्व नहीं करता है ।
  11. कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित S2 नियंत्रण मीडिया की दुकान ।
    नोट: भंडारण के बाद, संदूषण के लिए निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें ।

4. Concanavalin-A-लेपित ग्लास-तली व्यंजन और S2R + कोशिकाओं के चढ़ाना की तैयारी

  1. concanavalin के 10 मिलीलीटर एक (कोन) भंग करके समाधान 5 एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी की 10 मिलीलीटर में ०.५ मिलीग्राम/एमएल के 9 मिलीग्राम बनाओ । इस समाधान को अधिक सुविधाजनक वॉल्यूंस (५०० µ l से 1 mL) में Aliquot और इसे-20 ° c पर संग्रहीत करें ।
  2. एक ऊतक संस्कृति हूड में २०० µ एल के साथ एक डिश के ग्लास भाग कोटिंग द्वारा ३५ मिमी गिलास तली हुई व्यंजन तैयार एक समाधान और कमरे के तापमान पर लगभग 2 मिनट के लिए व्यंजन मशीन । अगले, सभी चुनाव एक समाधान निकालें (जो बनाए रखा जा सकता है और भविष्य के प्रयोगों के लिए reused) और बर्तन हवा सूखी पूरी तरह से अनुमति देते हैं ।
    नोट: व्यंजन बड़े बैचों में तैयार किया जा सकता है और एक सूखी जगह में इस तरह के एक प्रयोगशाला पीठ दराज के रूप में करने के लिए 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. प्रत्येक गिलास तली हुई डिश के लिए ताजा सेल संस्कृति मीडिया के लगभग 2 मिलीलीटर जोड़ें । resuspend S2R + कोशिकाओं को pipetting द्वारा परख द्वारा परीक्षण किया जा सेल संस्कृति माध्यम ऊपर और नीचे, यह प्रयोग करने के लिए किसी भी शिथिल पालन कोशिकाओं को अलग ।
  4. resuspend S2R + कोशिकाओं ३५-mm ग्लास तली हुई ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से युक्त व्यंजन ताकि वे ५०%-७०% के बीच धाराप्रवाह रहे है स्थानांतरण । कोशिकाओं की संख्या का अनुमान पाने के लिए मध्यम में निलंबित कोशिकाओं के कई मैदानों के माध्यम से और नीचे ध्यान केंद्रित करके ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत सेल घनत्व की जाँच करें.
    नोट: परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से, ५०% प्राप्त करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं के उपयुक्त घनत्व-७०% प्रवाह प्राप्त किया जा सकता है ।
  5. अनुमति कोशिकाओं को कांग्रेस के लिए संलग्न करने के लिए एक लेपित ग्लास-४५-६० मिनट के लिए तली हुई व्यंजन ।
    नोट: पूरी तरह से संलग्न S2R + कोशिकाओं दिखाई ' तला हुआ अंडे की तरह, ' चपटा और चरण-अंधेरे ।

5. कोहरे वातानुकूलित माध्यम की प्रभावकारिता परीक्षण, और सेलुलर सिकुड़ना परख

  1. यदि वांछित, कोहरे की उपज की पुष्टि-Myc उत्पादित और S2 से केंद्रित: कोहरा-Myc स्थिर कोशिकाओं एसडीएस द्वारा लाइनों-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता । एसडीएस-युक्त नमूना बफर के 10 µ एल जोड़ें केंद्रित कोहरे के 10 µ एल-Myc और यह 5 मिनट के लिए फोड़ा के लिए मानक एसडीएस-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल और विरोधी Myc के लिए दाग का पालन करने के लिए कोहरे Myc उत्पादन की पुष्टि ।
  2. सभी ढाल निकालें और संलग्न S2R से एम 3 माध्यम गाया + ४.३ कदम से धीरे से pipetting, और ध्यान से वापस जोड़ने के ताजा ढाल के ७५ µ एल और गाया माध्यम कोहरे की मात्रा को सीमित मध्यम इस्तेमाल किया वातानुकूलित ।
  3. कोहरे की ७५ µ एल जोड़ें-कांच के गिलास भाग के लिए मीडिया वातानुकूलित-५.२ कदम से नीचे पकवान १५० µ एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए, कोहरे के एक 1:1 अनुपात में मीडिया को ढाल के लिए वातानुकूलित और एम सी मीडिया गाया ।
    नोट: १५०-२०० µ एल की कुल मात्रा को पूरी तरह से एक ठेठ गिलास तली हुई पकवान के गिलास भाग को कवर करने की जरूरत है; हालांकि, यह ग्लास-बॉटम्ड डिश के इस्तेमाल के आयामों पर निर्भर करेगा ।
  4. कोशिकाओं के एक पूरे क्षेत्र का पालन करने के लिए 20X या 40X आवर्धन का उपयोग कर चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं के सिकुड़ना मॉनिटर. कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को ट्रैक और चरण अंधेरे और चरण प्रकाश ruffling आकार परिवर्तन के संकेत के बारी पैटर्न के लिए देखो ।
    नोट: कोहरे के आवेदन आम तौर पर 30% S2R + सेलुलर कसना के दौर से गुजर कोशिकाओं के ५०% की ओर जाता है, और 10 मिनट के बाद, कोशिकाओं को आराम करने के लिए, उनके चिकनी धार, तला हुआ अंडे की तरह आकृति विज्ञान के लिए लौट शुरू ।
  5. सेलुलर सिकुड़ना की मजबूती पर नजर रखें । यदि सेल रिस्पांस कोहरे के 1:1 के अनुपात का उपयोग कर बहुत मजबूत है वातानुकूलित माध्यम ताजा ढाल और ओरिजिनल माध्यम के लिए, कोहरे की मात्रा को कम करने के लिए वातानुकूलित मध्यम भविष्य के प्रयोगों के लिए केंद्रित कोहरे-Myc माध्यम के संरक्षण के लिए । एक 1:1 अनुपात मजबूत सेलुलर कसना करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है, तो पतला कोहरे वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करें; सामान्यतया, 1:3 का अनुपात सफलतापूर्वक प्रयोग को पूरा करने के लिए पर्याप्त प्रतिक्रिया पैदा करता है ।
    नोट: एक बार कोहरे के उपयुक्त अनुपात वातानुकूलित माध्यम से ताजा ढाल और गाया माध्यम कोहरे के प्रति दिए गए बैच के वातानुकूलित माध्यम की स्थापना की है, अंय सभी प्रयोगों के लिए इस अनुपात का उपयोग करें ।
  6. मॉनिटर गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय गतिशीलता सेलुलर सिकुड़ना परख के दौरान स्थिर S2R + सेल लाइन है कि GFP एक्सप्रेस-विनियामक प्रकाश श्रृंखला (S2R +: Sqh-EGFP) का उपयोग करके ।
  7. कोहरे के स्थापित अनुपात का उपयोग कर ताजा ढाल के लिए वातानुकूलित और कदम से एम 3 माध्यम गाया ५.२-५.५, एक पिपेट के साथ सेल-कल्चरल माध्यम को हटाने और कांच के नीचे की डिश के गिलास भाग में वापस ताजा ढाल और गाया माध्यम जोड़ें । Perfuse कोहरे-पूर्व निर्धारित अनुपात में वातानुकूलित मध्यम जबकि जीवित कोशिकाओं की एक छवि अनुक्रम प्राप्त करने; छिड़काव के दौरान कांच के नीचे वाली डिश को नहीं ले जाने के रूप में ध्यान रखें ।

6. फिक्सिंग और कसना S2R + कोशिकाओं के दाग

  1. फिक्स S2R + PEM बफर में एक 10% paraformaldehyde समाधान का उपयोग कर कोशिकाओं (१०० मिमी पाइप, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी MgCl2, पीएच ६.९) ।
    नोट: PEM बफर आमतौर पर 2x स्टॉक समाधान में किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. सेल कल्चरल मीडियम को फॉग-स्वास्थ्यकर्मी S2R + कोशिकाओं से pipetting करके निकालें और तुरंत इसे १.५-२.० एमएल के 10% paraformaldehyde सॉल्यूशन के साथ बदलें । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: फिक्स्ड कोशिकाओं कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण समाधान में संग्रहीत किया जा सकता; हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक 15 ंयूनतम निर्धारण कक्ष तापमान पर किया जाता है से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए ।
  3. pipetting द्वारा 10% paraformaldehyde समाधान निकालें और इस कार्बनिक अपशिष्ट उत्पाद के निपटान ठीक से । धीरे से कोशिकाओं कुल्ला pipetting १.५-२.० मिलीग्राम फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के ३५ मिमी गिलास नीचे पकवान । pipetting द्वारा पुराने पंजाबियों निकालें और ताजा पंजाबियों 2x के १.५-२.० मिलीलीटर के साथ बदलें और अवशिष्ट निर्धारण समाधान को दूर करने के लिए ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कक्ष से बाहर इस बिंदु पर प्रोटोकॉल में सूख नहीं है ।
  4. ब्लॉक लगभग २०० µ l के साथ कोशिकाओं को 5% सामांय बकरी के सीरम पतला है कि पंजाब में ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट (PBST) के साथ पूरक किया गया है 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
    नोट: आमतौर पर, समाधान अवरुद्ध सीरम है कि जीव माध्यमिक एंटीबॉडी में उठाया जाता है से मेल खाता है
  5. इसे PBST में कमजोर करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें । लगभग २०० µ एल के एक खंड का उपयोग पूरी तरह से गिलास तली हुई डिश के गिलास भाग को कवर ।
    1. pipetting द्वारा अवरुद्ध समाधान निकालें और डिश के गिलास भाग के लिए सीधे प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन या, वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. जब 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में मशीन, parafilm के साथ ३५-mm ग्लास-तली हुई पकवान लपेटना वाष्पीकरण को रोकने के लिए ।
  6. pipetting द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और कोशिकाओं को कुल्ला pipetting १.५-ताजा पंजाबियों के २.० एमएल के ३५ मिमी गिलास नीचे पकवान । pipetting द्वारा पंजाबियों को हटा दें और यह १.५ के साथ बदलें-ताजा पंजाबियों 2x के २.० मिलीलीटर अधिक ।
  7. द्वितीयक एंटीबॉडी का समाधान तैयार कर इसे PBST में कमजोर । २०० µ एल का एक खंड सिर्फ डिश के गिलास भाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है ।
    1. डिश के गिलास भाग के लिए सीधे द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें । कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
    2. लपेटें parafilm के साथ ३५-mm पकवान अगर रात भर गर्मी, वाष्पीकरण को रोकने के लिए ।
  8. pipetting द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और pipetting १.५-ताजा पंजाबियों के पकवान के लिए २.० मिलीलीटर से पंजाबियों के साथ कोशिकाओं कुल्ला । पुराने पंजाबियों निकालें और इसे और अधिक 2x की जगह, यह एक ही प्रक्रिया के बाद ।
  9. एक विरोधी फीका फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम से कांच के गिलास हिस्से को कवर-३५-mm डिश के लिए पर्याप्त जोड़कर फिक्स्ड और सना हुआ कोशिकाओं को बनाए रखने ।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान और प्रकाश से दूर ।
    नोट: फ्लोरोसेंट संकेत धीरे से भी अगर ठीक से संग्रहीत महीनों में क्षय होगा । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक सप्ताह के भीतर छवि ।

7. इमेजिंग और सेलुलर सिकुड़ना परख के ठहराव

  1. छवि तय S2R + चरण इसके विपरीत, उद्योग, या प्रतिदीप्ति इमेजिंग क्षमताओं के साथ एक मानक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं. 20X या 40X आवर्धन का उपयोग करना, सेल घनत्व के आधार पर कोशिकाओं के 10-30 नॉनओवरलैपिंग छवि क्षेत्रों पर कब्जा, शर्त के अनुसार २०० या अधिक कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ.
  2. एक मानक सेल काउंटर का उपयोग करना, गणना और अनुबंध की संख्या (चरण-काले, बोनट कोशिकाओं) रिकॉर्ड और प्रत्येक क्षेत्र प्रति गैर अनुबंधित कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया ।
    नोट: यह सबसे अच्छा है के लिए दो शोधकर्ताओं ने क्षेत्र के प्रति अनुबंधित और प्रतिकूल कोशिकाओं के स्वतंत्र गिनती ले, या वैकल्पिक रूप से, एक ही शोधकर्ता कोशिकाओं की एक ही छवि क्षेत्र तीन बार गणना कर सकते हैं, की एक औसत संख्या के लिए अनुमति कांट्रैक्ट और प्रति फ़ील्ड अनुबंधित कक्षों की गणना की जानी है ।
  3. कई चुनाव तैयार-एक-लेपित कांच के रूप में प्रयोगात्मक हालत प्रति बर्तन तली के रूप में ४.२ कदम में वर्णित है । पिपेट ऊपर और नीचे सेल संस्कृति के माध्यम से किसी भी शिथिल अनुयाई S2R +: Sqh-EGFP कोशिकाओं और उंहें थाली तो वे ५०%-७०%-३५ मिमी ग्लास-तली के बर्तन में धाराप्रवाह है बेदखल करना । 30-45 मिनट के लिए अनुलग्न करने के लिए कक्षों की अनुमति दें ।
  4. छवि S2R +: Sqh-EGFP कोशिकाओं एक कताई डिस्क का उपयोग कर रहते हैं, बह-क्षेत्र फोकल माइक्रोस्कोप, या प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी द्वारा 60X-100X आवर्धन का उपयोग कर । सभी ढाल निकालें और कांच तली हुई S2R युक्त पकवान से एम 3 मध्यम गाया +: Sqh-EGFP कोशिकाओं ।
    1. कोहरे के पूर्व निर्धारित अनुपात Perfuse-Myc वातानुकूलित माध्यम ताजा ढाल के लिए और कदम ५.२-५.५ से सीधे कांच के गिलास हिस्से पर एक पिपेट का उपयोग कर, सावधान के रूप में करने के लिए नहीं करने के लिए डिश की स्थिति को परेशान करने के लिए एम 3 माध्यम गाया उद्देश्य । 12-15 मिनट के लिए छवियों का अधिग्रहण करने के लिए दीक्षा और S2R के पूर्ण संकुचन +: Sqh-EGFP कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए ।
      नोट: यदि दाग गैर के लिए-मांसपेशी मायोसिन या मायोसिन-pRLC, कोशिकाओं की सतह पर एक तंग मायोसिन अंगूठी के गठन भी सिकुड़ना का संकेत है । यदि इमेजिंग S2R +: Sqh-EGFP कोशिकाओं रहते हैं, EGFP-टैग RLC समान तंग छल्ले फार्म ( चित्रा 3देखें) सिकुड़ना का संकेत होगा । आकार परिवर्तन होता है कि कोशिकाओं को "बोनट", 3 डी आकार लेने के कारण होगा; माइक्रोस्कोप के फोकस के विमान इस सेल आकार परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । नियंत्रण RNAi शर्तों के तहत, आमतौर पर, 30%-५०% कोशिकाओं कोहरे के अलावा पर कसना से गुजरना । ध्यान रखें कि कुछ RNAi की स्थिति कोहरे के अभाव में कसना का कारण बन सकती है.

Representative Results

s2 और s2: कोहरा-Myc कोशिकाओं को एक १५० सेमी2 ऊतक संस्कृति कुप्पी में धाराप्रवाह शर्तों के पास हो रहे थे और 25-75 µ एम CuSO4 के साथ 24-48 घंटे की अवधि में इलाज के लिए कोहरे की अभिव्यक्ति-Myc (चित्रा 2) प्रेरित थे । s2 कोशिकाओं से नमूने (चित्रा 2) और s2: कोहरा-Myc कोशिकाओं (चित्रा 2) हटा दिया गया था और कोहरे-Myc उत्पादन पश्चिमी दाग से नजर रखी थी । जैसा कि उंमीद थी, हम किसी भी स्थिति में S2 कोशिकाओं से काटा मीडिया में कोहरे-Myc का पता लगाने में विफल रहा है । हालांकि, हम S2 से काटा मीडिया में कोहरे का पता लगाने किया: कोहरा-Myc स्थिर सेल लाइन के रूप में 24 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में ७५ µ एम CuSO4के साथ प्रेरण के बाद । S2R + कांग्रेस के लिए संलग्न कोशिकाओं-एक लेपित ग्लास-तली व्यंजन एक EGFP-विनियामक प्रकाश श्रृंखला (GFP-RLC) गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय (आंकड़े ए. ए. और3 बी) के टैग व्यक्त । Live-सेल इमेजिंग एक उल्टे एक 100X/1.4 ना उद्देश्य लेंस के साथ कोहरे की छिड़काव के दौरान सुसज्जित माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया गया था कंडीशनल मीडिया । लगभग 5 मिनट के बाद कोहरे के साथ उपचार-Myc, RLC गठन के छल्ले गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय कसना का संकेत है । ये छल्ले immunostaining S2R के माध्यम से देखा जा सकता है + कोशिकाओं को एक सिंथेटिक मानव Ser19 मायोसिन के RLC आसपास के अवशेषों को इसी phosphopeptide के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ (आंकड़े 4a और 4B) । यह एंटीबॉडी Drosophila RLC के साथ परस्पर प्रतिक्रिया करता है ।

यहां हम सेलुलर सिकुड़ना परख का एक प्रतिनिधि उदाहरण नियंत्रण RNAi और Rho1 के खिलाफ dsRNA के साथ कोशिकाओं के 7 दिन के उपचार के बाद है (आंकड़े 5 ए - 5E) । S2R + कोशिकाओं कांग्रेस पर चढ़ाया गया एक लेपित गिलास तली हुई व्यंजन और कोहरे के साथ इलाज-वातानुकूलित (+ कोहरे) मीडिया या नियंत्रण मीडिया (-कोहरे) । अनुबंधित कक्षों की संख्या तब quantified निंनलिखित निर्धारण किया गया था । चरण-घने असंतोष कसना का संकेत है नियंत्रण घट गया कोशिकाओं कोहरे के साथ इलाज में प्रमुख था वातानुकूलित मीडिया (चित्रा 5बी) । चित्रा 5सीमें, Rho-समाप्त कोशिकाओं S2-वातानुकूलित माध्यम के साथ इलाज चिकनी धार, तला हुआ अंडे की तरह आकृति विज्ञान का एक विशिष्ट उदाहरण हैं । ध्यान दें कि Rho कोहरे संकेत मार्ग में एक भूमिका निभाता है, साथ ही साथ cytokinesis में; इस प्रकार, Rho-घट कोशिकाओं को अक्सर ठीक से विभाजित करने में विफल, सेल आकार और ploidy में वृद्धि करने के लिए अग्रणी । कोहरे के साथ नियंत्रण समाप्त कोशिकाओं के उपचार-कंडीशनल मीडिया ठेठ 30% की ओर जाता है, कसना के दौर से गुजर कोशिकाओं के ५०% है, जबकि हम Rho घट कोशिकाओं में पर्याप्त कसना निरीक्षण करने में विफल रहा है ।

Figure 1
चित्रा 1:ख्यात मार्ग संकेत कोहरा । कोहरे के अभाव में, Gα12/13 उपइकाई, Concertina (Cta), अपने बाध्यकारी भागीदारों gυ और Gβ के साथ, निष्क्रिय कर रहे है और सह रिसेप्टर्स धुंध और Smog के साथ जुड़े । रिक-8 chaperones Cta और अपने उपसेलुलर स्थानीयकरण को नियंत्रित करता है । कोहरे बाध्यकारी पर, Cta gυ से असंबद्धता, और कोशिका झिल्ली Gβ RhoGEF2 रंगरूटों जहां यह catalyzes के लिए सकल घरेलू उत्पाद के आदान प्रदान GTP छोटे GTPase Rho1 में । GTP-बाउंड Rho1, अब एक्टिव, Rho कळेनासे (Rok) को सक्रिय करता है, जो phosphorylates को गैर-मांसपेशी RLC, इसके सक्रियकरण और बाद में सेलुलर मायोसिन को प्रमुखता देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : कोहरा-Myc उत्पादन का समय-पाठ्यक्रम. इन पैनलों सेल संस्कृति मध्यम दिखाने के एक निकट १००% की धाराप्रवाह कुप्पी से काटा (एक) नियंत्रण s2 कोशिकाओं या () s2: कोहरे-Myc स्थिर कोशिकाओं । कोशिकाओं 24-48 घंटे की अवधि में 25-75 µ m CuSO4 के साथ इलाज किया गया । कोशिका संस्कृति माध्यम एकत्र और एसडीएस के लिए तैयार किया गया था-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता । कोहरा-Myc एक विरोधी Myc एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : लाइव-कोहरे प्रेरित कसना के सेल इमेजिंग । स्थिर S2R + सेल एक्सप्रेस EGFP-टैग RLC गैर की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय कोहरे के छिड़काव के दौरान बह-क्षेत्र फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे मीडिया वातानुकूलित । समय मिनट और सेकंड में दिखाया गया है । () इस पैनल को एक फोकल विमान के करीब समय 0:00 में कोहरे के छिड़काव-Myc के पहले coverslip अंतरफलक के पास एक छवि से पता चलता है । () इस पैनल के एक समय श्रृंखला (0:30-10:00) से पता चलता है चित्र कक्ष के शीर्ष के निकट एक फोकल विमान में ले लिया । सफेद तीर गैर के पुनर्गठन की मांसपेशी मायोसिन द्वितीय के रूप में संकेत के रूप में EGFP द्वारा संकेत-RLC सिकुड़ा के छल्ले में कसना के दौरान । स्केल बार 10 µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

Figure 4
चित्र 4 : Phosphorylated-RLC information to सिकुड़ा के छल्ले को कोहरा-Myc द्वारा कसना के बाद प्रेरण । S2R + कोशिकाओं को तय किया गया और actin के लिए दाग phalloidin (लाल) का उपयोग कर, phosphorylated RLC का उपयोग कर एक phosphoserine-19 एंटीबॉडी (हरा), और DAPI (डीएनए, नीला), के साथ उपचार के बाद (एक) नियंत्रण या () कोहरे-Myc-वातानुकूलित मीडिया. कोहरे के अलावा पर छल्ले में phosphorylated RLC के पुनर्गठन नोट-Myc । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 5
चित्रा 5 : कोहरा-प्रेरित सेलुलर सिकुड़ना परख के प्रतिनिधि ठहराव । S2R + कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए छोटे GTPase Rho1 के खिलाफ ( और बी) नियंत्रण RNAi या (सी और डी) dsRNA के साथ इलाज किया गया । इस बार के बाद, कोशिकाओं को कांग्रेस पर चढ़ाया-एक लेपित ग्लास-तली व्यंजन थे और ( और सी) नियंत्रण मीडिया या (बी और डी) कोहरे-Myc-मीडिया वातानुकूलित के साथ इलाज किया गया । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 10 µm. (E) एक तितर बितर भूखंड का मतलब है और शर्त प्रति अनुबंधित कोशिकाओं के अंश के ९५% विश्वास अंतराल को दर्शाता है । व्यक्तिगत अंक 40X आवर्धन पर देखने के प्रति फ़ील्ड अनुबंधित कक्षों के अंश का प्रतिनिधित्व करते है (10-120 कक्ष प्रति फ़ील्ड) और कोष्ठकों में संख्या तीन अलग से अधिक अनुबंधित और गैर-अनुबंधित कक्षों के लिए गिने गए कक्षों की कुल संख्या इंगित करती है RNAi गडबड आहे. तारांकन RNAi-और कोहरे-उपचार शर्तों के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर निरूपित करते हैं, जो Tukey के एकाधिक तुलना पोस्ट हॉक विश्लेषण के साथ एक-तरफा ANOVA (p < ०.०००१) द्वारा निर्धारित होता है । ध्यान दें कि Rho1 RNAi-इलाज नमूनों के बीच कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर (एन एस) नियंत्रण के साथ या कोहरे Myc के साथ इलाज किया गया मीडिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां, हम एक सेल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान सिकुड़ना परख एक Drosophila ऊतक संस्कृति सेल लाइन (S2R + कोशिकाओं) है, जो गैर-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय कसना कोहरे संकेत के रूप में एक प्रतिक्रिया के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस परख कोहरे मार्ग की जांच के लिए उपयोगी है, साथ ही साथ तंत्र है कि विनियमित गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना ।

सेल-संवर्धन विचार:
शर्तों के तहत जो S2R + कोशिकाओं को बनाए रखा है इस परख से विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब सिकुड़ना परख प्रदर्शन करने की योजना बना, यह सबसे अच्छा ढाल में S2R + कोशिकाओं को बनाए रखने और एम 3 कीट माध्यम गाया । जबकि S2R + कोशिकाओं अन्य कीट कोशिका संस्कृति मीडिया (जैसे, SF900 या Schneider कीट माध्यम) में कामयाब हो सकते हैं, वे अक्सर कोहरे के लिए अपनी प्रतिक्रिया खो देते हैं । S2R + कोशिकाओं है कि एक उच्च मार्ग संख्या है, आम तौर पर अधिक से अधिक 20-25 मार्ग, RNAi के लिए संवेदनशीलता खो शुरू करते हैं । यह सभी प्रयोगों के लिए जल्दी बीतने कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है । RNAi कमी प्रयोगों के लिए एक और महत्वपूर्ण पहलू उचित नियंत्रण का चयन है. आम नकारात्मक नियंत्रण dsRNA लक्ष्यीकरण EGFP या pBlueScript, जिनमें से न तो मक्खी जीनोम के लिए समरूपता है शामिल हैं । कोहरे मार्ग (Rho, Rok, आदि) में प्रोटीन लक्ष्यीकरण, जो, जब समाप्त, गैर के सक्रियण को रोकने-मांसपेशी मायोसिन सिकुड़ना, भी उपयोगी नियंत्रण कर रहे हैं । S2: कोहरे-Myc कोशिकाओं को एक वैकल्पिक सेल संस्कृति माध्यम में बनाए रखा जा सकता है जैसे SF900 १०० इकाइयों के साथ पूरक है/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ जी/एमएल streptomycin, और ०.२५ amphotericin बी ध्यान दें कि FBS में संवर्धन कक्षों की आवश्यकता नहीं है । कोशिका घनत्व भी Drosophila ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के सभी पहलुओं के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है । स्तनधारी ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के विपरीत, Drosophila-व्युत्पन्न ऊतक संस्कृति कोशिकाओं उच्च कोशिका घनत्व के तहत सबसे अच्छा कामयाब (घनत्व कोई कम से 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल) । हालांकि, जब यह परख प्रदर्शन, यह महत्वपूर्ण है कि चुनाव पर कोशिकाओं नहीं चढ़ाया जाता है एक लेपित ग्लास-८०% संगम से ऊपर तली हुई व्यंजन, के रूप में अनुबंधित बनाम गैर अनुबंधित कोशिकाओं के ठहराव बहुत थकाऊ हो जाएगा ।

महत्वपूर्ण पहलुओं और सेलुलर सिकुड़ना परख के वैकल्पिक दृष्टिकोण:
कोहरे के उत्पादन, ligand कि गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना ट्रिगर, इस परख का एक महत्वपूर्ण घटक है । कोहरे जीन सांकेतिक शब्दों में बदलना एक की भविष्यवाणी की आणविक वजन के साथ ७३० अमीनो एसिड की एक प्रोटीन ~ ७८ केडीए26. Hydropathy विश्लेषण एक स्राव संकेत अनुक्रम के रूप में कार्य कर सकता है कि कोहरे अमीनो-टर्मिनस में 12 hydrophobic अवशेषों के एक खिंचाव का पता चला । इसके अलावा, कोडिंग अनुक्रम भी संभावित एन के लिए कई साइटों और हे जुड़े glycosylation, आगे कोहरे का सुझाव है एक गुप्त प्रोटीन26है । इस के समर्थन में, कोहरे शिखर कसना16के दौर से गुजर प्रकल्पित एपिडर्मल कोशिकाओं में स्रावी बुलबुले के लिए स्थानीयकृत था । कोहरे-Myc अभिव्यक्ति मध्यम करने के लिए तांबे सल्फेट के अलावा पर प्रेरित किया गया था, और कोहरे या Myc के खिलाफ एंटीबॉडी एक १५०-संस्कृति मध्यम से प्रेरित संस्कृतियों से काटा लेकिन नहीं S2 कोहरे की कमी कोशिकाओं से प्रेरित मीडिया से Myc के निर्माण को मांयता दी । इस आणविक वजन की भविष्यवाणी की तुलना में अधिक था ८०-केडी कोहरे के आणविक वजन और पता चलता है कि S2 कोशिकाओं के स्रावी मशीनरी exocytosis करने से पहले प्रोटीन glycosylate हो सकता है । कोहरे की शुद्धि में संभावित परिवर्तनशीलता के कारण यह उचित है कि सभी प्रयोगों के लिए कोहरे की स्थिति वाले मीडिया का ही बैच इस्तेमाल करें. ऊपर केंद्रित कोहरे के बड़े बैचों बनाने-Myc मीडिया प्रयोगों के दौर में निरंतरता बनाए रखने में मदद मिलेगी ।

इस परख की सफलता भी आत्मविश्वास से कोशिकाओं है कि कसना आया है की पहचान पर निर्भर करता है । जबकि सीमित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जा सकता है, actin या गैर के लिए धुंधला द्वारा-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय, सबसे विश्वसनीय तरीका है की पहचान करने के लिए और सीमित कोशिकाओं यों तो यह चरण के माध्यम से है विपरीत या डिक माइक्रोस्कोपी । सटीक गिनती सबसे मानक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी पर 20X-40X आवर्धन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि यहां लिखा प्रोटोकॉल ग्लास तली हुई व्यंजन का उपयोग करता है, परख भी मानक १.५ ग्लास coverslips का उपयोग कर एक चोर के साथ लेपित प्रदर्शन किया जा सकता है कोहरे के अलावा एक parafilm पर रखा coverslip पर ऊतक संस्कृति के ३५ mm में किया जा सकता है, ताकि प्रत्येक परख के लिए इस्तेमाल कोहरे की मात्रा को सीमित करने के लिए । निर्धारण की गुणवत्ता परख के एक महत्वपूर्ण घटक है, के रूप में खराब निश्चित कोशिकाओं झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ताजा निर्धारण समाधान का उपयोग कर और यकीन है कि कोशिकाओं को एक बार कभी नहीं सूखी अधिक विश्वसनीय परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे बना । अंत में, यह कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या गिनती करने के लिए महत्वपूर्ण है । आमतौर पर, केवल 30%-अनुपचारित या नियंत्रण RNAi-इलाज कोशिकाओं के ५०% कोहरे के छिड़काव के बाद कसना । हालांकि, S2R + कोशिकाओं में होता है कि कसना के एक बेसल स्तर है, इसलिए कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में उपचार के कारण है कि सीमित कोशिकाओं के अंश में किसी भी परिवर्तन को सुनिश्चित करने के लिए की जरूरत है. इसके अलावा, कुछ गैर के विनियमन में शामिल प्रोटीन की कमी-मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना हाइपर-सिकुड़ना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यहां तक कि कोहरे के अभाव में । यहां प्रस्तुत आंकड़ों पर ३,६०० से अधिक कोशिकाओं है कि तीन क्रमिक RNAi कोहरे के एक ही बैच का उपयोग कर के उपचार में गिने गए मीडिया से है ।

सेलुलर सिकुड़ना परख के आवेदन:
यह सिकुड़ना परख, जब RNAi स्क्रीनिंग तरीकों के साथ युग्मित, एक शक्तिशाली प्रणाली के लिए सेल संकेतन, morphogenesis, और सेलुलर सिकुड़ना अध्ययन प्रदान करता है । पहले, यह दो कोहरे सह रिसेप्टर्स21में से एक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । १३८ ग्राम के एक लक्षित स्क्रीन प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) S2R + कोशिकाओं में RNAi द्वारा समाप्त हो गया है, और अपने कोहरे का जवाब करने की क्षमता के रूप में यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित परख की गई थी । १३८ GPCRs, एक एकल, पहले से विलक्षण जीन, अब धुंध के रूप में जाना जाता है, खुला था । धुंध के समारोह में आगे की जांच का प्रदर्शन किया है कि न केवल यह कोहरे के लिए आवश्यक S2R + कोशिकाओं में सेलुलर सिकुड़ना प्रेरित है, लेकिन यह भी gastrulation के लिए आवश्यक था Drosophila21के विकास में । इसके अलावा, इस परख के लिए है कि रिक-8, एक गैर विहित जीईएफ, यह भी कोहरे मार्ग27संकेत में एक घटक है प्रदर्शन किया गया । epistasis RNAi प्रयोगों की एक श्रृंखला सिकुड़ना परख के साथ मिलकर प्रदर्शन किया है कि रिक-8 Gα12/13 उपइकाई Cta और कार्यों के साथ बातचीत के लिए यह सेल के भीतर स्थानीयकरण, जो कोहरे प्रेरित सेलुलर सिकुड़ना के लिए महत्वपूर्ण है31 .

Drosophila ऊतक संस्कृति अच्छी तरह से नौसिखिया के लिए अनुकूल है, के रूप में कोशिकाओं को आसानी से कमरे के तापमान पर बनाए रखे हैं, सह2 या बफर सेल संस्कृति माध्यम की आवश्यकता नहीं है, और जब तक उचित सेल संस्कृति घनत्व बनाए रखा है मजबूत कर रहे हैं । सेलुलर सिकुड़ना परख सफलतापूर्वक एक स्नातक सेल जीवविज्ञान पाठ्यक्रम, जहां छात्रों संवर्धन कोशिकाओं या माइक्रोस्कोप के साथ कोई अनुभव करने के लिए थोड़ा था की प्रयोगशाला खंड द्वारा किया गया था । सेलुलर सिकुड़ना परख यहां प्रस्तुत एक शक्तिशाली, कोशिका आधारित उपकरण है कि जीन की खोज में कार्यरत किया जा सकता है, या कोहरे संकेत मार्ग पूछताछ, हमें मदद करने के लिए बेहतर विकास प्रक्रियाओं को समझने के लिए, जैसे शिखर कसना और गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना, सामांय में ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक को रोजर्स लैब और Applewhite लैब, ग्रेटा ग्लोवर, और रीड कॉलेज के स्प्रिंग २०१८ सेलुलर जीवविज्ञान पाठ्यक्रम, जो इस प्रोटोकॉल के विकास में योगदान दिया है में छात्रों के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अलावा, लेखक ध्यान से पढ़ने और संपादन इस पांडुलिपि के लिए रिट्ज लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस प्रकाशन में सूचना दी गई अनुसंधान को पुरस्कार संख्या ७१६९६४ के अंतर्गत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा D.A.A. और A.R. और रीड कॉलेज बायोलॉजी विभाग के सहयोग से किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S2R+ cells Drosophila Genomics Resorce Center  150 cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog
S2:Fog-myc cells Drosophila Genomics Resorce Center  218 cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter
S2R+ :Sqh-EGFP cells Drosophila Genomics Resorce Center  196 cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP
Shield and Sang M3 Sigma-Aldrich S3652 cell culture medium
SF900 insect medium Thermofisher Scientific 12658019 alternative cell cutlure medium
Schneider’s insect medium Thermofisher Scientific 21720024 alternative cell cutlure medium
Fetal Bovine Serum Thermofisher Scientific 16000044 media supplement
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermofisher Scientific 15240112 antimicrobial/antifugal media supplement
Concanavalin A MP Biomedicals 150710 used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion
Glass bottom plates Maktek P35G-1.5-10 used for assay and for fixing and staining cells
Glass cover slips Corning 2940-225 alternative to glass bottom dishes
Protein concentrators Millipore UFC903008 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks Genessee 25-204,25-206,25-208,25-210 used to culture cells
6-well and 12-well tissue culture dishes Genessee 25-105, 25-106 used to culture cells
Flourescent mounting medium Dako S3023 to preserve fixed cells
32% Paraformaldehyde EMS 15714-S used to fix cells
Pipes EMS 19240 used in PEM buffer for cell fixation
Anti-Myc Antibody Drosophila Hybirdoma Bank cat# 9E10 used to dectect Fog-Myc 
PhosphoSerine-19 antibody Cell Signaling 3671 antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19
488-Phalloidin, 568-Phalloidin Thermofisher Scientific A12379, A12380 to stain for f-actin
Hawk-VT multi-point array scanning confocal system  VisiTech International Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells
Eclipse TE300 Inverted microscope Nikon Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells

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एक सेल के आधार पर जांच करने के लिए परख गैर मांसपेशी मायोसिन द्वितीय सिकुड़ना के <em>माध्यम</em> से जोड़-gastrulation संकेतन मार्ग में <em>Drosophila</em> S2R + कोशिकाओं
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Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).More

Peters, K. A., Detmar, E., Sepulveda, L., Del Valle, C., Valsquier, R., Ritz, A., Rogers, S. L., Applewhite, D. A. A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells. J. Vis. Exp. (138), e58325, doi:10.3791/58325 (2018).

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