Summary
여기 우리는 초파리 S2R + 셀을 사용 하 여 수축 분석 결과 설명 합니다. Exogenous ligand, 접힌된 gastrulation (안개)의 응용 프로그램 신호 통로 세포 수축 안개의 활성화에 지도 한다. 이 분석 결과 세포 수축 단백질 안개 신호 전달 경로에서 규제 조사를 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 세포 기반 분석 결과 초파리 세포를 사용 하 여 접힌된 gastrulation (안개), secreted 상피 morphogen 시작 꼭대기 긴축이 개발 했습니다. 이 분석 결과에서 안개로 G 단백질 결합 된 수용 체 (안개), Gα12/13 단백질 (콘 서 티 나/Cta), 및 PDZ 도메인-포함 된 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (RhoGEF2)를 포함 하는 신호 폭포를 통해 활성화는 주 작동 근으로 사용 됩니다. 안개 신호 수축 지갑 문자열을 말라 골격의 급속 하 고 극적인 개편에서 결과. 수용 성 안개 안정적인 셀 라인에서 수집 하 고 ectopically 셀에 적용 된 S2R +, gastrulation 같은 발달 과정 동안 프로세스 관찰 꼭대기 수축 같은 형태학 상 변화를 선도. 이 분석 결과 높은 처리량 검열 의무가 있으며, RNAi를 사용 하 여이 통로에 관련 된 추가 유전자의 식별을 용이 하 게 수 있습니다.
Introduction
유전 모형 유기 체와 함께 실시 하는 embryogenesis의 연구는 세포 조직으로 조립 되는 방법에 대 한 우리의 이해에 귀중 한 입증 했다. 초파리 melanogaster의 연구 특히 이끈 핵심 유전자와는 morphogenesis 직접 생물학 원리의 식별 및 생물의 개발에 성인1,2 수정에서 , 3. 실시 초파리유전자 연구에 병렬로 과일 파리 조직에서 파생 된 교양된 셀 라인 또한 분자의 넓은 범위를 해결 하기 위해 강력한 시스템으로 등장 했습니다 및 세포 생물학 질문4, 5 , 6. 그들은 실내 온도 CO2없이 교양 초파리 조직 배양 세포 유지 관리에 대 한 최소한의 요구 사항을. 이와 같이, 그들은 의무가 고해상도 이미징, 그리고 그들은 유전자 억제에 자화 율의 높은 학위 RNAi6,7. 많은 그룹 사용 초파리 조직 배양 세포 도구로 셀 모양, cytoskeletal 역학, 생존, 식 균 작용, 및 신호 변환 통로4,8, 정의에 관련 된 유전자를 발견 하 9,,1011. 전체 동물 함께 모델 고용, 교양된 초파리 셀 라인의 제공 분자는 개발에 대 한 중요 한 식별을 가속화 하 고 있는 프레임 워크를 제공 하는 매우 상호 보완적 접근 12그들의 기계적 역할 결정 합니다. 여기, 우리는 꼭대기 긴축 통해 접혀 gastrulation (안개) 통로13,14트리거 신호 경로 연구 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 수축 세포 기반 분석 결과 모두 안개 신호 통로 비 근육 myosin II 수축 조절 하는 분자 메커니즘을 조사 하는 연구를 수 있습니다.
초기 초파리 배아의 gastrulation는 상피 morphogenesis 및 세포 전환 상피 간 엽 세포 id에 대 한 유전 모형으로 몇 년 동안 공부 했다. Gastrulation의 주요 이벤트 중 morphogenesis 모양15,,1617,18에 피라미드를 원주에서 배아 복 부 정중 선 따라 상피 세포의 부분 집합의 이다. 이 간단한 셀 모양 추정 mesodermal 세포의 국제화에 결과 변경 하 고 비 근육 myosin II 말라 네트워크16,,1920constricting의 모터 활동에 의해 구동 됩니다. 유전자 연구의 십 년간이이 통로의 분자 구성 요소를 확인 했다 하 고 다음 순서에 따라 순차적으로 그들을 배치 했다: 1) 안개 복 부 정중 선;에서 상피 세포의 꼭대기 도메인에서 분 비 2) 안개 G 단백질 결합 하는 공동 수용 체, 안개 및 스모그에 바인딩하고 복잡 한 Gα12/13 소 단위는 정식이 아닌 GEF 릭-8;에 의해 chaperoned는 콘 서 티 나 (Cta)를 포함 하는 heterotrimeric G-단백질을 통해 신호 3) Cta 활성화 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인, RhoGEF2, 차례 차례로 활성화 하는 작은 G-단백질 Rho1; 4) Rho1 활성화로 니 (한국); 5) 한국 활성화 비 근육 myosin II 수축 규제 빛 체인 (RLC)의 인 산화를 통해 꼭대기 도메인에 따라서 생산 꼭대기 수축 (그림 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,,2829. 이러한 구성 요소 중 몇 가지에 변이 정상 gastrulation와 날개 디스크 및 침 샘,이 통로 초파리 의 여러 단계에서 사용 해야 함을 나타내는의 형성을 포함 하 여 다른 전체적 움직임 방해 embryogenesis30,,3132. 안개 통로 상피 형성을 위한 최고의 공부 모델 중 하나 이며 중요 한 통찰력을 어떻게 조직 수준 morphogenesis 골격 구동 셀 움직임14,15 유전자 전사에서 통제 된다 제공 했다 ,21.
우리는 많은 세포질 응답의 하류 안개의 비행 배아17개발에 관찰이 수축 세포 기반 분석 결과 개발. 우리는 안개를 표현 하는 세포 라인에의 C- myc 매체에 황산 구리 (CuSO4)의 추가 따라 수확 수 있는 유도할 수 있는 metallothionine 발기인의 통제와 태그 안정 S2 설계. 셀의 개편을 받아야 안개 조건 미디어 S2 수용 체 + (S2R +) 세포, Frizzled 및 integrin 소 단위와 같은 수용 체의 그들의 차동 식에 의해 구별 s 2 세포의 subline, ectopically 적용 되는 골격 높은 꼭대기 수축12,17,,2733의 연상. 이러한 변화는 안개에 치료 비 근육 myosin II 수축에 방사형 증가 나타내는 단계 어두운 주름의 모양을 리드 단계 대조 현미경 검사 법 또는 형광 현미경 검사 법 안개 치료에 이르게 하 여 관찰 될 수 있다는 비 근육 myosin II 고리 EGFP 태그 RLC34를 표현 하는 셀의 형성. 이 고리는 myosin phosphorylated 규제 빛 체인 (pRLC) 표시 를 통해 immunostaining23,,3435포함. 이 안개 유도 응답 필요한 Cta, RhoGEF2로, 및 한국; 따라서, 재조합 안개-Myc 및 S2R + 셀을 사용 하 여, 우리 조직 문화 기반 시스템24,,2534에 안개 유도 수축 조사 하 설립 했다.
Protocol
1. 초파리 조직 배양 세포의 유지 보수
- S2R +, S2R +: RLC EGFP 및 S2:Fog 유지-실내 온도 20 ° C와 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린의 100 단위/mL, 100 µ g/mL 스와 0.25 암포 B에서 보충 하는 방패와 상 M3 곤충 매체에 25 ° C 사이 선호 Myc 세포는 밀도 5 x 105 셀/mL 보다 더 낮은.
참고: 낮은 세포 밀도 죽음으로 이어질. - 신속 하 게 보존 하는 곳을 알아내는 셀 튜브를 해 동 하 고 조직 배양 플라스 크에 그들을 전송. 문화를 설립 하 고 해빙 때문에 세포 죽음의 표시가 라 앉 때까지 세포 배양 매체의 4-5 mL의 볼륨에서 작은 조직 배양 플라스 크 (12.5 c m2 또는 25 c m2)로 시작 합니다.
참고: 해빙 때문에 세포 죽음의 매끄럽고, 둥근 모양 및 회 저 성 세포의 조직 문화 매체 지표에 세포질 파편의 작은 어두운 비트 부족 비 부착 한 세포 포함. - 천천히 100 %confluency, 세포 사이 작은 공간이 있다 그리고 그들은 서로에 무더기로 쌓이기 시작을 며칠 (4-8 d) 동안 그대로 성장 하는 세포를 함으로써 조직 문화의 크기를 확장할. 더 큰 조직 배양 플라스 크 (75 cm2)의 세포 배양 매체의 10 mL와 함께 보충을이 100 %confluent 작은 12.5 cm2 또는 25 c m2 플라스 크에서 모든 셀을 전송.
참고: 75 cm2 플라스 크에 세포를 유지 대부분 실험에 대 한 충분 한 세포를 얻을 것입니다. - 위쪽 및 아래쪽 셀 문화 매체를 pipetting으로 셀 마다 3-4 d 통로, 세포 조직 문화 플라스틱에서 준수 느슨하게 어떤을 꺼내 려 그것을 사용 하 여. 신선한 플라스 크로 resuspended 세포를 포함 하는 지금이 매체를 전송 합니다. 각 통로와 신선한 세포 배양 매체와 셀 1: 4을 희석 하 고 필요에 따라 반복 합니다.
2. RNAi 초파리 S2R + 셀의 치료
참고: 로저스, 로저스를 참조6 dsRNA 곤충 문화에 대 한 적합 한 생산 하는 방법에 대 한 자세한 내용은.
- S2R + 셀 밀도 105 셀/mL, 완전 한 방패와 상 m 3를 사용 하 여 x 5 셀 문화 미디어 RNAi 치료 보다 생존, 더 낮은 대 한 대조에 6-잘 또는 12 음 조직 문화 접시에 전송 합니다.
- 조직 문화 후드에서 working, 부드럽게 잘 6 또는 12 음 조직 문화 접시를 기울이기 세포 배양 매체는 피 펫과 발음을 오래 된 세포 배양 매체를 제거 합니다. 신속 하 게 각 우물에 pipetting으로 신선한 세포 배양 매체의 1 mL이 오래 된 세포 배양 매체 대체.
참고:이 수 후 할 수 상당한 손실 없이 셀 느슨하게 세포 배양 매체 교환 전에 30-45 분에 대 한 준수 허용 되었습니다. - 로저스 로저스에서 상세한 프로토콜에 따라 생성 된 dsRNA의 10 µ g/mL을 추가 RNAi 조건 당 세포의 각의 조직 문화 매체에 직접 pipetting으로6 .
- 매일 신선한 매체의 1 mL와 10 µ g/mL의 RNAi 조건 당 dsRNA 세포 배양 매체를 대체이 절차를 반복 합니다.
참고: RNAi 실험은 일반적으로 실시 7 d; 그러나, 정확한 타이밍 단백질 회전율과는 dsRNA의 효능에 따라 달라 집니다. RNAi 치료 3 d 짧은 다른 대상 필요 이상 치료6효과적으로 특정 단백질의 세포를 고갈 합니다.
3. 안개 생산 및 수확
- S2:Fog의 성장 최대 규모-맥시를 거의 100% confluent 75 cm2 플라스 크 셀 세포 배양 매체 (또는 양자 택일로, 세포 배양 매체의 20 ml에서 150 c m2 플라스 크)의 10 mL를 4-8 d 그대로 성장 하도록 함으로써 Myc 셀 mize 안개 생산입니다.
- 100mm CuSO4 (또는 100 m m CuSO4 150 c m2 플라스 크의 100 µ L) metallothionine 발기인의 유도 거의 100% confluent 75 cm2 플라스 크를 50 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 48 h에 품 어.
- 조직 배양 플라스 크에서 pipetting으로 안개 Myc 포함 된 매체를 제거 하 고 15 mL 또는 50 mL 원뿔 튜브에 그것을 전송. 2500 x g 세포와 세포질 파편의 매체를 10-15 분 4 ° c에서 원심.
- 새로운 원뿔 튜브에 지운된 셀 매체를 전송 하 고 얼음에 그것을 유지. 일괄 처리에서 작업, 재생된 셀 룰 로스 멤브레인과 3000 MW 집중의 15 mL 5 mL 선택된 매체의 전송 그리고 매체 집중을 한 번에 2500 x g 30 분 동안 4 ° C에서 원심.
참고: 또는, 더 큰 볼륨 용량 집중 수 사용된 (50 mL). 농도, 중 안개로 풍성 하 게 어두운 컬러 매체 V 자형 필터의 아래쪽에 구축 하기 위해 시작 됩니다. - 피 펫 팁은 집중의 "V"의 하단에 삽입 하 고 원심 분리의 각 라운드 사이 어두운 색된 미디어를 제거 하 고 신선한 1.7 mL microfuge 관에 그것을 전송. 얼음에 미디어를 유지 합니다.
- 3.4와 3.5 단계 어두운 색을 제거 하 여 집중 안개-Myc 미디어와 더 많은 교체 반복 같은 집중 장치를 사용 하 여 precleared 매체, 매체를 1로 집중 때까지 (즉, 1 mL의 10 mL에서 그것의 원래 양의 10 / 시작 자료)입니다.
- 4 ° c.에 게 집중된 안개-Myc
참고: 저장 후 반드시 저장의 장기간에서 발생할 수 있습니다 세균 오염에 대 한 모니터링. - SDS 페이지는 lysate를 변성 SDS 포함 된 버퍼의 10 µ L로 집중된 안개-Myc 매체의 10 µ L를 혼합 하 여 수행 합니다. SDS 페이지 젤 35 실행 약 1 h. mA 전송 젤 니트로 막 (또는 양자 택일로, PVDF 막) 1 h 120에 대 한 mA. 서쪽 오 점 150 kDa 밴드 감지를 어떤 상용 Myc 항 체를 사용 하 여 수행 합니다.
참고: 안개-Myc의 농도 조절된 매체에 일괄 처리 마다 달라질 수 있습니다. 분석 결과, 수행 하기 위해 안개-Myc의 정확한 농도 결정 하기 위해 필요 하지 않습니다 하지만 각 일괄 처리의 효능 실험을 수행 하기 전에 테스트 해야 합니다. - 다음 단계 3.1-3.2, S2 셀의는 거의 100% confluent 75 cm2 플라스 크에서 세포 배양 매체의 10 mL (또는, 양자 택일로, 20 mL 150 c m2 플라스 크에서) pipetting으로 수집 하 여 제어 S2 조건 미디어를 준비 합니다. 신선한 15 mL 또는 50 mL 원뿔 튜브에 S2 세포 배양 매체 제어를 전송.
- 다음 단계 3.4-3.7 (한 번에 30 분 동안 4 ° C에서 2500 x g )에서 원심 분리에 의해 세포 및 세포질 파편의 lysate 취소 집중 하 지운된 세포 lysate를 전송할 하 고 원심을 일괄 제어 매체를 집중 하도록 1/10 원래 볼륨.
참고: S2 조절 미디어의 응용 프로그램은 분석 결과에 상당한 세포 수축에 연결 되지 않습니다. - 몇 달 동안 4 ° C에서 집중된 S2 제어 미디어를 저장 합니다.
참고: 저장 후 반드시 오염에 대 한 모니터링.
4. 준비 Concanavalin A 코팅 유리 바닥 요리와 S2R + 셀의 도금
- 죄수 A의 5 mg 0.5 mg/mL의 최종 농도 물 10 mL에 용 해 하 여 concanavalin (con A) 솔루션의 10 mL를 확인 합니다. Aliquot 더 편리한 볼륨 (1 ml 500 µ L)으로이 솔루션-20 ° c.에 그것을 저장 하 고
- 200 µ L 콘 A 솔루션의 각 접시의 유리 부분을 코팅 하 여 35 m m 유리 바닥 요리를 준비 하 고 조직 문화 후드에 실 온에서 약 2 분 동안 요리를 품 어. 다음, (유지 하 고 수 있는 미래 실험을 위해 다시 사용)는 모든 콘 A 솔루션 제거 허용 완전히 건조를 요리.
참고 사항: 요리 대규모 배치에서 준비 될 수 있다 고 실험실 벤치 서랍 등 건조 한 곳에 6 개월까지 저장할 수 있습니다. - 각 유리 바닥 접시를 신선한 세포 배양의 약 2 개 mL를 추가 합니다. S2R + 셀 pipetting 셀 문화 매체 위쪽 및 아래쪽, 그것을 사용 하 여 느슨하게 접착 셀을 분리 하 여 분석 결과 의해 테스트 resuspend
- 그래서 그들은 50%-70% 합칠 사이 신선한 세포 배양 매체를 포함 하는 35 m m 유리 바닥 요리 resuspended S2R + 셀을 전송 합니다. 위쪽 및 아래쪽 셀 수의 추정을 중간에 중단 하는 세포의 여러 평원을 통해 집중 하 여 조직 문화 현미경 세포 밀도 확인 합니다.
참고: 시행 착오를 통해 셀 50%-70 %confluency 달성 하는 데 필요한 적절 한 밀도 얻을 수 있습니다. - 45-60 분 위한 콘 A 코팅 유리 바닥 접시에 연결할 셀 수 있습니다.
참고: 완전히 연결 된 S2R + 셀 표시 ' 튀긴 달걀-모양의 ' 병합 및 위상-다크.
5. 효능 테스트 안개 조절 매체 및 세포 수축 시험
- 원하는 경우, 확인 하는 안개-Myc의 수익률 생산 고는 S2:Fog에서 집중-Myc 안정 세포 SDS-PAGE 그리고 서쪽 blotting에 의해 라인. 집중 안개-Myc 및 종 5 분 위해 그것 표준 SDS 페이지 및 서쪽 더 럽 히 프로토콜에 따라 안티 Myc 안개 Myc 생산 확인에 대 한 오 점 10 µ L를 포함 하는 SDS 샘플 버퍼의 10 µ L를 추가 합니다.
- 부드럽게 pipetting으로 단계 4.3에서에서 연결 된 S2R + 셀에서 모든 방패와 상 M3 매체를 제거 하 고 신중 하 게 다시 75 µ L 안개 조절 매체 사용의 양을 제한 하는 신선한 방패와 상 매체의 추가.
- 단계 총 볼륨 안개 조건 미디어 방패를 상 M3 매체의 1:1 비율에서 150 µ L을가지고 5.2에서에서 유리 바닥 접시의 유리 부분에 안개 조건 미디어의 75 µ L를 추가 합니다.
참고: 150-200 µ L의 총 볼륨은 필요가 완벽 하 게 전형적인 유리 바닥 접시;의 유리 부분을 커버 그러나,이 사용 하는 유리 바닥 접시의 크기에 따라 달라 집니다. - 단계 대조 현미경 20 X 또는 40 X 확대를 사용 하 여 셀의 전체 분야를 관찰 하 여 세포의 수축을 모니터링 합니다. 세포의 형태를 추적 하 고 어두운 단계와 단계 빛의 모양 변화 지표를 구겨지지 교체 패턴을 찾고.
참고: 일반적으로 S2R + 셀 세포 수축 진행의 30%-50%에 리드의 응용 프로그램 그리고 10 분 후 셀 시작 휴식, 그들의 부드러운 모서리, 튀긴 달걀 같은 형태를 반환 합니다. - 세포질 수축의 견고성을 모니터링 합니다. 셀 응답이 신선한 방패와 상 중간 중간 안개 조절의 1:1 비율을 사용 하 여 매우 강한 경우 미래 실험을 위한 집중된 안개-Myc 매체를 보존 하기 위해 안개 조절 매체의 감소 합니다. 경우 1:1 비율 강력한 세포 수축;으로 이어질 하지 않는 undiluted 안개 조절 매체를 사용 일반적으로, 1: 3의 비율 실험을 성공적으로 수행에 충분 한 응답을 생성 합니다.
참고: 안개 조건 매체 신선한 방패와 상 매체의 적절 한 비율 주어진 안개 조절 매체의 배치 당 설정 되 면 다른 모든 실험에 대 한이 비율을 사용 합니다. - 안정적인 S2R + 셀 라인 GFP 태그 규제 빛 체인 (S2R +: Sqh-EGFP)를 표현 사용 하 여 셀룰러 수축 분석 결과 중 비 근육 myosin II 역학을 모니터링 합니다.
- 단계 5.2-5.5에서에서 신선한 방패와 상 M3 매체 안개 조절 매체의 설립된 비율을 사용 하는 피 펫과 세포 배양 매체를 제거 하 고 유리 바닥 접시의 유리 부분에 다시 신선한 방패와 상 매체를 추가. 라이브 셀;의 이미지 시퀀스를 인수 하는 동안 미리 정해진 비율로 매체 안개 조건 perfuse 움직이지는 관류 동안 유리 바닥 접시로 돌.
6. 고정 하 고 죄이 고 S2R + 셀의 얼룩
- S2R + PEM 버퍼 (100 m m 파이프, 1mm EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6.9)에 10 %paraformaldehyde 솔루션을 사용 하 여 셀을 수정 합니다.
참고: PEM 버퍼는 일반적으로 재고 솔루션 x 2에서 만들었고 4 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있다 - Pipetting으로 안개 처리 S2R + 세포에서 세포 배양 매체를 제거 하 고 즉시 10 %paraformaldehyde 솔루션의 1.5-2.0 mL와 함께 그것을 대체. 실 온에서 15 분 동안 품 어.
참고: 고정 된 셀에에서 저장할 수 있습니다 고정 솔루션 4 ° C에서 몇 일; 그러나, 그것은 중요 한 초기 15 분 고정 4 ° c 셀을 전송 하기 전에 실내 온도에 이루어집니다. - Pipetting으로 10 %paraformaldehyde 솔루션을 제거 하 고 유기 폐기물이 제대로 처리. 부드럽게 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 35 m m 유리 바닥 접시의 1.5-2.0 mL를 pipetting으로 셀 린스. Pipetting으로 오래 된 PBS를 제거 하 고 잔여 고정 솔루션을 제거 하려면 더 많은 x 신선한 PBS 2의 1.5-2.0 mL와 함께 그것을 대체.
참고:는 셀 건조 하지 마십시오 밖으로이 시점에서에 프로토콜에 중요 하다. - 0.1%의 비 이온 세제 (PBST) 실 온에서 20 분으로 보충 된 PBS에 희석 5% 정상 염소 혈 청의 약 200 µ L로 세포를 차단 합니다.
참고: 일반적으로, 차단 솔루션 2 차 항 체에서 발생 하는 유기 체와 일치 하는 혈 청을 들어. - PBST에 그것을 diluting 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다. 약 200 µ L의 볼륨을 사용 하 여 완전히 유리 바닥 접시의 유리 부분을 커버.
- Pipetting으로 차단 솔루션을 제거 하 고 접시의 유리 부분에 직접 주 항 체 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 1 h incubate 또는, 양자 택일로, 4 ° c.에서 밤새 품 어
- 4 ° C에서 하룻밤 배양 때 랩 35 m m 유리 바닥 접시 parafilm 증발을 방지 하기 위해 함께.
- Pipetting으로 주 항 체 솔루션을 제거 하 고 35 m m 유리 바닥 접시 신선한 PBS의 pipetting 1.5-2.0 mL로 세포를 씻어. Pipetting으로 PBS를 제거 하 고 신선한 PBS 2 더 x의 1.5-2.0 mL와 함께 그것을 대체.
- PBST에 그것을 diluting 하 여 이차 항 체의 솔루션을 준비 합니다. 200 µ L의 볼륨은 그냥 접시의 유리 부분을 커버 하는 충분 한.
- 접시의 유리 부분에 직접 2 차 항 체 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 1 h를 위한 이차 항 체 솔루션 셀을 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
- 랩 parafilm으로 35 mm 접시 증발을 방지 하기 위해 하룻밤 배양 하는 경우.
- Pipetting으로 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 접시에 신선한 PBS의 1.5-2.0 mL를 pipetting으로 PBS 가진 셀을 씻어. 오래 된 PBS를 제거 하 고 다음 동일한 절차, x 2.
- 35 m m 유리 바닥 접시의 유리 부분을 커버 하는 안티-페이드 형광 장착 매체의 이젠 그만 추가 하 여 고정 및 스테인드 세포를 유지 합니다.
- 샘플 4 ° C에서 그리고 멀리 빛을 저장 합니다.
참고: 형광 신호 것입니다 천천히 붕괴 개월 동안 제대로 저장 하는 경우에. 최상의 결과 얻으려면 1 주일 이내 이미지.
7. 이미징 및 세포 수축 분석 결과의 정량화
- S2R + 표준을 사용 하 여 셀을 고정 이미지 반전 단계 대조, DIC, 또는 형광 이미징 기능 가벼운 현미경. Using 20 X 또는 40 배 확대, 셀 밀도 200의 이미지를 취득의 목표에 따라 셀의 10-30 겹치지 않는 이미지 필드 또는 조건 마다 더 많은 세포를 캡처하십시오.
- 표준 셀 카운터를 사용 하 여 계산 하 고 계약된 (위상-어둠, bonneted 세포)와 캡처된 각 필드 당 noncontracted 세포의 수를 기록 합니다.
참고: 그것은 최고의 두 연구자 필드, 계약 및 noncontracted 셀의 독립적인 조사를 받아가지고 또는 양자 택일로, 동일한 연구원 셀 수 세포의 동일한 이미지 필드 세 번의 평균 수에 대 한 계약을 허용 하 고 noncontracted 셀 계산 필드입니다. - 4.2 단계에서 설명한 대로 여러 가지 콘 A 코팅 유리 바닥 요리 실험 조건 당을 준비 합니다. 느슨하게 부착 S2R +: Sqh EGFP 셀을 꺼내 려 하 고 그들을 그래서 그들은 50%-70% 합칠 35 m m 유리 바닥 요리에서 접시를 세포 배양 매체 위아래 플라스틱. 30-45 분 동안 연결할 셀 수 있습니다.
- 이미지 S2R +: Sqh EGFP 셀 회전 디스크, 휩 쓸 필드 confocal 현미경을 사용 하 여 또는 빛 시트 현미경 60 배-100 배 확대 사용 하. 연결 된 S2R +: Sqh EGFP 셀을 포함 하는 유리 바닥 접시에서 모든 방패와 상 M3 매체를 제거 합니다.
- 하지 않도록 주의로 목적에 접시의 위치를 방해 피 펫을 사용 하 여 유리 바닥 접시의 유리 부분에 직접 단계 5.2-5.5에서 신선한 방패와 상 M3 매체 안개-Myc 조절된 매체의 미리 결정 된 비율을 perfuse. 캡처 시작 및 S2R +: Sqh EGFP 셀의 전체 수축 하기 위해서는 12-15 분에 대 한 이미지를 취득 합니다.
참고: 경우, 비 근육 myosin 또는 myosin pRLC 얼룩이 지기 꽉 myosin 반지는 세포의 표면에 형성 수축의 지표 이기도 합니다. 경우 ( 그림 3참조) 나타내는 수축 반지 이미징 S2R +: Sqh EGFP 셀 라이브, EGFP 태그 RLC 꽉 비슷한 형성할 것 이다. 발생 하는 모양을 변경 하면 "보 닛"을 셀 차지 3D 모양; 현미경의 초점의 비행기는이 세포 모양 변화를 추적 하기 위해 조정 될 필요가 있습니다. 아래 RNAi 조건 제어, 일반적으로 30%-50%의 추가 따라 수축 받 다. 일부 RNAi 조건 안개의 부재에 수축으로 이어질 수 있습니다 다는 것을 유의 하십시오.
- 하지 않도록 주의로 목적에 접시의 위치를 방해 피 펫을 사용 하 여 유리 바닥 접시의 유리 부분에 직접 단계 5.2-5.5에서 신선한 방패와 상 M3 매체 안개-Myc 조절된 매체의 미리 결정 된 비율을 perfuse. 캡처 시작 및 S2R +: Sqh EGFP 셀의 전체 수축 하기 위해서는 12-15 분에 대 한 이미지를 취득 합니다.
Representative Results
S2와 S2:Fog-Myc 전지와 150 cm2 조직 배양 플라스 크에 confluent 조건에 가까운 성장 했다 안개-Myc (그림 2)의 표현을 유도를 24-48 시간 기간 동안 25-75 µ M CuSO4 로 치료 했다. S2 셀 (그림 2A) 및 S2:Fog에서 샘플-Myc 셀 (그림 2B) 제거 하 고 안개 Myc 생산 서쪽 오 점에 의해 감시 되었다. 예상 했던 대로, 우리가 어떤 조건 하에서 S2 세포에서 수확 하는 미디어에 안개-Myc를 감지 하지 못했습니다. 그러나, 우리는 S2:Fog에서 수확 하는 미디어에 안개 감지 않았다-Myc 안정적인 셀 라인 75 µ M CuSO4유도 후 24 시간으로 일찍. S2R + 콘 A 코팅 유리 바닥에 요리는 EGFP 태그 규제 빛 체인 (GFP RLC) 비 근육 myosin II (그림 3A 와 3B)의 표현에 연결 된 셀입니다. 라이브 셀 이미징 갖춘 100 X는 거꾸로 한 현미경에 수행한 / 1.4 나 안개 조건 미디어의 관류 동안 렌즈. 약 5 분 후 치료 안개 Myc, RLC 비 근육 myosin II 수축 나타내는 반지를 형성 했다. 이러한 고리 관찰할 수 있습니다 immunostaining 통해 S2R + 셀 해당 잔류물 인간의 myosin RLC (그림 4A 및 4B)의 Ser19를 포위 하는 합성 phosphopeptide에 대 한 발생 하는 항 체로. 이 항 체 초파리 RLC와 cross-reacts.
여기 우리 제어 RNAi 전지와 Rho1 상대로 dsRNA의 7 일간의 치료를 다음과 같은 세포 수축 시험의 대표적인 예는 (그림 5A - 5E). S2R + 셀 콘 A 코팅 유리 바닥 요리에 도금 했다 고 (안개 조절로 치료 + 안개) 미디어 또는 미디어 컨트롤 (-안개). 계약된 셀 수 다음 고정 다음 정량 했다. 수축 위상 밀도 주름 나타내는 제어 고갈 셀 안개 조건 미디어 (그림 5B)로 치료에 유명 했다. 그림 5C로 고갈 셀 S2 조절 매체와 치료는 부드러운 모서리, 튀긴 계란 같은 형태학의 전형적인 예입니다. Note로 역할을 한다는 한 안개 신호 통로 뿐만 아니라 cytokinesis; 따라서,로 고갈 셀 종종 실패 제대로 분할, 셀 크기와 ploidy의 증가로 이어지는. 전형적인 안개 조건 미디어 고갈 된 셀 리드 겪고 수축, 세포의 30%-50%를 우리로 고갈 세포에 상당한 수축 관찰을 실패 하는 반면 컨트롤의 치료.
그림 1:putative 안개 신호 전달 경로. 안개의 부재, Gα12/13 소 단위, 콘 서 티 나 (Cta), Gϒ 및 Gβ, 바인딩 파트너 함께 비활성화 됩니다 안개와 스모그 공동 수용 체와 관련 된. 릭 8 보호자 Cta 하 고 규제의 subcellular 지 방화. 안개 시 바인딩, Cta 분리 Gϒ, 및 Gβ에서 어디 그것은 작은 GTPase Rho1에 GTP에 대 한 GDP의 교환 catalyzes 세포 막에 RhoGEF2 신병. GTP 바인딩된 Rho1, 현재 활성 활성화로 니 (한국), 그것의 활성화 및 후속 세포 수축 비 근육 myosin의 RLC를 phosphorylates 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 안개 Myc 생산의 시간 과정. 이러한 패널 표시 세포 배양 매체 제어 S2 셀 (A) 또는 (B) S2:Fog의 가까운 100 %confluent 플라스 크에서 수확-Myc 안정적인 셀. 세포는 24-48 시간 기간 동안 25-75 µ M CuSO4 치료 했다. 세포 배양 매체 수집 되었고 SDS-PAGE 그리고 서쪽에 게 더 럽 히기에 대 한 준비. 안개-Myc 안티 Myc 항 체에 의해 감지 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 안개 유도 수축의 라이브 셀 이미징. 안정적인 S2R + 셀 라인 비 근육 myosin II 했다 안개 조건 미디어의 관류 동안 휩 쓸 필드 confocal 현미경 검사 법에 의해 몇 군데의 EGFP 태그 RLC를 표현 합니다. 시간 분, 초에 표시 됩니다. (A)이이 패널 시간 0에 가까운 셀 coverslip 인터페이스는 초점면의 이미지를 보여줍니다: 00 전에 안개-Myc. (B)이이 패널의 관류 시계열 표시 (0:30-10:00) 셀의 위쪽에 초점 비행기에서 촬영 한 이미지의. 흰색 화살표 EGFP RLC에 수축 성 반지로 수축 하는 동안 표시 된 대로 비 근육 myosin II의 개편을 나타냅니다. 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 수축 성 반지 안개-Myc.에 따라 수축의 유도에 phosphorylated RLC localizes S2R + 셀 고정 되었고 치료 제어 (A) 또는 (B) 안개 Myc 조절 미디어 다음 걸 phalloidin (적색)를 사용 하 여, phosphorylated RLC (녹색), phosphoserine-19 항 체를 사용 하 여 및 DAPI (DNA, 블루), 스테인드. 안개-Myc.의 추가 따라 링에 phosphorylated RLC의 개편을 참고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 안개 유도 세포 수축 분석 결과의 대표적인 정량화. S2R + 셀은 7 일 동안 (A 와 B) 제어 RNAi 또는 작은 GTPase Rho1에 대 한 (C 와 D) dsRNA 치료 했다. 이 시간에 따라 셀 콘 A 코팅 유리 바닥 요리에 도금 했다 고 (A 와 C) 제어 미디어 또는 (B 와 D) 안개 Myc 조절 미디어로 치료 했다. 눈금은 10 µ m. (E) A 점도 막대 상태 당 계약된 셀의 분수의 의미 및 95% 신뢰 간격을 나타냅니다. 개별 포인트 40 X 확대 (필드 당 10-120 셀) 시야 당 계약된 셀의 분수 나타내고 괄호 안에 있는 숫자가 표시 셀의 총 수 3 별도 계약 및 계약 비 셀 계산 RNAi 실험입니다. 별표는 Tukey의 다중 비교 특별 게시물 분석 RNAi 및 안개 처리 조건 일방통행 ANOVA (p < 0.0001)에 의해 결정으로 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. Rho1 RNAi 대우 샘플 컨트롤 또는 안개 Myc 조절 미디어 처리 사이 아무 통계적으로 유의 한 차이 (n.s.)는 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기, 선물이 초파리 조직 문화 전지 라인 (S2R + 셀), 겪 습 비 근육 myosin II 수축 안개에 대 한 응답으로이 사용 하 여 수축 세포 기반 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 신호. 이 분석 결과 안개 통로, 뿐만 아니라 비 근육 myosin II 수축 조절 메커니즘을 조사 하 고 유용 합니다.
세포 배양 고려 사항:
아래는 S2R + 셀 유지 조건이 분석이 결과에서 신뢰할 수 있는 데이터를 달성 하기 위해 매우 중요 하다. 방패와 상 M3 곤충 매체에 S2R + 세포를 유지 하기 위해 최고의 수축 분석 결과, 수행 계획. S2R + 셀 수 있는 다른 곤충 세포 배양에서 번 창 하는 동안 (예를 들어, SF900 또는 슈나이더의 곤충 매체), 그들은 종종 안개에 그들의 응답을 잃게됩니다. S2R + 세포 높은 통행 수, 더 이상 일반적으로 20-25 구절, RNAi에 감도 잃고 시작 합니다. 그것은 모든 실험에 대 한 초기 통과 셀을 사용 하입니다. RNAi 고갈 실험에 또 다른 중요 한 측면은 적절 한 컨트롤을 선택 하 고. 일반적인 부정적인 컨트롤 포함 dsRNA 타겟팅 EGFP 또는 pBlueScript, 어느 쪽도 아니는의 비행 게놈에 상 동. 안개 통로 (로, 한국, 등)에서 단백질을 대상으로, 어떤, 고갈 때 아닌 근육 myosin 수축 활성화 되지 않도록, 또한 유용한 컨트롤. S2:Fog-Myc 셀 페니실린, 100 µ g/mL 스의 100 단위/mL으로 보충 하는 SF900와 같은 다른 세포 배양 매체에 유지 될 수와 0.25 암포 B. 참고는 FBS는 때 SF900에서 세포를 배양 하지 필요. 셀 밀도 초파리 조직 배양 세포의 모든 측면에 중요 한 구성 요소 이기도합니다. 포유류 직물 문화 세포, 초파리와 달리-파생된 조직 문화 세포 높은 세포 밀도에서 최고 번성 (밀도 5 x 105 셀/mL 보다 더 낮은). 그러나,이 분석 결과 수행 하는 경우 그것은 중요 한 세포는 80% 합류, 위에 유리 바닥 요리 콘 A 코팅 도금 하지 계약 대 비 계약 셀의 정량화는 매우 지루한 될 것 이다.
중요 한 측면과 세포 수축 분석 결과의 다른 방법:
안개, 비 근육 myosin II 수축은 ligand의 생산은이 분석 결과의 주요 구성 요소 이다. 안개 유전자 ~ 78 kDa26의 예측 분자 무게 730 아미노산의 단백질을 인코딩합니다. Hydropathy 분석에 안개의 아미노산-분 비 신호 순서로 작동할 수 있는 12 소수 성 잔류물의 뻗 기를 계시 했다. 또한, 코딩 시퀀스 추가 제안 하는 안개는26분 비 단백질 잠재적인 N-및 O-연결 된 glycosylation 여러 사이트를 포함 되어 있습니다. 이 지원 안개 꼭대기 수축16을 겪고 추정 표 피 세포에서 분 비 소포에 지역화 되었습니다. 안개-Myc 식 매체, 구리 황산의 추가 따라 유도 되었다 안개 또는 Myc에 대하여 항 체 문화 매체에서 150-kD 단백질 유도 문화에서 수확 그러나에서 아닙니다 유도 안개 Myc 구문 부족 S2 세포에서 미디어를 인식 하 고 있습니다. 이 분자량의 예측된 80-kD 분자량 보다 높았다 고 S2 세포의 분 비 기계 glycosylate exocytosis 전에 단백질을 수 있습니다 제안 합니다. 안개 정화에 잠재적인 가변성 때문 그것은 모든 실험에 대 한 안개 조건 미디어의 동일한 일괄 처리를 사용 하는 것이 좋습니다. 집중된 안개-Myc 미디어의 큰 일괄 처리를 만드는 실험의 라운드에 걸쳐 일관성을 유지 하는 데 도움이 됩니다.
이 분석 결과의 성공 또한 자신 있게 수축 받은 셀 식별에 따라 달라 집니다. 죄이 고 세포는 말라 또는 비 근육 myosin II, 얼룩에 의해 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 될 수 있다 하는 동안 식별 하 고 압축된 셀 계량 가장 신뢰할 수 있는 방법은 단계 대조 또는 DIC 현미경입니다. 대부분의 표준 가벼운 현미경에 20 X-40 X 확대를 사용 하 여 정확한 수를 얻을 수 있습니다. 프로토콜 작성 여기 유리 바닥 접시를 사용 하지만 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 표준 1.5 유리 coverslips 콘 a 코팅을 사용 하 여 안개 또한 35mm 안개 각 분석 결과 대 한 사용의 양을 제한 하려면 parafilm에 배치 하는 coverslip에 조직 문화에에서 할 수 있습니다. 제대로 고정된 셀 수 가양성으로 고정 품질 분석 결과의 중요 한 구성 요소입니다. 신선한 고정 솔루션을 사용 하 고 있는지 결코 건조 한 번 고정 셀 더 신뢰할 수 있는 결과 이어질 것입니다. 마지막으로, 그것은 세포의 많은 수를 계산 하는 것이 중요입니다. 일반적으로, 단지 30%-50%의 치료 또는 제어 RNAi 대우 셀의 관류 다음 수축. 그러나, 셀의 많은 죄이 고 셀의 분수에 어떤 변화 든 지 치료 때문 인지 필요 하다 그래서 S2R + 세포에서 발생 하는 수축의 기초 수준이입니다. 또한, 비 근육 myosin II 수축의 규칙에 관련 된 몇 가지 단백질의 고갈 하이퍼-수축, 안개의 부재에도 발생할 수 있습니다. 여기에 제시 된 데이터는 3 연속 RNAi 치료 안개 조건 미디어의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 계산 된 3600 셀에서 이다.
세포질 수축 분석 결과의 응용 프로그램:
이 수축 분석 결과, 심사 방법, RNAi와 결합 하면 세포 신호, morphogenesis, 및 세포 수축에 강력한 시스템을 제공 합니다. 이전에, 그것 두 안개 공동 수용 체21중을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 138 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 대상된 화면 S2R + 세포, RNAi에 의해 고갈 되 고 여기에 제시 된 프로토콜에 설명 된 대로 안개에 대응 하는 능력 분석 했다. 138 GPCRs, 단일의 이전 새롭거나 유전자, 지금은 안개로 알려진 덮여 되지 않았습니다. 미스 트의 기능으로 추가 조사 시연 S2R + 셀, 안개 유도 세포 수축에 필요한 했다 뿐만 아니라 그것은 또한 gastrulation 초파리21개발에 대 한 필수. 또한,이 분석 결과 그 릭-8, 비 정식 GEF는 또한 안개 신호 통로27설명 하기 위해 사용 되었다. 일련의 수축 분석 결과 함께 결합 epistasis RNAi 실험 시연 릭-8 Gα12/13 소 단위 Cta와 안개 유도 세포 수축31에 중요 한 셀 내에서 지역화 기능 작용 .
초파리 조직 배양은 셀 쉽게 실내 온도 유지, CO2 필요 하지 않습니다 또는 세포 배양 매체, 버퍼링 하 고 강력한으로 적절 한 셀 문화 밀도 유지 됩니다, 초보자에 게 적합 합니다. 세포질 수축 분석 결과 학생 자란 세포 또는 현미경 작은 아무 경험을 했다 대학 세포 생물학 과정의 실험실 섹션에서 성공적으로 수행 되었다. 여기에 제시 된 세포 수축 분석 결과 유전자 검색에 사용할 수 있는 강력한, 셀 기반 도구를 나타냅니다 또는가 안개 신호 전달 경로, 더 나은 우리를 돕고 꼭대기 수축 등의 개발 프로세스를 이해 하 고 일반 비 근육 myosin II 수축.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 로저스 실험실 및 Applewhite 실험실, 그 레 타 글 로버, 그리고이 프로토콜의 개발에 기여한 리드 대학 봄 2018 세포 생물학 과정에 학생 들의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 또한, 저자는 신중 하 게 읽기 및 편집이 원고에 대 한 리츠 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 716964 D.A.A.와 아칸소 리드 대학 생물학과 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog |
| S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
| S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
| Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
| SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
| Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
| Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
| Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
| Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
| 25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
| 6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
| Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
| 32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
| Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
| Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
| PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
| 488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
| Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
| Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |
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