Summary
Здесь мы описываем пробирного сократительной способности, с помощью дрозофилы S2R + клеток. Применение экзогенных лиганд, сложенный гаструляция (туман), приводит к активации туман, сигнальные пути и сотовых сократимости. Этот assay может использоваться для изучения регуляции клеточной сократимости белков в тумане, сигнальный путь.
Abstract
Мы разработали на основе ячеек пробирного, с использованием клеток дрозофилы , резюмирует апикального сужения, инициированных сложенном гаструляция (туман), секретируемые эпителиальных morphogen. В этот assay туман используется как агониста для активации Ро через сигнальный Каскад, включающий наряду с G-белком рецептор (туман), белок Gα12/13 (концертина/Cta) и PDZ-домен содержащих фактор обменом нуклеотида гуанина (RhoGEF2). Туман, сигнализации результаты в быстрое и резкое реорганизации Цитоскелет актина сформировать строку сократительной кошелек. Растворимые туман собираются из стабильной клеток линии и ectopically применяется к S2R + клеток, приводит к морфологическим изменениям как апикального сужения, процесс наблюдается во время процессов развития, таких как гаструляция. Этот assay поддается высокопроизводительного скрининга и, с помощью РНК-интерференции, могут способствовать выявлению дополнительных генов, вовлеченных в этот путь.
Introduction
Исследования эмбриогенеза, с генетической модели организмов доказали неоценимое значение для нашего понимания как смонтирован клеток в тканях. Исследования Drosophila melanogaster, в частности, привели к выявлению ключевых генов и биологических принципов, которые направляют Морфогенез и развитие организмов от зачатия до зрелого возраста1,2 , 3. параллельно генетических исследований, проведенных с дрозофилы, культивированный клеточных линий, полученных от плодовой мушки тканей также стали мощной системы для решения широкого круга молекулярной и биологической клетки вопросы4, 5 , 6. клетки культуры ткани дрозофилы имеют минимальные требования к обслуживанию, как они культивировали при комнатной температуре и без CO2. Таким образом они поддаются с высоким разрешением изображения, и они имеют высокую степень восприимчивости к торможению гена РНК-интерференции6,7. Многие группы использовали дрозофилы клетки культуры ткани как инструмент для обнаружения генов, участвующих в определении формы клеток, цитоскелета динамики, жизнеспособность, фагоцитоз и сигнала трансдукции пути4,8, 9,10,11. Когда используются в качестве модели наряду с всего животного, культивированный дрозофилы клеточных линий предлагают набор очень взаимодополняющих подходов, позволяющих ускорить выявление молекул важно для развития и обеспечить рамки для Определите их механистического роли12. Здесь мы описываем на основе ячеек пробирного для изучения сигнальных путей, которые вызывают апикального сужения через сложенные гаструляция (туман) путь13,14. Этот assay сократительной способности на основе ячеек позволяет исследователям расследовать как туман, сигнальные пути и молекулярных механизмов, которые регулируют миозин-мышцы II сократимости.
Гаструляция раннего зародыша дрозофилы изучался на протяжении многих лет как генетическая модель для эпителиальных морфогенеза и клеточных переход от эпителиальных мезенхимальных клеток личности. Одним из ключевых событий гаструляция является морфогенез подмножество эпителиальных клеток вдоль эмбриональных вентральной midline от столбовой на пирамидальной формы15,16,17,18. Этот простой клетки форма изменить результаты в интернализации предполагаемого mesodermal клеток и управляется двигательная активность-мышцы миозин II сжимает актина сети16,19,20. Десятилетия генетических исследований были выявлены молекулярные компоненты этого пути и последовательно поместил их в следующем порядке: 1) туман выделяется из апикального домена эпителиальных клеток на вентральной midline; 2) туман связывается с G-белком сочетании совместно рецепторами, туман и смога и сигналы через G-белок гетеротримерные комплекс, содержащий Gα12/13 Субблок концертина (Cta), который является сопровождение в неканонических Ric ГЭФ-8; 3) Cta активирует фактор обменом нуклеотида гуанина, RhoGEF2, который в свою очередь активирует небольшое Rho1 G-белок; 4) Rho1 активирует Ро киназы (РК); 5) Республика Корея активизирует миозин-мышцы II сократимости на апикальной домена путем фосфорилирования регулирования лёгкие цепи (RLC), таким образом производящ апикального сужения (рис. 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,,2829. Мутации в нескольких из этих компонентов мешать нормальной гаструляция и других морфогенетических движений, включая формирование диске крыле и слюнных желез, указав, что этот путь используется на нескольких этапах дрозофилы Эмбриогенез30,,3132. Туман является одним из наиболее изученных моделей для формирования эпителиальных и предоставил важную информацию как тканевом уровне морфогенеза регулируется от транскрипции гена к инициативе цитоскелета клетки движения14,15 ,21.
Мы разработали на основе ячеек сократимости assay, который повторяет многие из клеточных реакций по течению тумана которые были отмечены в развивающихся эмбрионов летать17. Мы инженерии стабильной S2, линии клеток, которая выражает туман меткой в его C-terminus с myc под контролем промотора индуцибельной metallothionine, которые могут быть собраны на добавление сульфата меди (4CuSO) на носитель. Когда туман кондиционером СМИ применяется ectopically рецепторы S2 + (S2R +) клетки, которые являются сублинии S2 клеток отличают их дифференциального экспрессии рецепторов например Frizzled и Интегрин субблоков, клетки претерпевают реорганизации Цитоскелет очень напоминает апикального сужения12,17,27,33. Эти изменения могут наблюдаться фазово контрастной микроскопии, в котором туман лечения приводит к появлению фазы темный оборками свидетельствует радиального прироста в миозин-мышцы II сократимости, или где туман лечение приводит к микроскопии флуоресцирования формирование миозин-мышцы II колец в клетках, выражая EGFP-тегами RLC34. Эти кольца содержат миозин фосфорилированных регулирования лёгкие цепи (ПРЛК) видна через иммуноокрашивания23,34,35. Этот туман индуцированной ответ требуется Cta, RhoGEF2, Ро и Республика Корея; Таким образом с использованием рекомбинантного туман-Myc и S2R + клеток, мы создали средства для расследования туман индуцированной сдавливания в25,системы, основанные на ткани культура в24,34.
Protocol
1. поддержание клетки культуры ткани дрозофилы
- Поддерживать S2R +, S2R +: RLC-EGFP и S2:Fog-Myc клетки при комнатной температуре, предпочтительно между 20 ° C и 25 ° C, в щит и пел м3 насекомых среде, дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 амфотерицин в плотность не ниже чем 5 x 105 кл/мл.
Примечание: Ниже плотности клеток привести к смерти. - Быстро оттепель крио сохранились флаконов клеток и их передачи в колбу культуры ткани. Начните с небольшой культуры ткани колбу (12,5 см2 или 25 см2) в объеме 4-5 мл среды культуры клеток до тех пор, пока культура устанавливается и признаки смерти клетки из-за оттаивания на убыль.
Примечание: Признаки смерти клетки из-за оттаивания включают non сторонник клетки, которые не гладкая, округлую форму и малые Темный бит сотовой мусора в тканевой культуры средних свидетельствует некротических клеток. - Постепенно наращивать размер культуры ткани, позволяя клеткам расти нетронутыми в течение нескольких дней (4-8 d) до 100% confluency, где есть мало не пространство между клетками и они начинают накапливаться друг на друга. Передать все клетки от этого 100% вырожденная меньше 12,5 см2 или колбу 25-см2 больших культуры ткани настой (75 см2) с 10 мл среды культуры клеток.
Примечание: Сохранение клеток в колбе 75-cm2 даст достаточное количество клеток для большинства экспериментов. - Проход клетки каждые 3-4 d, закупорить клетки культуры средних вверх и вниз, используя его выбить любой слабо придерживался клетки культуры ткани пластика. Передача этой среде, теперь содержит ресуспензированы клетки, в свежий настой. Разбавьте 1:4 клетки с свежими клеток питательной среды с каждым проходом и повторите при необходимости.
2. Лечение RNAi дрозофилы S2R + клеток
Примечание: Обратитесь к Роджерс и Роджерс6 подробные инструкции о том, как производить dsRNA подходит для насекомых культуры.
- Передать S2R + клетки культуры ткани 6-ну или 12-ну пластины на благоприятных для обеспечения жизнеспособности, не ниже чем 5 x 105 клеток/мл, используя полный щит и пел м3 мобильных носителей культуры для лечения RNAi плотности.
- Работая в культуре ткани капюшоном, удалите старые клетки питательной среды, нежно наклона пластины 6-ну или 12-ну культуры ткани и аспирационных среднего культуры клеток с пипеткой. Быстро замените этот старый среднего культуры клеток с 1 мл свежего клетки культуры среднего дозирование в каждой скважине.
Примечание: Это может быть сделано без существенной потери после клетки было разрешено свободно следовать за 30-45 мин до обмена клеток питательной среды. - Добавить 10 мкг/мл двуцепочечной ДНК, которая была сформирована после подробного протокола в Роджерс и Роджерс6 , закупорить непосредственно в тканевой культуры среднего каждой скважины клеток на состояние RNAi.
- Повторите эту процедуру ежедневно, заменив среднего культуры клеток с 1 мл свежих средних и 10 мкг/мл двуцепочечной ДНК на РНК-интерференции условие.
Примечание: RNAi эксперименты обычно проводятся для 7 d; Однако точное время зависит от белка оборот и эффективность двуцепочечной ДНК. RNAi лечения как короче 3 d эффективно разрушают клетки определенных белков, в то время как другие цели требуют длительного лечения6.
3. тумана производства и урожай
- Масштабы роста S2:Fog-Myc клетки, позволяя им расти нетронутыми для 4-8 d получить почти 100% вырожденная 75-cm2 фляги клеток в 10 мл питательной среды (или альтернативно, 150см2 флакон 20 мл среды культуры клеток) до макси также производство туман.
- Добавьте 50 мкл, 100 мм CuSO4 (или 100 µL 100 мм CuSO4 колбу 150см2 ) для почти 100% вырожденная 75-cm2 Фляга для индукции metallothionine промоутер. Проинкубируйте 48 ч при комнатной температуре.
- Удалите средство туман-Myc содержащих из колбу культуры ткани, закупорить и перенести его на 15-мл или 50 мл Конические трубки. Центрифуга на 2500 x g при 4 ° C на 10-15 мин снимите средних клеток и клеточных обломков.
- Ячейки среднего передать новые Конические трубки и поддерживать его на льду. Работая в пакетах, передача 5 мл очищенной среды до 15 мл 3000 МВт концентраторы с регенерированной целлюлозы мембраны и центрифуги на 2500 x g при 4 ° C на 30 мин в то время, сконцентрировать средства.
Примечание: в качестве альтернативы, концентратор с большей емкости тома может быть используемые (50 мл). При концентрации темнее цветные среднего, который обогащен с туман, начнут строить в нижней части V-образный фильтр. - Вставьте наконечник пипетки в нижней части «V» концентратор и удалить темные цветные СМИ между каждый раунд центрифугирования и перенести его на свежий отцентрифугировать 1,7 мл трубку. Поддерживать средства массовой информации на льду.
- Используя же концентратор, повторите шаги 3.4 и 3.5, удалив темнее цвета сосредоточены туман-Myc СМИ и заменив его более проверяться средний, до тех пор, пока средство сконцентрирована на 1/10 от его первоначального объема (то есть, 1 мл из 10 мл исходного материала).
- Хранить концентрированный тумана-Myc при 4 ° C.
Примечание: После хранения, не забудьте следить за бактериального загрязнения, которые могут возникнуть в результате длительного хранения. - Выполните SDS-PAGE, смешивая 10 мкл концентрированного туман-Myc среды с 10 мкл денатурируя SDS-содержащих буфера сформировать lysate. Побегите гель SDS-PAGE 35 мА для примерно 1 ч. передать гель нитроцеллюлозную мембрану (или, альтернативно, PVDF мембрану) за 1 ч в 120 мА. Выполните Западная помарка, используя любые имеющиеся Myc антитела для обнаружения 150 кДа группы.
Примечание: Концентрация туман-Myc в среде с кондиционером могут меняться в пакете. Это не необходимо определить точные концентрации туман-Myc для выполнения анализа, но эффективность каждой партии должны быть проверены до проведения эксперимента. - Следующие шаги 3.1-3.2, подготовить элемент управления кондиционером S2 СМИ, собирая 10 мл среды культуры клеток от почти 100% вырожденная 75-cm2 фляги S2 клеток (или, альтернативно, 20 мл из колбы 150 см2 ), закупорить. Передача управления S2 клетки культуры среднего свежие 15 мл или 50 мл конические трубы.
- Следующие шаги 3.4-3.7, снимите lysate клетки и сотовой мусора путем центрифугирования (на 2500 x g при 4 ° C на 30 мин в то время) и затем передать концентраторы очищается lysate клетки и центрифуги их сконцентрировать средства управления пакетами для 1/10th первоначального объема.
Примечание: Применение S2-кондиционером СМИ не привести к сократимости существенные клеток в assay. - Храните концентрированный S2 управления на 4 ° C на несколько месяцев.
Примечание: После хранения, не забудьте следить за загрязнение.
4. Подготовка конканавалина А-покрытием прозрачным дном блюда и обшивка S2R + клетки
- Сделайте 10 мл конканавалина раствором (con A) растворяют в 10 мл воды для конечной концентрации 0.5 мг/мл 5 мг КОН А. Аликвота это решение в более удобной тома (500 мкл в 1 мл) и хранить его при-20 ° C.
- Готовить блюда 35-мм прозрачным дном, покрывая стекло часть каждого блюдо с 200 мкл раствора con A и инкубировать и блюда для около 2 минут при комнатной температуре в культуре ткани капюшоном. Далее, удалите все решения A con (которые могут быть сохранены и повторно использованы для дальнейших экспериментов) и позволяют блюда высохнуть полностью.
Примечания: Блюда могут быть подготовлены в больших серий и может храниться до 6 месяцев в сухом месте, например лаборатории скамейке ящик. - Добавьте примерно 2 мл свежего клетки культуры средств массовой информации к каждому блюду с прозрачным дном. Ресуспензируйте S2R + клеток в assay быть проверена закупорить клетки культуры средних вверх и вниз, используя его для отсоединения любого слабо придерживаясь клетки.
- Передача ресуспензированы S2R + клетки для 35-мм прозрачным дном блюд, содержащих свежие клетки питательной среды, так что они составляют 50% - 70% притока. Проверьте плотность клеток под микроскопом культуры ткани, сосредоточив внимание вверх и вниз через несколько равнины клеток, приостановлено в средне-и получить оценку числа клеток.
Примечание: Путем проб и ошибок, соответствующую плотность клеток, необходимых для достижения 50% - 70% confluency может быть достигнуто. - Позволяют клеткам для присоединения к кон A-покрытая прозрачным дном блюда для 45-60 мин.
Примечание: Полностью прилагаемый S2R + клетки появляются «жареный яйцо как,» плоский и фаза темно.
5. эффективность тест туман кондиционером средних и клеточных сократимости Assay
- При необходимости подтвердите доходность туман-Myc производятся и в основном из S2:Fog-Myc стабильной клеток линии SDS-PAGE и Западный blotting. Добавьте 10 мкл SDS-содержащие буфер образца 10 мкл концентрированного туман-Myc и варить его на 5 мин следовать стандартным SDS-PAGE и западных blotting протоколы и пятно для анти Myc для подтверждения туман-Myc производстве.
- Удалите все щит и пел м3 средний из прилагаемый S2R + клеток от шаг 4.3, нежно закупорить и тщательно мкл обратно 75 свежие щит и Санг средних и ограничить количество используемой среды, туман кондиционером.
- Мкл 75 туман кондиционером СМИ в части стекла прозрачным дном блюдо из шага 5.2 довести объем до 150 мкл, в соотношении 1:1 туман кондиционером щит и пел м3 средствами массовой информации.
Примечание: Общий объем 150-200 мкл необходимо полностью покрывать часть стекла типичное блюдо прозрачным дном; Однако это будет зависеть от размеров прозрачным дном блюдо используется. - Контролировать сократимость клеток при фазово контрастной микроскопии с помощью 20 X 40 X увеличение или соблюдать все поле клеток. Отслеживать морфологию клеток и искать попеременного этапа темно и свет этапа рассердило свидетельствует об изменении формы.
Примечание: Применение туман обычно приводит к 30% - 50% S2R + клетки проходят сотовой сужение, и после 10 мин, клетки начинают расслабиться, возвращаясь к их гладкими краями, жареный яйцо как морфология. - Мониторинг надежности сотовой сократимости. Если клеточный ответ является очень сильным, с использованием в соотношении 1:1 туман кондиционером средних свежих щит и Санг среднего, уменьшить количество туман кондиционером среды для сохранения концентрированный тумана-Myc среднего для дальнейших экспериментов. Использовать неразбавленное туман кондиционером среднего, если соотношение 1:1 не приводит к надежный сотовой сужение; как правило в соотношении 1:3 производит достаточно ответ успешно провести эксперимент.
Примечание: После того, как соответствующий коэффициент туман кондиционером средних свежих щит и Санг среднего устанавливается в данной партии туман кондиционером среды, используйте этот показатель для всех других экспериментов. - Отслеживать динамику II миозин-мышцы во время пробирного сотовой сократимости, используя стабильные S2R + клеток линии, которая выражает GFP-тегами регулирования лёгкие цепи (S2R +: ШСДШ-EGFP).
- С помощью установленного показателя туман кондиционером средних свежих щит и пел м3 средний от шагов 5.2-5.5, удалите культивируемых клеток средних с пипеткой и добавьте обратно свежие щит и Санг среднего в стеклянные части застекленные дном блюдо. Perfuse туман кондиционером среднего на заранее соотношение приобретая последовательность изображений живых клеток; Позаботьтесь о том, не перемещайте прозрачным дном блюдо во время перфузии.
6. крепление и окрашивание свёрнутые S2R + клетки
- Исправьте S2R + клеток с помощью 10% раствор параформальдегида в буфере PEM (100 мм трубы, 1 мм EGTA, MgCl 1 мм2, рН 6.9).
Примечание: Буфер PEM обычно производится на 2 x Стоковый раствор и может храниться в течение нескольких месяцев на 4 ° C. - Удалите средство культуры клеток из тумана лечение S2R + клеток, закупорить и сразу же заменить его с 1,5-2,0 мл раствора 10% параформальдегида. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
Примечание: Фиксированные клетки могут храниться в фиксации раствор при температуре 4 ° C на несколько дней; Однако важно, что первоначальный фиксации 15-мин осуществляется при комнатной температуре до передачи клетки до 4 ° C. - Удалите параформальдегида 10% раствор, закупорить и утилизировать изделие органических отходов. Промойте клетки, нежно закупорить 1,5-2,0 мл фосфат амортизированное saline (PBS) на 35-мм прозрачным дном блюдо. Удалите старый PBS, закупорить и заменить его с 1,5-2,0 мл свежего PBS 2 x больше, чтобы удалить остаточные фиксации решения.
Примечание: Важно, что клетки не высушить вне от этой точки на в протоколе. - Заблокируйте ячейки с приблизительно 200 мкл 5% нормальной козьего сыворотки разводят в PBS, который был дополнен с 0.1% неионные моющего средства (PBST) для 20 мин при комнатной температуре.
Примечание: Как правило, блокирования решения содержат сыворотку, которая соответствует возникновения вторичных антител в организме. - Приготовляют раствор основного антитела путем разбавления его в PBST. Используйте объем примерно 200 мкл полностью покрывать часть стекла прозрачным дном посуды.
- Удалять блокирующие решение, закупорить и добавить решение основное антитело непосредственно в части стекла блюдо. Инкубировать 1 час при комнатной температуре или, альтернативно, инкубировать на ночь при 4 ° C.
- При инкубации на ночь при 4 ° C, оберните 35-мм прозрачным дном блюдо с парафина для предотвращения испарения.
- Удаление решения основное антитело, закупорить и промойте клетки дозирования 1,5-2,0 мл свежего PBS для 35-мм прозрачным дном блюдо. Удалять PBS, закупорить и заменить его с 1,5-2,0 мл свежего PBS 2 x больше.
- Приготовляют раствор вторичные антитела путем разбавления его в PBST. Объем 200 мкл адекватна просто покрыть часть стекла блюдо.
- Вторичное антитело решение добавьте непосредственно в части стекла блюдо. Инкубировать клетки с вторичное антитело решение за 1 час при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
- Оберните 35-мм блюдо с парафина, если инкубации на ночь, чтобы предотвратить испарение.
- Удаление решения вторичного антитела, закупорить и промойте клетки с PBS дозирования 1,5-2,0 мл свежего PBS на блюдо. Удалите старый PBS и заменить его 2 x больше, после этой же процедуры.
- Сохранение фиксированных и окрашенных клеток, добавив достаточно анти затухания флуоресцентные монтажа среды для покрытия части стекла прозрачным дном 35-мм блюдо.
- Храните образцы на 4 ° C и от света.
Примечание: Флуоресцентные сигнал распадается медленно в течение месяцев даже если правильно храниться. Для достижения наилучших результатов, изображение в течение недели.
7. изображения и квантификация Assay сотовой сократимости
- Изображения фиксированной S2R + клеток с помощью стандартного Перевернутый световой микроскоп с фазового контраста, DIC или флуоресценции изображений возможностей. С помощью 20 X или 40 кратном, захватить 10-30 неперекрывающиеся изображения поля ячеек в зависимости от плотности клеток, с целью получения изображений 200 или более ячеек на условие.
- Используя счетчик стандартная ячейка, рассчитывать и записывать количество контракт (фаза темный, обычная клеток) и noncontracted клеток на каждое поле в плен.
Примечание: Это лучше иметь два исследователи принимают независимые количество контракт и noncontracted клеток на поле, или альтернативно, же исследователь может рассчитывать же поле изображения клеток в три раза, позволяющие среднее количество контракт и noncontracted клетки одного поля рассчитывается. - Подготовьте несколько кон A-покрытием прозрачным дном блюда на экспериментальные условия, как описано в шаге 4.2. Пипетка вверх и вниз клетки культуры среднего выбить любой слабо адэрентных клеток S2R +: ШСДШ-EGFP и пластины их, поэтому они являются 50% - 70% притока в 35-мм прозрачным дном блюда. Позволяют клеткам прикрепить на 30-45 минут.
- Изображения S2R +: ШСДШ-EGFP клетки живут с помощью спиннинг диск, прокатилась поле конфокального микроскопа или на свет лист микроскопии 60 X - 100 X увеличение. Удалите все щит и пел м3 средний с прозрачным дном блюдо, содержащих вложенные S2R +: ШСДШ-EGFP клетки.
- Perfuse предопределило отношение туман-Myc кондиционером средних свежих щит и пел м3 средний от шаги 5.2-5.5 непосредственно на часть стекла прозрачным дном блюдо с помощью пипетки, осторожны, чтобы не беспокоить положение спутниковой антенны на цели. Для захвата посвящения и полное сокращение клеток S2R +: ШСДШ-EGFP получить изображения для 12-15 мин.
Примечание: Если окрашивание миозин-мышцы или миозин ПРЛК, формирование жесткой миозин кольца на поверхности клеток является также показателем сократительной способности. Если изображений S2R +: ШСДШ-EGFP клетки живут, меткой EGFP RLC сформирует аналогичные жесткие кольца (см. рис. 3) показателем сократительной способности. Изменение формы, которое происходит будет вызывать клетки «крышка», занимая 3D формы; плоскость фокуса микроскоп может потребоваться скорректировать для отслеживания изменения формы этой ячейки. Под контроль интерференции условия, как правило, 30% - 50% клеток проходить сужение при добавлении туман. Имейте в виду, что некоторые условия, РНК-интерференции может привести к сужение в отсутствие тумана.
- Perfuse предопределило отношение туман-Myc кондиционером средних свежих щит и пел м3 средний от шаги 5.2-5.5 непосредственно на часть стекла прозрачным дном блюдо с помощью пипетки, осторожны, чтобы не беспокоить положение спутниковой антенны на цели. Для захвата посвящения и полное сокращение клеток S2R +: ШСДШ-EGFP получить изображения для 12-15 мин.
Representative Results
S2 и S2:Fog-Myc клеток выращивали почти вырожденная условия в колбе культуры ткани 150-cm2 и относились с 25-75 мкм CuSO4 в течение 24-48 часов, чтобы побудить выражение туман-Myc (рис. 2). Образцы из S2 клеток (рисA) и S2:Fog-Myc клеток (рис. 2B) были удалены и туман-Myc производства контролируется западную помарку. Как и ожидалось, мы не смогли обнаружить туман-Myc в СМИ, добываемых из S2 клеток при любых условиях. Однако, мы обнаружить туман в СМИ, добываемых из S2:Fog-Myc стабильной клеточная линия 24 часа после индукции с 75 мкм CuSO4в кратчайшие сроки. S2R + клеток, придает кон A-покрытая прозрачным дном блюда выражения с меткой EGFP регулирования света цепи (GFP-RLC)-мышцы миозин II (цифры 3A и 3B). Клеток была исполнена на инвертированным микроскопом с 100 X / 1.4 NA объектив во время перфузии туман кондиционером СМИ. Около 5 минут после лечения с туман-Myc, RLC сформировали колец свидетельствует о миозин-мышцы II сужения. Эти кольца могут наблюдаться через иммуноокрашивания S2R + клетки с антитело против синтетической phosphopeptide, соответствующий остатков, окружающие Ser19 человека миозина RLC (цифры 4A и 4B). Этот антитела cross-reacts с дрозофилы RLC.
Здесь у нас есть репрезентативного примера сотовой сократимости assay после 7-дневного лечения клеток с контролем RNAi и dsRNA против Rho1 (цифры 5A - 5E). S2R + клетки были покрытием на кон A-покрытая прозрачным дном блюда и относились с кондиционером туман (+ туман) средства массовой информации или управления СМИ (-туман). Количество контракт клеток были затем количественно после фиксации. Фаза плотные оборками указывает на сужение был видно в элемент управления в исчерпаны клетках, обработанных с кондиционером туман СМИ (рис. 5B). На рис. 5CРо истощены клетках, обработанных с кондиционером S2 средой являются типичным примером гладкими краями, жареные яйца как-морфологии. Обратите внимание, что Ро играет определенную роль в тумане сигнальный путь, а также цитокинез; Таким образом Ро истощены клетки часто не правильно разделить, приводит к увеличению размера ячейки и плоидности. Лечение управления истощенных клеток с кондиционером туман СМИ типичный приводит к 30% - 50% клеток происходят сужения, тогда как мы не смогли наблюдать значительное сужение в Ро истощенных клеток.
Рисунок 1:предполагаемого туман, сигнальный путь. В отсутствие туман, субъединицы Gα12/13 , концертина (Cta), вместе со своими партнерами привязки Gϒ и Gβ, являются неактивными и связанные с совместного рецепторов, туман и смога. Ric-8 сопровождающих Cta и регулирует ее субцеллюлярные локализации. После туман привязки, Cta отсоединяет от Gϒ и Gβ новобранцев RhoGEF2 клеточной мембраны, где она катализирует обмена ВВП для GTP в небольшой ГТФазы Rho1. GTP-прыгните Rho1, в настоящее время активные, активирует Ро киназы (РК), которая фосфорилирует RLC-мышцы миозина, ведущих к ее активации и последующих клеточных сократимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Время курс производства тумана-Myc. Эти панели показывают ячейки питательной среды, добываемых из почти 100% вырожденная колбу клетки управления S2 (A) или (B) S2:Fog-Myc стабильной клеток. Клетки были относиться с 25-75 мкм CuSO4 в течение 24-48 часов. Клетки культуры среднего была собрана и подготовлена для SDS-PAGE и Западный blotting. Туман-Myc был обнаружен антитела анти Myc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Live клеточной изображений туман индуцированной сдавливания. Стабильные S2R + клеточных линий, выражая EGFP-тегами RLC-мышцы миозин II были образы, прокатилась поле confocal микроскопии в перфузии туман кондиционером СМИ. Время показывается в минутах и секундах. (A) Эта группа показывает изображение фокальной плоскости недалеко от клеток coverslip интерфейс в момент времени 0:00 перед перфузии туман-Myc. (B) Эта группа показывает временных рядов (0:30-10:00) из изображений, снятых в фокальной плоскости в верхней части клетки. Белые стрелки указывают реорганизации миозин-мышцы II как указано EGFP-RLC в сократительной кольца во время сужение. Шкалы бар-10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Фосфорилированных-RLC локализует сократительной кольца после индукции сужение туман-Myc. S2R + клетки были исправлены и окрашенные актина, используя Фаллоидин (красный), фосфорилированных RLC, с помощью phosphoserine-19 антитела (зеленый) и DAPI (ДНК, синий), после лечения с управления (A) или (B) туман-Myc кондиционером СМИ. Обратите внимание реорганизации фосфорилированных RLC в кольца после добавления туман-Myc. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель квантификация assay туман индуцированных клеточных сократимости. S2R + клетки лечили контроль интерференции (A и B) или (C и D) dsRNA против небольшой ГТФазы Rho1 для 7 дней. После этого времени клетки были покрытием на кон A-покрытая прозрачным дном блюда и лечили (A и C) управления и средств массовой информации или (B и D) туман-Myc кондиционером СМИ. Шкалы и представляет 10 мкм. (E) A точечная указывает среднее и 95% доверительные интервалы фракции контракт ячеек на условие. Отдельные точки представляют доля контракт ячеек на поле зрения на 40 кратном (10-120 ячеек на поля) и цифры в скобках показывают, что общее количество клеток считается для клетки как договорной, так и не заключил контракт на три отдельных RNAi эксперименты. Звездочки обозначает статистически значимой разницы между RNAi и туман пропитанная условий как определено односторонний дисперсионный анализ (p < 0.0001) с Тьюки множественные сравнения пост Специального анализа. Обратите внимание, что не было статистически значимой разницы (н.с.) между выборками Rho1 RNAi-лечение, лечение с контролем или туман-Myc кондиционером СМИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Здесь мы представляем подробный протокол для assay на основе ячеек сократимости, с помощью дрозофилы линии клетки культуры ткани (S2R + клеток), проходит II сужение миозин-мышцы в ответ на туман сигнализации. Этот assay полезен для расследования туман путь, а также механизмов, которые регулируют миозин-мышцы II сократимости.
Культивирование клеток соображения:
Условия, при которых S2R + поддерживаются клетки имеет решающее значение для достижения надежных данных из этого анализа. При планировании выполнения пробирного сократимости, он лучше всего поддерживать S2R + клеток в щит и пел м3 насекомых среде. Хотя S2R + клетки могут процветать в других СМИ культуры клеток насекомых (например, SF900 или Шнейдера насекомых средний), они часто теряют их отзывчивость туман. S2R + клетки, которые имеют высокий проход число, как правило более чем 20-25 проходы, начинают терять чувствительность к интерференции. Это лучше всего использовать клетки рано проход для всех экспериментов. Еще одним важным аспектом для RNAi истощения экспериментов является выбор надлежащего контроля. Общие негативные элементы включают dsRNA ориентации EGFP или pBlueScript, ни из которых имеют гомологичностью к лету генома. Ориентация белков в тумане пути (Ро, Республика Корея и т.д.), который, при истощении, предотвратить активацию миозин-мышечной сократительную, также являются полезными элементами управления. S2:FOG-Myc клетки может быть сохранен в среде культуры альтернативного клеток например дополнена 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, SF900 и 0,25 амфотерицин B. Примечание что FBS не требуется при культивировании клеток в SF900. Плотность клеток также является критическим компонентом для всех аспектов дрозофилы клетки культуры ткани. В отличие от клеток млекопитающих культуры ткани, дрозофила-производных тканевой культуры клетки процветать лучший под более высокой плотности клеток (плотность не ниже чем 5 x 105 клеток/мл). Однако при выполнении этот assay, важно что клетки не покрытием на кон A-покрытая прозрачным дном блюда выше 80% слияния, как количественная оценка контракт по сравнению с не контракт клеток станет чрезвычайно утомительно.
Важнейшие аспекты и альтернативные подходы сотовой сократимости пробирного:
Производство туман, лигандом, вызывающее миозин-мышцы II сократимости, является ключевым компонентом этот assay. Туман ген кодирует белок 730 аминокислот с прогнозируемым молекулярной массой ~ 78 кДа26. Гидропатия анализ показал стрейч 12 гидрофобные остатков в туман в амино terminus который мог бы функционировать как последовательность сигнала секрецию. Кроме того кодирующая последовательность содержит несколько сайтов для потенциальных гликозилирования, N и O, связанных, далее заявил, что туман секретируемые белки26. В поддержку этого туман локализована в секреторные пузырьки в предполагаемого эпидермальных клеток, претерпевает апикального сужения16. Туман-Myc выражение были наведены на добавление сульфата меди на носитель, и антитела против тумана или Myc признали 150-kD белка от питательной среды заготавливаемым от индуцированного культур, но не от индуцированного СМИ от клеток S2 не хватает туман-Myc конструкции. Это молекулярный вес был выше, чем прогнозируемый молекулярный вес 80-kD тумана и свидетельствует о том, что механизма секреторных клеток S2 могут glycosylate белка до экзоцитоз. Из-за потенциальной изменчивости в тумане очистки желательно пользоваться той же партии туман кондиционером СМИ для всех экспериментов. Составляя больших серий концентрированный тумана-Myc средств массовой информации будет способствовать поддержанию согласованности всей раундов экспериментов.
Успех этот assay зависит также уверенно выявления клеток, которые претерпели сужения. Хотя свёрнутые клетки можно наблюдать микроскопии флуоресцирования, путем пятнать актина и миозина-мышцы II, самый надежный способ выявить и количественно свёрнутые клетки является через фазово контрастной или DIC микроскопии. Точное количество может быть достигнуто с помощью 20 X - 40 кратном на большинстве стандартных легких микроскопы. Хотя протокол написан здесь использует прозрачным дном блюда, assay может также выполняться с помощью стандартных coverslips 1.5 стекла покрытые кон а. Добавление туман может быть сделано в 35 мм культуры ткани на coverslip размещены на парафина, с тем чтобы ограничить количество туман, используемых для каждого пробирного. Качество фиксации является критически важным компонентом assay, как плохо фиксированные клетки могут привести к ложным положительным результатам. С помощью фиксации свежие решения и убедившись, что никогда не сухие клетки однажды фиксированной приведет к более надежные результаты. Наконец важно считать большое количество клеток. Как правило не лечить только 30% - 50% или клетки RNAi лечение управления сжимают после перфузии туман. Однако есть базальный уровень сужения, которое происходит в S2R + клеток, поэтому большое количество клеток, чтобы обеспечить любое изменение доли свёрнутые клеток из-за лечения. Кроме того истощение некоторых белков, участвующих в регуляции миозин-мышцы II сократимости может привести к гипер сократимость, даже в отсутствие туман. Здесь представлены данные из более чем 3600 клетки, которые были подсчитаны в три последовательных RNAi лечения с использованием той же партии туман кондиционером СМИ.
Применения клеточных сократимости пробирного:
Этот assay сократимости, в сочетании с RNAi скрининг методы, предлагает мощную систему для изучения клеток сигнализации, морфогенез и клеточных сократимости. Ранее он был использован для идентификации одного из двух туман Сопредседатель рецепторов21. Целевой экран 138 G-белок-рецепторы (GPCR) истощается RNAi в S2R + клеток, и ее способность реагировать на туман был assayed как описано в протоколе, представленные здесь. Из 138 GPCR, единый, ранее uncharacterized гена, теперь известный как туман, была раскрыта. Дальнейшее расследование функция туман продемонстрировал, что не только она требуется для туман индуцированных клеточных сократимости S2R + клеток, но также важно для гаструляция в разработке дрозофилы21. Кроме того чтобы продемонстрировать, что Рик-8, нестандартные ГЭФ, является также компонентом в тумане сигнальный путь27был использован этот assay. Серия экспериментов RNAi воспроизводится, в сочетании с Пробирной сократительной способности продемонстрировал, что Рик-8 взаимодействует с Gα12/13 Субблок Cta и функций для локализации в ячейке, которая имеет решающее значение для туман индуцированных клеточных сократимости31 .
Культура ткани дрозофилы хорошо подходит для новичков, как клетки легко поддерживается при комнатной температуре, не требуют CO2 или буферизировать клетки культуры среднего и надежны, до тех пор, как надлежащее клетки культуры плотности сохраняются. Assay сотовой сократимости была успешно проведена секцией лаборатории курса биологии undergraduate ячейки, где студенты имели практически нет опыта с культивирования клеток или микроскопии. Assay сотовой сократимости, представленные здесь представляет собой мощный инструмент на основе ячеек, которые могут быть использованы в открытие гена, или допросить туман, сигнальный путь, помогая нам лучше понять процессы развития, такие как апикального сужения и -мышцы миозин II сократительной способности, в целом.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов Роджерс лаборатории и лаборатории Эпплвайт, Greta Гловер и студентов в Reed College весной 2018 клеточной биологии курсы, которые способствовали разработке этого протокола. Кроме того авторы хотели бы поблагодарить членов Ritz лаборатории тщательно чтения и редактирования этой рукописи. Исследования в этой публикации было поддержано национального научного фонда под номером 716964 премию D.A.A. и а.р. и Рид колледж Биологический факультет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S2R+ cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | cell culture line, exhibits contractility when treated with Fog |
| S2:Fog-myc cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter |
| S2R+ :Sqh-EGFP cells | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP |
| Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | cell culture medium |
| SF900 insect medium | Thermofisher Scientific | 12658019 | alternative cell cutlure medium |
| Schneider’s insect medium | Thermofisher Scientific | 21720024 | alternative cell cutlure medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 16000044 | media supplement |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermofisher Scientific | 15240112 | antimicrobial/antifugal media supplement |
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion |
| Glass bottom plates | Maktek | P35G-1.5-10 | used for assay and for fixing and staining cells |
| Glass cover slips | Corning | 2940-225 | alternative to glass bottom dishes |
| Protein concentrators | Millipore | UFC903008 | 30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media |
| 25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | used to culture cells |
| 6-well and 12-well tissue culture dishes | Genessee | 25-105, 25-106 | used to culture cells |
| Flourescent mounting medium | Dako | S3023 | to preserve fixed cells |
| 32% Paraformaldehyde | EMS | 15714-S | used to fix cells |
| Pipes | EMS | 19240 | used in PEM buffer for cell fixation |
| Anti-Myc Antibody | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | used to dectect Fog-Myc |
| PhosphoSerine-19 antibody | Cell Signaling | 3671 | antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19 |
| 488-Phalloidin, 568-Phalloidin | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | to stain for f-actin |
| Hawk-VT multi-point array scanning confocal system | VisiTech International | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells | |
| Eclipse TE300 Inverted microscope | Nikon | Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells |
References
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
- Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
- Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
- Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
- Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
- Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
- Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
- Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
- Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
- Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).
- Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
- Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
- Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
- Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
- Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
- Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
- Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
- Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
- Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
- Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
- Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
- Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
- Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
- Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
- Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
- Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
- Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
- Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
- Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
- Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
