Summary
マウスの受精卵および初期胚は透明帯、遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。この資料では、ヘッジホッグ レンチウイルスベクターを持つ胚細胞、トランスジェニック マウスを作成するレーザーと帯を穿孔するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
異哺乳動物細胞への遺伝子導入のための効率的なベクトルであります。次の伝達、レンチ ウイルスのゲノムは、安定ホスト染色体に組み込まれており、子孫に渡されます。したがって、彼らは安定したセルラインの作成、指標、生体内で配信、トランスジェニック動物を作成する単一細胞の受精卵の伝達の理想的なベクトルであります。しかし、マウス受精卵、早い段階の胚は透明帯、レンチ ウイルス遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。レンチが大きすぎて帯を貫通する、通常囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースにウイルス粒子によって配信されます。熟練技術者や専門機器の要件がマウス胚への遺伝子導入のためのレンチの使用を最小限に抑えます。この資料では、レーザーで帯を穿孔によって構造のマウス受精卵のためのプロトコルについて説明します。レーザー穿孔胚に損害発生しませんができ異遺伝子デリバリーの萌芽期細胞へのアクセスを得るために。導入された胚は、胚盤胞、体外に開発し、偽妊娠マウスに注入した場合、トランスジェニック子犬に発展できます。このプロトコルで使用されるレーザーは、効果的で使いやすいです。安定のレンチによって配信される遺伝子マウス胚性細胞に組み込む、生殖著作。これはトランスジェニック マウスの作成を必要としないマイクロマニピュレーション、受精卵のための代替方法です。
Introduction
このメソッドは、レンチによる胚性細胞を遺伝子送達用アクセスできるように構造のマウス受精卵の透明帯の詳細な手順を提供します。レンチは、自然哺乳類細胞への効率的な遺伝子導入のために設計されています。彼らは分割と非分裂細胞に感染してそのホスト染色体1にレンチ ウイルスのゲノムを統合します。レンチ ウイルスの宿主細胞の範囲は、容易に VSV G 蛋白質2の広範な親和性により水疱性口内炎ウイルス (VSV G)、糖タンパク質と遺伝子組換えレンチ ウイルス、pseudotyping によって拡大します。次の伝達、レンチ ウイルス遺伝子は統合、トランスジェニック動物を生成するための理想的なツールを作成する彼らのホストの染色体の一部として安定。初期段階の胚細胞に配信、レンチ ウイルスのゲノムを複製および全体の有機体で表されます。レンチ ウイルス伝達はマウス、ラット、鶏、ウズラの生産につながっているし、豚の3,4,5,6,7遺伝子組み換えの他の種の間で。レンチ ウイルスの遺伝子配達の典型的な方法では、熟練した技術者や専門機器の初期段階の胚をカプセル化オスミウム障壁を克服するただし、必要があります。このメソッドの全体的な目標は、permeabilize ゾナ レンチ ウイルス遺伝子導入を容易にするためにレーザーを使用する方法について説明することです。
哺乳類の卵は、受精環境相互作用8,9を制限して多精子侵入に対する受精卵を保護するために、次を固める透明帯によって囲まれています。帯は、胚が胚盤胞と孵化まで胚細胞からレンチを保つバリアを形成します。培養マウスは 4 日後、卵のハッチを受精卵し、孵化仔に正常な開発のための前に偽妊娠マウスに注入する必要があります。したがって、伝達、レンチは、囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースに、ソナから孵化する前に microinjected が。
透明帯はしばしば受精率10を増加する人間の卵子の体外受精のため削除されます。ただし、マウス透明帯の化学取り外しは悪影響マウス胚発生に影響を与えるし、胚細胞11,12に有害であります。マウスの受精卵への遺伝子導入のための他の方法は、細胞核13に DNA の直接によって透明帯障壁を克服します。前核顕微注入は胚に遺伝子を提供する効率的な手段です。ただし、それぞれの胚は、マイクロインジェクションに対して個別に行われている、実践可能性があります骨の折れると初心者ユーザーのため時間がかかる。
エレクトロポレーションや photoporation などの他の方法は過渡の有用であり、短期の遺伝子導入マウス受精卵14,,1516。これらのメソッドは、CRISPR Cas9 コンポーネントとリコンビナーゼを配信に使用される広範囲。しかし、遺伝子組み換えを作成する遺伝子のエレクトロポレーションと photoporation の配信を効率的に使用できません。パンクチャド マウス精巣上体から収集される精子はまた異によって導入、トランスジェニック動物17,18,19、を生成する体外受精用20。
このプロトコルではマウス胚にレンチ ウイルス遺伝子導入はイオン レーザーを用いたゾナによって促進されます。XYClone レーザーは体外受精21と22胚性幹細胞の培養のための援助として開発されました。簡単なセットアップと使いやすい小型の装置です。顕微鏡にインストールされて、それは対物レンズの領域を占有し、付属のソフトにより、顕微鏡の接眼レンズをのぞきながらレーザーを目指して (プロトコルを見なさい: セクション 3)。帯は XYClone レーザによる穴あき、異できます遺伝子配信23の文化メディアに導入します。複数のレンチは、染色体の混入のための複数の遺伝子を同時に提供するされる可能性があります。
このプロトコルを特定する方法を説明し、文化マウス受精卵、透明帯の穿孔のためのレーザーの使用を示しています、レンチによるマウス胚性細胞の情報伝達を示します。
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Protocol
すべての動物の手続きと治療このプロトコルで使われる NIH/NIEHS 動物のケアのガイドラインに遵守しているし、動物ケアと NIH/NIEHS プロトコル 2010年-0004 動物の使用委員会 (ACUC) によって承認されました。
1. 準備
- 興味の遺伝子を運ぶ遺伝子組換えの停留のレンチを準備/購入。この研究では、レンチ SBI511 カイアシ類緑色蛍光蛋白を発現する (copGFP; GFP と略記) 伝達に使用された係数 1 a プロモーターから伸びを。2は作成に使用された標準プロトコルおよび 1e8 変換単位 (TU/mL) よりも高い抗体の力価レンチ。
注: 注意を払い、レンチに接触されているすべての材料を漂白剤します。レンチの安全な使用と処理のための研究所のガイドラインを参照してください。 - 胚を収穫前に一日必要なマウス系統の繁殖ペアをセットアップします。この実験では、マウス c57bl/6 j 菌株を使用しました。雌マウスの卵巣と卵管のコレクションに使用される排卵のためのホルモンと扱われなかった。
- マウス受精卵を収穫する前 2-24 h は次のようにいくつかのカリウム単体最適化中24 (KSOM) ドロップ プレートを準備: 2 ml の 35 mm 培養治療ディッシュとカバーの真ん中に KSOM 媒体の 50 μ L ドロップを追加ジメチルポリシロキサン (DMPS5X)、37 のoC、5% CO25% O2 90% N2で平衡に。
注: は使い捨ての滅菌プレートを使用し、異に露出の後で破棄します。 - 原液から M2 中のヒアルロニダーゼの 1 x ソリューションの準備 (100 x, 30 mg/mL、-20 ° C で保存)。100 x 貯蔵液は、水で調製しました。
- 24 h 投稿レーザーア シスト伝達マウス受精卵、繁殖の偽妊娠雌マウスを準備する、精管の雌雄マウス間ペアを設定してください。
2. 分離マウスの受精卵
- 16-24 h のポストは交尾、交尾の膣にプラグとメスのマウスを選択し、人道的安楽死25。本研究で使用されるマウスは、深い CO2またはイソフルレン吸入下頚部転位によって安楽死されました。
- 卵巣と卵管の標準プロトコル25によると分離します。
- M2 メディアを含む 35 mm ディッシュに卵巣と卵管を転送します。
- それぞれの卵巣の卵丘細胞に囲まれた受精卵を解放する離れて乳頭を引き裂きます。
- 受精卵を転送して 3-5 分間室温でインキュベート 35 mm に卵丘細胞 M2 中 1 x ヒアルロニダーゼを含む料理します。
- ピペットは受精卵丘細胞を解放するために、上下の卵です。
- M2 メディアと上下にヒアルロニダーゼを洗浄するピペットを含む 35 mm ディッシュに受精卵を転送します。
- KSOM ・ ピペット上・下で残りの M2 メディアとヒアルロニダーゼを洗浄を含む 35 mm ディッシュに受精卵を転送します。
- 手順 1.3 から受精卵を準備 KSOM ドロップ プレートに転送します。
注: KSOM のマウス受精卵は、37 ° C、5% CO25% O2と平衡に 90% N2で組織文化のインキュベーターで保たれなければなりません。15 分以上のためのインキュベーターからプレートを削除する被害のことを胚になります。 - インキュベーターで 2 h の次のステップに移動する前に回復する受精卵を許可します。
3. 穿孔マウス受精卵 XYClone レーザー
- セットアップし、製造元の推奨に従って XYClone レーザーを調整します。受精卵を穿孔する XYClone レーザー通常体外受精に使用される他のレーザーを置き換えることができます。
- 顕微鏡のレーザー装置にレーザー コント ローラー ボックスのワイヤを接続します。
- レーザー コント ローラー ボックスを USB ポート経由でレーザー ソフトウェアを実行しているコンピューターに接続します。3.1.3。 レーザー コント ローラーを接続し、それを切り替えます。
- 接眼レンズをのぞき、穿孔テスト サンプル (ガラス スライド上にドライ消去マーキングなど) です。
- (レーザー キットに含まれる) 小さなスクリュー ドライバーを使用して、X を調整して LED に合わせてレーザーの Y 位置顕微鏡の接眼レンズを通して見える光しレーザーを調整します。
- 顕微鏡ステージ上のマウス受精卵を含む KSOM ドロップ プレートを配置します。15 分以上のためのインキュベーター外プレートを保持しません。
- 顕微鏡の接眼レンズに目を通すと、胚の透明帯は、フォーカス、レーザー LED ライトが表示されます。
- LED ライト/レーザーとソナを対象に顕微鏡のステージを移動します。
- コンピュータ ソフトウェアを使用して 250 μ s に XYClone レーザーを設定しました。
- (この実験で 5 を設定) 必要に応じて大きさを LED ライトのサイズを調整します。
- レーザーで三度受精卵の透明帯に穴を開けます。帯かはピアスしたり薄くできます。上記の設定を使用して、レーザーは、10 μ m (図 2) の直径の穴が生成されます。
注: 極体に近い目指して萌芽期細胞からレーザーを近づけない。 - 受精卵培養インキュベーターで 2 h の次のステップに移動する前に回復するを許可します。
4. マウスの伝達受精卵の XYClone レーザー穿孔
- ピペット 2 μ L の濃縮レンチ ウイルス (1e8 TU/mL 価以上) 50 μ L KSOM ドロップに。ないピペットを上下に行います。受精卵は、ピペット先端部に容易に接続します。我々 の経験に基づいて、1e5 5e5 レンチ ウイルス 3 μ L より小さいボリュームの変換単位は、遺伝子デリバリーに最適です。
- 受精卵のインキュベーター内 4 日間の胚盤胞に成長するを許可します。メディアを変更する必要はありません。
5. 擬似妊娠マウスに導入されたマウス胚の非外科的転送
- 1.5 準備した偽妊娠マウス、交尾後 3.5 日を使用します。
- 非外科的胚転送 (小委員会) デバイスを使用して、マウス胚を偽妊娠マウスに注入します。
- 手術や解剖顕微鏡を使用すると、頸を視覚化する腟鏡を挿入します。
- 約 2 μ L のボリュームで子宮頸部と預金の胚に約 5 mm の非外科的胚転送 (小委員会) デバイスを挿入します。
注: 滅菌小委員会デバイスは各転送に使用される、プロシージャの後破棄されます。胚の操作で使用されるすべての試薬は滅菌である必要があります。
- 各偽妊娠マウスに KSOM の 2 μ L のボリュームで 10-15 健康な胚盤胞を転送します。
- 引き続き注視し、小委員会が成功したかどうかを確認する次の日に偽妊娠マウスの体重を測定します。
- 自然出産する妊娠マウスを許可または 17 日胚転送26後帝王子犬を回復します。帝王切開は、非常にいくつかの胚が存在し、彼らは自然出産のため非常に大きくなる必要があります。
- 遺伝子27の率を決定する遺伝子型のための子犬から組織を収集します。
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Representative Results
分離導入マウス受精卵の開発は、(図 1) 毎日顕微鏡下で確認できます。健康な胚は 3-4 日以内の胚盤胞に発展します。このプロトコルでは、未処理の胚の 60-70% は胚盤胞23に発展します。54 114 のレーザー穿孔導入された胚から胚盤胞 (率 47%) へと発展し、46 胚盤胞は、GFP を表明した (46/54 = 85%)23。
マウス胚は、レーザー穿孔収穫の日。レーザー治療に最適の設定された受精卵 1 個につき 3 つの穴と穴 (図 2) を作成する代わりに透明帯を薄く 250 さんレーザーを目指すべき。これは恩恵をそのままカプセル化オスミウム レンチ ウイルス伝達に寛容になっている間に胚をことができます。これらの実験でマウス胚が伸長因子 1 a プロモーターからカイアシ GFP (略称 GFP) を発現する組換えレンチ ウイルスで導入しました。伝達、レンチ ウイルスの 2 uL は培地に導入されました。ウイルスの量が増え、直接、胚胚盤胞23に影響を及ぼす、GFP を発現導入された胚の数が影響を受けます。KSOM ドロップ量の 10% を超えるウイルスのボリュームを「胚盤胞の形成 (例えば50 μ L KSOM ドロップでウイルスの 5 μ L より大きい)」とも悪影響。
実行可能性を検証するため、導入されたマウス胚非外科的偽妊娠マウスに移されました。六つの小委員会イベント、合計 9 遺伝子23の率 75% を産する 12 の合計から GFP トランスジェニック子犬の結果 58 の胚盤胞を転送します。小委員会プロトコルは 30-35% 出生28を実験で観察された 21% の利回りと比較して収量に報告された (12/58)。レンチ ウイルス治療胚発生における役割を果たしたされ低胚転送速度に貢献しています。複数のレンチ ウイルスの統合と GFP の高発現と子犬は青い LED ランプ (465-470 nm) の下で視覚的に緑だった (図 3)。組み込まれた GFP のコピーの数は 0-6 〜 コピーし、子犬組織23からの染色体 DNA の分離の定性 PCR を行うことで決定しました。
図 1: 開発導入されたマウスの受精卵培養。C57bl/6 j マウス受精卵は 0 (収穫された受精卵)、日 1 (2 セル)、日 2 (8-16 セル)、3 日 (桑実胚) と 4 日目 (胚盤胞) の日に監視されました。胚は GFP 遺伝子を運ぶレンチ ウイルスを導入されました。2-3 日目に導入された胚の蛍光の存在が明らかとなった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マウスのレーザー治療は、卵を受精します。透明帯が薄くなる穴対を生成する穿孔の例です。
図 3: GFP を発現するトランスジェニック マウスします。暗いリーダー (DR スポット ランプ、DRSL 9) は、暗い環境での GFP 陽性子犬を視覚化に使用されました。非遺伝子組換えのコントロールの子犬は、コントラストのグループに追加されました。結果子犬 (赤矢印) が誘因と 0-6 から含まれているレンチ ウイルスの遺伝子/GFP のコピー。
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Discussion
彼らのホストのゲノムに統合する、異能力は彼らに安定的に遺伝子配達のための理想的なベクトルをなります。レンチウイルスベクターは、セル固有または誘導性プロモーターや選択マーカー蛍光部分に対応することができます遺伝物質の最大 8.5 プラスミド ペア (kbp) を運ぶことができます。ゲノム剤、宿主ゲノムの一部としてレプリケートすることができます、表現目的の時点でアクティブまたは非アクティブに調整されます。これらのベクトル遺伝子送達のための強力なツールとして開発およびブランドのレンチのさまざまな段階での遺伝子発現の時空間制御を可能にします。
レーザーア シスト レンチ ウイルス遺伝子は、遺伝子発現の生体内で効果的かつ簡単に使用できる方法です。このメソッドは、生体内でタンパク質生産、遺伝子にエンコードされた指標や機能研究の表現の使用できます。他の方法と比較して、レーザーア シスト レンチ ウイルス遺伝子導入前核顕微注入として有効ですが、技術的なスキルや高価なマイクロインジェクション ワークステーションは必要ありません。XYClone レーザーは小型、ポータブル、およびいくつかの研究所の間で簡単に共有することができます。
レーザーア シスト レンチ ウイルス遺伝子導入は安定していない一時的なエレクトロポレーションや受精卵の photoporation のように。拡張表現が異常な結果につながる可能性がありますので、一過的遺伝子配達は CRISPR Cas9 コンポーネントまたはリコンビナーゼの配信のためのより多くの利点です。このプロトコル マウス受精卵の一時的な情報伝達のため、インテグラーゼの欠乏レンチ (IDLVs) が代わりにできます。IDLVs は、レンチ ウイルスの感染性を保持が異29の統合機能の一部 (8% 未満) を保持します。レンチ ウイルス遺伝子のレーザは、彼らの目的の結果に基づく、ユーザー評価の追加遺伝子配信オプションです。
レンチ ウイルス伝達の最大の難点は、配信の遺伝子をランダムに挿入です。また、同じ胚内のセルは、transgenic におけるモザイクにつながる複数のレンチ ウイルス統合をホスト可能性があります。子孫の遺伝子型と複数回計画的繁殖の単一の遺伝子座の遺伝子組換え動物を確立する必要です。同様の繁殖戦略はまた、従来の遺伝子導入方法30で用いられます。
このプロトコルの重要なステップは、レーザー穿孔に費やされた時間の長さです。KSOM の培養マウス受精卵は、15 分以上のためのインキュベーター外維持できません。初心者ユーザーが M2 の中に受精卵を移動、KSOM 胚中の高度なか板あたりの胚の数を制限します。我々 の結果によると 47% 導入された培養マウス受精卵の胚盤胞23に発展します。したがって、プレートごと 30 40 受精卵の培養は十分な数の偽妊娠マウスへの伝達のための 1 つのプレートで導入された胚盤胞になります。
マウス受精卵の透明帯のレーザ穿孔がまた他の種の帯を適用する、ウイルスやトランスフェクション試薬の他の種類の入力を許可します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立研究所の健康 (NIH)、国立環境衛生研究所 (NIEHS) の学内研究プログラムによって支えられました。原稿および有用な助言の批判的な読みの博士ロバート Petrovich と博士ジェイソン ・ ウィリアムスに感謝しております。認め、博士ベルント光沢、ノックアウト コア、フローサイトメトリーの流れ設備、蛍光顕微鏡とイメージング センター、彼らの技術的な貢献のため、NIEHS の比較医学支店設備を感謝も申し上げます。比較医学支店から氏デビッド グールディングと写真やイラストをご提供する NIEHS イメージング センターさんロイス Wyrick に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
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