Summary
Ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene. Este artículo describe un protocolo para perforar la zona con un láser para transducir las células embrionarias con vectores lentivirales y crear ratones transgénicos.
Abstract
Lentiviruses son eficientes vectores para la entrega de genes a células de mamíferos. Después de transducción, el genoma lentivirales estable se incorpora en el cromosoma del huésped y se pasa a la progenie. Así, son vectores ideales para la creación de líneas celulares estables, en vivo entrega de indicadores y transducción de los huevos sola célula fertilizada para crear animales transgénicos. Sin embargo, ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene lentivirales. Lentiviruses son demasiado grandes para penetrar en la zona y por lo general son entregados por microinyección de partículas virales en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias. El requisito para tecnólogos altamente capacitados y equipo especializado ha minimizado el uso de lentiviruses para la entrega de genes a los embriones de ratón. Este artículo describe un protocolo para permeabilizing los huevos fertilizado de ratón por la zona de perforación con láser. Perforación del laser no produce ningún daño a los embriones y permite lentiviruses acceder a las células embrionarias para la entrega del gene. Transduced embriones pueden convertirse en blastocistos in vitro y si implantados en ratones seudopreñadas, convertirse en crías transgénicas. El láser utilizado en este protocolo es eficaz y fácil de usar. Entregado por lentivirus estable los genes incorporan células embrionarias de ratón y son germinales transmisibles. Se trata de un método alternativo para la creación de ratones transgénicos que no requiere micromanipulación y microinyección de huevos fertilizados.
Introduction
Este método proporciona instrucciones detalladas para permeabilizing la zona pelúcida de los huevos fertilizado de ratón para acercar a las células embrionarias para la entrega del gene por lentivirus. Lentiviruses son diseñados por naturaleza para la entrega eficaz de genes a células de mamíferos. Infectar células divisorias y no se dividen e integrar el genoma lentivirales su anfitrión cromosomas1. La gama de las células del huésped lentivirales se expande fácilmente por pseudotyping los lentivirus recombinante con la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), debido al amplio tropismo del VSV-G proteína2. Después de transducción, lentivirales genes estable están integrados y expresados como parte de sus cromosomas de host creando una herramienta ideal para la generación de animales transgénicos. Si se entrega a las células embrionarias de la etapa temprana, el genoma lentivirales es replica y expresa en todo el organismo. Transducción de lentivirales ha llevado a la producción de ratones, rata, pollo, codorniz y cerdo3,4,5,6,7 entre otras especies de transgénicos. El método típico de la entrega del gene lentivirales, sin embargo, requiere de técnicos especializados y equipo especializado para superar la barrera de la zona pelúcida que encapsula los embriones de etapa temprana. El objetivo general de este método es describir cómo permeabilizar la zona usando un laser para facilitar la entrega del gene lentivirales.
Huevos de mamíferos están rodeados por la zona pelúcida que se endurece después de fertilización para proteger los huevos fertilizados contra polyspermy y limitar las interacciones ambientales8,9. La zona forma una barrera que aleja de lentiviruses las células embrionarias hasta que los embriones están sombreados como blastocisto. Cultivado ratón fertilizado los huevos traman después de 4 días y debe ser implantado en ratones seudopreñadas antes de incubación para el desarrollo normal en los cachorros. Por lo tanto, para la transducción, los lentiviruses son microinyectados antes de la eclosión de la zona en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias.
La zona pelúcida se quita a menudo para fertilización in vitro de óvulos humanos para aumentar la tasa de fertilización del10. Sin embargo, remoción química de ratón zona pelúcida adversamente afecta el desarrollo del embrión de ratón y es perjudicial para las células embrionarias11,12. Otros métodos para la entrega de genes en huevos fertilizado de ratón superan la barrera de la zona pelúcida por microinyección directa de ADN en el núcleo de la célula del13. Microinyección pronuclear es un medio eficaz de entrega de genes a los embriones. Sin embargo, puesto que cada embrión se lleva a cabo en el lugar individualmente para microinyección, la práctica puede ser laborioso y desperdiciador de tiempo para un usuario novicio.
Otros métodos como la electroporación y photoporation son útiles para transitorio y a corto plazo entrega de genes ratón fertilizado huevos14,15,16. Estos métodos son ampliamente utilizados para la entrega de recombinasas y CRISPR Cas9 componentes. Sin embargo, electroporación y photoporation entrega de genes no puede utilizarse eficazmente para crear transgénicos. Espermatozoides que se recogen del epidídimo de ratón pinchado también pueden ser transduced por lentivirus y utilizados para la fertilización in vitro para producir animales transgénicos17,18,19, 20.
En el presente Protocolo, la entrega del gene lentivirales a embriones de ratón facilita permeabilizing la zona utilizando un láser. El láser de XYClone fue desarrollado como una ayuda para el cultivo de células madre embrionarias22y en vitro fecundación21 . Es un aparato pequeño que es fácil de configurar y fácil de usar. Una vez instalado en un microscopio, que ocupa el espacio de un objetivo y permite que el software que lo acompaña para apuntar el láser mientras mira a través de los oculares del microscopio (ver Protocolo: la sección 3). Una vez que la zona está perforado por el láser de XYClone, lentivirus pueden introducirse en los medios de cultivo para gene entrega23. Lentiviruses múltiples podrían utilizarse para ofrecer simultáneamente varios genes cromosómicos incorporación.
Este protocolo describe cómo aislar y cultura ratón huevos fertilizados, muestra el uso del laser para la perforación de la zona pelúcida y demuestra la transducción de células embrionarias de ratón por lentivirus.
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Protocol
Todos los animales procedimientos y tratamientos que se utilizan en este protocolo fueron cumpliendo con las directrices de cuidado de los animales de NIH/NIEHS y fueron aprobados por el cuidado Animal y el Comité uso (ACUC) en el NIH/NIEHS, Animal protocolo 2010-0004.
1. preparaciones
- Prepara o compra recombinantes lentivirus no multiplicación llevando tu gen de interés. En este estudio, lentivirus SBI511 expresan la proteína fluorescente verde de copépodo (copGFP; abreviado a GFP) de un alargamiento factor 1a promotor fue usado para la transducción. Protocolos estándar2 fueron utilizados para producir y lentivirus título a concentraciones superiores de 1e8 transductoras unidades por mL (TU/mL).
Nota: Tenga cuidado y blanquear todo el material que han estado en contacto con lentivirus. Consulte las directrices de su Instituto para el uso y manejo de los lentivirus. - Configurar pares de crianza de la cepa de ratón deseado el día antes de la cosecha de embriones. En este experimento, se utilizó la cepa C57BL/6J de ratones. Utilizado para la colección de oviducto y los ovarios de ratones femeninos no fueron tratados con cualquier hormonas para la ovulación múltiple.
- 2 – 24 h antes de la cosecha de huevos fertilizado de ratón, prepare varias placas de gota de24 (KSOM) potasio simple optimizado medio como sigue: Añadir una gota de 50 μL de medio KSOM en el centro de un plato de cultivo de tejidos tratados de 35 mm y cubrir con 2 mL de Dimetilpolisiloxano (DMPS5X) y en lugar a 37 oC, 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 se equilibren.
Nota: Utilizar platos desechables estériles y desechar después de la exposición a lentivirus. - Preparar 1 x solución de hialuronidasa en medio M2 de solución madre (100 x, 30 mg/mL, almacenar a-20 ° C). 100 x solución fue preparada en agua.
- 24 h post transducción asistida por láser de huevos fertilizado de ratón, configurar pares entre ratones machos y hembras vasectomía preparar seudopreñadas ratones hembra de cría.
2. aislamiento del ratón huevos fertilizados
- 16 – 24 h post apareamiento, seleccione ratones hembra con tapones vaginales indicativos del éxito de apareamiento y eutanasia humanamente25. Los ratones utilizados en este estudio fueron sacrificados por dislocación cervical bajo CO2 o isoflurano inhalación profunda.
- Aislar los ovarios y oviductos según protocolos estándar25.
- Transferencia de los ovarios y oviductos en un plato de 35 mm que contiene medios M2.
- Para cada ovario, rasgón ampolla aparte para liberar óvulos fecundados rodeados de células del cúmulo.
- Transferencia de óvulos fecundados y células del cúmulo a un 35 mm plato que contiene hialuronidasa de x 1 en medio M2 e incuban a temperatura ambiente durante 3 a 5 min.
- Pipeta fertilizan huevos hacia arriba y hacia abajo para liberar las células del cúmulo.
- Transferencia de óvulos fecundados a un plato de 35 mm que contiene la pipeta hacia arriba y hacia abajo para lavar hialuronidasa y medios M2.
- Transferencia de óvulos fecundados a un plato de 35 mm que contiene KSOM y pipeta hacia arriba y hacia abajo para lavar los restantes medios de M2 y la hialuronidasa.
- Transferir huevos fertilizados a las placas de gota KSOM preparadas en el paso 1.3.
Nota: Los huevos fertilizado de ratón en KSOM deben guardarse en una incubadora de cultivo de tejidos en 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 se equilibren. Quitar las placas de la incubadora durante más de 15 minutos puede causar daños a los embriones. - Permiten huevos fertilizados recuperar durante 2 horas en la incubadora antes de pasar al siguiente paso.
3. perforación de ratón fertilizado huevos con XYClone láser
- Configurar y calibrar el laser de XYClone según las recomendaciones del fabricante. Otros láseres, que generalmente se utilizan para fertilización in vitro , pueden sustituirse por XYClone láser para perforar huevos fertilizados.
- Conecte el cable de caja de controlador de láser para el aparato de láser en el microscopio.
- Fije la caja del regulador del laser para el equipo que ejecuta el software del láser mediante un puerto USB. 3.1.3. Enchufe el controlador láser y enciéndalo.
- Mira por el ocular, perforar una muestra (p. ej. marcas de borrado en seco en un portaobjetos de vidrio).
- Utilice un destornillador pequeño (incluido en el kit de láser) para ajustar el X y Y del laser para que coincida con el LED de luz visible a través del ocular del microscopio y calibrar el láser.
- Coloque una placa de gota KSOM que contengan huevos fertilizado de ratón en la platina del microscopio. No mantenga la placa fuera de la incubadora durante más de 15 minutos.
- Mire por el ocular del microscopio y zona pelúcida del embrión está en foco y el láser de luz LED es visible.
- Mover la platina del microscopio a la zona con la luz del LED/laser.
- Utilizando el programa informático conjunto XYClone láser a 250 μs.
- Ajustar el tamaño de luz de LED a las dimensiones deseadas (posición 5 en este experimento).
- Perforar la zona de cada óvulo fecundado tres veces con el láser. La zona puede ser traspasado o adelgazado. Utilizando la configuración de arriba, el láser produce un orificio con un diámetro de 10 μm (figura 2).
Nota: Con el objetivo de cerca el cuerpo polar aleja láser las células embrionarias. - Permiten huevos fertilizados recuperar durante 2 horas en la incubadora de cultivo de tejidos antes de pasar al siguiente paso.
4. transducción de señales del ratón fertilizado huevos sigue la perforación láser de XYClone
- Pipeta 2 μL de lentivirus concentrado (mayor que el título de 1e8 TU/mL) sobre la gota KSOM de 50 μL. No no la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Huevos fertilizados se conecte fácilmente a la punta de la pipeta. Basándonos en nuestra experiencia, 1e5 5e5 unidades transductoras de lentivirus en un volumen de menos de 3 μL es óptimo para la entrega del gene.
- Permiten huevos fertilizados convertirse en blastocistos por 4 días en la incubadora. No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación.
5. non-surgical transferencia de embriones de ratón Transduced ratones pseudo-embarazada
- Utilizar ratones seudopreñadas, día 3,5 después de aparearse, preparado en el paso 1.5.
- Utilice el dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET) para implantar embriones de ratón en ratones seudopreñadas.
- Utilizando un microscopio quirúrgico o disección, insertar un espéculo vaginal para visualizar el cuello uterino.
- Inserte el dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgico (NSET) aproximadamente 5 mm en el cuello uterino y depósito de embriones en un volumen de aproximadamente 2 μL.
Nota: Un dispositivo estéril de NSET es utilizado para cada transferencia y desechado después del procedimiento. Todos los reactivos utilizados en la manipulación de los embriones deben ser estériles.
- Transferencia de blastocistos saludables 10 – 15 en el volumen 2 de μL de KSOM cada ratones seudopreñadas.
- Seguir supervisar y medir la ganancia de peso en ratones seudopreñadas en próximos días para determinar si el NSET fue exitosa.
- Recuperar cachorros por que los ratones embarazados a dar a luz naturalmente o realizar una cesárea 17 días después el embrión transferir26. Una cesárea es a menudo necesaria si existen muy pocos embriones y crecen demasiado grandes para el parto natural.
- Obtener tejido de cachorros para la genotipificación para determinar la tasa de transgénesis27.
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Representative Results
Desarrollo de los huevos fertilizado de ratón aislados/transduced puede comprobarse diariamente al microscopio (figura 1). Embriones sanos convierten en blastocisto dentro de 3 a 4 días. En este protocolo, 60 – 70% de los embriones convertirse en blastocisto23. De embriones transduced perforada por láser 114, 54 convertido en blastocisto (tasa del 47%) y 46 blastocistos expresan GFP (46/54 = 85%)23.
Los embriones de ratón fueron perforada por láser en el día de la cosecha. El ajuste óptimo para el tratamiento de láser era 3 agujeros por el óvulo fertilizado y Sra. 250 el láser debe encaminarse para hacer que la zona en lugar de crear un agujero (figura 2). Esto permite que los embriones en desarrollo se beneficien de un encapsulado intacto zona pelúcida volviéndose permisiva a la transducción lentivirales. En estos experimentos, embriones de ratón fueron transduced con un lentivirus recombinante que expresa copépodo GFP (GFP abreviado) de un promotor de 1a del factor de elongación. Para transducción de señales, 2 uL de lentivirus se introdujo en los medios de cultivo. Aumento de la cantidad de virus, afecta directamente el número de embriones transduced que expresan GFP al afectar negativamente el desarrollo del embrión a blastocisto23. Mayores que 10% del volumen de gota KSOM virales volúmenes afectaría también negativamente formación del blastocisto (p. ej. mayor de 5 μL del virus en una gota KSOM 50 μL).
Para validar la viabilidad, embriones de ratón transduced no quirúrgico fueron transferidos a ratones seudopreñadas. Seis diferentes eventos NSET, transfiriendo un total de 58 blastocistos, dio lugar a 9 cachorros transgénicos GFP de total de 12, obteniendo 75% porcentaje de transgénesis 23. El protocolo NSET se divulga para 30-35% nacidos vivos28 comparado con el 21% de rendimiento observados en nuestros experimentos (12/58). El tratamiento lentivirales puede han desempeñado un papel en el desarrollo del embrión y contribuyó a la tasa de transferencia de embriones bajo. Cachorros con múltiples integraciones lentivirales y alta expresión de GFP eran visualmente verdes bajo una lámpara de LED azul (465-470 nm) (figura 3). El número de copias GFP incorporados oscilan entre 0-6 copias y se determinó al realizar la PCR cualitativa de aislado ADN cromosómico del perrito tejido23.
Figura 1: desarrollo de Transduced ratón fertilizado huevos en cultura. Los huevos fertilizado de ratón de C57BL/6J fueron monitoreados en el día 0 (huevo fertilizado cosechado), día 1 (dos células), día 2 (8-16 células), día 3 (mórula) y 4 días (blastocisto). Los embriones fueron transduced con un lentivirus que porta un gen GFP. Presencia de fluorescencia en embriones de transduced se hizo evidente, por día 2-3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tratamiento con láser del ratón fertilizado huevos. Ejemplos de perforar la zona para producir un agujero vs adelgazamiento de la zona.
Figura 3: ratones transgénicos que expresan GFP. Lector oscuro (DR Spot lámpara, DRSL-9S) fue utilizado para visualizar cachorros positivo GFP en un ambiente oscuro. Cachorros de control no-transgénicas fueron agregados al grupo de contraste. Los cachorros resultantes (flechas rojas) fueron genotipados y contenida de 0-6 copias de lo genes/GFP lentivirales.
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Discussion
La capacidad de los lentivirus para integrarse en su genoma de host hace un vector ideal para genes estable. Vectores lentivirales pueden llevar hasta 8,5 pares del kilobase (kbp) de material genético que puede acomodar a promotores celulares específicos o inducibles, marcadores o moléculas fluorescentes. Incorporado material genómico puede replicar como parte de su genoma huésped y regularse para expresar o desactivar en puntos de tiempo deseado. Estos vectores permiten control spatiotemporal sobre expresión génica en las distintas etapas de desarrollo y lentivirus marca como herramientas poderosas para la entrega del gene.
Transgénesis lentivirales asistida por láser es un método efectivo y fácil de usar para la expresión de genes en vivo. Este método puede ser utilizado para en vivo la producción de proteínas, expresión de indicadores genético codificados o estudios funcionales. En comparación con otros métodos, genes lentivirales asistida con láser es tan eficaz como la microinyección pronuclear pero no requieren habilidades técnicas o estaciones de trabajo de microinyección costosos. El láser de XYClone es pequeño, portátil y puede ser fácilmente compartida entre varios laboratorios.
Genes lentivirales asistida por láser es estable y no transitoria, como en electroporación o photoporation de huevos fertilizados. Transitoria de genes es más ventajas para la entrega de componentes CRISPR Cas9 o recombinasas ya extendida expresión podría conducir a consecuencias aberrantes. En el presente Protocolo, las integrasa deficiente lentivirus (IDLVs) pueden sustituirse por transducción transitoria de huevos fertilizado de ratón. IDLVs conservan infectividad lentivirales pero conservar sólo una fracción (menos del 8%) de la capacidad integradora de lentiviruses29. Transgénesis lentivirales asistida por láser es una opción de entrega de genes adicionales para los usuarios evaluar basado en su resultado deseado.
La desventaja principal de lentivirales de transducción es la inserción al azar del gen entregado. Además, las células en el embrión mismo podrían alojar múltiples integraciones lentivirales que conduce a mosaicismo en los transgénicos. Genotipificación de la progenie y múltiples rondas de la cría planificada son necesarios establecer un animal transgénico solo locus. Estrategias de crianza similares se emplean también en métodos de transgénesis convencional30.
Un paso crítico en este protocolo es la longitud del tiempo empleado en la perforación del laser. Huevos fertilizado de ratón cultivadas en KSOM no se puede mantener fuera de la incubadora durante más de 15 minutos. Un usuario novicio debe mover los huevos fertilizados a medio M2, uso avanzado KSOM embrión medio o limitar el número de embriones por placa. Según nuestros resultados, el 47% de huevos de ratón cultivadas transduced fertilizado convertirse en blastocistos23. Por lo tanto, cultivo de 30-40 huevos fertilizados por placa garantizará suficiente número de blastocistos transduced en una placa de transferencia en ratones seudopreñadas.
Perforación láser-asistida de la zona de huevos fertilizado de ratón también puede ser aplicable a la zona de otras especies y permitir la entrada de otros tipos de virus o de reactivos de transfección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS). Agradecemos al Dr. Robert Petrovich y Dr. Jason Williams lectura crítica del manuscrito y consejos útiles. También nos gustaría reconocer y agradecer a Dr. Bernd Gloss, el núcleo de octavos de final, el servicio de citometría de flujo, la microscopía de fluorescencia y centro de la imagen y las instalaciones de la rama de medicina comparativa de la NIEHS por sus contribuciones técnicas. Nos gustaría agradecer al Sr. David Goulding desde la rama de medicina comparativa y la Sra. Lois Wyrick del centro de la imagen en el NIEHS por facilitarnos fotografías e ilustraciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
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