Summary
Mus befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot gen leverans. I artikeln beskrivs ett protokoll för perforering av zona med laser transduce embryonala celler med lentiviral vektorer och skapa transgena möss.
Abstract
Lentiviruses är effektiva vektorer för gen leverans till däggdjursceller. Efter transduktion, lentiviral genomet är stabilt införlivas med kromosomen värd och förs vidare till avkomman. Således, är de idealiska vektorer för skapandet av stabila cellinjer, i vivo leverans av indikatorer och transduktion enda cell befruktade ägg att skapa transgena djur. Men musen befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot lentiviral gen leverans. Lentiviruses är för stora för att tränga in i zona och levereras vanligtvis av Mikroskop av viruspartiklar in perivitelline kaviteten, avståndet mellan zona och embryonala celler. Kravet på högutbildade tekniker och specialutrustning har minimerat användningen av lentiviruses för gen leverans till musembryon. I artikeln beskrivs ett protokoll för permeabilizing mus befruktade ägg av perforering i zona med laser. Laserperforering resulterar inte i någon skada embryon och tillåter lentiviruses att få tillgång till embryonala celler för gen leverans. Sensorik embryon kan utvecklas till blastocysten in vitro och om implanteras i pseudopregnant möss, utvecklas till transgena pups. Den laser som används i detta protokoll är effektiv och lätt att använda. Gener som levereras av lentiviruses stabilt införliva mus embryonala celler och är könsceller överförbara. Detta är en alternativ metod för skapandet av transgena möss som kräver ingen mikromanipulation och Mikroskop av befruktade ägg.
Introduction
Denna metod ger detaljerade anvisningar för permeabilizing zona pellucida mus befruktade ägg att göra embryonala celler tillgängligt för gen leverans genom lentiviruses. Lentiviruses är designad av naturen för effektiv gen leverans till däggdjursceller. De infektera avdelande och icke-dela celler och integrera deras värd kromosomerna1lentiviral genomet. Lentiviral värd cellintervallet utökas lätt genom pseudotyping den rekombinanta lentivirus med den vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSV-G), på grund av den breda tropism av VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener är stabilt integrerat och uttryckt som del av deras värd kromosomer skapar ett idealiskt verktyg för att generera transgena djur. Om levereras till tidiga skede embryonala celler, lentiviral genomet replikeras och uttryckt i hela organismen. Lentiviral transduktion har lett till produktionen av möss, råttor, kyckling, vaktel och gris3,4,5,6,7 bland andra arter av transgenics. Den typiska lentiviral gen leverans, dock kräver skickliga tekniker och specialutrustning för att övervinna den zona pellucida barriär som kapslar in de tidiga skede embryona. Det övergripande målet med denna metod är att beskriva hur man permeabilize de zona använder en laser för att underlätta lentiviral gen leverans.
Däggdjur ägg är omgivna av zona pellucida som stelnar efter befruktning att skydda de befruktade äggen mot polyspermy och begränsa miljösamspel8,9. Zona bildar en barriär som håller lentiviruses borta från de embryonala cellerna tills embryon har kläckts som en blastocyst. Odlade mus befruktade äggen kläcks efter 4 dagar och måste implanteras i pseudopregnant möss före kläckningen för normal utveckling till valpar. Därför för transduktion, är lentiviruses microinjected före kläckningen från zona in i det perivitelline hålet, avståndet mellan zona och embryonala celler.
Zona pellucida är ofta bort för in vitro- befruktning av ägg från människa att öka de befruktning ränta10. Dock kemisk borttagning av mus zona pellucida negativt påverkar mus embryots utveckling och är skadligt för embryonala celler11,12. Andra metoder för genterapi leverans till mus befruktade ägg övervinna zona pellucida barriären av direkta Mikroskop av DNA i cellen kärna13. Pronukleär Mikroskop är ett effektivt sätt att leverera gener till embryon. Eftersom varje embryo hålls på plats individuellt för Mikroskop, kan praxis dock mödosamt och tidskrävande för en novis användare.
Andra metoder såsom elektroporation och photoporation är användbara för övergående och kortvariga gen leverans till mus befruktade ägg14,15,16. Dessa metoder används i stor utsträckning för att leverera CRISPR-Cas9 komponenter och rekombinaser. Elektroporation och photoporation leverans av gener inte kan dock användas effektivt skapa transgenics. Spermier som samlas in från punkterad mus bitestiklarna kan också sensorik av lentiviruses och används för in vitro- befruktning för att producera transgena djur17,18,19, 20.
I detta protokoll underlättas lentiviral gen leverans till musembryon av permeabilizing i zona med hjälp av en laser. XYClone lasern utvecklades som ett stöd för in vitro- fertilisering21 och odling av embryonala stamceller22. Det är en liten apparat som är enkel att installera och lätt att använda. En gång installerat på ett mikroskop, det upptar utrymmet av en objektiv och den medföljande programvaran tillåter för att sikta lasern medan du tittar i Mikroskop okularen (se protokoll: avsnitt 3). När zona är perforerad av XYClone lasern, kan lentiviruses införas i kultur media för gen leverans23. Flera lentiviruses kunde användas samtidigt leverera flera gener för kromosomala iblandning.
Detta protokoll ska beskriva hur man isolera och kultur mus befruktade ägg, illustrerar användningen av laser för perforering av zona pellucida och visar transduktion mus embryonala celler av lentiviruses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden och behandlingar som används i detta protokoll var enligt NIH/NIEHS djurvård riktlinjer och godkändes av djur vård och användning kommittén (ACUC) på den NIH/NIEHS, djur protokoll 2010-0004.
1. förberedelser
- Förbereda/köp rekombinant icke-föröknings lentiviruses transporterar din gen av intresse. I denna studie, lentivirus SBI511 uttrycker hoppkräftor grönt fluorescerande protein (copGFP; förkortas till GFP) från en töjning faktor 1a arrangören användes för transduktion. Standardprotokoll2 användes för att producera och antikroppnivåns lentiviruses på titrar högre än 1e8 transducing-enheter per mL (TU/mL).
Obs: Försiktig och bleker allt material som har varit i kontakt med lentiviruses. Hänvisas till din institutets riktlinjer för säker användning och hantering av lentiviruses. - Setup häckande par av önskad mus stam dagen innan skörd embryon. I detta experiment användes C57BL/6J stam av möss. Honmöss som används för äggstockarna och äggledaren samling behandlades inte med några hormoner för superovulation.
- 2 – 24 h före skörd mus befruktade ägg, förbereda flera kalium Simplex optimerad Medium24 (KSOM) släpp plattor enligt följande: Lägg till en 50 μL droppe KSOM medium till mitten av en 35 mm vävnadsodling-behandlade skålen och täck med 2 mL Dimetylpolysiloxan (DMPS5X) och sker på 37 oC, 5% CO2, 5% O2 och 90% N2 temperera.
Obs: Använd sterila engångstallrikar och kassera efter exponering för lentiviruses. - Bered 1 x lösning av hyaluronidas i M2 medium från stamlösning (100 x, 30 mg/mL, förvaras vid-20 ° C). 100 x stamlösning förbereddes i vatten.
- 24 h efter laser-assisterad transduktion mus befruktade ägg, ställa in häckande par mellan vasektomerade manliga och kvinnliga möss att förbereda pseudopregnant honmöss.
2. isolering av mus befruktade ägg
- 16 – 24 h efter parning, Välj honmöss med vaginal pluggar vägledande för lyckad parning och humant sätt avliva25. De möss som används i denna studie var euthanized av cervikal dislokation under djupa CO2 eller isofluran inandning.
- Isolera äggstockarna och oviducts enligt standardprotokoll25.
- Överföra äggstockarna och oviducts till en 35 mm maträtt som innehåller M2 media.
- För varje äggstock, riv ampulla isär för att släppa befruktade ägg omgiven av cumulus celler.
- Överföra befruktade ägg och cumulus celler till en 35 mm maträtt som innehåller 1 x hyaluronidas i M2 medium och odla i rumstemperatur i 3 – 5 min.
- Pipettera befruktade ägg upp och ner för att släppa cumulus cellerna.
- Överföra befruktade ägg till en 35 mm maträtt som innehåller M2 media och Pipettera upp och ner för att tvätta bort hyaluronidas.
- Överföra befruktade ägg till en 35 mm maträtt som innehåller KSOM och Pipettera upp och ner för att tvätta bort återstående M2 media och hyaluronidas.
- Överföra befruktade ägg till beredda KSOM släpp plattorna från steg 1.3.
Obs: Mus befruktade ägg i KSOM måste hållas i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 och 90% N2 temperera. Ta bort plattor från inkubatorn längre än 15 min kommer att resultera i skada embryon. - Tillåta befruktade ägg att återvinna för 2 h i inkubatorn innan du flyttar till nästa steg.
3. perforering av mus befruktade ägg med XYClone Laser
- Setup och kalibrera XYClone laser enligt tillverkarens rekommendation. Kan ersätta andra lasrar, som vanligtvis används för in vitro- fertilisering, XYClone laser för att perforera befruktade ägg.
- Fäst laser controller låda tråden laser apparaten på mikroskopet.
- Fäst rutan laser controller till datorn som kör laser programvaran via en USB-port. 3.1.3. Anslut laser handkontrollen och slå på den.
- Tittar genom okularet, perforera ett prov (t.ex. torr-radera markeringar på en glasskiva).
- Använd en liten skruvmejsel (ingår i laser kit) för att justera X och Y-position av laser för att matcha LED lätt synlig genom mikroskopet okularet och kalibrera lasern.
- Placera en KSOM släppa plattan innehåller mus befruktade ägg på Mikroskop scenen. Förvara inte plattan utanför inkubatorn längre än 15 min.
- Titta igenom Mikroskop okularet och säkerställa att embryots zona pellucida är i fokus och laser LED-lampan är synlig.
- Flytta Mikroskop scenen att rikta zona med LED ljus/laser.
- Med hjälp av datorprogramvara inställt XYClone laser 250 μs.
- Justera storleken LED ljus till önskade dimensioner (inställning 5 i detta experiment).
- Perforera zona av varje befruktat ägg trefalt med laser. Zona kan genomborrat eller tunnas. Använder inställningarna ovan, kommer att lasern producera ett hål med en diameter av 10 μm (figur 2).
Obs: Sikte nära polar kroppen håller laser från embryonala cellen. - Tillåta befruktade ägg att återvinna för 2 h i vävnadsodling inkubatorn innan du flyttar till nästa steg.
4. transduktion mus befruktade ägg efter XYClone laserperforering
- Pipettera 2 μL av koncentrerad lentivirus (större än 1e8 TU/mL titer) till 50 μL KSOM drop. Gör inte Pipettera upp och ner. Befruktade ägg fäster lätt till Pipettera spetsen. Baserat på vår erfarenhet, 1e5-5e5 transducing enheter av lentivirus i en volym som är mindre än 3 μL är optimal för gen leverans.
- Tillåta befruktade ägg utvecklas till blastocyst i 4 dagar i inkubatorn. Du behöver inte ändra media.
5. icke-kirurgiska överföring av sensorik musembryon till pseudo dräktiga möss
- Använd pseudopregnant möss, 3,5 dag efter parning, bereddes i steg 1,5.
- Använda icke-kirurgisk Embryo Transfer (NSET) enhet för att implantatet musembryon i pseudopregnant möss.
- Använder ett kirurgiskt eller dissekera Mikroskop, infoga ett spekulum att visualisera livmoderhalsen.
- Infoga icke-kirurgisk Embryo Transfer (NSET) enheten cirka 5 mm i livmoderhalsen och insättning embryon i en volym på cirka 2 μL.
Obs: En steril NSET enhet används för varje överföring och kasseras efter ingreppet. Alla reagenser som används i manipulering av embryon måste vara sterila.
- Överför 10 – 15 friska blastocysten i 2 μL volym av KSOM till varje pseudopregnant möss.
- Fortsätta att övervaka och mäta viktökning i pseudopregnant möss följande dagar för att avgöra om NSET var framgångsrik.
- Återvinna pups genom att låta de dräktiga möss att föda naturligt eller utföra ett kejsarsnitt 17 dagar efter att embryot överföra26. Ett kejsarsnitt är ofta nödvändigt om mycket få embryon är närvarande och de växer alltför stora för naturlig födelse.
- Samla vävnad från pups för genotypning att avgöra graden av genmodifiering27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utveckling av isolerade/sensorik mus befruktade ägg kan kontrolleras under mikroskopet dagligen (figur 1). Friska embryon utvecklas till blastocyst inom 3 – 4 dagar. I detta protokoll utvecklas 60 – 70% av obehandlade embryon till blastocyst23. Av 114 laser-perforerade sensorik embryon, 54 utvecklats till blastocyst (andelen 47%) och 46 blastocyster uttryckt GFP (46/54 = 85%)23.
Musembryon var laser-perforerade på dagen för skörd. Optimal inställning för laserbehandling var 3 hål per befruktade ägg och 250 ms. lasern bör riktas till tunna i zona istället för att skapa ett hål (figur 2). Detta gör att utveckla embryon till nytta en intakt kapsla in zona pellucida samtidigt som de blir tillåtande till lentiviral transduktion. I dessa experiment, var musembryon sensorik med en rekombinant lentivirus som uttryckt hoppkräftor GFP (förkortat GFP) från en elongation factor 1a arrangören. Transduktion infördes 2 uL av lentivirus i kultur media. Öka mängden virus, påverkas direkt antalet sensorik embryon som uttryckte GFP medan negativt påverkar embryots utveckling i blastocysten23. Viral volymer som är större än 10% av KSOM droppe volym skulle också negativt påverka blastocysten bildandet (t.ex. större än 5 μL av virus i en 50 μL KSOM droppe).
För att validera livskraft, överfördes sensorik musembryon icke-kirurgiskt pseudopregnant möss. Sex separata NSET händelser, överföra totalt 58 blastocyst, resulterade i 9 GFP transgena valpar av totalt 12, vilket ger 75 procent av genmodifiering 23. NSET protokollet rapporteras ge 30-35% levande födda28 jämfört med 21% avkastning som observerades i våra experiment (12/58). Lentiviral behandling kan ha spelat en roll i embryots utveckling och bidragit till låg embryot överföringshastigheten. Valpar med flera lentiviral integrationer och högt uttryck av GFP var visuellt gröna under en blå LED-lampan (465-470 nm) (figur 3). Antalet ingående GFP kopior varierade från 0-6 kopior och bestämdes genom att utföra kvalitativ PCR på isolerade kromosomala DNA från pup vävnad23.
Figur 1: utvecklingen av sensorik mus befruktade ägg i kultur. C57BL/6J mus befruktade äggen övervakades på dag 0 (skördade befruktade ägg), dag 1 (två-cell), dag 2 (8-16 celler), dag 3 (morula) och dag 4 (blastocysta). Embryon var sensorik med ett lentivirus som bär en GFP-genen. Förekomsten av fluorescens i sensorik embryon blev uppenbart vid dag 2-3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Laser-behandling av mus befruktade ägg. Exempel på perforering i zona för att producera en hål vs gallring av zona.
Figur 3: transgena möss uttrycker GFP. Mörka läsare (DR Spot lampa, DRSL-9S) användes för att visualisera GFP positiva valpar i en mörk miljö. Icke-transgena kontroll pups har lagts till gruppen för kontrast. Resulterande valpar (röda pilar) var genotypbestämts och innehöll från 0-6 kopior av den lentiviral genen/GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lentiviruses förmåga att integrera i sin värd genomet gör dem en idealisk vektor för stabil gen leverans. Lentiviral vektorer kan bära upp till 8,5 kilobase par (kbp) av genetiskt material som kan rymma-specifika eller inducerbara initiativtagare, markörerna eller fluorescerande beståndsdelarna. Bolagiserade genomisk material kan replikeras som en del av sin värd genomet och regleras för att uttrycka eller inaktivera vid önskade tidpunkter. Dessa vektorer Tillåt för spatiotemporal kontroll över genuttryck i olika stadier av utveckling och varumärket lentiviruses som kraftfulla verktyg för gen leverans.
Laser-assisterad lentiviral genmodifiering är en effektiv och lätt-till-använda metod för gen uttryck i vivo. Denna metod kan användas för in-vivo produktion av proteiner, uttryck för genetiskt kodade indikatorer eller funktionella studier. Jämfört med andra metoder, laser-assisterad lentiviral gen leverans är lika effektivt som pronukleär Mikroskop men kräver inga tekniska kunskaper eller kostsamma Mikroskop arbetsstationer. XYClone lasern är liten, portabel, och kan enkelt delas mellan flera laboratorier.
Laser-assisterad lentiviral gen leverans är stabil och inte övergående, som i elektroporation eller photoporation av befruktade ägg. Övergående gen leverans är fler fördelar för leverans av CRISPR-Cas9 komponenter eller rekombinaser sedan utökade uttryck kan leda till absurda konsekvenser. I detta protokoll, kan övergående transduktion mus befruktade ägg ersätta de integras bristfällig lentiviruses (IDLVs). IDLVs behåller lentiviral smittsamhet men bara behålla en bråkdel (mindre än 8%) av integrativ kapacitet i lentiviruses29. Laser-assisterad lentiviral genmodifiering är ett ytterligare gen leveransalternativ för användarna att utvärdera baserat på deras önskade resultatet.
Den stora nackdelen med lentiviral transduktion är slumpmässiga införandet av levererade genen. Dessutom kunde celler inom samma embryot värd flera lentiviral integrationer som leder till mosaicism i den transgena. Genotypning av avkomman och flera rundor av planerad avel är nödvändigt att fastställa ett enda locus transgena djur. Liknande strategier för avel är också anställda i konventionella genmodifiering metoder30.
Ett viktigt steg i detta protokoll är längden av tid som tillbringas på laserperforering. Mus som befruktade ägg odlade i KSOM kan inte hållas utanför inkubatorn längre än 15 min. En nybörjare bör flytta de befruktade äggen till M2 medium, använda avancerade KSOM Embryo Medium eller begränsa antalet embryon per platta. Enligt våra resultat utvecklas 47% av sensorik odlade mus befruktade ägg till blastocyster23. Därför kommer att odling 30-40 befruktade ägg per platta säkerställa tillräckligt antal sensorik blastocyster i en platta för överföring i pseudopregnant möss.
Laser-assisterad perforering av mus som befruktade ägg zona kan också vara tillämpliga på zona av andra arter och tillåta inresa för andra typer av virus eller transfection reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi är tacksamma att Dr. Robert Petrovich och Dr Jason Williams för kritisk läsning av manuskript och användbara råd. Vi vill också erkänna och tacka Dr. Bernd Gloss, Knockout kärnan, Flow flödescytometri anläggningen, den fluorescensmikroskopi och Imaging Center och jämförande medicin gren anläggningar i NIEHS för deras tekniska bidrag. Vi vill tacka Mr David Goulding från grenen jämförande medicin och Ms. Lois Wyrick för Imaging Center vid NIEHS för att förse oss med fotografier och illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
