Summary
Mouse di uova fecondate ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene. Questo articolo descrive un protocollo per la zona di perforazione con un laser per trasdurre cellule embrionali con vettori lentivirali e creare topi transgenici.
Abstract
Lentivirus sono efficienti vettori per la consegna del gene in cellule di mammifero. A seguito di trasduzione, il genoma lentivirale stabile è incorporato nel cromosoma ospite ed è passato sopra alla progenie. Pertanto, essi sono vettori ideale per la creazione di linee cellulari stabilizzate, in vivo consegna degli indicatori e trasduzione di uova di singola cellula fecondata per creare animali transgenici. Tuttavia, mouse fecondato uova ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene lentivirali. Lentivirus sono troppo grandi per penetrare la zona e sono in genere consegnati dal microinjection di particelle virali in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali. Il requisito per i tecnologi altamente qualificati e attrezzature specializzate è ridotto al minimo l'uso di lentivirus per consegna del gene di embrioni di topo. Questo articolo descrive un protocollo per permeabilizing le uova fecondata del mouse di perforare la zona con un laser. Perforazione laser non comporta alcun danno agli embrioni e permette lentivirus ottenere l'accesso alle cellule embrionali per consegna del gene. Trasdotte embrioni possono svilupparsi in blastocisti in vitro e se impiantati nei topi pseudopregnant, svilupparsi in cuccioli transgenici. Il laser utilizzato in questo protocollo è efficace e facile da usare. Geni consegnati da lentivirus stabile incorporano nelle cellule embrionali di topo e sono germinale trasmissibile. Si tratta di un metodo alternativo per la creazione di topi transgenici che non richiede nessun micromanipolazione e microiniezione di uova fecondate.
Introduction
Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per permeabilizing la zona pellucida di uova fecondata mouse per rendere le cellule embrionali accessibile per la consegna del gene di lentivirus. Lentivirus sono progettati dalla natura per la consegna efficiente del gene in cellule di mammifero. Essi infettano le cellule di divisione e divisione e integrare il genoma lentivirale nella loro ospite cromosomi1. La gamma delle cellule dell'ospite lentivirali prontamente viene espanso dal pseudotipizzazione il lentivirus ricombinanti con la glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSV-G), dovuto il vasto trofismo della proteina VSV-G2. A seguito di trasduzione, geni lentivirali sono stabilmente integrati ed espresso come parte del loro cromosomi ospite creando uno strumento ideale per la generazione di animali transgenici. Se consegnato alle prime cellule embrionali di fase, il genoma lentivirale è replicato ed espresso nell'intero organismo. Trasduzione lentivirale ha portato alla produzione di ratto, topi, quaglie, pollo e maiale3,4,5,6,7 , tra le altre specie di transgenica. Il tipico metodo di consegna del gene lentivirali, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e tecnici specializzati di superare la barriera di zona pellucida che incapsula gli embrioni in fase precoce. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere come permeabilize la zona usando un laser per facilitare la consegna del gene lentivirali.
Le uova dei mammiferi sono circondate dalla zona pellucida che indurisce dopo fertilizzazione per proteggere le uova fecondate contro gamete e per limitare le interazioni ambientali8,9. La zona costituisce una barriera che allontana le cellule embrionali lentivirus fino a quando gli embrioni sono nati come una blastocisti. Coltivati del topo fecondate le uova si schiudono dopo 4 giorni e devono essere impiantati in topi pseudopregnant prima schiusa per lo sviluppo normale in cuccioli. Pertanto, per la trasduzione, lentivirus vengono microiniettati prima della schiusa dalla zona in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali.
La zona pellucida viene spesso rimosso per fecondazione in vitro di ovuli umani per aumentare il tasso di fertilizzazione10. Tuttavia, rimozione chimica di mouse zona pellucida negativamente colpisce lo sviluppo dell'embrione di topo ed è nociva per le cellule embrionali11,12. Altri metodi per la consegna del gene di uova fecondata mouse superare la barriera di zona pellucida di microiniezione diretta del DNA nella cellula nucleo13. Microiniezione pronuclei è un mezzo efficace di fornire geni agli embrioni. Tuttavia, poiché ogni embrione è tenuto in posizione singolarmente per la microiniezione, la pratica può essere laborioso e che richiede tempo per un utente inesperto.
Altri metodi quali l'elettroporazione e photoporation sono utili per transitori e a breve termine consegna del gene di topo fecondato uova14,15,16. Questi metodi sono ampiamente utilizzati per la consegna di ricombinasi e componenti CRISPR-Cas9. Tuttavia, elettroporazione e photoporation consegna dei geni non utilizzabile in modo efficiente per creare transgenica. Gli spermatozoi che vengono raccolti da epididimo forato del mouse possono anche essere microlavorati lentivirus e utilizzati per la fecondazione in vitro per la produzione di animali transgenici17,18,19, 20.
In questo protocollo, la consegna del gene lentivirali di embrioni di topo è facilitata da permeabilizing la zona utilizzando un laser. Il laser XYClone è stato sviluppato come sussidio per la coltivazione di cellule staminali embrionali22e in vitro fertilizzazione21 . Si tratta di un piccolo apparecchio che è semplice da configurare e facile da usare. Una volta installata su un microscopio, occupa lo spazio di una lente obiettiva e il software in dotazione permette di puntamento laser mentre guardando attraverso gli oculari del microscopio (Vedi protocollo: sezione 3). Una volta che la zona è perforata dal laser XYClone, lentivirus può essere introdotto nel terreno di coltura per gene consegna23. Lentivirus multiple potrebbero essere utilizzati per inviare simultaneamente diversi geni per costituzione cromosomica.
Questo protocollo descriverà come isolare e cultura mouse fecondato uova, viene illustrato l'utilizzo del laser per perforazione della zona pellucida e dimostra la trasduzione di cellule embrionali di topo da lentivirus.
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Protocol
Tutte le procedure animale e trattamenti utilizzati nel presente protocollo erano in conformità con le linee guida di NIH/NIEHS cura degli animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) presso il NIH/NIEHS, animale protocollo 2010-0004.
1. preparati
- Preparare/acquisto ricombinante non propagante lentivirus che trasporta il gene di interesse. In questo studio, lentivirus SBI511 espressione della proteina fluorescente verde Copepoda (copGFP; abbreviato in GFP) da un allungamento promotore 1a fattore è stato usato per la trasduzione. Protocolli standard2 sono stati utilizzati per produrre e lentivirus titolo a titoli superiori a 1e8 transducing unità / mL (TU/mL).
Nota: Prestare attenzione e tutto il materiale che sono stati a contatto con lentivirus di candeggina. Fare riferimento alle linee guida del vostro Istituto per sicurezza d'uso e la manipolazione di lentivirus. - L'installazione di coppie riproduttrici di razza del topo desiderato il giorno prima della raccolta di embrioni. In questo esperimento, è stato utilizzato C57BL/6J ceppo di topi. Utilizzato per la raccolta di ovidotto e ovaie di topi femmina non sono stati trattati con ormoni per superovulazione.
- 2 – 24 h prima della raccolta uova mouse fertilizzato, preparare diverse piastre di goccia24 (KSOM) di potassio Simplex ottimizzato Medium come segue: aggiungere una goccia di 50 μL di mezzo KSOM per mezzo di una piastra di coltura tissutale-trattati di 35 mm e coprire con 2 mL di Dimetilpolisiloxano (DMPS5X) e posto al 37 oC, 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 per equilibrare.
Nota: Usare piastre sterili monouso e gettare a seguito dell'esposizione a lentivirus. - Preparare soluzione 1x dell'ialuronidasi nel terreno di M2 da soluzione madre (100 x, 30 mg/mL, conservare a-20 ° C). 100 x soluzione di riserva è stato preparato in acqua.
- 24h post laser-assistita di trasduzione delle uova fecondata del mouse, impostare coppie tra vasectomia topi maschi e femmine per preparare i topi femminili pseudopregnant.
2. isolamento del Mouse fecondate le uova
- 16 – 24 h post accoppiamento, selezionare topi femminili con spine vaginali indicative di accoppiamento riuscito e umanamente eutanasia25. I topi utilizzati in questo studio sono stati eutanasizzati di dislocazione cervicale sotto profonda inalazione di CO2 o isoflurano.
- Isolare le ovaie e ovidotti secondo protocolli standard25.
- Trasferire le ovaie e ovidotti ad un piatto di 35 mm contenente M2 media.
- Per ogni ovaia, strappare ampolla a pezzi per rilasciare le uova fecondate circondate da cellule del cumulo.
- Trasferire le uova fecondate e le cellule del cumulo a un 35 mm piatto contenente 1 ialuronidasi x nel mezzo di M2 e incubare a temperatura ambiente per 3 – 5 min.
- Dispensare fecondate le uova su e giù per rilasciare le cellule del cumulo.
- Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente M2 media e dispensare su e giù per lavare via l'ialuronidasi.
- Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente KSOM e dispensare su e giù per lavare via i rimanenti M2 media e ialuronidasi.
- Trasferire le uova fecondate per le piastre di goccia KSOM preparate dal passaggio 1.3.
Nota: Mouse fecondato uova in KSOM devono essere mantenute in coltura tissutale incubatore a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 per equilibrare. Rimozione di piastre da incubatrice per più di 15 min si tradurrà in danno agli embrioni. - Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice prima di passare al passaggio successivo.
3. perforazione del Mouse fecondato uova con Laser XYClone
- Configurare e calibrare XYClone laser secondo la raccomandazione del costruttore. Altri laser, in genere utilizzato per la fecondazione in vitro , può essere sostituito con XYClone laser perforare le uova fecondate.
- Collegare il filo di casella controller laser all'apparato laser sul microscopio.
- Fissare la scatola del regolatore laser al computer che esegue il software laser tramite una porta USB. 3.1.3. Collegare il controller laser e accenderlo.
- Guardando attraverso l'oculare, perforare un campione (ad es. a secco-erase marcature su un vetrino).
- Utilizzare un piccolo cacciavite (incluso nel kit laser) per regolare la X e posizione Y del laser per abbinare il LED luce visibile attraverso l'oculare del microscopio e tarare il laser.
- Posizionare un piatto di goccia KSOM contenenti uova fecondata mouse sul tavolino del microscopio. Non tenere la piastra di fuori dell'incubatore per più di 15 min.
- Guardare attraverso l'oculare del microscopio e assicurarsi che zona pellucida dell'embrione è a fuoco e il laser luce LED è visibile.
- Spostare il tavolino del microscopio per indirizzare la zona con il laser e la luce del LED.
- Utilizzo del software PC impostato XYClone laser 250 μs.
- Regolare le dimensioni di luce LED per dimensioni desiderate (impostazione 5 in questo esperimento).
- Perforare la zona di ogni ovulo fecondato tre volte con il laser. La zona può essere trafitto o diluito. Utilizzando le impostazioni di cui sopra, il laser si produrrà un buco con un diametro di 10 μm (Figura 2).
Nota: Laser che mira vicino al corpo di polar allontana le cellule embrionali. - Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice di coltura del tessuto prima di passare al passaggio successivo.
4. trasduzione del Mouse fecondate le uova dopo perforazione Laser XYClone
- Pipettare 2 μL di concentrato lentivirus (maggiore di titolo TU/mL 1e8) nella goccia KSOM 50 μL. Non pipettare su e giù. Le uova fecondate facilmente collegare il puntale. Basandoci sulla nostra esperienza, 1e5-5e5 unità trasduzione di lentivirus in un volume minore di 3 µ l è ottimale per la consegna del gene.
- Consentire uova fecondate di svilupparsi in blastocisti per 4 giorni nell'incubatrice. Nessuna necessità di cambiare il supporto.
5. non-chirurgico trasferimento degli embrioni del Mouse trasdotte ai topi pseudo-incinto
- Utilizzare il mouse pseudopregnant, 3,5 giorno dopo l'accoppiamento, preparata al punto 1.5.
- Usare il dispositivo Non-Surgical Embryo Transfer (SNE) per impiantare embrioni di topo in pseudopregnant topi.
- Utilizzando un microscopio chirurgico o dissezione, inserire uno speculum vaginale per visualizzare la cervice.
- Inserire il dispositivo di trasferimento di embrioni Non-Surgical (SNE) circa 5 mm la cervice e deposito embrioni in un volume di circa 2 µ l.
Nota: Un dispositivo sterile SNE è utilizzato per ogni trasferimento e scartato dopo la procedura. Tutti i reattivi utilizzati nella manipolazione degli embrioni devono essere sterili.
- Trasferire 10 – 15 blastocisti sano nel volume 2 di μL di KSOM ogni pseudopregnant topi.
- Continuare a monitorare e misurare il guadagno di peso nei topi pseudopregnant nei giorni successivi per determinare se lo SNE è stata completata.
- Recuperare i cuccioli permettendo i topi incinto a partorire naturalmente o effettuando un taglio cesareo 17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione26. Un taglio cesareo è spesso necessario se pochissimi embrioni sono presenti e crescono troppo grande per nascita naturale.
- Raccogliere tessuto da cuccioli per la genotipizzazione determinare il tasso di transgenesi27.
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Representative Results
Sviluppo di uova mouse isolato/trasdotte fertilizzato può essere verificato sotto il microscopio ogni giorno (Figura 1). Gli embrioni sani si sviluppano in blastocisti entro 3-4 giorni. In questo protocollo, 60 – 70% degli embrioni non trattati sviluppano in blastocisti23. Su 114 embrioni trasdotte traforato al laser, 54 sviluppato in blastocisti (tasso del 47%) e 46 blastocisti espresso GFP (46/54 = 85%)23.
Gli embrioni del mouse erano traforato al laser il giorno della raccolta. L'impostazione ottimale per il trattamento laser è stato 3 fori per ogni uovo fecondato e 250 ms il laser deve essere finalizzato per fluidificare la zona invece di creare un foro (Figura 2). In questo modo gli embrioni in sviluppo di beneficiare di un'intatta pellucide incapsulamento diventando permissivo alla trasduzione lentivirale. In questi esperimenti, embrioni di topo sono state trasdotte con un lentivirus ricombinanti che esprime Copepoda GFP (GFP abbreviato) da un promotore di 1a fattore di allungamento. Per la trasduzione, 2 uL di lentivirus fu introdotto in terreni di coltura. Aumentando la quantità di virus, direttamente influenzato il numero di embrioni trasdotte che espresse GFP e influire negativamente lo sviluppo dell'embrione in blastocisti23. Virale volumi superiori a 10% del volume della goccia KSOM pregiudicherebbe anche formazione di blastocisti (es. maggiore di 5 μL di virus in una goccia KSOM 50 μL).
Per convalidare la redditività, embrioni del mouse trasdotte non chirurgico sono stati trasferiti ai topi pseudopregnant. Sei distinti eventi SNE, trasferendo un totale di 58 blastocisti, 9 cuccioli transgenici GFP su totale di 12, producendo il 75% del tasso di transgenesi 23ha provocato. Il protocollo di SNE è segnalato per produrre 30-35% nati vivi28 rispetto al 21% di rendimento che sono stati osservati nei nostri esperimenti (12/58). Il trattamento lentivirale può avere un ruolo nello sviluppo dell'embrione e contribuito per la velocità di trasferimento dell'embrione basso. Cuccioli con più integrazioni lentivirali e alta espressione della GFP erano visivamente verdi sotto una lampada a LED blu (465-470 nm) (Figura 3). Il numero di copie GFP incorporate ha variato da 0-6 copie ed è stata determinata eseguendo PCR qualitativa il DNA cromosomico isolato dal pup tessuto23.
Figura 1: sviluppo del Mouse trasdotte fecondate le uova nella cultura. Le uova fecondata del mouse C57BL/6J sono state controllate il giorno 0 (ovulo fecondato raccolto), 1 giorno (due-cellula), 2 ° giorno (8-16 celle), 3 ° giorno (morula) e giorno 4 (blastocisti). Gli embrioni sono state trasdotte con un lentivirus che trasporta un gene GFP. Presenza di fluorescenza in embrioni trasdotte divenne evidente di giorno 2-3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: trattamento del Laser del Mouse fecondato uova. Esempi della perforazione della zona per produrre un foro vs assottigliamento della zona.
Figura 3: topi transgenici che esprimono GFP. Scuro Reader (DR Spot lampada, DRSL-9S) è stato utilizzato per visualizzare il cuccioli positivo GFP in un ambiente buio. Cuccioli di controllo non-transgenici sono stati aggiunti al gruppo per contrasto. Cuccioli risultanti (frecce rosse) sono stati genotipizzati e contenuta da 0-6 copie della lentivirali gene/GFP.
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Discussion
La capacità di integrare nel loro genoma ospite il lentivirus li rende un vettore ideale per consegna stabile del gene. Vettori lentivirali possono trasportare fino a 8,5 paio di kilobase (kbp) di materiale genetico che può ospitare promotori cellula-specifico o inducibili, marcatori di selezione o moiety fluorescente. Materiale genomico incorporato può replicare come parte del loro genoma ospite e regolato per esprimere o disattivare a intervalli di tempo desiderato. Questi vettori consentono un controllo spatiotemporal sopra espressione genica nelle varie fasi di sviluppo e lentivirus di marca come potenti strumenti per la consegna del gene.
Transgenesi lentivirale laser-assistita sono un metodo efficace e facile da usare per l'espressione genica in vivo. Questo metodo può essere utilizzato per la produzione in vivo della proteina, espressione di indicatori codificati geneticamente, o studi funzionali. Rispetto ad altri metodi, consegna del gene lentivirali laser-assistita è efficace quanto la microiniezione pronuclei ma non richiede competenze tecniche o postazioni di lavoro costose microiniezione. Il laser XYClone è piccolo, portatile e possono essere facilmente condivisi tra diversi laboratori.
Consegna del gene lentivirali laser-assistita è stabile e non transitori, come in elettroporazione o photoporation di uova fecondate. Consegna del gene transitoria è più vantaggi per la consegna di componenti CRISPR-Cas9 o ricombinasi poiché espressione estesa potrebbe portare a conseguenze aberranti. In questo protocollo, il lentivirus carenti di integrasi (IDLVs) può essere sostituito per trasduzione transiente di uova fecondata di mouse. IDLVs conservare lentivirali infettività ma conservano solo una frazione (meno dell'8%) di capacità integrativa di lentivirus29. Laser-assistita transgenesi lentivirale sono un'opzione di consegna supplementari del gene agli utenti di valutare sulla base loro risultato desiderato.
Lo svantaggio principale di trasduzione lentivirale è l'inserimento casuale del gene trasportato. Inoltre, le cellule all'interno dell'embrione stesso potrebbero ospitare più integrazioni lentivirali che conduce al mosaicismo nel transgenico. Genotipizzazione della prole e vari cicli di allevamento pianificato sono necessari stabilire un animale transgenico singolo locus. Simili strategie di allevamento vengono impiegate anche in transgenesi convenzionali metodi30.
Un passaggio fondamentale in questo protocollo è la lunghezza del tempo trascorso su perforazione laser. Uova fecondata mouse coltivate in KSOM non possono essere tenute all'esterno dell'incubatrice per più di 15 min. Un utente inesperto deve spostare le uova fecondate su M2 media, utilizzare Advanced KSOM embrione medio oppure limitare il numero di embrioni per piastra. Secondo il nostro risultato, 47% di trasdotte coltivati del topo fecondato uova svilupparsi in blastocisti23. Pertanto, 30-40 uova fecondate per piastra di coltura garantirà un numero adeguato di blastocisti trasdotte in un piatto per il trasferimento in pseudopregnant topi.
Perforazione laser-assistita della zona di uovo fecondato del mouse può anche essere applicabile per la zona di altre specie e consentire l'ingresso di altri tipi di virus o reagenti di transfezione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institute of Health (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS). Siamo grati al Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams per una lettura critica del manoscritto e consigli utili. Inoltre vorremmo citare e ringraziare il Dr. Bernd Gloss, il nucleo di Knockout, la struttura di citometria a flusso, la microscopia a fluorescenza e Imaging Center e le strutture di ramo di medicina comparativa del NIEHS per i loro contributi tecnici. Vorremmo ringraziare Mr. David Goulding dal ramo di medicina comparativa e MS. Lois Wyrick di Imaging Center presso il NIEHS per averci fornito con fotografie e illustrazioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD510B-1 plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culturing embryos |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | used to remove cumulus cells |
| XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforating mouse fertilized eggs | |
| Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device | ParaTechs | 60010 | NSET of embryos |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | culturing embryos |
| Composition of KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Lactic Acid, sodium salt | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µL | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6.3 | ||
| 0.5% phenol red | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Essential Amino Acids | 1mL | ||
| MEM Non-essential AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | culturing embryos |
| Composition of M2: | mg/100mL | ||
| Calcium Chloride | 25.1 | ||
| Magnesium Sulfate (anhydrous) | 16.5 | ||
| Potassium Chloride | 35.6 | ||
| Potassium Phosphate, Monobasic | 16.2 | ||
| Sodium Bicarbonate | 35 | ||
| Sodium Chloride | 553.2 | ||
| Albumin, Bovine Fraction | 400 | ||
| D-Glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Phenol Red | 1.1 | ||
| Pyruvic Acid | 3.6 | ||
| DL-Lactic Acid | 295 |
References
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
- McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
- Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
- Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
- Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
- Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
- Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
- Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
- Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
- Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
- Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
- Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
- Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
- Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
- Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
- Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
- Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
- Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
